專利名稱：：一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因的尋找方法，具體是指涉及一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法。技術(shù)背景高血壓病是最常見的心血管疾病之一，在我國3575歲成年人其發(fā)病率高達(dá)27.2%，男性(28.6%)略高于女性(25.8%)。高血壓病作為一種嚴(yán)重危害老年人健康并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢的常見多發(fā)的疾病，它是導(dǎo)致腦血管意外、冠狀動脈疾病、外周血管疾病和進(jìn)行性腎臟損害的重要危險因素，但其發(fā)病機(jī)理不明。根據(jù)近幾年國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果表明高血壓病是一種整合基因因素和環(huán)境因素(鈉鹽，酒精過量和肥胖)的疾病，因此高血壓病一般可分為原發(fā)性高血壓病和繼發(fā)性高血壓病，而原發(fā)性高血壓病有很強(qiáng)的遺傳傾向，尤其家族聚集性高血壓患者有很強(qiáng)的遺傳傾向，可參見MunroePB,CaulfielddM:.geneticsofhypertension.CurrentOpinioninGenetics&2000,10:325-329;O'shaughnessyKM:Thegeneticsofessentialhypertension.BrJClinPharmacol2000,51:5-11。有研究認(rèn)為，30%到50%的原發(fā)性高血壓可能都具有遺傳性，可參見DominiczakAF，NegrinDC,ClarkJS，etal.Genesandhypertension:fromgenemappinginexperimentalmodelstovasculargenetransferstrategies.Hypertension,2000,35(lPt2):164-172。在國外已完成了一些已知基因(如血管緊張素II、血管緊張素受體、腎素、激肽、G蛋白信號2調(diào)節(jié)基因及心鈉素等)在動物體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)或基因敲除研究，可參見BaderM,etal:Transgenicanimalsincardiovasculardiseaseresearch.Exp.Physiol2000,85(6):713-7311;RiddleEL，RanaBK，MurthyKK，etal:PolymorphismsandHaplotypesoftheRegulatorofGProteinSignaling-2GeneinNormotensivesandHypertensives.2006，47(3):415-20.11;GelbanddCH,etal:CurrentPerspectivesontheUseofgeneTherapyforHypertension.C7rc2000,87:1118-1122。高血壓病的基因治療也已拉開序幕，如過度表達(dá)舒張血管基因(心鈉素，血管舒緩素，內(nèi)皮一氧化氮合成酶)等，及敲除血管緊張素原，血管緊張素II受體，中性肽鏈內(nèi)切酶等基因，可參見WangT,LiH，ZhaoC，etal:Recombinantadeno-associatedvirus-mediatedkallikreingenetherapyreduceshypertensionandattenuatesitscardiovascularinjuries.2004S?。?1(17):1342-50;ZhaoC,WangP，XiaoX,etal:Genetherapywithhumantissuekallikreinreduceshypertensionandhyperinsulinemiainfructose-inducedhypertensiverats.Hypertension.2003Nov;42(5):1026-33。但是，目前醫(yī)學(xué)界對高血壓病發(fā)病機(jī)理及基因調(diào)控仍不清楚，其發(fā)病屬于單基因還是多基因仍有爭議。因此，如果能夠獲知更多與高血壓病致病相關(guān)基因，無疑對建立新的高血壓診斷方法以及開發(fā)高血壓病新的基因治療藥物具有非常重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容為了探討高血壓病的發(fā)病機(jī)理，尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因，也為建立新的高血壓診斷方法和開發(fā)高血壓病新的基因治療藥物打下基礎(chǔ)，本發(fā)明的目的是提供了一種穩(wěn)定可靠的尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是包括以下步驟(1)、試驗組和對照組的選取以及組織采集選取至少三只純種患有自發(fā)性高血壓病哺乳動物作為試驗組，選擇與試驗組同物種且數(shù)量相同的血壓正常的哺乳動物作為對照組，并分別對試驗組和對照組中的哺乳動物的阻力血管組織和腎臟組織進(jìn)行采集；(2)、總RNA和mRNA的提取分別從試驗組和對照組中采集到的阻力血管組織和腎臟組織中提取總RNA并進(jìn)一步分離提取mRNA;(3)、mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:分別將試驗組和對照組中提取的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;(4)、利用基因芯片法初步篩選有差異表達(dá)的候選基因利用至少含IO，OOO大鼠基因的表達(dá)譜芯片比較試驗組和對照組的基因表達(dá)情況，尋找出基因表達(dá)水平上調(diào)的一組候選基因和下調(diào)的一組候選基因；基因芯片法能一次性對大鼠10,000個基因進(jìn)行篩選，操作成本相對較低，效率高。(5)、對候選基因采用RT-PCR進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增并對鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析排除掉基因芯片法獲得的候選基因中的假陽性基因分別對試驗組和對照組候選基因的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄DNA合成酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并對cDNA進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，然后再對鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析排除掉假陽性的候選基因；(6)、對經(jīng)過RT-PCR排除后剩下的候選基因采用熒光實時定量RT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步驗證得到與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因。本方案對試驗組和對照組的阻力血管組織和腎臟組織進(jìn)行采集，并通過基因芯片法、RT-PCR、實時定量RT-PCR逐次篩選驗證，排出假陽性的候選基因，來獲得與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因，另外選用阻力血管組織和腎臟組織作為采集組織使得篩選結(jié)果更加可靠進(jìn)一步設(shè)置是所述的試驗組選用3只13周齡的自發(fā)性高血壓大鼠，所述的對照組選用三只13周齡的正常大鼠。本設(shè)置選用13周齡自發(fā)性高血壓大鼠和13周齡的正常大鼠作為試驗組和對照組不僅成本便宜，自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和非高血壓正常大鼠(WKY)因遺傳因素簡單，環(huán)境因素可嚴(yán)格控制，能夠比較有效地排出干擾。進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟4為用Cy3-dUTP標(biāo)記試驗組總RNA，用Cy5-dUTP標(biāo)記對照組總RNA,再對標(biāo)記過的試驗組和對照組中的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備兩組cDNA探針，將含10,000個大鼠基因表達(dá)譜芯片和探針分別在95"C水浴中變性5分鐘，將探針加在大鼠表達(dá)譜芯片上，用蓋玻片封片，置于42"C雜交12-20小時，沖洗蓋玻片，洗滌10分鐘，室溫晾干，再通過基因芯片讀片儀進(jìn)行掃描分析。進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟5為通過Oligo引物法分別將試驗組和對照組的含候選基因的mRNA片段逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以候選基因為模板設(shè)計上、下游引物，并經(jīng)Blast驗證，內(nèi)參照基因選用GAPDH基因，其上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，；下游引物5，-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，并分別按下列條件進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增在9(TC一10(TC變性0.5分鐘，然后在55'C—60。C退火0.5分鐘，然后在65。C一75。C延伸1分鐘，根據(jù)不同基因做18、22、26、30、34個循環(huán)，最后在65°C—75。C延伸10min，取出反應(yīng)管置于4'C下10分鐘，然后將鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物在含醫(yī)用染料的2%瓊脂糖凝膠上電泳，并對電泳成像圖結(jié)果進(jìn)行攝像，并以看家基因GAPDH為內(nèi)參照比對，排除掉假陽性的候選基因。進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟6為分別對試驗組和對照組中含經(jīng)過RT-PCR排除后留下的候選基因的mRNA進(jìn)行熒光實時定量RT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步驗證，反應(yīng)體系為10SYBRGreenPCR緩沖液13ul、5pmo1引物1ul、cDNA模板+雙蒸水11ul共25ul，5(TC孵育2分鐘，然后95i:水浴變性2分鐘;接著進(jìn)行40個循環(huán)95"C下變性15秒再59t下孵育l-3分鐘。進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟6分別對試驗組和對照組的mRNA做至少3次條件完全相同的PCR反應(yīng)孔。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過對試驗組和對照組的阻力血管組織和腎臟組織進(jìn)行采集，并通過基因芯片法、RT-PCR、實時定量RT-PCR逐次篩選驗證，排出假陽性表達(dá)的候選基因，比較可靠穩(wěn)定地尋找到與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因，并且本發(fā)明選用阻力血管組織和腎臟組織作為組織采集對象，使尋找到的基因更加可靠，另外本發(fā)明尋找與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，對建立新的高血壓診斷方法以及開發(fā)高血壓病新的基因治療藥物具有非常重要的意義。下面結(jié)合說明書附圖和具體實施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。說明書附1本發(fā)明具體實施方式流程圖具體實施方式如圖1所示的本發(fā)明的具體實施方式，包括以下步驟(1).試驗組和對照組的選取以及組織采集選取三只13周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為試驗組，選取三只13周齡的正常大鼠(WKY)作為對照組，并分別對試驗組和對照組的大鼠的阻力血管組織和腎臟組織進(jìn)行采集。本步驟中自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)源于東京遠(yuǎn)交系Wistar大鼠，1963年由0kamoto培育。用群體動物中患有自發(fā)性高血壓的雄鼠與一只血壓升高的雌鼠交配繁殖，之后進(jìn)行兄妹連續(xù)交配，以獲得自發(fā)性高血壓動物模型。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和非高血壓正常大鼠(WKY)因遺傳因素簡單，環(huán)境因素可嚴(yán)格控制，是被最為廣泛應(yīng)用的高血壓研究動物模型，可參見(OkamotoK,AokiK.Developmentofastrainofspontaneouslyhypertensiverats.JpnCircJ，1963，27:282—293)。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的高血壓及終末器官的損害和人類相似，可參見(McBrideMW，CharcharFJ,GrahamD,etal.Functionalgenomicsinrodentmodelsofhypertension.JPhysiol，2004;554:56—63，MuellerPW,HallWD),(CaudillSP，etal.Anin-depthexaminationoftheexcretionofalbuminandothersensitivemarkersofrenaldamageinmildhypertension.AmJHypertens,1995,8:1072-1082)。另外，動物隨年齡的增加，血壓模式和外周血液動力學(xué)發(fā)生改變，高血壓的患病率增加，除了環(huán)境因素的影響外，內(nèi)源性的因素可能也伴隨著年齡的增加而影響血壓，可參見(FranklinSS，LarsonMQKhanSA，etal.DoestherelationofbloodpressuretocoronaryheartdiseaseriskchangewithagingTheframinghamheartstudy.Circulation,2001，103:1245—1249)、(SafarME,LevyBI，andStruijker-BoudierH.Currentperspectivesonarterialstiffiiessandpulsepressureinhypertensionandcardiovasculardiseases.Circulation,2003,107:2864-2869.)。既往有基因芯片法研究過自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的3周、4周、9周和22周的腎或平滑肌細(xì)胞的基因表達(dá)水平，可參見(Ja-RyongKoo,KaiHuiLiang，NosratolaDVaziri.MicroarrayAnalysisofAlteredGeneExpressioninKidneysofAdultSpontaneouslyHypertensiveRats.JApplres,2004，4(1):111-126.)、(HuWY,FukudaN，KanmatsuseK.Growthcharacteristics,angiotensinIIgeneration,andmicroarray曙determinedgeneexpressioninvascularsmoothmusclecellsfromyoungspontaneouslyhypertensiverats.JHypertens,2002,20(7):1323-1333.)，而自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的13周是高血壓形成進(jìn)展期，但耙器官還未出現(xiàn)明顯損害，因此本發(fā)明采用了13周齡的S服為試驗對象具有更好的穩(wěn)定性和借鑒意義。另外腎臟和高血壓密切相關(guān)，最有說服力的證據(jù)主要來自近30年的臨床或?qū)嶒炐缘哪I臟移植結(jié)果。在正常血壓者移植了遺傳性高血壓患者的腎臟，則會發(fā)生高血壓，而在遺傳性高血壓患者移植了正常血壓人的腎臟，則血壓會下降，可參見(GuidiE,MenghettiD,MilaniS,etal.Hypertensionmaybetransplantedwiththekidneyinhumans:along-termhistoricalprospectivefollow-upofrecipientsgraftedwithkidneyscomingfromdonorswithorwithouthypertensionintheirfamilies.JAmSocNephrol,1996，7:113l-l138.)、(SmallegangeC，KlineRL，AdamsMA.TransplantationofenalapriltreatedkidneysconferspersistentloweringofarterialpressureinSHR.Hypertension,2003,42:932-936.)，另一方面，在人的各型高血壓或各種高血壓動物模型中外周血管阻力均增加，腸系膜二、三級動脈代表外周阻力血管,其在高血壓形成中起重要作用。因此本發(fā)明采用阻力血管組織(腸系膜二、三級動脈)和腎臟組織作為mRNA的采集對象。(2)、總RNA和mRNA的提取分別從試驗組和對照組中采集到的阻力血管組織和腎臟組織中提取總RNA并進(jìn)一步分離提取mRNA;本步驟直接采用試劑盒來提前RNA，本實施方式采用QIANEN公司生產(chǎn)的提取總RNA試劑盒來提取總RNA，然后再用GIBCO公司生產(chǎn)的提取mRNA試劑盒從總RNA中分離提取mRNA。(3)、mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:分別將試驗組和對照組中提取的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;本實施方式該步驟采用GIBCO公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄DNA合成酶，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。(4)、利用基因芯片法初步篩選有差異表達(dá)的候選基因Cy3-dUTP標(biāo)記試驗組總RNA，Cy5-dUTP標(biāo)記對照組總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄制備兩組cDNA探針，將含10,000個大鼠基因表達(dá)譜芯片和探針分別在95"C水浴中變性5分鐘，本實施方式采用含10,000個大鼠基因表達(dá)譜芯片，將探針加在所述的大鼠表達(dá)譜芯片上，用蓋玻片封片，置于42r雜交16小時，沖洗蓋玻片，洗滌10分鐘，室溫晾干，再通過基因芯片讀片儀進(jìn)行掃描分析，本實施方式所述的基因芯片讀片儀采用Axon公司的GenePix4100，并用GenePixPro4.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強(qiáng)度和比值。經(jīng)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化后，用以下2個條件為判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)①Cy3和Cy5信號比值>2.0為表達(dá)上調(diào)，<0.5為表達(dá)下調(diào)，0.52.0為不存在顯著表達(dá)差異。②Cy3和Cy5信號值其中之一必須大于200或其中之一大于800及Cy5/Cy3在0.110之間，作為判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。通過分析比較試驗組中與對照組的基因表達(dá)情況，尋找到基因表達(dá)水平上調(diào)的一組基因和下調(diào)的一組基因，均定義為候選基因，如表1、表2所示:表l利用基因芯片的方法獲得的SHR下調(diào)基因基因庫標(biāo)識基因名稱下調(diào)倍數(shù)NM一139192stearoyl-CoenzymeAdesaturase121U05341p55CDC2.17NM—021909FXYDdomain-containingiontransportregulator52.33XM—131732similartohypotheticalproteinDJ159A19.32.21NM一012797InhibitorofDNAbinding1,helix-loop-helixprotein2.01NM一053907deoxyribonucleaseI-like33.66M18854RatT-cellreceptoractivebeta-chainC-regionmRNA15.63羅—017014Glutathione-S-transferase,tnutype23.22NM」31902Cyclindependentkinaseinhibitor2C2.82L22653Ratanti-acetylcholinereceptorantibodygene,kappa-chain10.59NM一017165glutathioneperoxidase42.05AB028626mRNAforR-rasGTPaseactivatingprotein2NM一016698ringfingerprotein1014.04AF343581RanBp21mRNA2.13NM一O19292carbonicanhydrase313.37BC022167nuclearprotein952.32麗—013191S100calcium-bindingprotein,beta2.38NM一017332fattyacidsynthase2.38XM一131329similartoMitogen-activatedproteinkinasekinasekinase75.85表2利用基因芯片的方法獲得的SHR上調(diào)的基因基因文庫標(biāo)識基因名稱上調(diào)倍數(shù)U40652tyrosinephosphatase-likeproteinIA-2amRNA3.812畫一l30744stellatecellactivationassociatedprotein3.036NM—017116calpain23.029顧—031822nuclearreceptorcoactivator23.022AY090783platelet-derivedgrowthfactorreceptorbeta2.596畫—024369follistatin-relatedproteinprecursor2.399AF139830insulin-likegrowthfactorbindingprotein52.535NM—053583Olf-l/EBFassociatedZnfingerproteinRoaz2.35NM—030856neuronalleucine-richrepeatprotein-32.246X72859mRNAfortropomyosinisoform62.227NM053582glucocorticoid-inducibleprotein2.225NM—021587NM—022948NM—017064Z75029transforminggrowthfactor-betatricarboxylatecarrier-likeproteinSignaltransducerandactivatoroftranscription5ahsp70.2mRNAforheatshockprotein70Proteolipidproteinvascularendothelialgrowthfactorgenesolutecarrierfamily7A8Musmusculuscofilin22.1572.1512.1352.1062.092.0762.0272.02NM_030990U22372NM—053442XM122409(5)、對候選基因采用RT-PCR進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增并對鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析排除掉假陽性的候選基因通過OligO引物法分別將試驗組和對照組的含候選基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以各個候選基因為模板設(shè)計上、下游引物，本實施方式采用引物設(shè)計軟件Premier5.0和Oligo6.71進(jìn)行引物設(shè)計，并經(jīng)Blast驗證，內(nèi)參照基因選用GAPDH基因，其上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';下游弓l物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，并分別按下列條件進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增在90。C一100。C變性0.5分鐘，然后在55。C一60。C退火0.5分鐘，然后在65。C一75X:延伸l分鐘，根據(jù)不同基因做18、22、26、30、34個循環(huán)，基因的豐度越高，表達(dá)數(shù)越多，需要的PCR循環(huán)數(shù)越少。所以，不同的基因，需要做的循環(huán)數(shù)不同，最后在65'C—75'C延伸10min，取出反應(yīng)管置于4'C下10分鐘，然后將鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物在含醫(yī)用染料的2%瓊脂糖凝膠上電泳，并對電泳成像圖結(jié)果進(jìn)行攝像，本實施方式采用美國PharmaciaBiotech凝膠成像系統(tǒng)對圖像結(jié)果進(jìn)行攝像，并以看家基因GAPDH為內(nèi)參照比對，排除掉假陽性的候選基因。經(jīng)過本步驟排除掉一些假陽性表達(dá)的候選基因，剩余的候選基因如表3所示表3RT-PCR驗證后的候選基因列表<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>(6)、對經(jīng)過RT-PCR排除后剩下的候選基因采用熒光實時定量RT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步驗證得到與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因，分別對試驗組和對照組中含經(jīng)過RT-PCR排除后留下的候選基因的mRNA進(jìn)行熒光實時定量RT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步驗證，反應(yīng)體系10SYBRGreenPCR緩沖液13ul、5pmo1引物1ul加cDNA模板+雙蒸水11ul共25ul，5(TC孵育2分鐘，然后95。C，2分鐘;接著進(jìn)行40個循環(huán)95°C，15秒；59'C，1分鐘。本實施方式本步驟采用實時定量RT-PCR儀(ABIPrism7000)來完成，且分別對試驗組和對照組的RNA做至少3次條件完全相同的PCR反應(yīng)孔。最終確定與自發(fā)性高血壓致病相關(guān)基因，如表4所示，表4定量RT-PCR驗證的自發(fā)性高血壓致病相關(guān)基因<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>權(quán)利要求1.一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，其特征是包括以下步驟(1)、試驗組和對照組的選取以及組織采集選取至少三只純種患有自發(fā)性高血壓病的哺乳動物作為試驗組，選擇與試驗組同物種且數(shù)量相同的血壓正常的哺乳動物作為對照組，并分別對試驗組和對照組中的哺乳動物的阻力血管組織和腎臟組織進(jìn)行采集；(2)、總RNA和mRNA的提取分別從試驗組和對照組中采集到的阻力血管組織和腎臟組織中提取總RNA并進(jìn)一步分離提取mRNA；(3)、mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA分別將試驗組和對照組中提取的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；(4)、利用基因芯片法初步篩選有差異表達(dá)的候選基因利用至少含10,000大鼠基因片段的芯片比較試驗組和對照組的基因表達(dá)水平，尋找出在試驗組基因表達(dá)水平上調(diào)的一組候選基因和下調(diào)的一組候選基因；(5)、對候選基因采用RT-PCR進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增并對鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析排除基因芯片法獲得的候選基因中的假陽性基因分別對試驗組和對照組候選基因的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄DNA合成酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并對cDNA進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，然后再對鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析排除假陽性的候選基因；(6)、對經(jīng)過RT-PCR排除后剩下的候選基因采用熒光實時定量RT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步驗證得到與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，特征在于所述的試驗組選用三只13周齡的自發(fā)性高血壓大鼠，所述的對照組選用三只13周齡的正常大鼠。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，其特征在于所述的步驟4為使用Cy3-dUTP標(biāo)記試驗組總RNA，使用Cy5-dUTP標(biāo)記對照組總RNA，再對標(biāo)記過的試驗組和對照組中的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備兩組cDNA探針，將含io,ooo個大鼠基因表達(dá)譜芯片和探針分別在95t:水浴中變性5分鐘，將探針加在大鼠表達(dá)譜芯片上，用蓋玻片封片，置于42"C雜交12-20小時，沖洗蓋玻片，洗滌，室溫晾干，再通過基因芯片讀片儀進(jìn)行掃描分析。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，其特征在于所述的步驟5為通過Oligo引物法分別將試驗組和對照組的含候選基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以候選基因為模板設(shè)計上、下游引物，并經(jīng)Blast驗證，內(nèi)參照基因選用GAPDH基因，其上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3';下游弓l物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，并分別按下列條件進(jìn)行鏈?zhǔn)綌U(kuò)增在90。C一100。C變性0.5分鐘，然后在55。C—60'C退火0.5分鐘，然后在65。C—75'C延伸l分鐘，根據(jù)不同基因做18、22、26、30、34個循環(huán)，最后在65'C—75。C延伸10min，取出反應(yīng)管置于fC下10分鐘，然后將鏈?zhǔn)綌U(kuò)增產(chǎn)物在含醫(yī)用染料的2%瓊脂糖凝膠上電泳，并對電泳成像圖結(jié)果進(jìn)行攝像，并以看家基因GAPDH為內(nèi)參照比對，排除掉假陽性的候選基因。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，其特征在于所述的步驟6為分別對試驗組和對照組中含經(jīng)過RT-PCR排除后留下的候選基因的mRNA進(jìn)行熒光實時定量RT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步驗證，反應(yīng)體系為10SYBRGreenPCR緩沖液13ul、5pmol引物lul、cDNA模板+雙蒸水11ul共25ul，5(TC孵育2分鐘，然后95"C水浴變性2分鐘;接著進(jìn)行40個循環(huán)95"C下變性15秒再59'C下孵育1-3分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，其特征在于所述的步驟6分別對試驗組和對照組的RNA做至少3次條件完全相同的PCR反應(yīng)孔。全文摘要本發(fā)明公開了一種尋找自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，對試驗組和對照組的阻力血管組織和腎臟組織進(jìn)行采集，并通過基因芯片法、RT-PCR、實時定量RT-PCR逐次篩選驗證，排出假陽性的候選基因，來獲得與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過對試驗組和對照組的阻力血管組織和腎臟組織進(jìn)行采集，并通過基因芯片法、RT-PCR、實時定量RT-PCR逐次篩選驗證，排出假陽性表達(dá)的候選基因，比較可靠穩(wěn)定地尋找到與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因，并且本發(fā)明選用阻力血管組織和腎臟組織作為組織采集對象，使尋找到的基因更加可靠，另外本發(fā)明尋找與自發(fā)性高血壓病致病相關(guān)基因的方法，對建立新的高血壓診斷方法以及開發(fā)高血壓病新的基因治療藥物具有非常重要的意義。文檔編號C12Q1/68GK101265499SQ20081002357公開日2008年9月17日申請日期2008年4月8日優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日發(fā)明者楊德業(yè)申請人:楊德業(yè)