專利名稱：黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)四草酸鉀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)四草酸鉀的方法，尤指 一種利用黑曲霉的分離純化及黑曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)四草酸 鉀的方法。
背景技術(shù)：
四草酸鉀，化學(xué)名又稱之為草酸三氫鉀、乙二酸三氫鉀、四
乙二酸鉀；英文名為 potassium trihydrogen dioxalate dehydrate 或 potassium tetraoxalate ; 分子式為 KH3(C204)2'2H20 或 C4H3K08*2H20;分子量為254.19。純品為無色晶體或白色粉末。 加熱至IO(TC失水成無水物，更高溫度時分解為碳酸鉀和一氧化 碳等，能溶于水，微溶于醇。
國產(chǎn)分析純的四草酸鉀，目前的市場價位為120 150元 /Kg。進口優(yōu)級純的四草酸鉀，市場價位為1568-1850元/Kg。
四草酸鉀在工業(yè)上有廣泛的用途，是制革、織物整理劑，媒 染劑，金屬拋光、防銹處理劑，有機化工原料，催化劑，化學(xué)分 析的基準物和分析試劑，也用于感光材料的制備。目前四草酸鉀 的制備，是由過量草酸與碳酸鉀或氯化鉀等鉀鹽進行化學(xué)反應(yīng)制 得?；瘜W(xué)反應(yīng)生產(chǎn)四草酸鉀，其副產(chǎn)物鹽酸、草酸給環(huán)境帶來污 染；過量的草酸增加了環(huán)境危害；使用碳酸鉀、氯化鉀作為反應(yīng) 基質(zhì)，在生產(chǎn)碳酸鉀、氯化鉀的同時給環(huán)境造成了二次污染，使 得四草酸鉀的生產(chǎn)成本高。但利用微生物生產(chǎn)四草酸鉀，還未見 報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)工 業(yè)合成四草酸鉀的相對高成本、高環(huán)境污染的問題，提供一種黑 曲霉發(fā)酵生產(chǎn)四草酸鉀的方法，使用馬鈴薯、蔗糖作為基本培養(yǎng) 基質(zhì)，安全、無毒害，實現(xiàn)了四草酸鉀的低成本、全能環(huán)保型生產(chǎn)。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 一種 黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)四草酸鉀的方法，該方法包括如下步驟
a、 黑曲霉的分離純化選取皺邊石杉植株的莖段，經(jīng)流水
沖洗2-3小時—75%酒精消毒1-2 min — 0.01mol/L鹽酸、 5%次氯酸鈉、2.4 mmol/L檸檬酸依次沖洗一遍一5%次氯酸鈉 消毒 10 12 min — 無菌水沖洗3-5次 一10%雙氧水消毒 8-12 min —無菌水沖洗4~5次一無菌吸水紙上吸干表面水 —接種于PDA平板上一分離、純化得到黑曲霉。
b、 黑曲霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)每升PDA液體培養(yǎng)基，加入蔗 糖5 25 g， pH值調(diào)節(jié)至4.7 6.4，無菌狀態(tài)下，接種黑曲霉 孢子，黑曲霉孢子加入量為1升PDA培養(yǎng)液加1% (體積)黑 曲霉孢子，孢子濃度為1 X 104 106 cfu/mL、培養(yǎng)溫度為30 40 匸，轉(zhuǎn)速為120 150轉(zhuǎn)/分鐘，通空氣量為培養(yǎng)液總體積即PDA 培養(yǎng)液、蔗糖和黑曲霉孢子接種量的總和的30%，恒溫發(fā)酵培養(yǎng) 72-100小時，過濾菌絲，發(fā)酵液濃縮至培養(yǎng)液總體積的1/20 1/15，析出結(jié)晶，超純水洗滌4 5次，40 50。C烘干，得四草 酸鉀產(chǎn)品。
本發(fā)明將黑曲霉的分離純化與其液體發(fā)酵培養(yǎng)相結(jié)合，使用 馬鈴薯、蔗糖作為基本培養(yǎng)基質(zhì)，安全、無毒害，每升PDA培 養(yǎng)基至少可生產(chǎn)1.22 g純度達98%的四草酸鉀白色粉末狀產(chǎn) 品，實現(xiàn)了四草酸鉀的全程、全能環(huán)保型生產(chǎn)；以目前國產(chǎn)分析 純的四草酸鉀市場價位為計算依據(jù)，可使四草酸鉀的產(chǎn)出、投入 比達到40 50:1，其生產(chǎn)成本比現(xiàn)有技術(shù)大幅下降。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進 一 步說明。
首先，分離、純化得到黑曲霉選取皺邊石杉植株的莖段， 經(jīng)流水沖洗2-3小時一75%酒精消毒1-2 min — 0.01 mol/L 鹽酸、5%次氯酸鈉、2.4 mmol/L檸檬酸依次沖洗一遍一5%次氯酸鈉消毒10 12 min —無菌水沖洗3-5次一10%雙氧水 消毒8-12 min —無菌水沖洗4 5次一無菌吸水紙上吸干 表面水一接種于PDA平板上一分離、純化得到黑曲霉。
例一300 g新鮮馬鈴薯去皮，稱取1 cm方塊大小的馬鈴薯 200 g，加入800 mL蒸餾水煮沸30分鐘，過濾，濾液體積補充 至900 mL，加入蔗糖5 g， pH值調(diào)至5.3，滅菌。無菌條件下 接種黑曲霉孢子懸液10mL(孢子濃度為1X105 cfu/mL)，無菌 水補充培養(yǎng)基總體積至1 L。轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘，37'C恒溫培 養(yǎng)72小時。過濾菌絲，發(fā)酵液濃縮至1/20,析出四草酸鉀結(jié)晶， 超純水洗漆4 5次，4(TC烘干，得1.22 g純度達98%的四草 酸鉀白色粉末狀產(chǎn)品。
例二 300 g新鮮馬鈴薯去皮，稱取1 cm方塊大小的馬鈴薯 200 g，加入800 mL蒸餾水煮沸30分鐘，過濾，濾液體積補充 至900 mL，加入蔗糖20g， pH值調(diào)至5.8，滅菌。無菌條件下 接種黑曲霉孢子懸液10mL(孢子濃度為1 X 106 cfu/mL)，無菌 水補充培養(yǎng)基總體積至1 L。轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘，34X:恒溫培 養(yǎng)84小時。過濾菌絲，發(fā)酵液濃縮至1/20，析出四草酸鉀結(jié)晶， 超純水洗滌4 5次，40'C烘干，得1.76 g純度達98%的四草
酸鉀白色粉末狀產(chǎn)品。
例三300 g新鮮馬鈴薯去皮，稱取lcm方塊大小的馬鈴薯 200 g，加入800 mL蒸餾水煮沸30分鐘，過濾，濾液體積補充 至900 mL，加入蔗糖15g， pH值調(diào)至5.6，滅菌。無菌條件下 接種黑曲霉孢子懸液10mL(孢子濃度為1 X 104 cfu/mL)，無菌 水補充培養(yǎng)基總體積至1 L。轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘，37'C恒溫培 養(yǎng)72小時。過濾菌絲，發(fā)酵液濃縮至1/20，析出四草酸鉀結(jié)晶， 超純水洗滌4 5次，4(TC烘干，可生產(chǎn)2.1 g純度達98%的四 草酸鉀白色粉末狀產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1、一種黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)四草酸鉀的方法，其特征在于該方法包括如下步驟a、黑曲霉的分離純化選取皺邊石杉植株的莖段，經(jīng)流水沖洗2-3小時→75％酒精消毒1～2min→0.01mol/L鹽酸、5％次氯酸鈉、2.4mmol/L檸檬酸依次沖洗一遍→5％次氯酸鈉消毒10～12min→無菌水沖洗3—5次→10％雙氧水消毒8-12min→無菌水沖洗4～5次→無菌吸水紙上吸干表面水→接種于PDA平板上→分離、純化得到黑曲霉。b、黑曲霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)每升PDA液體培養(yǎng)基，加入蔗糖5～25g，pH值調(diào)節(jié)至4.7～6.4，無菌狀態(tài)下，接種黑曲霉孢子，黑曲霉孢子加入量為1升PDA培養(yǎng)液加1％(體積)黑曲霉孢子，孢子濃度為1×104～106cfu/mL、培養(yǎng)溫度為30～40℃，轉(zhuǎn)速為120～150轉(zhuǎn)/分鐘，通空氣量為培養(yǎng)液總體積即PDA培養(yǎng)液、蔗糖和黑曲霉孢子接種量的總和的30％，恒溫發(fā)酵培養(yǎng)72-100小時，過濾菌絲，發(fā)酵液濃縮至培養(yǎng)液總體積的1/20～1/15，析出結(jié)晶，超純水洗滌4～5次，40～50℃烘干，得四草酸鉀產(chǎn)品。
全文摘要
一種黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)四草酸鉀的方法，該方法包括黑曲霉的分離純化，及黑曲霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)每升PDA液體培養(yǎng)基，加入蔗糖5～25g，pH值調(diào)節(jié)至4.7～6.4，無菌狀態(tài)下，黑曲霉孢子接種量為1％，孢子濃度為1×10<sup>4</sup>～10<sup>6</sup>cfu/mL、培養(yǎng)溫度為30～40℃，恒溫發(fā)酵培養(yǎng)72-100小時，過濾菌絲，發(fā)酵液濃縮至培養(yǎng)液總體積的1/20～1/15，析出結(jié)晶，超純水洗滌、烘干，得四草酸鉀白色粉末狀產(chǎn)品。本發(fā)明將黑曲霉的分離純化與其液體發(fā)酵培養(yǎng)相結(jié)合，使用馬鈴薯、蔗糖作為基本培養(yǎng)基質(zhì)，安全、無毒害，實現(xiàn)了四草酸鉀的全程、全能環(huán)保型生產(chǎn)，生產(chǎn)成本大幅下降。
文檔編號C12P7/46GK101532037SQ20081003077
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日
發(fā)明者劉仲華, 史云峰, 禹利君, 胡維新, 范鐵芳 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)