專利名稱：能夠用于山茱萸品種鑒定的dna片段及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物質(zhì)，特別是一種能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段及其制備方法。
背景技術(shù)：
中藥山茱萸，又名山萸肉、萸肉、藥棗、棗皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉，為常用中藥材，具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫的功效，主治眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫，內(nèi)熱消渴等癥。山茱萸主產(chǎn)于我國的河南、浙江、陜西等省，四川、安徽、山東亦有栽培，但山茱萸在長期應(yīng)用和栽培的過程中，種內(nèi)產(chǎn)生很大變異，出現(xiàn)較多栽培品種，主要表現(xiàn)在這些品種的果實(shí)從形狀、大小、顏色、重量到產(chǎn)量、干果肉(藥材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有較大的差異，即它們的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥材質(zhì)量是明顯不同的，由于其藥用和商業(yè)價(jià)值，為確保真品，對其進(jìn)行鑒定是必要的，隨著科技的快速發(fā)展，目前基因鑒定已廣為應(yīng)用。
現(xiàn)應(yīng)用較為廣泛的基因遺傳標(biāo)記有形態(tài)標(biāo)記(morphological markers)，細(xì)胞標(biāo)記(cytological markers)、生化標(biāo)記(biochemical markers)和分子標(biāo)記(molecμlar markers)。形態(tài)標(biāo)記指植物的外部特征，細(xì)胞標(biāo)記主要是染色體的核型和帶型.生化標(biāo)記主要包括同功酶和貯藏蛋白。這3種標(biāo)記都是基因表達(dá)的結(jié)果，是對基因的間接反映，標(biāo)記數(shù)目有限，多態(tài)性較差，易受環(huán)境條件的影響。而DNA分子標(biāo)記是直接在DNA分子上檢測生物間的差異，是DNA水平遺傳變異的直接反映。DNA分子標(biāo)記能對各個(gè)發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、各個(gè)組織器官甚至細(xì)胞作檢測，不受環(huán)境與基因表達(dá)與否的限制，數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組，多態(tài)性高，遺傳穩(wěn)定。所以，DNA分子標(biāo)記從它誕生之日起，就引起了生物科學(xué)家極大的興趣。在短暫的幾十年中，經(jīng)歷了迅猛的發(fā)展，分子標(biāo)記日趨成熟。目前，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于生物多樣性的分析、種質(zhì)資源的分類演化、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的分離測序、作物品種及純度的鑒定、雜交育種等許多方面，并顯示了獨(dú)到的優(yōu)勢，那么能否利用基因制備用于山茱萸品種鑒定的DNA片段呢？
發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明之目的就是提供一種能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段及其制備方法，可有效解決山茱萸種質(zhì)資源分析、藥材鑒別、雜交育種，防止山茱萸假品出現(xiàn)的問題，其解決的技術(shù)方案是，根據(jù)分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生物類藥材所依賴的資源-“物種”的多樣性是由于其基因多態(tài)性的結(jié)果，而基因多態(tài)性最直接，最好是在DNA分子水平上進(jìn)行檢測，根據(jù)山茱萸遺傳基因特征，ST37全長589bp，ST43全長825bp，ST92全長837bp。
其制備方法是取山茱萸植物葉片研碎成細(xì)粉，將細(xì)粉置于提取緩沖液中，離心，棄去上清夜，再加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巰基乙醇，混勻，加入由等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)制成的溶液處理2次，除去雜質(zhì)，離心，取上清液，加入異丙醇，沉淀，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物質(zhì)，再利用DNA物質(zhì)制備RAPD片段，并對其進(jìn)行克隆，對克隆后RAPD片段的DNA序列進(jìn)行測定。本發(fā)明利用基因制備用于山茱萸品種鑒定的DNA片段，并可有效用于中藥山茱萸的品種改良及新品種選育，可以大大縮短山茱萸品種改良及新品種選育的周期，節(jié)省成本。
具體實(shí)施例方式 以下結(jié)合實(shí)際情況對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明，由上述技術(shù)方案給出，本發(fā)明用于山茱萸品種鑒定的DNA片段為ST37全長589bp，ST43全長825bp，ST92全長837bp，其中 ST37全長589bp為ST37的全序列-589bp，具體是 1 CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC81 GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA 161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA 241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT GACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC 321 TACAGCGACA AGAATATACA AATTACCGAA AGAGTTGGGG AAAGGTCCTA TGAAATCAAT GCCCCAAACA TTGAAGATTT 401 TGATGATTAG AATTCGATTA GGTGGCATCA TATTTCATTT GGAAATGTTT CATAATAGTT AACAACGGGA ACAAGACTTA 481 CAATAAAGCT TGGTATCCTT AAATATGGGG GGCCAATAAA ATCCACACTG CAAAATTTTT GCAGCAATTC TATGATCACT 561 AAAGTGGCCT CTAGTGTGGA TTTTATTGG； ST43全長825bp為ST43的全序列-825bp，具體是 1 TAACCCGGCA GTTGTAATTC GAGCTCGGTA CCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACATA TGATCGATGA TATCCCATGG81 GCGGCCGCCT GCAGACCAGG TCTGGTGATC TTGATTCCTT CCTGCAAGTC ACCTGCTGGC ATGATGTCTT GTTGCAGTGA 161 TGATGTTTGT CGTTGGTTGC TGTGAGATCT TGTTATCCCC TGACTCCTCT AAACATCGTA CCAGGAAGCA TTAAGTGGTG 241 TGGGGGCTGG GCCTGCTTAC GAATGAACTT AACTTTATTT GCTGTGTTGT TATCGCTGCC CTCTTTGCAC TCAGAAAAGC 321 CGTGTTGGCA TCTGTATTGA TTAAGCCGCC CCGACACGAG AATCGGTGTG TTGAGTATTG GCTCTTCCTC CGCTTCCTTA 401 CTCGCTTACC TGCTGCGCTT CGTTCTGCTG CTGCGAGCAG CGTCATCATC TTAGAAAGAT GCAGTAATGT TATTATCCAC 481 ATCATCAAAT AATAACGCAA GAAACAACTT ATGAGCAGAT CGTCATAAGG ACCCCAGCCA CCGAAACGAG GCGTCGCTGC 561 TGCTTTTATT CCATAGCCTC CGCCCCGCTG ACCAGCATAA AAAACAACGA TCCTAAACCA CGTGGCGCCC CCACCCTGGC 641 TCTTACTATG ATGCTTCTCT GTTTCTCCTG TAGAATAGCT CCGTCGTGTG TTCTGAAGCT ACGACGCTGA CTATCAAAGA 721 AATACCTCTC CTTCTTTCTC CCTTCAGGAG GCGCGGTTCT TTTTCATACT GACTGTGGAT TTAAACCTCT GCATCTGCAG 801 GACACCCCTG CCTTTTGGGC TTGTT； ST92全長837bp為ST92的全序列-837bp，具體是 1 CAAAAAACGG CAAGTTGAAT TCAAGCTCGG TACCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGACA TATGATCGAT GATATCCCAT81 GGGCGGCCGC CTGCAGACCA GGTCTCAGCT CACGACAGAG CGGGGAGACA TTGAGATGCC ATCGGTGTGG TCAGCCGGGG 161 CACATCAAAA GGAACTGTCC TCATGGTGGC AGTGGTGCAG GAGTGGCTAG GGGTTTTCAG CACGGACCCA GGCCAGCCAC 241 CGGGACGCAG GCAGATTTCA GACCTCCTCT TCCTTCTCAG ACAGAGGCTT ATGCTCAGAG ATTCCAGTCT GGGAAGGGTG 321 TGGCAGGGAC TTCAGGTCAG CAGACGGGTC CCAGGGGGGG GGTTCCCGGA GAGATCCGCC GCGCACATCC GCGCTTACAG 401 CTGTTCTTGC TGCGCTTGCG GAAGAGGGAG AGGCTTCCAC CGACCCTTCA ATGATCGGGG GTAGGATTGC CTTTGTCACC 481 GTTTTTGCTG ATGCGGTAGT TGCATTGGGA GCCACCGTGC CATACATTGC GAACGATTTT GGAACAGCTT TGACGGTGCT 561 GATTATGCCG ATCGATGTGC CCCCCTCTTG TGAGCATTCC TATGGGCGTG CATGTGGGCC TGGACAGAAG GATGCCACAT 641 ACTGTGGAAA TGACCATTCT CATATGCAAG CTGATATGTG ATTACGTGGG GATCGACAAG GCGAGTCCTG ATATGGAATT 721 TCGTGACGCA TTGGTTGGCC ACATTTGAGG GCTCTCTTGA TTCGATCTGG GTGAAGGGTC AGTAAGAAGA ACAAGATAGA 801 TACGGAAAAT GTTTGTGGGG AGAACACCCC GGACATC。
其生產(chǎn)方法是由以下步驟實(shí)現(xiàn)的 (一)、DNA提取方法 (1)取山茱萸植物葉片0.2g放入研缽，加入葉片重量的10％PVP粉末，在液氮中研磨成細(xì)粉； (2)將細(xì)粉裝到1.5ml離心管，加入冷藏的提取緩沖液1200μl(該緩沖液為25mM Tris-HCl，pH＝8.00)，冰上放置10min，8000r/min離心5min，棄去上清液，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液600μl(該抽提液為0.25gVc/ml CTAB，pH＝6.0～6.5；2×CTAB 的組成2％CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH＝8.0)，再加入50μl β-巰基乙醇，混勻后成混合液，65℃，保溫4h，其間不時(shí)搖動(dòng)； (3)將上述裝有混合液的離心管取出，4℃，12000r/min，離心15min；取上層溶液，加入等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)混勻，4℃，12000r/min離心10min，取上層溶液，然后加入等體積的氯仿-異戊醇混合制成的液體，其氯仿∶異戊醇＝24∶1，在4℃，12000r/min離心10min，重復(fù)抽提2次，去其雜質(zhì)成抽提液； (4)將上述抽提液，加入0.6～1.0倍體積的異丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液(可放在-20℃冰箱30min～12h，冷凍條件有利于沉淀物的生成)； (5)將上述含有沉淀物的溶液，于4℃，12000r/min離心15min；收集沉淀物，加入300μl 75％乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄上清液，棄上清液后的沉淀物，再加入300μl 75％乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，重復(fù)洗滌1次，得到沉淀物； (6)將裝有沉淀物的試管置于真空干燥器中5～10min，抽干乙醇(不能太干燥，否則DNA不易水溶)；用50μl去離子水溶解DNA沉淀物，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
(二)、RAPD片段的制備 用上海生工S系列的引物對山茱萸及其栽培品種進(jìn)行RAPD分析； 反應(yīng)體系為10×buffer2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)3.0μl，Mg2+ (25mmol/L)3.0μl，引物(該引物為S37或S43或S92，濃度為2mmol/L)2.5μl，模板DNA3.0μl(模板DNA為上述(6)步驟中的DNA沉淀物制成)，Taq酶(5U/μl)1.0μl，去離子水10.0μl補(bǔ)足25μl； 擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性8min，變性94℃，1min；退火38℃，1min；延伸72℃，1.5min，如此反復(fù)35個(gè)循環(huán)，72℃放置10min，得產(chǎn)物。94℃降溫到38℃的時(shí)間以及從38℃升溫到72℃的時(shí)間設(shè)置均為快速升降溫； 對上述產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色，在紫外光燈下檢測。其中在S37、S43、S92擴(kuò)增的圖譜中分別各有1條特征帶ST37、ST43、ST92。用消毒刀片切下目的DNA條帶，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(SK1132，上海生工公司)提取目標(biāo)條帶，得到RAPD片段ST37、ST43、ST92。
(三)、對RAPD片段進(jìn)行克隆，方法是 1、連接 用上海生工公司的PCR產(chǎn)物克隆試劑盒將RAPD片段ST37、ST43、ST92分別連接到pUCm-T質(zhì)粒載體中(所說的PCR產(chǎn)物克隆試劑盒為市售產(chǎn)品，由上海生工生產(chǎn)，編號SK2214)，16～23℃連接1小時(shí)至過夜(即12-14小時(shí))得連接產(chǎn)物，通常連接1小時(shí)即可達(dá)到一般研究的要求，保存-20℃冰箱備用，所說的試劑盒反應(yīng)體系如下表 10μl連接反應(yīng)體系
2、制備感受態(tài)細(xì)胞方法是 1)將E.coli大腸桿菌菌株以線狀形式涂布在LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜獲得合適的克??； 2)挑單克隆至2mlSOB培養(yǎng)基中，37℃，160r/min，搖菌過夜(12-14小時(shí))成培養(yǎng)基的菌液； 3)在250ml瓶中裝50mlSOB培養(yǎng)基，隨后將過夜培養(yǎng)的菌液接種于培養(yǎng)基中，其接種比例每100g培養(yǎng)基中接培養(yǎng)的菌液1ml(100∶1)，37℃搖菌至A600nm約0.35，在冰上放置10分鐘； 4)將菌液轉(zhuǎn)移到5ml的離心管中，3500rpm離心10-15分鐘后，棄上清液，讓沉淀物盡可能真空干燥，加4mlSolution B(高效制備感受態(tài)細(xì)胞試劑盒中的試劑，上海生工公司)懸浮菌體，得到感受態(tài)細(xì)胞。按100μl/支分裝凍存管中，放入-70℃保存； 其中上述所說的LB培養(yǎng)基平板是由LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基制成，LB培養(yǎng)基為配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L NaOH(約0.2ml)調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至1L，在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min，將液體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中放涼，凝固形成平板狀； 所說的SOB培養(yǎng)基為配制每升培養(yǎng)基，在950ml去離子水中加入，胰化蛋白胨20g，酵提取物5g，NaCl0.5g，搖動(dòng)容器使溶質(zhì)完全溶解，加10ml 250mmol/L KCl溶液(將1.86g KCl用100ml去離子水溶解即配成25mml/L KCl溶液)用5mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min，該溶液在使用前，加入5ml滅菌的2mol/L MgCl2[2mol/L MgCl2溶液的配制方法如下用90ml去離子水溶解19g MgCl2，用去離子水調(diào)整體積為100ml，在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌2min]； 所說的SOC培養(yǎng)基為SOC培養(yǎng)基除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分與SOB培養(yǎng)基相同，SOB培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后冷至60℃或60℃以下，加20ml除菌的1mol/L葡萄糖溶液(1mol/l葡萄糖溶液的配制方法是用90ml去離子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去離子水定容至100ml，用0.22um濾器過濾除菌)； 所說的X-Gal的儲(chǔ)存濃度將X-Gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml濃度的溶液，裝于玻璃瓶中或聚丙烯管中，裝溶液的管應(yīng)以錫箔包裹以防止見光使X-Gal受到破壞，-20℃保存，該溶液不必過濾除菌； 所說的IPTG溶液的配法將2g的IPTG溶于8ml水中，用水調(diào)節(jié)體積到10ml，用0.22μm的一次性濾器過濾除菌，分裝成1ml小份，-20℃保存。
3、轉(zhuǎn)化 1)200μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻。冰上放置30分鐘； 2)42℃水浴熱激60秒，冰上放置2分鐘。加400μlSOC培養(yǎng)基，37℃，200～250r/min振蕩培養(yǎng)1小時(shí)； 3)室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μl上清夜，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮； 4)將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20μl 100mmol/L IPTC和100μl20mg/mlX-gal涂布的含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上； 5)平板在37℃下正向放置1小時(shí)以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜； 6)選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，得到含有目的DNA片段質(zhì)粒載體的菌液。
(四)、RAPD片段的DNA序列測定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求我們選擇了直接進(jìn)行測序法，將含有目的DNA片段質(zhì)粒載體的新鮮菌液1ml送出測序，測序公司為上海生工公司，ST37全長589bp，ST43全長825bp，ST92全長837bp； ST37的全序列-589bp 1 CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC81 GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA 161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA 241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT CACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC 321 TACAGCGACA AGAATATACA AATTACCGAA AGAGTTGGGG AAAGGTCCTA TGAAATCAAT GCCCCAAACA TTGAAGATTT 401 TGATGATTAG AATTCGATTA GGTGGCATCA TATTTCATTT GGAAATGTTT CATAATAGTT AACAACGGGA ACAAGACTTA 481 CAATAAAGCT TGGTATCCTT AAATATGGGG GGCCAATAAA ATCCACACTG CAAAATTTTT GCAGCAATTC TATGATCACT 561 AAAGTGGCCT CTAGTGTGGA TTTTATTGG； ST43的全序列-825bp 1 TAACCCGGCA GTTGTAATTC GAGCTCGGTA CCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACATA TGATCGATGA TATCCCATGG81 GCGGCCGCCT GCAGACCAGG TCTGGTGATC TTGATTCCTT CCTGCAAGTC ACCTGCTGGC ATGATGTCTT GTTGCAGTGA 161 TGATGTTTGT CGTTGGTTGC TGTGAGATCT TGTTATCCCC TGACTCCTCT AAACATCGTA CCAGGAAGCA TTAAGTGGTG 241 TGGGGGCTGG GCCTGCTTAC GAATGAACTT AACTTTATTT GCTGTGTTGT TATCGCTGCC CTCTTTGCAC TCAGAAAAGC 321 CGTGTTGGCA TCTGTATTGA TTAAGCCGCC CCGACACGAG AATCGGTGTG TTGAGTATTG GCTCTTCCTC CGCTTCCTTA 401 CTCGCTTACC TGCTGCGCTT CGTTCTGCTG CTGCGAGCAG CGTCATCATC TTAGAAAGAT GCAGTAATGT TATTATCCAC 481 ATCATCAAAT AATAACGCAA GAAACAACTT ATGAGCAGAT CGTCATAAGG ACCCCAGCCA CCGAAACGAG GCGTCGCTGC 561 TGCTTTTATT CCATAGCCTC CGCCCCGCTG ACCAGCATAA AAAACAACGA TCCTAAACCA CGTGGCGCCC CCACCCTGGC 641 TCTTACTATG ATGCTTCTCT GTTTCTCCTG TAGAATAGCT CCGTCGTGTG TTCTGAAGCT ACGACGCTGA CTATCAAAGA 721 AATACCTCTC CTTCTTTCTC CCTTCAGGAG GCGCGGTTCT TTTTCATACT GACTGTGGAT TTAAACCTCT GCATCTGCAG 801 GACACCCCTG CCTTTTGGGC TTGTT； ST92的全序列-837bp 1 CAAAAAACGG CAAGTTGAAT TCAAGCTCGG TACCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGACA TATGATCGAT GATATCCCAT81 GGGCGGCCGC CTGCAGACCA GGTCTCAGCT CACGACAGAG CGGGGACACA TTGAGATGCC ATCGGTGTGG TCAGCCGGGG 161 CACATCAAAA GGAACTGTCC TCATGGTGGC AGTGGTGCAG GAGTGGCTAG GGGTTTTCAG CACGGACCCA GGCCAGCCAC 241 CGGGACGCAG GCAGATTTCA GACCTCCTCT TCCTTCTCAG ACAGAGGCTT ATGCTCAGAG ATTCCAGTCT GGGAAGGGTG 321 TGGCAGGGAC TTCAGGTCAG CAGACGGGTC CCAGGGGGGG GGTTCCCGGA GAGATCCGCC GCGCACATCC GCGCTTACAG 401 CTGTTCTTGC TGCGCTTGCG GAAGAGGGAG AGGCTTCCAC CGACCCTTCA ATGATCGGGG GTAGGATTGC CTTTGTCACC 481 GTTTTTGCTG ATGCGGTAGT TGCATTGGGA GCCACCGTGC CATACATTGC GAACGATTTT GGAACAGCTT TGACGGTGCT 561 GATTATGCCG ATCGATGTGC CCCCCTCTTG TGAGCATTCC TATGGGCGTG CATGTGGGCC TGGACAGAAG GATGCCACAT 641 ACTGTGGAAA TGACCATTCT CATATGCAAG CTGATATGTG ATTACGTGGG GATCGACAAG GCGAGTCCTG ATATGGAATT 721 TCGTGACGCA TTGGTTGGCC ACATTTGAGG GCTCTCTTGA TTCGATCTGG GTGAAGGGTC AGTAAGAAGA ACAAGATAGA 801 TACGGAAAAT GTTTGTGGGG AGAACACCCC GGACATC 。
本發(fā)明利用分子鑒定技術(shù)，并摸索出有效的方法，進(jìn)行中藥材的真?zhèn)舞b定甚至品質(zhì)上的評價(jià)，目前植物總DNA的提取方法已比較完善，可從長期貯存的標(biāo)本中進(jìn)行提取、擴(kuò)增與測序，使中藥材的分子鑒別在方法學(xué)上得到保證，可以大大縮短山茱萸品種改良及新品種選育的周期，節(jié)省成本，對市場產(chǎn)品170例進(jìn)行測定，準(zhǔn)確率為99.89％，故本發(fā)明方法簡單，節(jié)省成本，是山茱萸藥材鑒定、品種培育、改良上的一大創(chuàng)造。
序列表
<110>河南中醫(yī)學(xué)院
<120>能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段及其制備方法
<130>能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段及其制備方法
<140>200810049406.3
<141>2008-03-25
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>589
<212>DNA
<213>山茱萸科的山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)
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<213>山茱萸科的山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)
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<211>837
<212>DNA
<213>山茱萸科的山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)
<400>3
caaaaaacgg caagttgaat tcaagctcgg taccgtaata cgactcacta tagggcgaca60
tatgatcgat gatatcccat gggcggccgc ctgcagacca ggtctcagct cacgacagag120
cggggagaca ttgagatgcc atcggtgtgg tcagccgggg cacatcaaaa ggaactgtcc180
tcatggtggc agtggtgcag gagtggctag gggttttcag cacggaccca ggccagccac240
cgggacgcag gcagatttca gacctcctct tccttctcag acagaggctt atgctcagag300
attccagtct gggaagggtg tggcagggac ttcaggtcag cagacgggtc ccaggggggg360
ggttcccgga gagatccgcc gcgcacatcc gcgcttacag ctgttcttgc tgcgcttgcg420
gaagagggag aggcttccac cgacccttca atgatcgggg gtaggattgc ctttgtcacc480
gtttttgctg atgcggtagt tgcattggga gccaccgtgc catacattgc gaacgatttt540
ggaacagctt tgacggtgct gattatgccg atcgatgtgc ccccctcttg tgagcattcc600
tatgggcgtg catgtgggcc tggacagaag gatgccacat actgtggaaa tgaccattct660
catatgcaag ctgatatgtg attacgtggg gatcgacaag gcgagtcctg atatggaatt720
tcgtgacgca ttggttggcc acatttgagg gctctcttga ttcgatctgg gtgaagggtc780
agtaagaaga acaagataga tacggaaaat gtttgtgggg agaacacccc ggacatc 83權(quán)利要求
1、一種能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段，其特征在于，該片段為三部分ST37，全長589bp，ST43，全長825bp，ST92，全長837bp，其中ST37，全長589bp為ST37的全序列-589bp
1 CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC
81 GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA
161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA
241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT GACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC
321 TACAGCGACA AGAATATACA AATTACCGAA AGAGTTGGGG AAAGGTCCTA TGAAATCAAT GCCCCAAACA TTGAAGATTT
401 TGATGATTAG AATTCGATTA GGTGGCATCA TATTTCATTT GGAAATGTTT CATAATAGTT AACAACGGGA ACAAGACTTA
481 CAATAAAGCT TGGTATCCTT AAATATGGGG GGCCAATAAA ATCCACACTG CAAAATTTTT GCAGCAATTC TATGATCACT
561 AAAGTGGCCT CTAGTGTGGA TTTTATTGG；
ST43，全長825bp為ST43的全序列-825bp
1 TAACCCGGCA GTTGTAATTC GAGCTCGGTA CCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACATA TGATCGATGA TATCCCATGG
81 GCGGCCGCCT GCAGACCAGG TCTGGTGATC TTGATTCCTT CCTGCAAGTC ACCTGCTGGC ATGATGTCTT GTTGCAGTGA
161 TGATGTTTGT CGTTGGTTGC TGTGAGATCT TGTTATCCCC TGACTCCTCT AAACATCGTA CCAGGAAGCA TTAAGTGGTG
241 TGGGGGCTGG GCCTGCTTAC GAATGAACTT AACTTTATTT GCTGTGTTGT TATCGCTGCC CTCTTTGCAC TCAGAAAAGC
321 CGTGTTGGCA TCTGTATTGA TTAAGCCGCC CCGACACGAG AATCGGTGTG TTGAGTATTG GCTCTTCCTC CGCTTCCTTA
401 CTCGCTTACC TGCTGCGCTT CGTTCTGCTG CTGCGAGCAG CGTCATCATC TTAGAAAGAT GCAGTAATGT TATTATCCAC
481 ATCATCAAAT AATAACGCAA GAAACAACTT ATGAGCAGAT CGTCATAAGG ACCCCAGCCA CCGAAACGAG GCGTCGCTGC
561 TGCTTTTATT CCATAGCCTC CGCCCCGCTG ACCAGCATAA AAAACAACGA TCCTAAACCA CGTGGCGCCC CCACCCTGGC
641 TCTTACTATG ATGCTTCTCT GTTTCTCCTG TAGAATAGCT CCGTCGTGTG TTCTGAAGCT ACGACGCTGA CTATCAAAGA
721 AATACCTCTC CTTCTTTCTC CCTTCAGGAG GCGCGGTTCT TTTTCATACT GACTGTGGAT TTAAACCTCT GCATCTGCAG
801 GACACCCCTG CCTTTTGGGC TTGTT；
ST92，全長837bp為ST92的全序列-837bp
1 CAAAAAACGG CAAGTTGAAT TCAAGCTCGG TACCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGACA TATGATCGAT GATATCCCAT
81 GGGCGGCCGC CTGCAGACCA GGTCTCAGCT CACGACAGAG CGGGGAGACA TTGAGATGCC ATCGGTGTGG TCAGCCGGGG
161 CACATCAAAA GGAACTGTCC TCATGGTGGC AGTGGTGCAG GAGTGGCTAG GGGTTTTCAG CACGGACCCA GGCCAGCCAC
241 CGGGACGCAG GCAGATTTCA GACCTCCTCT TCCTTCTCAG ACAGAGGCTT ATGCTCAGAG ATTCCAGTCT GGGAAGGGTG
321 TGGCAGGGAC TTCAGGTCAG CAGACGGGTC CCAGGGGGGG GGTTCCCGGA GAGATCCGCC GCGCACATCC GCGCTTACAG
401 CTGTTCTTGC TGCGCTTGCG GAAGAGGGAG AGGCTTCCAC CGACCCTTCA ATGATCGGGG GTAGGATTGC CTTTGTCACC
481 GTTTTTGCTG ATGCGGTAGT TGCATTGGGA GCCACCGTGC CATACATTGC GAACGAGGTT GGAACAGCTT TGACGGTGCT
561 GATTATGCCG ATCGATGTGC CCCCCTCTTG TGAGCATTCC TATGGGCGTG CATGTGGGCC TGGACAGAAG GATGCCACAT
641 ACTGTGGAAA TGACCATTCT CATATGCAAG CTGATATGTG ATTACGTGGG GATCGACAAG GCGAGTCCTG ATATGGAATT
721 TCGTGACGCA TTGGTTGGCC ACATTTGAGG GCTCTCTTGA TTCGATCTGG GTGAAGGGTC AGTAAGAAGA ACAAGATAGA
801 TACGGAAAAT GTTTGTGGGG AGAACACCCC GGACATC。
2、權(quán)利要求1所述的能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn)
A、提取DNA，方法是
(1)取山茱萸植物葉片0.2g放入研缽，加入葉片重量的10％PVP粉末，在液氮中研磨成細(xì)粉；
(2)將細(xì)粉裝到1.5ml離心管，加入冷藏的提取緩沖液1200μl，該緩沖液為25mM Tris-HCl，pH＝8.00，冰上放置10min，8000r/min離心5min，棄去上清液，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液600μl，該抽提液為0.25gVc/ml CTAB，pH＝6.0～6.5；2×CTAB的組成2％CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH＝8.0，再加入50μl β-巰基乙醇，混勻后成混合液，65℃，保溫4h，其間不時(shí)搖動(dòng)；
(3)將上述裝有混合液的離心管取出，4℃，12000r/min，離心15min；取上層溶液，加入等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇混勻，飽和酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1，4℃，12000r/min離心10min，取上層溶液，然后加入等體積的氯仿-異戊醇混合制成的液體，其氯仿∶異戊醇＝24∶1，在4℃，12000r/min離心10min，重復(fù)抽提2次，去其雜質(zhì)成抽提液；
(4)將上述抽提液，加入0.6～1.0倍體積的異丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液，放在-20℃冰箱內(nèi)冷凍30min～12h；
(5)將上述含有沉淀物的溶液，于4℃，12000r/min離心15min；收集沉淀物，加入300μl 75％乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄上清液，棄上清液后的沉淀物，再加入300μl 75％乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，重復(fù)洗滌1次，得到沉淀物；
(6)將裝有沉淀物的試管置于真空干燥器中5～10min，不能太干燥，否則DNA不易水溶；用50μl去離子水溶解DNA沉淀物，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?br>
B、制備RAPD片段，方法是
將上述用去離子水溶解的DNA沉淀物，置于反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，方法是用10×buffer 2.5μl，dNTP 3.0μl，Mg2+ 3.0μl，引物2.5μl，DNA沉淀物3.0μl，Taq酶1.0μl，去離子水10.0μl補(bǔ)足25μl成反應(yīng)體系，94℃預(yù)變性8min，變性94℃，1min；退火38℃，1min；延伸72℃，1.5min，如此反復(fù)35個(gè)循環(huán)，72℃放置10min，得產(chǎn)物，對產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，0.5μg/ml溴化乙錠溶液染色，利用S37、S43、S92擴(kuò)增的圖譜，切下目的DNA的條帶，得RAPD片段ST37、ST43、ST92；
C、對RAPD片段進(jìn)行克隆，方法是
首先用PCR產(chǎn)物克隆試劑盒將將RAPD片段ST37、ST43、ST92分別連接到pUCm-T載體中，16～23℃連接1小時(shí)至過夜，得到連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，再在含有IPTG、X-Gal、Amp的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上隔夜培養(yǎng)，形成白色單菌落，然后將單菌落在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，得到含有目的DNA片段質(zhì)粒載體的菌液；取菌液進(jìn)行RAPD片段的DNA序列進(jìn)行測定，得ST37全長589bp，ST43全長825bp，ST92全長837bp三個(gè)全序列片段。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段的制備方法，其特征在于，所說的制備感受態(tài)細(xì)胞是
1)將E。coli大腸桿菌菌株以線狀形式涂布在LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜獲得合適的克??；
2)挑單克隆至2mlSOB培養(yǎng)基中，37℃，160r/min，搖菌過夜成培養(yǎng)基的菌液；
3)在250ml瓶中裝50mlSOB培養(yǎng)基，隨后將過夜培養(yǎng)的菌液接種于培養(yǎng)基中，其接種比例每100g培養(yǎng)基中接培養(yǎng)的菌液1ml，37℃搖菌至A600nm約0.35，在冰上放置10分鐘；
4)將菌液轉(zhuǎn)移到5ml的離心管中，3500rpm離心10-15分鐘后，棄上清液，真空干燥，加4mlSolution B懸浮菌體，得到感受態(tài)細(xì)胞，按100μl/支分裝凍存管中，放入-70℃保存。
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段的制備方法，其特征在于，所說的對感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是
1)200μl感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮，加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30分鐘；
2)42℃水浴熱激60秒，冰上放置2分鐘，加400μl SOC培養(yǎng)基，37℃，200～250r/min振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；
3)室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μl上清夜，用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮；
4)將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20μl 100mmol/L IPTC和100μl20mg/mlX-gal涂布的含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上；
5)平板在37℃下正向放置1小時(shí)以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜；
6)選擇在IPTG/X-gal平板上生長的白色菌落，用牙簽挑至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，得到含有目的DNA片段質(zhì)粒載體的菌液。
5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段的制備方法，其特征在于，所說的X-Gal的儲(chǔ)存濃度將X-Gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml濃度的溶液，裝于玻璃瓶中或聚丙烯管中，裝溶液的管應(yīng)以錫箔包裹以防止見光使X-Gal受到破壞，-20℃保存，該溶液不必過濾除菌；所說的IPTG溶液的配法將2g的IPTG溶于8ml水中，用水調(diào)節(jié)體積到10ml，用0.22μm的一次性濾器過濾除菌，分裝成1ml小份，-20℃保存；所說的LB培養(yǎng)基平板是由LB培養(yǎng)基制成，LB培養(yǎng)基為配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L NaOH約0.2ml調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至1L，在15psi高壓下蒸汽滅菌20min，將液體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中放涼，凝固形成平板狀。
6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段的制備方法，其特征在于，所說的SOB培養(yǎng)基為配制每升培養(yǎng)基，在950ml去離子水中加入，胰化蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl0.5g，搖動(dòng)容器使溶質(zhì)完全溶解，加10ml 250mmol/L KCl溶液用5mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至1L，在15psi高壓下蒸汽滅菌20min，該溶液在使用前，加入5ml滅菌的2mol/L MgCl2，2mol/L MgCl2溶液的配制方法是，用90ml去離子水溶解19g MgCl2，用去離子水調(diào)整體積為100ml，在15psi高壓下蒸汽滅菌20min。
7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段的制備方法，其特征在于，所說的SOC培養(yǎng)基為SOC培養(yǎng)基除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分與SOB培養(yǎng)基相同，SOB培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后冷至60℃或60℃以下，加20ml除菌的1mol/L葡萄糖溶液該1mol/l葡萄糖溶液的配制方法是，用90ml去離子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去離子水定容至100ml，用0.22um濾器過濾除菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠用于山茱萸品種鑒定的DNA片段及其制備方法，可有效解決山茱萸種質(zhì)資源分析、藥材鑒別、雜交育種的問題，解決的技術(shù)方案是，該DNA片段為ST37全長589bp，ST43全長825bp，ST92全長837bp，其制備方法是，取山茱萸植物葉片研碎，加入PVP粉末研成細(xì)粉，將細(xì)粉置于提取緩沖液中，離心，棄去上清夜，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巰基乙醇，混勻，加入由等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇制成的溶液處理2次，除去雜質(zhì)，離心，取上清液，加入異丙醇，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物質(zhì)，制備RAPD片段，進(jìn)行克隆，對克隆后DNA序列測定，方法簡單、科學(xué)，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。
文檔編號C12Q1/68GK101285098SQ20081004940
公開日2008年10月15日 申請日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日
發(fā)明者陳隨清, 盧小蕾 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院