專利名稱：一種固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集γ-氨基丁酸的制備方法
一種固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集Y-氨基丁酸的制備方法技術(shù)領(lǐng)域一種固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集Y-氨基丁酸(GABA)的制備方法，屬于 米糠精深加工技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景稻谷是地球上主要的糧食作物之一，中國素來以"稻米王國"著稱，稻谷 年產(chǎn)量占世界稻谷總產(chǎn)量的35%左右，居世界首位。米糠作為稻谷的副產(chǎn)品， 來源十分豐富，如很好利用，可實(shí)現(xiàn)很高的附加值。米糠中谷氨酸脫羧酶酶活 性很高，可以用來作催化劑，催化味精發(fā)生脫羧反應(yīng)生成GABA。而我國的米 糠資源絕大部分以傳統(tǒng)的飼料形式消費(fèi)掉，十分浪費(fèi)。日本現(xiàn)已有高GABA含量的各種食品在市場中銷售，例如發(fā)芽糙米、GABA 茶、GABA護(hù)膚品、保健品等，并且市場很好，而我國還沒有此類商品上市， 急待我國生產(chǎn)廠商補(bǔ)充國內(nèi)空白。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集GABA的制備方法，利 用健康無毒的海藻酸鈉固定化米糠谷氨酸脫羧酶，所得產(chǎn)品較常規(guī)的直接用米 糠富集GABA所得產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和糖含量大幅下降，僅為后者的1/10，實(shí)現(xiàn) GABA的富集與分離的同步進(jìn)行，省去了GABA的分離成本。并且由于產(chǎn)品雜 質(zhì)含量大為減少，應(yīng)用的范圍更廣。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集Y-氨基丁酸的制備 方法，先將米糠粉碎、過篩，與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合并攪拌均勻，裝 入制球設(shè)備并逐滴滴入CaCl2溶液中成球，硬化球體，清洗多余CaCl2和未被固 定化的米糠，得固定化米糠谷氨酸脫羧酶；將此酶與PBS緩沖溶液混合，并加 入0.05mol/L的谷氨酸鈉作為底物，45'C搖床反應(yīng)得Y-氨基丁酸富集液，烘干即 得廣品；(1) 米糠粉碎、過篩先將米糠進(jìn)行粉碎，要求過60目篩網(wǎng)，以防止較 大顆粒堵住制球設(shè)備的孔眼。原料米糠要新鮮制備，防止陳舊米糠的谷氨酸脫 羧酶酶活力太低。(2) 過篩后米糠與海藻酸鈉溶液混合先配制質(zhì)量濃度為2%的海藻酸鈉溶液，海藻酸鈉溶解完全后加入過篩米糠，使過篩米糠質(zhì)量濃度控制6%，攪拌均勻，得混合液。由于海藻酸鈉溶解性較差，可在溶液溫度低于45"C的條件下加熱攪拌以促進(jìn)溶解，當(dāng)溶解完畢后應(yīng)立即或盡快使用，因海藻酸鈉溶液較長時間放置后易 失去原有的粘稠度，直至不能包裹固定住米糠。米糠和海藻酸鈉溶液應(yīng)充分混 勻再制球，混合越充分，包裹效果越好。(3) 制球配制質(zhì)量濃度為1%-1.5%的CaCl2溶液，保持溶液攪拌流動； 將上步驟(2)的混合液裝進(jìn)制球設(shè)備，保持1滴/s的滴出速度，在距液面10cm 處滴入CaCl2溶液中，立即成球。保持CaCl2溶液攪拌流動速度適當(dāng)，以落入溶液中的球體不相粘連為宜，過 快易使球體破裂；制球設(shè)備的滴出速度保持1滴/s，過快或過慢所成球體均不圓。液滴保持距液面10cm處滴入CaCl2溶液中，立即成球，過高或過低亦影響 球體形狀和固定化效果。(4) 硬化保持CaCl2溶液流動，以使其中的球體懸浮，不需過快或過慢， lh后傾去CaCl2溶液，時間長會降低酶活，lh后傾去CaCl2溶液。嚴(yán)格控制CaCl2 溶液濃度，CaCl2嚴(yán)重影響固定化米糠谷氨酸脫羧酶的酶活，低濃度時球體易 破裂，物理機(jī)械性不夠好，高濃度會強(qiáng)烈抑制酶活。(5) 清洗以等于CaCl2溶液體積的去離子水替換CaCl2溶液，保持?jǐn)嚢瑁?清洗球體，共換三次水，每次攪拌20min;清洗的目的是除去未固定化的米糠， 所述的清洗時間和次數(shù)已足夠，不需額外再加。清洗時需時刻保持球體懸浮，才能洗凈多余的CaCl2，以防抑制酶活。(6) 潤洗將去離子水換為PBS緩沖溶液，保持?jǐn)嚢?，潤洗球體，共換兩 次PBS緩沖溶液，每次攪拌20min，得固定化谷氨酸脫羧酶；潤洗操作即是清 洗的繼續(xù)，又是為反應(yīng)做準(zhǔn)備。此操作需保持球體時刻懸浮。(7) 反應(yīng)以固定化谷氨酸脫羧酶PBS緩沖溶液質(zhì)量比控制為3 : 4的 比例于保溫容器中，按0.01-0.05mol/L的濃度加入谷氨酸鈉，保持?jǐn)嚢璺磻?yīng)，溫 度45'C，反應(yīng)10-13h小時后，得反應(yīng)液；谷氨酸鈉的濃度可以調(diào)節(jié)，0.01-0.05mol/L的濃度均可，高濃度的谷氨酸鈉 可增強(qiáng)酶活，但谷氨酸鈉加入量大；低濃度的谷氨酸鈉酶活增加少，但谷氨酸 鈉加入量少。攪拌速度以所有球體懸浮為宜，過快或過慢均不利于谷氨酸鈉穿 越海藻酸鈣膜，從而降低反應(yīng)速率。反應(yīng)時間可在10-13h內(nèi)調(diào)節(jié)，時間過短GABA產(chǎn)量太低，時間過長米糠中 的GABA轉(zhuǎn)氨酶會引起生成的GABA分解。(8) 烘干除去反應(yīng)液中的水分，即得富集Y-氨基丁酸產(chǎn)品。溫度不宜過 高以防氨基酸分解。所述固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集Y-氨基丁酸的制備方法，原料米糠為新 鮮的第一道米糠；PBS緩沖溶液的配制為0.05mol/L KH2P04和0.05mol/L Na2HP04的混合溶液，pH值為5.6。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明方法制備的富含Y-氨基丁酸產(chǎn)品，在相同Y-氨基丁酸含量條件下，其蛋白質(zhì)含量和糖含量僅為傳統(tǒng)的直接利用米糠富集Y-氨基丁酸法所得產(chǎn)品的1/10，適用范圍更加廣闊。由于雜質(zhì)含量少，可廣泛應(yīng) 用于健康或功能性食品添加劑、保健品、藥品、化妝品等的生產(chǎn)，本發(fā)明方法 設(shè)計科學(xué)合理，對實(shí)現(xiàn)米糠資源的綜合利用和提高其附加值具有重要的意義。
圖1固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集GABA的制備工藝流程示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1稱取20g海藻酸鈉溶解于1L去離子水中，攪拌溶解均勻得海藻酸鈉溶液， 溶液重量作為固定化酶總重之一部分；原料米糠經(jīng)粉碎過60目篩，稱取60g篩 后米糠與溶解好的海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻，裝入制球器，以1滴/s的速度距 液面10cm處滴入1.5%的CaCl2溶液中(盛CaCl2溶液的容器具攪拌裝置，攪拌 速度以溶液中的球體不沉底為宜)，制球。當(dāng)制球結(jié)束后，使顆粒于CaCl2溶液 中攪拌懸浮lh硬化。lh后除去CaCl2溶液，加入與CaCl2溶液等量的去離子水 調(diào)節(jié)繼續(xù)攪拌20min， 20min后換新鮮去離子水重新攪拌，如此用去離子水清洗 球體三次，每次20min，再換用PBS緩沖溶液潤洗球體兩次，每次20min;除去 PBS緩沖溶液得到固定化酶約1.13 kg。將固定化酶加入1.5 L (約1.5 kg) PBS 緩沖溶液，加入13.1g (0.07mol)谷氨酸鈉，保溫45'C攪拌反應(yīng)12h， 12h后除 去固定化酶，干燥反應(yīng)液，得富含GABA產(chǎn)品。實(shí)施例2稱取10g海藻酸鈉溶解于0.5L去離子水中，攪拌溶解均勻得海藻酸鈉溶液， 溶液重量作為固定化酶總重之一部分；原料米糠經(jīng)粉碎過60目篩稱取30g與溶 解好的海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻，裝入制球器，以1滴/s的速度距液面10cm 處滴入1%的CaCl2溶液(盛CaCl2溶液的容器具攪拌裝置，攪拌速度以溶液中 的球體不沉底為宜)中，制球。當(dāng)制球結(jié)束后，使顆粒于CaCV溶液中攪拌懸浮 lh硬化。lh后除去CaCV溶液，加入與CaCl2溶液等量的去離子水調(diào)節(jié)繼續(xù)攪 拌20min， 20min后換新鮮去離子水重新攪拌，如此用去離子水清洗球體三次， 每次20min，換用PBS緩沖溶液潤洗球體兩次，每次20min;除去PBS緩沖溶 液得到固定化酶約0.56kg。將固定化酶加入0.75L (約0.75kg) PBS緩沖溶液， 加入6.55g (0.035mol)谷氨酸鈉，保溫45。C攪拌反應(yīng)12h， 12h后除去固定化 酶，干燥反應(yīng)液，得富含GABA產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1、一種固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集γ-氨基丁酸的制備方法，其特征是先將米糠粉碎、過篩，與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合并攪拌均勻，裝入制球設(shè)備并逐滴滴入CaCl2溶液中成球，硬化球體，清洗多余CaCl2和未被固定化的米糠，得固定化米糠谷氨酸脫羧酶；將此酶與PBS緩沖溶液混合，并加入0.01-0.05mol/L的谷氨酸鈉作為底物，45℃搖床反應(yīng)得γ-氨基丁酸富集液，烘干即得產(chǎn)品；(1)米糠粉碎、過篩先將米糠進(jìn)行粉碎，要求過60目篩網(wǎng)；(2)過篩后米糠與海藻酸鈉溶液混合先配制質(zhì)量濃度為2％的海藻酸鈉溶液，海藻酸鈉溶解完全后加入過篩米糠，使過篩米糠質(zhì)量濃度控制6％，攪拌均勻，得混合液；(3)制球配制質(zhì)量濃度為1％的CaCl2溶液，保持溶液攪拌流動；將上步驟(2)的混合液裝進(jìn)制球設(shè)備，保持1滴/s的滴出速度，在距液面10cm處滴入CaCl2溶液中，立即成球；(4)硬化保持CaCl2溶液流動，以使其中的球體懸浮，1h后傾去CaCl2溶液；(5)清洗以等于CaCl2溶液體積的去離子水替換CaCl2溶液，保持?jǐn)嚢瑁逑辞蝮w，共換三次水，每次攪拌20min；(6)潤洗將去離子水換為PBS緩沖溶液，保持?jǐn)嚢?，潤洗球體，共換兩次PBS緩沖溶液，每次攪拌20min，得固定化谷氨酸脫羧酶；(7)反應(yīng)以固定化谷氨酸脫羧酶∶PBS緩沖溶液質(zhì)量比控制為3∶4的比例于保溫容器中，按0.01-0.05mol/L的濃度加入谷氨酸鈉，保持?jǐn)嚢璺磻?yīng)，溫度45℃，反應(yīng)12小時后，得反應(yīng)液；(8)烘干除去反應(yīng)液中的水分，即得富集γ-氨基丁酸產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集Y-氨基丁酸的制備方 法，其特征是原料米糠為新鮮的第一道米糠；PBS緩沖溶液的配制為0.05mol/L KH2P04和0.05mol/L Na2HP04的混合溶液，pH值為5.6。
全文摘要
一種固定化米糠谷氨酸脫羧酶富集γ-氨基丁酸的制備方法，屬于米糠精深加工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以稻谷加工后的副產(chǎn)物-米糠為原料，經(jīng)粉碎、過篩、與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合并攪拌均勻，裝入制球設(shè)備并逐滴滴入CaCl<sub>2</sub>溶液中成球，硬化球體，清洗多余CaCl<sub>2</sub>和未被固定化的米糠，得固定化米糠谷氨酸脫羧酶；將此酶與PBS緩沖溶液混合，并加入0.01-0.05mol/l的谷氨酸鈉作為底物，45℃搖床反應(yīng)得γ-氨基丁酸富集液，烘干即得產(chǎn)品；其蛋白質(zhì)含量和糖含量僅為傳統(tǒng)的直接利用米糠富集γ-氨基丁酸法所得產(chǎn)品的1/10，可作為功能性食品添加劑使用，具有降血壓、鎮(zhèn)靜、助眠、保肝等功效。本發(fā)明方法設(shè)計科學(xué)合理，對實(shí)現(xiàn)米糠資源的綜合利用和提高其附加值具有重要的意義。
文檔編號C12N11/04GK101265487SQ20081002513
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月24日
發(fā)明者姚惠源, 暉 張, 立 王, 郭曉娜, 馬曉博 申請人:江南大學(xué)