两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法

文檔序號(hào):597346閱讀:356來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)
釀酒酵母(5^c/^ramyc" cewv&^)雖然能利用木酮糖,但因?yàn)獒劸平?母中缺少木糖還原酶,因此不具備木糖代謝能力,不能有效發(fā)酵植物纖維水解 液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決釀酒酵母中缺少木糖還原酶,不具備木糖代謝能 力,不能有效發(fā)酵植物纖維水解液的問(wèn)題,而提供的一種表達(dá)木糖還原酶基因 的質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行 一、克隆休哈塔 假絲酵母菌的^T丄1基因;二、克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列;三、 克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因;四、回收、純化步驟一至三制備的基因 片段,然后在分別與pGEMT Easy載體在16。C的條件下連接10~12h,得到 pGMT-JOTl、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、構(gòu)建質(zhì)粒pADH,以釀酒酵 母整合質(zhì)粒p406ADHl為骨架引入ADHt基因;六、構(gòu)建質(zhì)粒pAK,將KanR 基因引入質(zhì)粒pADH中;七、將Z7丄l基因引入質(zhì)粒pAK,即得到表達(dá)木糖還 原酶基因的質(zhì)粒;其中步驟一中擴(kuò)增上游引物序列為 5'-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3,, 下游引物序列為 5'-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3';步驟二中擴(kuò)增上游引物序列 為5,- CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3,,下游引物序列為5,-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3,; 步驟三中擴(kuò)增上游引物序列 為5'-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3,, 下游引物序列為5,-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3 ,。
由于不同木糖還原酶(XR)輔酶的偏好性不同,致使木糖按不同的途徑
代謝,導(dǎo)致不同代謝產(chǎn)物的積累。本發(fā)明方法將木糖還原酶基因zm和乙醇脫氫酶(ADH)的強(qiáng)啟動(dòng)子的終止子序列(ADHt)構(gòu)建于同一個(gè)質(zhì)粒載體上, 在增添了木糖代謝為乙醇的途徑外,還抑制了木糖代謝為木糖醇,能夠介導(dǎo)釀 酒酵母高效代謝木糖生產(chǎn)乙醇。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以 下步驟進(jìn)行 一、克隆休哈塔假絲酵母菌的基因;二、克隆質(zhì)粒pKT0150 中的ADHt基因序列;三、克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因;四、回收、純 化步驟一至三制備的基因片段,然后在分別與pGEMT Easy載體在16。C的條 件下連接10 12h,得到pGMT-^T丄l、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、構(gòu)建 質(zhì)粒pADH,以釀酒酵母整合質(zhì)粒p406ADHl為骨架引入ADHt基因;六、 構(gòu)建質(zhì)粒pAK,將KanR基因引入質(zhì)粒pADH中;七、將^T丄1基因引入質(zhì)粒 pAK,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒;其中步驟一中擴(kuò)增上游引物序列為 5,-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC誦3,, 下游引物序列為 5,曙TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3,;步驟二中擴(kuò)增上游弓|物序列 為5 ,-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3 ,,下游引物序列為5,-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3,; 步驟三中擴(kuò)增上游引物序列 為5,陽(yáng)TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3,, 下游引物序列為5,-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3 ,。
本實(shí)施方式步驟四用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的DNA膠回收試劑 盒(Gel Extraction Mini Kit)進(jìn)行回收。步驟四連接操作參見試劑盒使用操作手 冊(cè)。
本實(shí)施方式步驟四中的連接產(chǎn)物pGMT-Xm 、 pGMT-ADHt和 pGMT-KanR轉(zhuǎn)化五.co// DH5a進(jìn)行保存擴(kuò)增。
本實(shí)施方式步驟一上游引物中加入Xba I的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分), 步驟一下游引物中加入BamH I的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分);步驟二上游引 物中加入Xho I的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分),步驟二下游引物中加入Kpn I 的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分);步驟三上游引物中加入Aat II的識(shí)別位點(diǎn)(加 下劃線部分),步驟三下游引物中加入AatII的識(shí)別位點(diǎn)(加下劃線部分)。步 驟一至三PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物放于4。C條件下保存。本實(shí)施方式質(zhì)粒pKT0150購(gòu)自于Addgene公司,休哈塔假絲酵母菌基因 組DNA利用天凈沙公司的真菌基因組DNA提取試劑盒得到。本實(shí)施方式中 使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得,若無(wú)特殊要求則濃 度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。
本實(shí)施方式步驟四至七各步驟得到的質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證后可轉(zhuǎn)化入 DH5a中保存和擴(kuò)增。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中 PCR反應(yīng)體系為10pL,由1mL IOxPCR buffer、 0.8|iL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 lnL濃度為lpmol L的上游引物、lpL濃度為lpmol/^L的下游引物、 0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2^iL休哈塔假絲酵母菌基因組DNA、 0.2pL 濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min,變性94。C lmin,退火50°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸 72"C10min。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中 PCR反應(yīng)體系為IO(jL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8|iL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 lnL濃度為lpmol/pL的上游引物、lpL濃度為lpmol/pL的下游引物、 0.8^L濃度為25mmol/L的MgCl2、 2^iL質(zhì)粒pKT0150、 0.2pL濃度為5U/mL 的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 2min,變性 94°C 45s,退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30個(gè)循環(huán),延伸72°C 7min。其 它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg"。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中 PCR反應(yīng)體系為lOpL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8pL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 1^iL濃度為lpmol4iL的上游引物、l^iL濃度為lpmol/pL的下游引物、 0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2jxL濃度為5U/mL 的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 2min,變性 94°C lmin,退火45。C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸72°C 7min。 其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。本實(shí)施方式中用到的10xPCRbuffer中不含有Mg2+。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟五中用 限制性內(nèi)切酶XhoI和KpnI對(duì)質(zhì)粒p406ADHl和pGMT-ADHt分別進(jìn)行雙酶 切,然后用T4DNA連接酶(T4 DNA Ligase)進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pADH。
其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式步驟五中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 p406ADHl或pGMT-ADHt)、 2[iL10xbuffer 、 lpL Xho I、 ljxL Kpn I和余量的 無(wú)菌去離子水組成。
本實(shí)施方式步驟五中連接反應(yīng)體系為10pL,由2nL p406ADHl雙酶切產(chǎn) 物、2pL pGMT-ADHt雙酶切產(chǎn)物、5(iL無(wú)菌去離子水和l|iL T4 DNA Ligase 組成;連接反應(yīng)條件在16T:的條件下連接10 12h。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟六中用 限制性內(nèi)切酶Aat II對(duì)質(zhì)粒pGMT-KanR和pADH分別進(jìn)行單酶切,然后用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pAK。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式步驟六中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pGMT-KanR或pADH)、 2pL10xbuffer 、 lpL Aat II和余量的無(wú)菌去離子水組 成。
本實(shí)施方式步驟六中連接反應(yīng)體系為10pL,由2pL pGMT-KanR雙酶切產(chǎn) 物、2pLpADH雙酶切產(chǎn)物、5pL無(wú)菌去離子水和lpLT4DNA Ligase組成; 連接反應(yīng)條件在16"C的條件下連接10 12h。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟七中用 限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I對(duì)質(zhì)粒pAK和pGMT-XKLl分別進(jìn)行雙酶切, 然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒。其它步 驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式步驟七中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5jiL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pAK或pGMT-JOXl)、 2pL10xbuffer 、 lpLXbal、 lpLBamHI和余量的無(wú)菌 去離子水組成。
本實(shí)施方式步驟七中連接反應(yīng)體系為10pL,由2pLpGMT-Zm雙酶切產(chǎn) 物、2pLpAK雙酶切產(chǎn)物、5^iL無(wú)菌去離子水和lpLT4DNALigase組成;連接反應(yīng)條件在16'C的條件下連接10 12h。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中 PCR反應(yīng)體系為lOpL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8(iL濃度為2.5mmol/L的 dNTP、 1^iL濃度為lpmol/nL的上游引物、1^iL濃度為lpmol/^iL的下游引物、 0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2^iL休哈塔假絲酵母菌基因組DNA、 0.2pL 濃度為5U/tnL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min,變性94。C lmin,退火50°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸 72。C10min;步驟二中PCR反應(yīng)體系為10pL,由lpL 10xPCR buffer、 0.8jiL 濃度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol/^L的上游引物、lpL濃度為 lpmol4iL的下游引物、0.8nL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2^L濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94。C 2min,變性94°C 45s,退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30個(gè)循環(huán), 延伸72°C 7min;步驟三中PCR反應(yīng)體系為10^iL,由l^iL 10xPCRbuffer、0.8pL 濃度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol/^iL的上游引物、1jiL濃度為 lpmol/|xL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94。C 2min,變性94°C lmin,退火45。C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循 環(huán),延伸72°C 7min;步驟五中用限制性內(nèi)切酶Xho I禾D Kpn I對(duì)質(zhì)粒 p406ADHl和pGMT-ADHt分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶(T4 DNA Ligase)進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pADH;步驟六中用限制性內(nèi)切酶Aat II對(duì)質(zhì)粒 pGMT-KanR和pADH分別進(jìn)行單酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,得 到質(zhì)粒pAK;步驟七中用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I對(duì)質(zhì)粒pAK和 pGMT-JOXl分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,即得到表達(dá) 木糖還原酶基因的質(zhì)粒。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
本實(shí)施方式中用到的10xPCR buffer中不含有Mg2+。
本實(shí)施方式步驟五中雙酶切反應(yīng)體系為20nL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 p406ADHl或pGMT-ADHt)、 2pL10xbuffer 、 ljiLXhoI、 lpLKpnl和余量的 無(wú)菌去離子水組成。本實(shí)施方式步驟五中連接反應(yīng)體系為lOpL,由2|iL p406ADHl雙酶切產(chǎn)物、2pL pGMT-ADHt雙酶切產(chǎn)物、5pL無(wú)菌去離子水和1uLT4DNALigase組成;連接反應(yīng)條件在16。C的條件下連接10~12h。
本實(shí)施方式步驟六中雙酶切反應(yīng)體系為20pL,由5nL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pGMT-KanR或pADH)、 2nL10xbuffer 、 lpL Aat II和余量的無(wú)菌去離子水組 成。本實(shí)施方式步驟六中連接反應(yīng)體系為10|iL,由2pL pGMT-KanR雙酶切產(chǎn) 物、2pLpADH雙酶切產(chǎn)物、5pL無(wú)菌去離子水和lpLT4DNALigase組成; 連接反應(yīng)條件在16"C的條件下連接10 12h。
本實(shí)施方式步驟七中雙酶切反應(yīng)體系為20nL,由5pL被酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒 pAK或pGMT-JOXl)、 2|iL10xbuffer 、 lpLXbal、 lpL BamH I和余量的無(wú)菌 去離子水組成。本實(shí)施方式步驟七中連接反應(yīng)體系為10pL,由2^LpGMT-JT7丄l 雙酶切產(chǎn)物、2pLpAK雙酶切產(chǎn)物、5jxL無(wú)菌去離子水和1^LT4DNALigase 組成;連接反應(yīng)條件在16"C的條件下連接10 12h。
本實(shí)施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購(gòu)得, 若無(wú)特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。
受體菌活化將釀酒酵母菌株在酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)及上進(jìn)行活 化,三區(qū)劃線將單菌落接種于lOmLYEPD液體培養(yǎng)基,在3(TC、 180r/min的 條件下?lián)u床培養(yǎng)10 12h。測(cè)定菌液的OD值,使其稀釋至50mL時(shí)OD^達(dá)到 0.4,再繼續(xù)培養(yǎng)2 4h。
采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 入釀酒酵母,結(jié)果顯示60世代(每24h為10世代)后的穩(wěn)定性為99%。[質(zhì) 粒穩(wěn)定性計(jì)算公式穩(wěn)定性(%)=(帶有整合質(zhì)粒的菌落數(shù)+總菌數(shù))><100%
制備粗酶液將大腸桿菌及本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒 培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)期(約培養(yǎng)llh),多次離心洗滌后用緩沖溶液重懸菌體,并 計(jì)算菌懸液的菌體濃度(cells/mL),記為NO;再超聲波間歇式處理,功率為 300W,①2變幅桿,變幅桿的末端插入液面下約15mm處,超聲波處理5s、 間歇10s,超聲波全程處理20min,計(jì)算菌懸液的菌體濃度(cells/mL),記為 Nl,再用公式(1-N1) / NOX100。/。計(jì)算破壁率,當(dāng)破壁率<90%,繼續(xù)超聲 波破壁處理。再采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色測(cè)定本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還 原酶基因的質(zhì)粒所制備的粗酶液中不含其它蛋白,木糖還原酶的濃度為 10nL/mL。木糖還原酶酶活測(cè)定
以lmL反應(yīng)液在340nm下檢測(cè)NADPH被氧化的量(即在340nm做時(shí)間掃 描)。酶的比活力定義為每mg酶蛋白,每分鐘轉(zhuǎn)化NADPH的pmol/L數(shù)即U/mg 蛋白。反應(yīng)體系lOOOpL,由300|_iL濃度為5mmol/L的木糖、50pL濃度為 2.5mol/L的還原型輔酶II(NADPH)、 150pL粗酶液和500^iL濃度為0.5 mol/L、 pH值為7.4的磷酸鉀緩沖液組成。
酶活測(cè)定結(jié)果顯示,本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化 的重組釀酒酵母的木糖還原酶酶活力大幅提高,釀酒酵母出發(fā)菌株不具備木糖 還原酶,而重組釀酒酵母的酶活力為0.2U/mg,說(shuō)明本實(shí)施方式構(gòu)建的表達(dá)木 糖還原酶基因的質(zhì)粒可實(shí)現(xiàn)木糖還原酶基因的高效穩(wěn)定表達(dá)。序列表
〈110>黑龍江大學(xué)
〈120> —種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法
<歸6
〈210> 1 〈211〉 27 <212>腿 <213>人工序列
〈220〉
〈223〉根據(jù)休哈塔假絲酵母菌的^IZ1基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增上游引物。 <400> 1
acttctagat acatccacaa tgagccc 27
<210> 2 〈211〉 27 〈212> DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223>根據(jù)休哈塔假絲酵母菌的JOTl基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增下游引物。 〈400〉 2
ttcggatcct ctacgcaaag aaagcag 27
〈210> 3 〈211> 27 〈212〉 ■ <213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增上游引物。 〈400〉 3
cgcctcgagt ttgttactgc tgctggt 27
<210> 4 〈211〉 27 〈212>腿 <213>人工序列<220>
<223>根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增下游引物。 〈400> 4
cttggtaccc aagactgtca aggaggg 27
〈210> 5 <211〉 26 <212〉腿 〈213>人工序列
<220〉
〈223〉根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增上游引物。 <400> 5
ttcgacgtct ctgtttagct tgcctc 26
<210> 6 <211〉 27 <212〉腿 〈213>人工序列
〈220〉
<223〉根據(jù)質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增下游引物。 <400> 6
gcggacgtct atcatcgatg aattcga 2權(quán)利要求
1、一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,其特征在于表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行一、克隆休哈塔假絲酵母菌的XYL1基因;二、克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列;三、克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因;四、回收、純化步驟一至三制備的基因片段,然后在分別與pGEMT Easy載體在16℃的條件下連接10~12h,得到pGMT-XYL1、pGMT-ADHt和pGMT-KanR;五、構(gòu)建質(zhì)粒pADH,以釀酒酵母整合質(zhì)粒p406ADH1為骨架引入ADHt基因;六、構(gòu)建質(zhì)粒pAK,將KanR基因引入質(zhì)粒pADH中;七、將XYL1基因引入質(zhì)粒pAK,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒;其中步驟一中擴(kuò)增上游引物序列為5’-ACTTCTAGATACATCCACAATGAGCCC-3’,下游引物序列為5’-TTCGGATCCTCTACGCAAAGAAAGCAG-3’;步驟二中擴(kuò)增上游引物序列為5’-CGCCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’,下游引物序列為5’-CTTGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’;步驟三中擴(kuò)增上游引物序列為5’-TTCGACGTCTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’,下游引物序列為5’-GCGGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟一中PCR反應(yīng)體系為10nL,由lpL10xPCRbuffer、 0.8pL濃 度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol&L的上游引物、lpL濃度為 lpmol/|iL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2|iL休哈塔假絲酵 母菌基因組DNA、 0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min,變性94°C lmin,退火50°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循環(huán),延伸72。C 10min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟二中PCR反應(yīng)體系為lO)iL,由lpL 10xPCRbuffer、 0.8|iL濃 度為2.5mmol/L的dNTP、 1&濃度為lpmol/^L的上游引物、1jiL濃度為 lpmol4iL的下游引物、0.8nL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94°C 2min,變性94°C 45s,退火49°C 30s,延伸72°C 45s,共30個(gè)循環(huán),延伸72""C 7min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟三中PCR反應(yīng)體系為lOpL,由ljxL10xPCRbuffer、 0.8pL濃 度為2.5mmol/L的dNTP、 lpL濃度為lpmol/nL的上游引物、lpL濃度為 lpmol/piL的下游引物、0.8|iL濃度為25mmol/L的MgCl2、 2pL質(zhì)粒pKT0150、 0.2nL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水的組成;PCR反應(yīng)條件預(yù)變 性94。C 2min,變性94°C lmin,退火45°C lmin,延伸72°C 2min,共30個(gè)循 環(huán),延伸72。C 7min。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟四中的連接產(chǎn)物pGMT-Z7丄l 、 pGMT-ADHt和pGMT-KanR轉(zhuǎn) 化DH5a進(jìn)行保存擴(kuò)增。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟五中用限制性內(nèi)切酶Xho I和Kpn I對(duì)質(zhì)粒p406ADHl和 pGMT-ADHt分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒 pADH。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟六中用限制性內(nèi)切酶Aat II對(duì)質(zhì)粒pGMT-KanR和pADH分別 進(jìn)行單酶切,然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接,得到質(zhì)粒pAK。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法, 其特征在于步驟七中用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I對(duì)質(zhì)粒pAK和 pGMT-JOXl分別進(jìn)行雙酶切,然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,即得到表達(dá) 木糖還原酶基因的質(zhì)粒。
全文摘要
一種表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法,它涉及一種質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。它解決了釀酒酵母中缺少木糖還原酶,不具備木糖代謝能力,不能有效發(fā)酵植物纖維水解液的問(wèn)題。構(gòu)建方法先克隆XYL1基因、ADHt基因序列和KanR基因;再回收、純化步驟一至三制備的基因片段,分別與載體連接;然后構(gòu)建質(zhì)粒pADH、質(zhì)粒pAK;再將XYL1基因引入質(zhì)粒pAK,即得到表達(dá)木糖還原酶基因的質(zhì)粒。本發(fā)明方法將木糖還原酶基因XYL1和乙醇脫氫酶的強(qiáng)啟動(dòng)子的終止子序列構(gòu)建于同一個(gè)質(zhì)粒載體上,在增添了木糖代謝為乙醇的途徑外,還抑制了木糖代謝為木糖醇,能夠介導(dǎo)釀酒酵母高效代謝木糖生產(chǎn)乙醇。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101302533SQ200810064829
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者新 于, 凌宏志, 剛 宋, 平文祥, 杜春梅, 葛菁萍, 丹 趙, 高冬妮 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
欧美激情高清一区二区三区| 久久av网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费高清在线观看视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 91av网站免费观看| 国产免费现黄频在线看| av有码第一页| 精品亚洲成国产av| 日本欧美视频一区| 中文字幕制服av| 黄色 视频免费看| 国产成+人综合+亚洲专区| 9191精品国产免费久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 中文字幕最新亚洲高清| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费看十八禁软件| 国产精品久久久人人做人人爽| 9热在线视频观看99| 日韩大片免费观看网站| 三级毛片av免费| 国产成人免费观看mmmm| 成人三级做爰电影| 亚洲精品乱久久久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久这里只有精品19| 中文字幕高清在线视频| 久久久久视频综合| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中文字幕高清在线视频| 黄片播放在线免费| 久久久久精品国产欧美久久久 | 欧美精品av麻豆av| 伦理电影免费视频| 久久久久精品国产欧美久久久 | 中国国产av一级| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美黄色淫秽网站| 性少妇av在线| 久久久国产一区二区| 麻豆国产av国片精品| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产色视频综合| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久久久国内视频| 久久香蕉激情| 一区在线观看完整版| 美女主播在线视频| 十分钟在线观看高清视频www| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品免费大片| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| av天堂久久9| 窝窝影院91人妻| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲中文日韩欧美视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 97人妻天天添夜夜摸| 久久人人爽人人片av| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩亚洲高清精品| 老熟女久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 两个人免费观看高清视频| 日本黄色日本黄色录像| 免费高清在线观看日韩| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产黄色免费在线视频| 69精品国产乱码久久久| 精品国产乱码久久久久久小说| 操出白浆在线播放| 国产区一区二久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品熟女久久久久浪| 麻豆乱淫一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美午夜高清在线| 国产成人精品在线电影| 中文字幕人妻丝袜制服| 啪啪无遮挡十八禁网站| 黄片大片在线免费观看| 国产精品成人在线| 精品久久久久久电影网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av国产精品久久久久影院| 国产1区2区3区精品| 欧美人与性动交α欧美软件| 在线观看www视频免费| 成年av动漫网址| 一区福利在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 免费观看av网站的网址| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 热99re8久久精品国产| 国产区一区二久久| 青春草亚洲视频在线观看| 美女福利国产在线| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 好男人电影高清在线观看| 日本五十路高清| av欧美777| videosex国产| 国产成人精品无人区| 美女主播在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一级毛片女人18水好多| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 纯流量卡能插随身wifi吗| av在线app专区| 他把我摸到了高潮在线观看 | a级片在线免费高清观看视频| 国产精品二区激情视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日韩大码丰满熟妇| 极品人妻少妇av视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产片内射在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲情色 制服丝袜| 99国产精品一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久精品免费免费高清| 久久久久精品人妻al黑| 91av网站免费观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 一本色道久久久久久精品综合| 男人舔女人的私密视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 妹子高潮喷水视频| 久久狼人影院| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产色视频综合| 国产精品免费大片| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品一二三区在线看| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 91老司机精品| 老司机影院成人| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品国产av在线观看| 91av网站免费观看| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美国产精品一级二级三级| 午夜日韩欧美国产| 动漫黄色视频在线观看| 国产在线观看jvid| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产av又大| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜91福利影院| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产xxxxx性猛交| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 一级片免费观看大全| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 老司机福利观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品1区2区在线观看. | 免费高清在线观看日韩| 交换朋友夫妻互换小说| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久精品94久久精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久人人97超碰香蕉20202| 后天国语完整版免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| www.精华液| 精品久久久精品久久久| 国产日韩欧美视频二区| videos熟女内射| 成人亚洲精品一区在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久国产精品影院| 精品国产一区二区三区四区第35| 在线永久观看黄色视频| 国产亚洲精品久久久久5区| av福利片在线| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 我要看黄色一级片免费的| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲,欧美精品.| av超薄肉色丝袜交足视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线观看免费视频网站a站| 99国产综合亚洲精品| 日本一区二区免费在线视频| 人妻久久中文字幕网| 又黄又粗又硬又大视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 十八禁网站网址无遮挡| 99精品久久久久人妻精品| 久久久久久久久免费视频了| 一区二区三区激情视频| 搡老岳熟女国产| 久久久国产精品麻豆| 99香蕉大伊视频| 久久ye,这里只有精品| 老司机影院成人| 丁香六月天网| 午夜免费观看性视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 一进一出抽搐动态| 正在播放国产对白刺激| av电影中文网址| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 国产成人免费无遮挡视频| 久久国产精品影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产精品影院久久| www.av在线官网国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品亚洲成国产av| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久ye,这里只有精品| a 毛片基地| 日韩视频在线欧美| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲欧美一区二区三区久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产在线视频一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 在线观看免费高清a一片| www.自偷自拍.com| 人妻一区二区av| 午夜福利免费观看在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲av片天天在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 香蕉丝袜av| 国产区一区二久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| av欧美777| 午夜福利在线观看吧| 一级片'在线观看视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 丝袜喷水一区| 狠狠狠狠99中文字幕| 男女国产视频网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 操美女的视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产成人免费观看mmmm| 美国免费a级毛片| 久久人人爽人人片av| 男女床上黄色一级片免费看| tocl精华| 国产av国产精品国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 一级片'在线观看视频| 久久人人爽人人片av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产日韩欧美在线精品| 大型av网站在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 手机成人av网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 青草久久国产| 精品少妇内射三级| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品久久久av美女十八| 51午夜福利影视在线观看| 正在播放国产对白刺激| 亚洲精品在线美女| 黄片小视频在线播放| 后天国语完整版免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲中文av在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 正在播放国产对白刺激| 妹子高潮喷水视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品国产乱码久久久久久小说| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美97在线视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 亚洲天堂av无毛| 精品少妇内射三级| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 黑人操中国人逼视频| 999精品在线视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 深夜精品福利| 中国美女看黄片| 国产免费视频播放在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美精品一区二区大全| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜福利在线免费观看网站| 99久久精品国产亚洲精品| 我要看黄色一级片免费的| 日本五十路高清| 在线看a的网站| 久久热在线av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产免费视频播放在线视频| 免费黄频网站在线观看国产| 美女大奶头黄色视频| 正在播放国产对白刺激| 午夜视频精品福利| 日本a在线网址| 一区二区av电影网| 日日夜夜操网爽| 国产深夜福利视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜免费成人在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 久久青草综合色| tube8黄色片| 亚洲人成电影观看| 国产精品一区二区免费欧美 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99国产精品一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 一级片免费观看大全| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 老司机靠b影院| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久久久视频综合| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产一卡二卡三卡精品| av福利片在线| 欧美性长视频在线观看| 亚洲精品一二三| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲五月色婷婷综合| 国产一区二区三区综合在线观看| 热99re8久久精品国产| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美日韩成人在线一区二区| 在线观看舔阴道视频| 国产成人av教育| av电影中文网址| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产伦理片在线播放av一区| 国产97色在线日韩免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美中文综合在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩制服丝袜自拍偷拍| av超薄肉色丝袜交足视频| 看免费av毛片| 久久亚洲精品不卡| 国产一区二区在线观看av| 97精品久久久久久久久久精品| 久久久国产精品麻豆| 国产人伦9x9x在线观看| 97在线人人人人妻| 在线观看免费日韩欧美大片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 成年人免费黄色播放视频| av网站在线播放免费| 嫩草影视91久久| 嫁个100分男人电影在线观看| 一本久久精品| 亚洲成人国产一区在线观看| 在线av久久热| 丝袜在线中文字幕| 亚洲av日韩在线播放| 色视频在线一区二区三区| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲av国产av综合av卡| 黑人操中国人逼视频| 免费在线观看完整版高清| 日韩中文字幕视频在线看片| 999精品在线视频| 亚洲黑人精品在线| 真人做人爱边吃奶动态| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成人av一区二区三区在线看 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 啦啦啦 在线观看视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| www日本在线高清视频| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲国产av新网站| 秋霞在线观看毛片| 天堂中文最新版在线下载| 脱女人内裤的视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| bbb黄色大片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 黑丝袜美女国产一区| 人人澡人人妻人| 亚洲第一av免费看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 男男h啪啪无遮挡| 久久av网站| www.精华液| 亚洲少妇的诱惑av| 制服诱惑二区| 水蜜桃什么品种好| 久久人妻熟女aⅴ| 在线观看免费高清a一片| 国产精品国产av在线观看| 精品久久久久久电影网| 国产成人欧美| 午夜福利在线观看吧| 超碰成人久久| 久久国产精品大桥未久av| 制服人妻中文乱码| 午夜福利视频在线观看免费| 国产极品粉嫩免费观看在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人av激情在线播放| 国产精品国产av在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 丝袜人妻中文字幕| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产欧美亚洲国产| √禁漫天堂资源中文www| 国产野战对白在线观看| 69精品国产乱码久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲七黄色美女视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 天堂8中文在线网| 在线观看免费视频网站a站| 最新在线观看一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一区二区三区精品91| 老司机影院成人| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人av激情在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产日韩一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一区二区三区四区激情视频| 精品乱码久久久久久99久播| www.精华液| 亚洲第一av免费看| 在线av久久热| 97在线人人人人妻| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 丝袜在线中文字幕| 制服诱惑二区| 亚洲三区欧美一区| 永久免费av网站大全| 搡老熟女国产l中国老女人| videosex国产| av在线播放精品| 亚洲av美国av| 亚洲综合色网址| 亚洲第一av免费看| 欧美日韩福利视频一区二区| a 毛片基地| 丝袜美腿诱惑在线| 黑人操中国人逼视频| 国产成人精品在线电影| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品第一国产精品| 国产91精品成人一区二区三区 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 蜜桃国产av成人99| 一区二区三区精品91| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 又黄又粗又硬又大视频| 国产男女超爽视频在线观看| 大片免费播放器 马上看| 亚洲男人天堂网一区| av天堂久久9| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美久久黑人一区二区| kizo精华| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美97在线视频| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜免费成人在线视频| 久久这里只有精品19| 午夜精品国产一区二区电影| 国产成人影院久久av| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久国产精品大桥未久av| 在线观看免费高清a一片| 日本黄色日本黄色录像| 久久热在线av| 免费在线观看完整版高清| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费在线观看完整版高清| 欧美国产精品一级二级三级| 精品人妻在线不人妻| 欧美另类一区| av视频免费观看在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品一二三区在线看| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费高清在线观看日韩| 亚洲视频免费观看视频| 午夜免费成人在线视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品1区2区在线观看. | 女人久久www免费人成看片| 亚洲国产欧美网| 99精国产麻豆久久婷婷| 美国免费a级毛片| 欧美xxⅹ黑人| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 免费av中文字幕在线| 国产av一区二区精品久久| 精品第一国产精品| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 黄片播放在线免费| 日韩三级视频一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品一区二区三区四区五区乱码| 男女午夜视频在线观看| 免费不卡黄色视频| 少妇精品久久久久久久| 一本色道久久久久久精品综合| 国产淫语在线视频| 国产片内射在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产成人av激情在线播放| 久久久水蜜桃国产精品网| 在线观看免费高清a一片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 脱女人内裤的视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国精品久久久久久国模美| 日韩视频一区二区在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产亚洲一区二区精品| 在线观看免费午夜福利视频| 乱人伦中国视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产日韩欧美在线精品| 久久久国产一区二区| 欧美黑人精品巨大| 精品一区在线观看国产| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 看免费av毛片| 国产精品av久久久久免费| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最新的欧美精品一区二区| 超碰97精品在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 国产淫语在线视频| 久久久久久久久免费视频了|