專利名稱：：一種KDRsiRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)的小分子干擾RNA(siRNA)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤區(qū)域的血管密切相關(guān)，腫瘤區(qū)域的新生毛細(xì)血管是腫瘤賴以生長和生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，腫瘤細(xì)胞需要新生血管為迅速生長的腫瘤提供營養(yǎng)和排出代謝廢物。早在七十年代初就有人提出把抑制腫瘤血管形成作為腫瘤治療的一個(gè)途徑，隨后這種以腫瘤血管為靶標(biāo)的治療策略——腫瘤血管靶向治療逐步發(fā)展成為當(dāng)今腫瘤領(lǐng)域研究的主攻方向之一。以前的很多研究都是將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作為靶基因，但對于血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)的研究相對卻很少。大量的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤區(qū)域新生血管高表達(dá)VEGFR是為腫瘤部位所特有的，因而可以作為血管靶向治療的理想靶點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)的VEGF受體有三種VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(FLK-1、KDR)和FLT-4，由含7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外區(qū)、膜區(qū)及酪氨酸激酶區(qū)組成，均是跨膜受體。其共同特點(diǎn)是催化域內(nèi)有酪氨酸激酶插入?yún)^(qū)，該酪氨酸激酶的活性通過受體和配體結(jié)合而激活，由受體磷酸化而引起細(xì)胞內(nèi)許多酶和其他反應(yīng)。但在細(xì)胞的生長和分化中起重要作用而與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成有關(guān)的只有FLK-1(含激酶插入?yún)^(qū)受體kinaseinsertdomain_containingreceptor，KDR)。它在胚胎血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較高，而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)下降。實(shí)體腫瘤分泌VEGF,以自分泌或旁分泌的方式作用于KDR，在兩個(gè)水平發(fā)揮作用(1)促血管生成作用:VEGF作用于血管內(nèi)皮上的KDR，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)新血管的形成，提髙血管的通透性。(2)直接剌激腫瘤細(xì)胞增殖部分腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌細(xì)胞，表達(dá)KDR，存在VEGF-KDR自分泌環(huán)，VEGF作用于自身后，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。抑制腫瘤血管內(nèi)皮上的KDR能夠減少腫瘤毛細(xì)血管的生長，切斷腫瘤血供，導(dǎo)致腫瘤缺血壞死。由于在腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞遠(yuǎn)較腫瘤細(xì)胞少，每根毛細(xì)血管滋養(yǎng)數(shù)百個(gè)腫瘤細(xì)胞，摧毀腫瘤區(qū)域的毛細(xì)血管所產(chǎn)生的抗癌效果要比攻擊大的瘤負(fù)荷容易得多。因此，目前普遍認(rèn)為針對腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的治療有廣闊的應(yīng)用前景。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的基因沉默技術(shù)，siRNA是RNAi的效應(yīng)分子，體外合成siRNA則是RNA干擾技術(shù)的最新發(fā)展，尤其是在特異性抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)方面，為基因治療開創(chuàng)了新的道路。目前，處于研發(fā)階段的siRNA類核酸藥物根據(jù)修飾成分的不同分為三種裸siRNA(即未修飾的siRNA)、載體連接的siRNA及化學(xué)修飾的siRNA。裸siRNA由于半衰期短、穩(wěn)定性差、易被核酸酶降解且不易被細(xì)胞攝取，故應(yīng)用范圍不廣。載體連接的siRNA常采用質(zhì)粒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等傳統(tǒng)載體，具有諸多弊端，如插入的外源性基因可能與內(nèi)源性基因發(fā)生重組、病毒載體本身可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)并可能誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化等，而且對于siRNA能否在細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)而不發(fā)生丟失尚不能確定。鑒于上述風(fēng)險(xiǎn)，故以傳統(tǒng)載體連接的siRNA還不能滿足臨床安全性和長效性的需要；而化學(xué)修飾的siRNA可提高siRNA的穩(wěn)定性和RNA干擾活性、能抵抗核酸酶的降解作用、利于被細(xì)胞攝取、具有siRNA傳統(tǒng)載體(如病毒、質(zhì)粒等)不可比擬的優(yōu)勢。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)的小分子干擾RNA。本發(fā)明KDRsiRNA的核苷酸序列如下正義鏈5'-gccaccauguucucuaauaLiu-3'反義鏈3'-uucggugguacaagagamiau-5'。本發(fā)明通過在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中獲取人KDRmRNA的序列全長(GI:11321596)，依據(jù)RNAi原理，結(jié)合設(shè)計(jì)軟件，在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成并篩選出有效的針對人KDR基因的一段21nt的siRNA。為提高siRNA在體內(nèi)抵抗核酸酶水解的能力，可對本發(fā)明KDRsiRNA的核苷酸序列進(jìn)行氟代修飾，優(yōu)選對其正義鏈進(jìn)行核苷酸戊糖2'-羥基的氟代修飾。對合成的siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，能夠增加siRNA的穩(wěn)定性，同時(shí)有效抑制目的基因的表達(dá)。siRNA的化學(xué)修飾主要有三類磷酸骨架修飾、核糖修飾和堿基修飾。其中對siRNA最重要的修飾是對核苷酸戊糖2'-羥基(2'-0H)的修飾。核苷酸戊糖2'-羥基是RNA與DNA的主要區(qū)別，RNA水解時(shí)，在RNA酶催化下，2'-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用下形成水解產(chǎn)物。在核糖的2'-OH位置引入氟取代基后，使siRNA具有更強(qiáng)的抵抗核酸酶水解的性能；2'-F使RNA酶不易識(shí)別siRNA，從而增加了siRNA的穩(wěn)定性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)和小鼠體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2'-FsiRNA與2'-0HsiRNA的基因沉默效應(yīng)無明顯差別。另外，siRNA的正義鏈和反義鏈有不同的功能，反義鏈3'端的突起起識(shí)別與結(jié)合靶mRNA的作用，正義鏈突出端的修飾不影響靶點(diǎn)的識(shí)別，從而不影響siRNA干擾的效果。對正義鏈的修飾或正義鏈少數(shù)堿基不配對較少影響siRNA的活性，而反義鏈的修飾對siRNA基因沉默的活性影響較大。因此在本實(shí)驗(yàn)我們的設(shè)計(jì)中選擇了對正義鏈進(jìn)行氟代修飾，反義鏈不修飾的方法，既提高了siRNA的穩(wěn)定性，提高siRNA在哺乳動(dòng)物體內(nèi)抵抗核酸酶水解的能力，又保證了抗腫瘤作用的特異性。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供KDRsiRNA在制備抗乳腺癌基因治療藥物中的應(yīng)用。以往的實(shí)驗(yàn)表明，大多陽離子脂質(zhì)體對血清很敏感，因而在整個(gè)基因轉(zhuǎn)染過程均不能含有血清，因而在轉(zhuǎn)染試劑加入細(xì)胞的前后必須更換培養(yǎng)液，以提高轉(zhuǎn)染效率，降低細(xì)胞毒性。陽離子多聚物載體具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定靈活，性能易于調(diào)整，目的基因容量大及合成簡便等優(yōu)點(diǎn)，聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是一種人工合成型陽離子多聚物，能與DNA通過靜電吸附作用而自組裝成納米微粒，已經(jīng)被很多研究證明是抑制特定基因表達(dá)的理想工具，比病毒載體和裸siRNA具有一定的優(yōu)勢，生物體內(nèi)穩(wěn)定性比陽離子脂質(zhì)體好，具有較低的免疫原性和細(xì)胞毒性。jetSr-ENDO為陽離子聚合物聚乙烯亞胺的衍生物，依靠細(xì)胞本身的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，對細(xì)胞的傷害性非常低，可以耐受血清，在轉(zhuǎn)染試劑加入細(xì)胞的前后不必更換培養(yǎng)液，細(xì)胞毒性低。在體外試驗(yàn)中利用jetSI-ENDO做轉(zhuǎn)染試劑，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中利用InvivojetPErM作為轉(zhuǎn)染試劑，將針對人KDR基因的小分子干擾RNA轉(zhuǎn)染人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和裸鼠移植瘤，在體內(nèi)外誘導(dǎo)RNAi。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法，細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)法，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)，蛋白印跡試驗(yàn)等檢測siRNA治療組和對照組基因表達(dá)及細(xì)胞增殖凋亡的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，本發(fā)明化學(xué)修飾的KDRsiRNA能有效介導(dǎo)RNAi，在體內(nèi)外均能成功下調(diào)靶基因KDR的表達(dá)，抑制MCF-7細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，為乳腺癌的治療提供了一個(gè)新的特異性基因治療手段。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖lRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siRNA后MCF-7細(xì)胞KDRmRNA表達(dá)水平；1:DNA標(biāo)準(zhǔn)2:無核酶水3:50nmol/LKDRsiRNA組4:100nmol/LKDRsiRNA組5:200nmol/LKDRsiRNA組6:jetSI組7:空白對照組圖2westernblotting分析轉(zhuǎn)染siRNA后MCF-7細(xì)胞KDR蛋白表達(dá)；1:KDRsiRNA轉(zhuǎn)染組2:jetSI組3:空白對照組圖3siRNA轉(zhuǎn)染48h后MCF-7細(xì)胞的增殖X100;A:空白對照組B:jetSI組C:100nmol/LsiRNA組圖4siRNA轉(zhuǎn)染對MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；A:jetSI組B:KDRsiRNA轉(zhuǎn)染組圖5轉(zhuǎn)染siRNA后MCF-7細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；A:jetSI組中MCF-7細(xì)胞B:siRNA轉(zhuǎn)染組中MCF-7細(xì)胞圖6治療后各組生長曲線對照；A:空白對照組B:jetPEI轉(zhuǎn)染試劑組C:小劑量處理組D:大劑量處理組圖7乳腺癌移植瘤用藥前后照片；A:治療前大劑量KDRsiRNA治療組B:治療前空白對照組C:治療后大劑量KDRsiRNA治療組D:治療后空白對照組圖8HE染色和免疫組化染色；圖9RT-PCR檢測siRNA治療后瘤組織KDRmRNA表達(dá)水平。1:空白對照組2:jetPEI轉(zhuǎn)染試劑組3:小劑量處理組4:大劑量處理組具體實(shí)施方式一、實(shí)驗(yàn)材料(一)動(dòng)物BALB/cnu/nu裸鼠，購自上海斯萊克動(dòng)物有限公司，雌性，4周齡，體重為1214g。按規(guī)定詞養(yǎng)于無菌動(dòng)物試驗(yàn)室。經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動(dòng)物自由飲食。(二)細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自中國協(xié)和基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。(三)藥品及試劑MTT、DMS0、PBS、鼠抗人KDR—抗、P-actin—抗和抗鼠IgG二抗購自美國Sigma公司，Hoechst33258購自碧云天生物公司，InvivojetPEI、jetsr-END0購自法國polyplustransfection公司，TRIzolReagent購自美國Invitrogen公司，RT-PCRSystem購自美國Promega公司，ECL發(fā)光試劑為北京普利萊公司產(chǎn)品，免疫組化檢測試劑盒PV6002，北京中杉公司產(chǎn)品。(四)儀器C02培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)公司)，倒置顯微鏡、顯微照相機(jī)(日本尼康公司)，酶標(biāo)儀(Rayto2100C)，Eppendorf微量核酸蛋白分析儀、Eppendorf5417R冷凍離心機(jī)(德國艾本德股份公司產(chǎn)品)，天能凝膠成像分析系統(tǒng)(深圳天能公司)，VIDAS圖象分析系統(tǒng)(德國歐波同公司)，藍(lán)盾621可見凝膠投射儀(廈門百維信生物科技有限公司)。二實(shí)驗(yàn)方法(一)化學(xué)修飾的KDRsiRNA在體外對MCF-7細(xì)胞KDR基因表達(dá)的影響1.siRNA設(shè)計(jì)合成通過在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取人KDRmRNA的序列全長(GI:11321596)，依據(jù)RNAi原理，結(jié)合設(shè)計(jì)軟件，在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成并篩選出有效的針對人KDR基因的一段21nt的siRNA，KDRsi脂A序列為-5'_gccaccauguucucuaauauu-3'(正義鏈)，3'-uucggugguacaagagauuau-5'(反義鏈)。行BLAST比對檢查以保證和其他基因沒有同源性。以NTP為原料，利用ABI3900核酸合成儀化學(xué)分別合成單鏈RNA,在退火緩沖液的條件下兩條單鏈RNA退火形成雙鏈RNA。為提高siRNA在體內(nèi)抵抗核酸酶水解的能力，在正義鏈化學(xué)合成之前，利用化學(xué)反應(yīng)將正義鏈合成原料的核糖進(jìn)行2'-羥基的氟代修飾。上述合成工藝由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司(廠商地址浦東張江哈雷路1011號(hào)602，郵編201203)進(jìn)行化學(xué)合成。2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組MCF-7細(xì)胞在含有10%滅活的新生牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37。C、5%C02、飽和濕度的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液1次，4天傳代1次，實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均處于對數(shù)生長期，且存活細(xì)胞百分率均在95%以上(臺(tái)盼藍(lán)拒染法)。MCF-7細(xì)胞根據(jù)要求分為5組(1)50nmol/L組吸出正常培養(yǎng)基，加入無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后siRNA終濃度為50歷ol/L。(2)100nmol/L組siRNA終濃度為100nmol/L。(3)200nmol/L組siRNA終濃度為200nmol/L。(4)jetSI組吸出正常培養(yǎng)基，加入無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，不加siRNA只加入轉(zhuǎn)染試劑jetSI-END0。(5)空白對照組實(shí)驗(yàn)時(shí)吸出正常培養(yǎng)基，加入無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基。作用48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.轉(zhuǎn)染按JetSP1-ENDO試劑說明書操作。4.半定量RT-PCR檢測KDRmRNA的水平收集100nmol/LKDRsiRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)細(xì)胞，按照Trizol試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA，所提RNA溶于50ul無酶水中，Eppendorf核酸定量測定儀測RNA濃度和純度，并行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA完整性。將lpg總RNA行20ul體系逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取cDNA后續(xù)25ul體系PCR反應(yīng)，并以無酶水作為陰性模板對照。KDR引物序列為5'-CTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCA-3'5'-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3'，擴(kuò)增長度為795bp;內(nèi)參照GAPDH引物序列為5'-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3'5'-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG_3'，擴(kuò)增長度為509bp;PCR擴(kuò)增條件94"預(yù)變性5min，94°C45s，64°C45s，72°C90s，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸5min。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳上觀察拍照，并運(yùn)用天能分析軟件對條帶進(jìn)行光密度掃描，檢測各組KDRmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物與其對應(yīng)的內(nèi)參GAPDHmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物J值，然后將A。,/A，;/的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。5.Westernblotting檢測KDR蛋白的表達(dá)常規(guī)消化收集100nmol/LKDRsiRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)的細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，棄上清，加入細(xì)胞裂解液[O.P/。十二烷基磺酸鈉(SDS)，100ug/ml苯甲基磺酰氟(PMSF)，1%NP-40，0.5%去氧膽酸鈉，0.02%疊氮鈉，lug/ml抑蛋白酶月太(Aprotinin)，150聽1/LNaCl和50mmo1/LTris-HCLPH7.5]冰上充分裂解，4°C12OOOg離心5min，收集上清液定量，取lOOug蛋白上樣，行12%的SDS-PAGE電泳，蛋白充分分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Sigma公司)上，于含5%脫脂奶粉的封閉液中4。C過夜。KDR—抗1:1000稀釋室溫孵育2h,二抗1:2000稀釋室溫孵育lh，ECL發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色反應(yīng)，X膠片曝光，拍照。對條帶進(jìn)行光密度掃描，檢測各組KDR蛋白和內(nèi)參e-actin蛋白所對應(yīng)條帶A值，然后將Ak。b/A^^的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(二)化學(xué)修飾的KDRsiRNA在體外對MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響1.MTT測定收集對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，每孔6乂103個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞過夜貼壁，每組做6個(gè)平行孔，每孔終體積為IOOul，按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。置37。C，5。/。C02孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)后加MTT(10mg/ml)10u1/孔，繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄上清，加DMSO100"1/孔，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)儀492nm波長處測各孔的吸光度，以公式(1-A/C)X100。/。計(jì)算siRNA對腫瘤細(xì)胞的生長抑制率(A,C分別為給藥組細(xì)胞和空白對照組吸收度平均值)，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2.細(xì)胞周期的變化常規(guī)消化收集100nmol/LKDRsiRNA己轉(zhuǎn)染48小時(shí)的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化離心收集并重懸于PBS中，于4。C用700mL/L乙醇固定30min。用含RNase及碘化丙錠(propidiumiodide,PI)的染色液染色30min后，以流式細(xì)胞儀(EPICS-ELITE-ESP)進(jìn)行細(xì)胞周期的分析，每個(gè)樣本檢測約11000個(gè)細(xì)胞，得出各期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率。3.Hoechst33258染色常規(guī)消化收集100nmol/LKDRsiRNA已轉(zhuǎn)染48小時(shí)的細(xì)胞，收集細(xì)胞，制備爬片，加入多聚甲醛固定lh，去固定液，PBS洗3遍，再加入10mg/LHoechst33258(0.5mL/L)避光染色10min，用封片液(500g/LPBS+500mL/L甘油)封片后，熒光顯微鏡觀察。(三)化學(xué)修飾的KDRsiRNA裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)1.動(dòng)物模型的建立及分組選4周齡BALB/Cnu裸鼠，每周兩次腹腔注射苯甲酸雌二醇10mg/kg,連續(xù)2周。取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用Hank's液清洗2次，在細(xì)胞記數(shù)板上作細(xì)胞記數(shù)，并調(diào)節(jié)使活細(xì)胞濃度為5X107/ml，于裸鼠右側(cè)腋窩偏背部接種O.1ml/只(含細(xì)胞5X106個(gè))。按試劑說明siRNA與InvivojetPErM最佳質(zhì)量體積比為10ug:1.8ul，以5%葡萄糖溶液作為稀釋液，在體外將siRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，然后直接注射瘤體內(nèi)。以瘤體直徑^5mm為成瘤陽性，將成瘤陽性的裸小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。進(jìn)行瘤內(nèi)給藥。大劑量KDRsiRNA處理組注射KDRsiRNA1mg/kg;小劑量KDRsiRNA處理組注射KDRsiRNA0.5mg/kg;jetPEI轉(zhuǎn)染試劑組注射InvivojetPEI和5°/。葡萄糖溶液；空白對照組僅注射5%葡萄糖溶液，終體積均為IOOul。每三天注射一次，連續(xù)8次。22天后拉頸處死。部分瘤組織加入液氮?jiǎng)驖{提取RNA;部分行病理學(xué)檢查(10。/。甲醛固定后，HE染色)及免疫組織化學(xué)檢查。2.腫瘤體積與抑瘤率分析裸鼠每周監(jiān)測裸鼠體重，按公式V二0.5aXb2(V代表瘤體積，a為長徑b短徑)每三天測量瘤體積，繪制瘤體增長曲線。22天后拉頸處死裸鼠，分離得瘤體，稱重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對照組瘤重X100。/^。3.HE染色，免疫組化染色取瘤組織后，在10%中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，2um厚連續(xù)切片。采用蘇木精-伊紅染色和免疫組化兩步法染色，切片常規(guī)脫蠟水化后，其余操作按試劑盒說明書進(jìn)行。4.半定量RT-PCR分析按照Trizol試劑盒操作說明提取腫瘤組織總RNA，所提RNA溶于20ul無酶水中，Eppendorf核酸定量測定儀測RNA濃度和純度，并行O.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA完整性。將5iug總RNA行20ul體系逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取cDNA后續(xù)25ul體系PCR反應(yīng)。KDR引物序列為5'-CTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCA-3'5'-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3'，擴(kuò)增長度為795bp;內(nèi)參照GAPDH引物序列為5,-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3,5'-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3'，擴(kuò)增長度為509bp;PCR擴(kuò)增條件94。C預(yù)變性5min，94°C45s，64°C45s，72°C90s，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸5min。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2。/。的瓊脂糖凝膠電泳上觀察拍照，運(yùn)用天能分析軟件對條帶進(jìn)行光密度掃描，檢測各組KDRmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物與其對應(yīng)的內(nèi)參GAPDHmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物A值，然后將A,/A^DH的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(四)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用spss軟件進(jìn)行處理，各樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。三結(jié)果(一)化學(xué)修飾的KDRsiRNA在體外對MCF-7細(xì)胞KDR基因表達(dá)的影響1.半定量RT-PCR檢測KDRmRNA的水平RT-PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示與空白對照組比較，50nmol/LKDRsiRNA組、jetSI組均無明顯差異(M05);KDRsiRNA10Onmol/L和200nmol/L兩組數(shù)據(jù)均有顯著差異(尸<0.05)，而這兩組之間比較無差異(尸〉0.05),結(jié)果表明，達(dá)到一定濃度的KDRsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后明顯下調(diào)了KDRmRNA的表達(dá)，如圖l。2.VEGFsiRNA對MCF-7細(xì)胞靶蛋白表達(dá)的影響采用Westernblotting方法檢測了KDRsiRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示，KDR基因表達(dá)顯著下調(diào)了(與空白對照組比較尸〈0.05)。而jetSI組KDR基因表達(dá)無明顯變化(與空白對照組比較尸〉0.05)，各組內(nèi)參照基因表達(dá)無差異。(二)化學(xué)修飾的KDRsiRNA在體外對MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響1.siRNA對MCF-7細(xì)胞增殖的影響顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染VEGFsiRNA48小時(shí)后，MCF-7細(xì)胞克隆明顯減慢，細(xì)胞皺縮，活力下降，如圖3，MTT數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果顯示VEGFsiRNA3個(gè)濃度組抑制率與JetSI組比較有顯著性差異(P〈0.05);jetSI組與空白對照組比較沒有顯著性差異(尸〉0.05)。100nmol/L組和200nmol/L組比較無顯著性差異(尸>0.05)。這表明VEGFsiRNA對細(xì)胞增殖有抑制作用，且在一定范圍內(nèi)抑制率隨著濃度增加而增加，終濃度為100nmol/L時(shí)己達(dá)最佳抑制效果，增加siRNA濃度并不提高沉默作用。各組抑制率數(shù)值見表l:表lMTT比色法檢測MCF-7轉(zhuǎn)染siRNA48h后增殖情況(；is，n=6，％)分組0D值(492nm)抑制率(％)50畫1/Lsi讓0.383±0.021*17.35100nmol/LsiRNA0.232±0.013*50.01200腸1/LsiRNA0.221±0.030*52.21jetSI組0.452±0.0492.41空白對照組0.463±0.054'尸<0.01與jetSI對照組2.轉(zhuǎn)染siRNA后對MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示轉(zhuǎn)染組中G。/G,期細(xì)胞的比率升高，S期細(xì)胞的比率降低;jetSI對照組和空白對照組中，MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期未出現(xiàn)上述變化。如表2和圖4，表明siRNA轉(zhuǎn)染對MCF-7細(xì)胞的增殖具有抑制作用，與MTT比色法檢測的結(jié)果相符。表2轉(zhuǎn)染siRNA后MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期變化分組G。/Gt期S期G2/M期siRNA75.04±0.65*17.82±1.25*7.14±0.60*jetSI對照組58.76±1.2540.18±0.851.06±0.42空白對照組58.37±2.1239.52±1.622.11±1.17>〈0.01與jetSI對照組3.siRNA誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用Hoechst33258染色檢測顯示siRNA組的細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞核染色質(zhì)高度聚集并裂解為碎塊，可見凋亡小體。空白對照組、jetSI對照組的細(xì)胞，均沒有出現(xiàn)上述形態(tài)學(xué)的改變，如圖5。(三)化學(xué)修飾的KDRsiRNA裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)1.監(jiān)測裸鼠皮下移植瘤體積結(jié)果顯示如圖6:與轉(zhuǎn)染試劑組比較，小劑量和大劑量KDRsiRNA處理組移植瘤增長趨勢均受抑(代0.Q5)，大小劑量組相比亦有顯著性差異(代0.05)，轉(zhuǎn)染試劑組與空白對照組相比無差異(AO.05)。圖7結(jié)果顯示在治療前后，KDRsiRNA明顯抑制了腫瘤的生長，而空白對照組在治療后，腫瘤生長未受到抑制。2.治療前后體重，瘤重，抑瘤率①體重治療后，大、小劑量治療組與轉(zhuǎn)染試劑組相比明顯增長，差別有顯著性(代0.05)，大、小劑量治療組相比無顯著性差別(尸>0.05)，轉(zhuǎn)染試劑組與空白對照組相比差別無顯著性(&0.05)。②瘤重大、小劑量治療組低于對照組，差別有顯著性(p<0.01)，大、小劑量治療組相比差別也有顯著性(P〈0.05)。轉(zhuǎn)染試劑組與空白對照組相比差別無顯著性(P〉0.05)。③抑瘤率大、小劑量組相比差別有顯著性(P〈0.05)。結(jié)果見表3:一表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>HE染色腫瘤細(xì)胞呈上皮性，巢狀排列，血管數(shù)目KDRsiRNA治療組(圖8B)顯著低于空白對照組(圖8A)，并且與轉(zhuǎn)染試劑組(圖8C)相比KDRsiRNA治療組可見大片細(xì)胞壞死(圖8D)，可能與新生血管的數(shù)量少，營養(yǎng)供應(yīng)不足有關(guān)。免疫組化染色KDR的陽性物質(zhì)為棕黃色細(xì)顆粒，主要定位于腫瘤間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，可以看到，KDRsiRNA治療組(圖8F)染色陽性血管數(shù)明顯低于轉(zhuǎn)染試劑組(圖8E).另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面也見陽性著色，呈彌漫或局灶分布，表明KDR在腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)。4.半定量RT-PCR分析結(jié)果結(jié)果表明(圖9)，大、小劑量KDRsiRNA治療組明顯下調(diào)了KDRmRNA的表達(dá)(與轉(zhuǎn)染試劑組比較尸<0.05)，大、小劑量治療組相比差別也有顯著性(尸<0.05)，轉(zhuǎn)染試劑組與空白對照組相比差別無顯著性(^>0.05)。序列表〈110〉葛銀林〈120〉一種KDRsiRNA及其應(yīng)用〈160〉2〈210〉1〈211〉21〈212〉讓〈213〉人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA〈400〉1gccaccauguucucuaauauu21〈210〉2<211〉21<212>RNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人工合成的小雙鏈RNA〈400〉2uauuagagaacaugguggcuu2權(quán)利要求1.一種KDRsiRNA，其特征在于，所述KDRsiRNA的核苷酸序列如下正義鏈5′-gccaccauguucucuaauauu-3′反義鏈3′-uucggugguacaagagauuau-5′。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種KDRsiRNA，其特征在于，對所述核苷酸序列進(jìn)行氟代修飾。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種KDRsiRNA，其特征在于，對所述核苷酸序列正義鏈的核苷酸戊糖2'-羥基進(jìn)行氟代修飾。4.權(quán)利要求1至3所述KDRsiRNA在制備抗乳腺癌基因治療藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種可抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)的小分子干擾RNA(siRNA)序列及其化學(xué)修飾物，該化學(xué)修飾物提高了siRNA的穩(wěn)定性，以及KDRsiRNA在哺乳動(dòng)物體內(nèi)抵抗核酸酶水解的能力，又保證了其抗腫瘤作用的特異性。本發(fā)明還公開了KDRsiRNA在制備抗乳腺癌基因治療藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/11GK101215563SQ200810069209公開日2008年7月9日申請日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日發(fā)明者琳侯,曉張,張金玉,葛銀林,薛美蘭申請人:葛銀林