專利名稱：：一種厭氧活性污泥dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及活性污泥DNA的提取方法。
背景技術(shù)：
：目前，通常采用酶法(如溶菌酶、蛋白酶K等)或者試劑盒法提取DNA。但是，在厭氧活性污泥DNA提取過程中發(fā)現(xiàn)，污泥中的懸浮物、膠體物質(zhì)、硫化物、詹殖質(zhì)等對溶菌酶、蛋白酶K和Taq酶的活性有抑制作用的成分，導(dǎo)致提取的DNA量少、純度不夠，不能準確地反映厭氧活性污泥中微生物的多樣性和種群豐度。若抑制物含量高會影響PCR反應(yīng)的效果，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量低甚至擴增失敗，成為制約后續(xù)變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)技術(shù)等分子操作的限速步驟。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有提取厭氧活性污泥DNA的方法存在產(chǎn)量小、純度低的缺陷，而提供一種厭氧活性污泥DNA的提取方法。本發(fā)明提取厭氧活性污泥DNA的方法按如下步驟進行一、污泥清洗a、取2g的厭氧活性污泥加入1.5mL的離心管中，加入lmL的PBS緩沖液震蕩，以9000r/min的速度離心lmin;b、取離心下層污泥，重復(fù)步驟a兩次，即得到清洗好的厭氧活性污泥；二、裂解細胞取100mg清洗好的厭氧活性污泥放入1.5mL的離心管中，加入0.5g石英砂、40^LDNA提取緩沖液、20^iL濃度為40mg/mL的RNA酶和160^L濃度為100mg/mL的溶菌酶，于37。C保溫lh，并來回顛倒離心管2030次，再加入400^LDNA提取緩沖液、40^iL濃度為100mg/mL的蛋白酶K和600^LSDS緩沖液，于6(TC保溫lh，并來回顛倒離心管2030次，以卯OOr/min的速度離心lmin，取上清液加入另一個離心管中；三、DNA的純化向步驟二得到的上清液中加入上清液體積1/4的異丙醇，加入到離心吸附柱中，以9000r/min的速度離心15s，倒掉收集管中的液體，再以卯00r/min的速度離心15s，在離心吸附柱中加入50(HiL質(zhì)量濃度為75%的乙醇，靜置lmin，以9000r/min的速度離心30s后倒掉收集管中的液體，再將離心吸附柱放入同一收集管中，再加入500^iL質(zhì)量濃度為75%的乙醇，以卯00r/min離心30s,倒掉收集管中的液體，將離心吸附柱再放入收集管中以卯00r/min的速度離心lmin，然后將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，然后將100^L濃度為2mmol/L的Tris溶液(三羥甲基氨基甲烷溶液)加入到離心吸附柱中，在6(TC的條件下保溫5min，再以12000r/min的速度離心lmin，即提取出厭氧活性污泥的DNA。本發(fā)明厭氧活性污泥DNA的提取方法步驟一中的PBS緩沖液的pH值為7.4，PBS緩沖液中NaCl的質(zhì)量濃度為0.8%、KC1的質(zhì)量濃度為0.02%，Na2HP04的質(zhì)量濃度為0.14%，KH2P04的質(zhì)量濃度為0.02%;步驟二中的DNA提取緩沖液的pH值為8.0，DNA提取緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L，EDTA的濃度為100mmol/L，NaCl的濃度為200mmol/L，CTAB的質(zhì)量濃度為2.0%;步驟二中的SDS緩沖液的pH值為8.0，SDS緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L，NaCl的濃度為200mmol/L，SDS的質(zhì)量濃度為2.0%。本發(fā)明厭氧活性污泥DNA的提取方法的原理及優(yōu)點1、通過污泥清洗減少了厭養(yǎng)活性污泥中抑制物的含量，有利于后續(xù)的細胞裂解，有效增加了提取DNA模板的產(chǎn)量和純度；2、細胞裂解采用酶法與物理法聯(lián)用的方法增加了DNA模板的產(chǎn)量；3、吸附柱純化合理避免了由于雜質(zhì)過多而導(dǎo)致的純化過程中DNA流失的現(xiàn)象有效增加了提取的DNA模板產(chǎn)量和純度；4、綜上所述，本發(fā)明提取的DNA模板的產(chǎn)量比現(xiàn)有方法提高了200%~400%，DNA模板的純度比現(xiàn)有方法提高了38.8%46.2%。圖1為具體實施方式五提取的厭氧活性污泥DNA與現(xiàn)有方法提取的厭氧活性污泥DNA瓊脂糖檢測對比圖，圖2為具體實施方式五提取的厭氧活性污泥DNA與現(xiàn)有方法提取的厭氧活性污泥DNA變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測樣品微生物多樣性對比圖譜。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式提取厭氧活性污泥DNA的方法按如下步驟進行一、污泥清洗a、取2g的厭氧活性污泥加入1.5mL的離心管中，加入lmL的PBS緩沖液震蕩，以9000r/min的速度離心lmin;b、取離心下層污泥，重復(fù)步驟a兩次，即得到清洗好的厭氧活性污泥；二、裂解細胞取100mg清洗好的厭氧活性污泥放入1.5mL的離心管中，加入0.5g石英砂、40|xLDNA提取緩沖液、20pL濃度為40mg/mL的RNA酶和160pL濃度為100mg/mL的溶菌酶，于37。C保溫lh，并來回顛倒離心管20~30次，再加入400pLDNA提取緩沖液、40nL濃度為100mg/mL的蛋白酶K和600pLSDS緩沖液，于60。C保溫lh，并來回顛倒離心管20-30次，以9000r/min的速度離心lmin，取上清液加入另一個離心管中；三、DNA的純化向步驟二得到的上清液中加入上清液體積1/4的異丙醇，加入到離心吸附柱中，以9000r/min的速度離心15s，倒掉收集管中的液體，再以9000r/min的速度離心15s，在離心吸附柱中加入500pL質(zhì)量濃度為75%的乙醇，靜置lmin，以9000r/min的速度離心30s后倒掉收集管中的液體，再將離心吸附柱放入同一收集管中，再加入500pL質(zhì)量濃度為75%的乙醇，以卯00r/min離心30s，倒掉收集管中的液體，將離心吸附柱再放入收集管中以9000r/min的速度離心lmin,然后將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，然后將lOOiiL濃度為2mmol/L的Tris溶液(三羥甲基氨基甲垸溶液)加入到離心吸附柱中，在60。C的條件下保溫5min，再以12000r/min的速度離心lmin，即提取出厭氧活性污泥的DNA。本實施方式中所用的吸附柱、RNA酶、溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶K溶解液均購自上海華舜生物工程有限公司。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點為步驟一中的PBS緩沖液的pH值為7.4，PBS緩沖液中NaCl的質(zhì)量濃度為0.8%、KC1的質(zhì)量濃度為0.02%,Na2HP04的質(zhì)量濃度為0.14%,KH2P04的質(zhì)量濃度為0.02%。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體賣施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同點為步驟二中的DNA提取緩沖液的pH值為8.0，DNA提取緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L，EDTA的濃度為100mmol/L，NaCl的濃度為200mmol/L，CTAB的質(zhì)量濃度為2.0%。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一的不同點為步驟二中的SDS緩沖液的pH值為8.0，SDS緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L,NaCl的濃度為200mmol/L，SDS的質(zhì)量濃度為2.0%。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一的不同點為步驟一中的PBS緩沖液的pH值為7.4，PBS緩沖液中NaCl的質(zhì)量濃度為0.8%、KC1的質(zhì)量濃度為0.02%，Na2HP04的質(zhì)量濃度為0.14%，KH2P04的質(zhì)量濃度為0.02%;步驟二中的DNA提取緩沖液的pH值為8.0，DNA提取緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L，EDTA的濃度為100mmol/L，NaCl的濃度為200mmol/L，CTAB的質(zhì)量濃度為2.0%;步驟二中的SDS緩沖液的pH值為8.0，SDS緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L，NaCl的濃度為200mmol/L，SDS的質(zhì)量濃度為2.0%。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。將本實施方式的方法步驟三提取出的DNA與以下現(xiàn)有方法提取的DNA進行對照采用本實施方式的方法做出兩個平行樣，編號為3-a，3-b;采用酶法提取DNA做出兩個平行樣，編號為l-a，1-b;采用試劑盒法提取DNA做出兩個平行樣，編號為2-a，2-b;對上述平行樣分別進行瓊脂糖檢測和DNA樣品微生物多樣性的DGGE檢觀!l,瓊脂糖檢測結(jié)果如圖1所示；DGGE檢測DNA樣品微生物多樣性圖譜如圖2所示；表征DNA純度的A260/A280值和DGGE圖譜條帶數(shù)如表1所示。表lDNA提取的純度和DGGE條帶數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1說明本實施方式提取的DNA模板的純度比現(xiàn)有方法提高了38.8%~46.2%。從圖.1可以看出本實施方式提取的DNA模板的產(chǎn)量比現(xiàn)有方法明顯提高。從圖2結(jié)合表1可以看出本實施方式提取的DNA模板比現(xiàn)有方法更能體現(xiàn)出微生f的多樣性，因為其DGGE條帶數(shù)比現(xiàn)有方法多4至8條。權(quán)利要求1、一種厭氧活性污泥DNA的提取方法，其特征在于提取厭氧活性污泥DNA的方法按如下步驟進行一、污泥清洗a、取2g的厭氧活性污泥加入1.5mL的離心管中，加入1mL的PBS緩沖液震蕩，以9000r/min的速度離心1min；b、取離心下層污泥，重復(fù)步驟a兩次，即得到清洗好的厭氧活性污泥；二、裂解細胞取100mg清洗好的厭氧活性污泥放入1.5mL的離心管中，加入0.5g石英砂、40μLDNA提取緩沖液、20μL濃度為40mg/mL的RNA酶和160μL濃度為100mg/mL的溶菌酶，于37℃保溫1h，并來回顛倒離心管20～30次，再加入400μLDNA提取緩沖液、40μL濃度為100mg/mL的蛋白酶K和600μLSDS緩沖液，于60℃保溫1h，并來回顛倒離心管20～30次，以9000r/min的速度離心1min，取上清液加入另一個離心管中；三、DNA的純化向步驟二得到的上清液中加入上清液體積1/4的異丙醇，加入到離心吸附柱中，以9000r/min的速度離心15s，倒掉收集管中的液體，再以9000r/min的速度離心15s，在離心吸附柱中加入500μL質(zhì)量濃度為75％的乙醇，靜置1min，以9000r/min的速度離心30s后倒掉收集管中的液體，再將離心吸附柱放入同一收集管中，再加入500μL質(zhì)量濃度為75％的乙醇，以9000r/min離心30s，倒掉收集管中的液體，將離心吸附柱再放入收集管中以9000r/min的速度離心1min，然后將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中，然后將100μL濃度為2mmol/L的Tris溶液加入到離心吸附柱中，在60℃的條件下保溫5min，再以12000r/min的速度離心1min，即提取出厭氧活性污泥的DNA。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種厭氧活性污泥DNA的提取與純化方法，其特征在于步驟一中的PBS緩沖液的pH值為7.4，PBS緩沖液中NaCl的質(zhì)量濃度為0.8%、KC1的質(zhì)量濃度為0.02%,Na2HP04的質(zhì)量濃度為0.14%,KH2P04的質(zhì)量濃度為0.02%。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種厭氧活性污泥DNA的提取與純化方法，其特征在午步驟二中的DNA提取緩沖液的pH值為8.0，DNA提取緩沖液中Tris-HCl的濃度為100mmol/L,EDTA的濃度為100mmol/L，NaCl的濃度為200mmol/L，CTAB的質(zhì)量濃度為2.0%。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種厭氧活性污泥DNA的提取方法，其特征在于步驟二中的SDS緩沖液的pH值為8.0,SDS緩沖液中Tris-HCl的濃度為lOOmmol/L,NaCl的濃度為200mmol/L，SDS的質(zhì)量濃度為2.0%。全文摘要一種厭氧活性污泥DNA的提取方法，它涉及活性污泥DNA的提取方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有提取厭氧活性污泥DNA的方法存在產(chǎn)量小、純度低的缺陷。本發(fā)明提取厭氧活性污泥DNA的方法按照以下步驟進行一、污泥清洗；二、裂解細胞；三、DNA的純化；即提取出厭氧活性污泥DNA。本發(fā)明的DNA提取方法提取出的DNA純度高、產(chǎn)量大。文檔編號C12P19/00GK101392248SQ20081006477公開日2009年3月25日申請日期2008年6月20日優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日發(fā)明者充劉,張運晴,王愛杰,闞洪靜申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)