專利名稱:一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù):
釀酒酵母(5^c/^ramyc" cewv&^)雖然能利用木酮糖,但因?yàn)獒劸平?母中缺少木糖還原酶,因此不具備木糖代謝能力,不能有效發(fā)酵植物纖維水解 液。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決釀酒酵母中缺少木糖還原酶,不具備木糖代謝能 力,不能有效發(fā)酵植物纖維水解液的問(wèn)題,而提供的一種表達(dá)木糖還原酶基因 的質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行 一、克隆休哈塔 假絲酵母菌的^T丄1基因;二、克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列;三、 克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因;四、回收、純化步驟一至三制備的基因 片段,然后在分別與pGEMT Easy載體在16。C的條件下連接10~12h,得到 pGMT-JOTl、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、構(gòu)建質(zhì)粒pADH,以釀酒酵 母整合質(zhì)粒p406ADHl為骨架引入ADHt基因;六、構(gòu)建質(zhì)粒pAK,將KanR 基因引入質(zhì)粒pADH中;七、將Z7丄l基因引入質(zhì)粒pAK,即得到表達(dá)木糖還 原酶基因的質(zhì)粒;其中步驟一中擴(kuò)增上游引物序列為 5'-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3,, 下游引物序列為 5'-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3';步驟二中擴(kuò)增上游引物序列 為5,- CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3,,下游引物序列為5,-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3,; 步驟三中擴(kuò)增上游引物序列 為5'-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3,, 下游引物序列為5,-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3 ,。
由于不同木糖還原酶(XR)輔酶的偏好性不同,致使木糖按不同的途徑
代謝,導(dǎo)致不同代謝產(chǎn)物的積累。本發(fā)明方法將木糖還原酶基因zm和乙醇脫氫酶(ADH)的強(qiáng)啟動(dòng)子的終止子序列(ADHt)構(gòu)建于同一個(gè)質(zhì)粒載體上, 在增添了木糖代謝為乙醇的途徑外,還抑制了木糖代謝為木糖醇,能夠介導(dǎo)釀 酒酵母高效代謝木糖生產(chǎn)乙醇。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以 下步驟進(jìn)行 一、克隆休哈塔假絲酵母菌的基因;二、克隆質(zhì)粒pKT0150 中的ADHt基因序列;三、克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因;四、回收、純 化步驟一至三制備的基因片段,然后在分別與pGEMT Easy載體在16。C的條 件下連接10 12h,得到pGMT-^T丄l、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、構(gòu)建 質(zhì)粒pADH,以釀酒酵母整合質(zhì)粒p406ADHl為骨架引入ADHt基因;六、 構(gòu)建質(zhì)粒pAK,將KanR基因引入質(zhì)粒pADH中;七、將^T丄1基因引入質(zhì)粒 pAK,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒;其中步驟一中擴(kuò)增上游引物序列為 5,-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC誦3,, 下游引物序列為 5,曙TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3,;步驟二中擴(kuò)增上游弓|物序列 為5 ,-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3 ,,下游引物序列為5,-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3,; 步驟三中擴(kuò)增上游引物序列 為5,陽(yáng)TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3,, 下游引物序列為5,-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3 ,。
本實(shí)施方式步驟四用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的DNA膠回收試劑 盒(Gel Extraction Mini Kit)進(jìn)行回收。步驟四連接操作參見試劑盒使用操作手 冊(cè)。
本實(shí)施方式步驟四中的連接產(chǎn)物pGMT-Xm 、 pGMT-ADHt和 pGMT-KanR轉(zhuǎn)化五.co// DH5a進(jìn)行保存擴(kuò)增。
本實(shí)施方式步驟一上游引物中加入Xba I的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分), 步驟一下游引物中加入BamH I的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分);步驟二上游引 物中加入Xho I的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分),步驟二下游引物中加入Kpn I 的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分);步驟三上游引物中加入Aat II的識(shí)別位點(diǎn)(加 下劃線部分),步驟三下游引物中加入AatII的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分)。步 驟一至三PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物放于4。C條件下保存。本實(shí)施方式質(zhì)粒pKT0150購(gòu)自于Addgene公司,休哈塔假絲酵母菌基因 組DNA利用天凈沙公司的真菌基因組DNA提取試劑盒得到。本實(shí)施方式中 使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得,若無(wú)特殊要求則濃 度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。
本實(shí)施方式步驟四至七各步驟得到的質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證后可轉(zhuǎn)化入 DH5a中保存和擴(kuò)增。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中 PCR反應(yīng)體系為10pL,由1mL IOxPCR buffer、 0.8|iL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 lnL濃度為lpmol L的上游引物、lpL濃度為lpmol/^L的下游引物、 0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2^iL休哈塔假絲酵母菌基因組DNA、 0.2pL 濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min,變性94。C lmin,退火50°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸 72"C10min。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中 PCR反應(yīng)體系為IO(jL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8|iL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 lnL濃度為lpmol/pL的上游引物、lpL濃度為lpmol/pL的下游引物、 0.8^L濃度為25mmol/L的MgCl2、 2^iL質(zhì)粒pKT0150、 0.2pL濃度為5U/mL 的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 2min,變性 94°C 45s,退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30個(gè)循環(huán),延伸72°C 7min。其 它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中 PCR反應(yīng)體系為lOpL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8pL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 1^iL濃度為lpmol4iL的上游引物、l^iL濃度為lpmol/pL的下游引物、 0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2jxL濃度為5U/mL 的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 2min,變性 94°C lmin,退火45。C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸72°C 7min。 其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。本實(shí)施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg2+。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟五中用 限制性內(nèi)切酶XhoI和KpnI對(duì)質(zhì)粒p406ADHl和pGMT-ADHt分別進(jìn)行雙酶 切,然后用T4DNA連接酶(T4 DNA Ligase)進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pADH。
其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式步驟五中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 p406ADHl或pGMT-ADHt)、 2[iL10xbuffer 、 lpL Xho I、 ljxL Kpn I和余量的 無(wú)菌去離子水組成。
本實(shí)施方式步驟五中連接反應(yīng)體系為10pL,由2nL p406ADHl雙酶切產(chǎn) 物、2pL pGMT-ADHt雙酶切產(chǎn)物、5(iL無(wú)菌去離子水和l|iL T4 DNA Ligase 組成;連接反應(yīng)條件在16T:的條件下連接10 12h。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟六中用 限制性內(nèi)切酶Aat II對(duì)質(zhì)粒pGMT-KanR和pADH分別進(jìn)行單酶切,然后用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pAK。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式步驟六中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pGMT-KanR或pADH)、 2pL10xbuffer 、 lpL Aat II和余量的無(wú)菌去離子水組 成。
本實(shí)施方式步驟六中連接反應(yīng)體系為10pL,由2pL pGMT-KanR雙酶切產(chǎn) 物、2pLpADH雙酶切產(chǎn)物、5pL無(wú)菌去離子水和lpLT4DNA Ligase組成; 連接反應(yīng)條件在16"C的條件下連接10 12h。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟七中用 限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I對(duì)質(zhì)粒pAK和pGMT-XKLl分別進(jìn)行雙酶切, 然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒。其它步 驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式步驟七中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5jiL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pAK或pGMT-JOXl)、 2pL10xbuffer 、 lpLXbal、 lpLBamHI和余量的無(wú)菌 去離子水組成。
本實(shí)施方式步驟七中連接反應(yīng)體系為10pL,由2pLpGMT-Zm雙酶切產(chǎn) 物、2pLpAK雙酶切產(chǎn)物、5^iL無(wú)菌去離子水和lpLT4DNALigase組成;連接反應(yīng)條件在16'C的條件下連接10 12h。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中 PCR反應(yīng)體系為lOpL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8(iL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 1^iL濃度為lpmol/nL的上游引物、1^iL濃度為lpmol/^iL的下游引物、 0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2^iL休哈塔假絲酵母菌基因組DNA、 0.2pL 濃度為5U/tnL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min,變性94。C lmin,退火50°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸 72。C10min;步驟二中PCR反應(yīng)體系為10pL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8jiL 濃度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol/^L的上游引物、lpL濃度為 lpmol4iL的下游引物、0.8nL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2^L濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94。C 2min,變性94°C 45s,退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30個(gè)循環(huán), 延伸72°C 7min;步驟三中PCR反應(yīng)體系為10^iL,由l^iL 10xPCRbuffer、0.8pL 濃度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol/^iL的上游引物、1jiL濃度為 lpmol/|xL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94。C 2min,變性94°C lmin,退火45。C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循 環(huán),延伸72°C 7min;步驟五中用限制性內(nèi)切酶Xho I禾D Kpn I對(duì)質(zhì)粒 p406ADHl和pGMT-ADHt分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶(T4 DNA Ligase)進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pADH;步驟六中用限制性內(nèi)切酶Aat II對(duì)質(zhì)粒 pGMT-KanR和pADH分別進(jìn)行單酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,得 到質(zhì)粒pAK;步驟七中用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I對(duì)質(zhì)粒pAK和 pGMT-JOXl分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,即得到表達(dá) 木糖還原酶基因的質(zhì)粒。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式中用到的10xPCR buffer中不含有Mg2+。
本實(shí)施方式步驟五中雙酶切反應(yīng)體系為20nL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 p406ADHl或pGMT-ADHt)、 2pL10xbuffer 、 ljiLXhoI、 lpLKpnl和余量的 無(wú)菌去離子水組成。本實(shí)施方式步驟五中連接反應(yīng)體系為lOpL,由2|iL p406ADHl雙酶切產(chǎn)物、2pL pGMT-ADHt雙酶切產(chǎn)物、5pL無(wú)菌去離子水和1uLT4DNALigase組成;連接反應(yīng)條件在16。C的條件下連接10~12h。
本實(shí)施方式步驟六中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5nL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pGMT-KanR或pADH)、 2nL10xbuffer 、 lpL Aat II和余量的無(wú)菌去離子水組 成。本實(shí)施方式步驟六中連接反應(yīng)體系為10|iL,由2pL pGMT-KanR雙酶切產(chǎn) 物、2pLpADH雙酶切產(chǎn)物、5pL無(wú)菌去離子水和lpLT4DNALigase組成; 連接反應(yīng)條件在16"C的條件下連接10 12h。
本實(shí)施方式步驟七中雙酶切反應(yīng)體系為20nL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pAK或pGMT-JOXl)、 2|iL10xbuffer 、 lpLXbal、 lpL BamH I和余量的無(wú)菌 去離子水組成。本實(shí)施方式步驟七中連接反應(yīng)體系為10pL,由2^LpGMT-JT7丄l 雙酶切產(chǎn)物、2pLpAK雙酶切產(chǎn)物、5jxL無(wú)菌去離子水和1^LT4DNALigase 組成;連接反應(yīng)條件在16"C的條件下連接10 12h。
本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得, 若無(wú)特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。
受體菌活化將釀酒酵母菌株在酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)及上進(jìn)行活 化,三區(qū)劃線將單菌落接種于lOmLYEPD液體培養(yǎng)基,在3(TC、 180r/min的 條件下?lián)u床培養(yǎng)10 12h。測(cè)定菌液的OD值,使其稀釋至50mL時(shí)OD^達(dá)到 0.4,再繼續(xù)培養(yǎng)2 4h。
采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 入釀酒酵母,結(jié)果顯示60世代(每24h為10世代)后的穩(wěn)定性為99%。[質(zhì) 粒穩(wěn)定性計(jì)算公式穩(wěn)定性(%)=(帶有整合質(zhì)粒的菌落數(shù)+總菌數(shù))><100%
制備粗酶液將大腸桿菌及本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒 培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)期(約培養(yǎng)llh),多次離心洗滌后用緩沖溶液重懸菌體,并 計(jì)算菌懸液的菌體濃度(cells/mL),記為NO;再超聲波間歇式處理,功率為 300W,①2變幅桿,變幅桿的末端插入液面下約15mm處,超聲波處理5s、 間歇10s,超聲波全程處理20min,計(jì)算菌懸液的菌體濃度(cells/mL),記為 Nl,再用公式(1-N1) / NOX100。/。計(jì)算破壁率,當(dāng)破壁率<90%,繼續(xù)超聲 波破壁處理。再采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色測(cè)定本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還 原酶基因的質(zhì)粒所制備的粗酶液中不含其它蛋白,木糖還原酶的濃度為 10nL/mL。木糖還原酶酶活測(cè)定
以lmL反應(yīng)液在340nm下檢測(cè)NADPH被氧化的量(即在340nm做時(shí)間掃 描)。酶的比活力定義為每mg酶蛋白,每分鐘轉(zhuǎn)化NADPH的pmol/L數(shù)即U/mg 蛋白。反應(yīng)體系lOOOpL,由300|_iL濃度為5mmol/L的木糖、50pL濃度為 2.5mol/L的還原型輔酶II(NADPH)、 150pL粗酶液和500^iL濃度為0.5 mol/L、 pH值為7.4的磷酸鉀緩沖液組成。
酶活測(cè)定結(jié)果顯示,本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化 的重組釀酒酵母的木糖還原酶酶活力大幅提高,釀酒酵母出發(fā)菌株不具備木糖 還原酶,而重組釀酒酵母的酶活力為0.2U/mg,說(shuō)明本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木 糖還原酶基因的質(zhì)粒可實(shí)現(xiàn)木糖還原酶基因的高效穩(wěn)定表達(dá)。序列表
〈110>黑龍江大學(xué)
〈120> —種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法
<歸6
〈210> 1 〈211〉 27 <212>腿 <213>人工序列
〈220〉
〈223〉根據(jù)休哈塔假絲酵母菌的^IZ1基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增上游引物。 <400> 1
acttctagat acatccacaa tgagccc 27
<210> 2 〈211〉 27 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223>根據(jù)休哈塔假絲酵母菌的JOTl基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增下游引物。 〈400〉 2
ttcggatcct ctacgcaaag aaagcag 27
〈210> 3 〈211> 27 〈212〉 ■ <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增上游引物。 〈400〉 3
cgcctcgagt ttgttactgc tgctggt 27
<210> 4 〈211〉 27 〈212>腿 <213>人工序列<220>
<223>根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增下游引物。 〈400> 4
cttggtaccc aagactgtca aggaggg 27
〈210> 5 <211〉 26 <212〉腿 〈213>人工序列
<220〉
〈223〉根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增上游引物。 <400> 5
ttcgacgtct ctgtttagct tgcctc 26
<210> 6 <211〉 27 <212〉腿 〈213>人工序列
〈220〉
<223〉根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增下游引物。 <400> 6
gcggacgtct atcatcgatg aattcga 2權(quán)利要求
1、一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,其特征在于表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、克隆休哈塔假絲酵母菌的XYL1基因;二、克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列;三、克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因;四、回收、純化步驟一至三制備的基因片段,然后在分別與pGEMT Easy載體在16℃的條件下連接10~12h,得到pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、構(gòu)建質(zhì)粒pADH,以釀酒酵母整合質(zhì)粒p406ADH1為骨架引入ADHt基因;六、構(gòu)建質(zhì)粒pAK,將KanR基因引入質(zhì)粒pADH中;七、將XYL1基因引入質(zhì)粒pAK,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒;其中步驟一中擴(kuò)增上游引物序列為5’-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3’,下游引物序列為5’-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3’;步驟二中擴(kuò)增上游引物序列為5’-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’,下游引物序列為5’-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’;步驟三中擴(kuò)增上游引物序列為5’-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’,下游引物序列為5’-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟一中PCR反應(yīng)體系為10nL,由lpL10xPCRbuffer、 0.8pL濃 度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol&L的上游引物、lpL濃度為 lpmol/|iL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2|iL休哈塔假絲酵 母菌基因組DNA、 0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min,變性94°C lmin,退火50°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸72。C 10min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)體系為lO)iL,由lpL 10xPCRbuffer、 0.8|iL濃 度為2.5mmol/L的dNTP、 1&濃度為lpmol/^L的上游引物、1jiL濃度為 lpmol4iL的下游引物、0.8nL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94°C 2min,變性94°C 45s,退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30個(gè)循環(huán),延伸72""C 7min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟三中PCR反應(yīng)體系為lOpL,由ljxL10xPCRbuffer、 0.8pL濃 度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol/nL的上游引物、lpL濃度為 lpmol/piL的下游引物、0.8|iL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2nL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94。C 2min,變性94°C lmin,退火45°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循 環(huán),延伸72。C 7min。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟四中的連接產(chǎn)物pGMT-Z7丄l 、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR轉(zhuǎn) 化DH5a進(jìn)行保存擴(kuò)增。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟五中用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I對(duì)質(zhì)粒p406ADHl和 pGMT-ADHt分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒 pADH。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟六中用限制性內(nèi)切酶Aat II對(duì)質(zhì)粒pGMT-KanR和pADH分別 進(jìn)行單酶切,然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pAK。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟七中用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I對(duì)質(zhì)粒pAK和 pGMT-JOXl分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,即得到表達(dá) 木糖還原酶基因的質(zhì)粒。
全文摘要
一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,它涉及一種質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。它解決了釀酒酵母中缺少木糖還原酶,不具備木糖代謝能力,不能有效發(fā)酵植物纖維水解液的問(wèn)題。構(gòu)建方法先克隆XYL1基因、ADHt基因序列和KanR基因;再回收、純化步驟一至三制備的基因片段,分別與載體連接;然后構(gòu)建質(zhì)粒pADH、質(zhì)粒pAK;再將XYL1基因引入質(zhì)粒pAK,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒。本發(fā)明方法將木糖還原酶基因XYL1和乙醇脫氫酶的強(qiáng)啟動(dòng)子的終止子序列構(gòu)建于同一個(gè)質(zhì)粒載體上,在增添了木糖代謝為乙醇的途徑外,還抑制了木糖代謝為木糖醇,能夠介導(dǎo)釀酒酵母高效代謝木糖生產(chǎn)乙醇。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101302533SQ200810064829
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者新 于, 凌宏志, 剛 宋, 平文祥, 杜春梅, 葛菁萍, 丹 趙, 高冬妮 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)