專利名稱：一種制備重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生物信息學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體涉及用pHsh表達(dá)系統(tǒng)制備重組耐熱e -葡萄糖醛酸酶，以及應(yīng)用重組耐熱e -葡萄糖醛酸酶制備甘草次酸的方法。
背景技術(shù)：
e-葡萄糖醛酸酶降解甘草酸產(chǎn)生甘草次酸或者單葡萄糖醛酸甘草次酸(Takashi K. Microbial production of glycyrrhetic acid 3-0-mono-卩-D-glucuronide from glycyrrhizin by cryptococcus magnus MG-27.Biosci Biotech Biochem, 1994, 58: 455-458)。國內(nèi)外學(xué)者對于e-葡萄糖醛酸酶的研究注重于(1)甘草酸到甘草 次酸或者單葡萄糖醛酸甘草次酸的轉(zhuǎn)化途徑的研究，以及甘草酸、甘草次酸的藥 理及其生理功能；(2)對e-葡萄糖醛酸酶在腫瘤、癌癥中作用機(jī)理的研究，或 在植物中作報(bào)告基因的研究，有些學(xué)者克隆該酶基因傳染真核生物，獲得高酶活 的表達(dá)(馮世江,定向合成GAMG的菌株篩選及其催化特性的研究.石河子大學(xué)碩 士學(xué)位論文,2006)。目前，以P-葡萄糖醛酸酶作為生物催化劑為目的的研究較 少，研究報(bào)道僅見于魚紅閃，吳少杰，馮世江，李春研究組和TakashiKuramoto， TaikoAkao等國內(nèi)外學(xué)者。但是這些研究中所選用的基因都來自常溫生長的微生 物，所產(chǎn)生的酶熱穩(wěn)定性低，使用壽命短，不利于工業(yè)化應(yīng)用。海棲熱袍菌(77 e^ra om^ 7H3ri"y^)是一種生長在55 9(TC的海底火山口 附近、嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌。海棲熱袍菌產(chǎn)生的e-葡萄糖醛酸酶(GenBankNO. NC—000853)具有很好的熱穩(wěn)定性(RoberH， Thomas L, Helmut a/. 7Tze "wc^oga mafnY/Twa sp.nov. represents a new genus of unique extremely thermophilic eubacteria growing up 90 °C. Arch Microbiol' 1986,144 :324 - 333)，但 是來源于嗜熱微生物的基因在大腸桿菌等常溫菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)表達(dá)水平通常較 低。HamzahM. Salleh等運(yùn)用pET28a載體在大腸桿菌中對海棲熱袍菌e _葡萄糖 醛酸酶基因進(jìn)行表達(dá)，只能獲得大約5 mg/L蛋白。因此，對于該酶的開發(fā)利用 至關(guān)重要的研究是采用高效率的熱激載體進(jìn)行基因表達(dá)，并對目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn) 誘變，從而獲得高效低成本的制備方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種用pHsh表達(dá)系統(tǒng)制備重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶的方法。我們使用高效表達(dá)載體pHsh，對耐熱P -葡萄糖醛酸酶基因進(jìn)行高效表達(dá)，并通過基因定向改造改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了 P -葡萄糖醛酸酶基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。從而獲得了產(chǎn)量高，成本低，易于純化的生產(chǎn)重組耐熱e-葡萄糖酸酸酶的方法。熱激表達(dá)載體pHsh是由大腸桿菌sigma32因子識(shí)別和 調(diào)控的質(zhì)g，通過熱激誘導(dǎo)，可以避免使用化學(xué)誘導(dǎo)劑。具有本底表達(dá)底，重組 蛋白產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)(Shao, Weilan, Huawei Wu， Jianjun Pei. A novel expression vector system regulated by cj32 and methods for using it to produce recombinant protein, US Patent Application No. 11/614,626 (Represented by BAKER Donelson))。所說的重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶的制備方法，其特征在于，用表達(dá)載體pHsh表達(dá)耐熱e-葡萄糖醛酸酶基因或其突變體，得到重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶；具體方法步驟如下(1) 將耐熱e -葡萄糖醛酸酶基因插入基因表達(dá)載體pHsh，構(gòu)建成耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒pHsh-bg;(2) 對耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒pHsh-bg中的mRNA翻譯起始區(qū)潛 在的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析，并通過基因誘變打破mRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、降低自 由能，得到優(yōu)化的重組質(zhì)粒；(3) 用耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒或優(yōu)化的耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得基因工程菌，并在基因工程菌的生長過程中進(jìn)行熱激誘 導(dǎo)，使耐熱f3-葡萄糖醛酸酶得到表達(dá)；(4) 收集細(xì)胞，破壁并離心獲得粗酶液；(5) 對上述粗酶液中的重組酶進(jìn)行純化得到純化的重組耐熱e -葡萄糖醛酸酶。上述步驟(i)中所說的耐熱e-葡萄糖醛酸酶基因，可以從海棲熱袍菌中提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增獲得。海棲熱袍菌基因組的DNA的提取和PCR 擴(kuò)增等基因操作均按《分子克隆手冊》第三版上的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrookand Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。上述步驟(2)中所述的基因誘變方法是對海棲熱袍菌的e-葡萄糖醛酸酶的基因設(shè)計(jì)改變基因內(nèi)部堿基的突變引物為，引物l: 5'-aggagatataaacatggtaaga ccgcaacgaaa-3，, 弓l斗勿2: 5，-tcttgtcaacaattaacaggtcattggatcatgg-3，,以耐實(shí)為P —葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒為模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變，得到優(yōu)化的耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì) 粒。上述步驟(3)中所述的大腸桿菌可以是大腸桿菌菌株K12或其衍生菌株， 大腸桿菌菌株K12的衍生菌株是JM109, BL21或DH5a等。上述步驟(4)中所述的純化方法可以用超聲波破碎細(xì)胞后，75'C處理lh， 離心得到的重組耐熱P -葡萄糖醛酸酶。上述步驟(3)中所述的熱激誘導(dǎo)方法參見專利文獻(xiàn)中國發(fā)明專利 ZL200410065776.8。通過本發(fā)明方法得到的重組耐熱e -葡萄糖醛酸酶應(yīng)用于甘草次酸制備的方法是將重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶作為催化劑，催化甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸的反應(yīng)。本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1) 本發(fā)明首次使用表達(dá)載體pHsh對耐熱P-葡萄糖醛酸酶基因進(jìn)行高效 表達(dá),可獲得高達(dá)280 mg/L蛋白。(2) 本發(fā)明中，耐熱e-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒可以在原位對基因進(jìn)行定 點(diǎn)突變和定向改造，使mRNA的序列得到優(yōu)化，從而進(jìn)一步提高耐熱e-葡萄糖 醛酸酶在pHsh中的表達(dá)水平。0 -葡萄糖醛酸酶的活性測定和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果表明經(jīng)優(yōu)化的耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)水平提高30%。(3) 用本發(fā)明的方法生產(chǎn)耐熱e-葡萄糖醛酸酶，能夠收到產(chǎn)量高，成本 低，重組酶易于純化，有利于工業(yè)化發(fā)酵等有益效果。
圖1為重組耐熱P -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒pHsh-bg的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，表明海棲熱袍菌耐熱e -葡萄糖醛酸酶在大腸桿菌中高效表達(dá)及經(jīng)熱處理達(dá)到的純化效果。M:分子標(biāo)記；1:空載pHsh表達(dá)載體；2:高效表達(dá)后的細(xì)胞提取液；3: 75'C熱處理10 min后的酶液；4: 75'C熱處理1 h后純化的酶液。圖3為標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，其中1為甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品；2為甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品。圖4為酶轉(zhuǎn)化液的高效液相色譜圖，其中2為酶法轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的甘草次酸。
具體實(shí)施方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。 應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范 圍。在以下的實(shí)施例中，海棲熱袍菌購于美國菌種保藏中心(貨號ATCC43589)。 海棲熱袍菌的培養(yǎng)見參考文獻(xiàn)(Yu Jiang et al.， FEMS Microbiol Lett 2006， 259: 254-259 )。所用的質(zhì)粒pHsh的來源或制備參見(Shao， Weilan， Huawei Wu， Jianjun Pei. A novel expression vector system regulated by a32 and methods for using it to produce recombinant protein, US Patent Application No. 11/614,626)。實(shí)施例中未詳細(xì)描述的各禾中 過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列 出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例i:海棲熱袍菌e-葡萄糖醛酸酶基因高效表達(dá)及應(yīng)用(1) 按常規(guī)方法培養(yǎng)海棲熱袍菌，從海棲熱袍菌中提取基因組DNA;按照已知的耐熱P-葡萄糖醛酸酶基因(GenBank NO. NC—000853)設(shè)計(jì)引物，以海 棲熱袍菌的基因組DNA為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到耐熱e-葡 萄糖醛酸酶的原始基因；其中基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增等基因操作按《分 子克隆手冊》第三版上的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook and Russell， 2001, CSHLpress, Cold Spring Harbor, New York),引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合 成；基因操作所用的工具酶購自寶生物工程(大連)有限公司。對PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物和載體pHsh分別進(jìn)行酶切和純化后，用T4DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿 菌得到重組表達(dá)質(zhì)粒pHsh-bg (圖1)。(2) 對來源于海棲熱袍菌的耐熱3 -葡萄糖醛酸酶基因的mRNA翻譯起始 區(qū)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析，通過定點(diǎn)突變和定向改造對其進(jìn)行優(yōu)化。以重組表達(dá) 質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)的突變引物為弓I物1: 5 ， -aggagatata^catggtaagaccgcaacgaaa-3 ，, 弓I物2: 5 ，陽tcttgtcgac巡ttaacaggtcattggatcatgg-3 ，，其中，下劃線表示突變位點(diǎn)。以重組表達(dá)質(zhì)粒為模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變，得到優(yōu) 化的耐熱e-葡萄糖醛酸表達(dá)質(zhì)粒，基因定點(diǎn)誘變方法可參照《分子克隆手冊》第三版上的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。(3) 基因表達(dá)用耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)?；騼?yōu)化的耐熱e -葡萄糖酸酸酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入含100ug/mL氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng) 基，37'C培養(yǎng)過夜后，按1 %轉(zhuǎn)接到200 mL含100 ug/mL Amp的LB培養(yǎng)液中 繼續(xù)培養(yǎng)。OD6()()達(dá)到0.8左右時(shí)，將菌種接入裝有3 L含100 ug/mL Amp的 TB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐A，于3(TC培養(yǎng)至OZ)6(K) 0.8左右，將發(fā)酵罐A中的培養(yǎng)液 注入裝有1 L同樣培養(yǎng)基的預(yù)熱至42卩的發(fā)酵罐B中(熱激方法參見專利文獻(xiàn): 中國發(fā)明專利ZL 200410065776.8)，繼續(xù)培養(yǎng)9個(gè)小時(shí)左右。(4) 重組酶的純化和分析 熱激誘導(dǎo)表達(dá)完成后離心收集細(xì)胞，用50mM的Tris-HCl緩沖液重懸，用超聲波破碎細(xì)胞后，75'c熱處理ih，離心獲得可溶性的重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶。P -葡萄糖醛酸酶的活性測定和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果(圖2) 表明，經(jīng)優(yōu)化的耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)水平提高30%。(5) 重組酶在甘草次酸制備中的應(yīng)用將純化過的重組耐熱e -葡萄糖醛酸酶用作催化劑，將甘草酸水解為甘草次酸，反應(yīng)條件為7(TC，反應(yīng)使用的緩沖為pH 6.2咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。 結(jié)果如圖3、圖4所示，與現(xiàn)有酸堿水解的化學(xué)制備法相比，酶法制備甘草次酸 具有對環(huán)境友好，能耗低，可調(diào)控性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例2:重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶在甘草次酸制備中的應(yīng)用，其步驟如下用純化重組耐熱p -葡萄糖醛酸酶催化從甘草酸到甘草次酸的水解反應(yīng)，反應(yīng)條件為60'C，反應(yīng)使用的緩沖為pH 4.6磷酸緩沖液。實(shí)施例3:重組耐熱P-葡萄糖醛酸酶在甘草次酸制備中的應(yīng)用，其步驟如下用未純化重組耐熱0 -葡萄糖醛酸酶催化從甘草酸到甘草次酸的水解反應(yīng)，反應(yīng)條件為80'C，反應(yīng)使用的緩沖為pH 7. 4咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。SEQUENCE LISTING <110>南京師范大學(xué)〈120〉一種制備重組耐熱0 -葡萄糖醛酸酶的方法 <160>2<210>1 <211>33 <212>DNA <213>人工序列<400>1aggagatata aacatggtaa gaccgcaacg aaa 33<210>2 <211>34 <212>DNA <213>人工序列<400>2tcttgtcaac aattaacagg tcattggatc atgg3權(quán)利要求
1. 一種制備重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶的方法，其特征在于，用表達(dá)載體pHsh表達(dá)耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因或其突變體，得到重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶；具體方法步驟如下(1)將耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因插入基因表達(dá)載體pHsh，構(gòu)建成耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)對耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒中的mRNA翻譯起始區(qū)潛在的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線分析，并通過基因誘變打破mRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、降低自由能，得到優(yōu)化的重組質(zhì)粒；(3)用耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)?；騼?yōu)化的耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得基因工程菌，并在基因工程菌的生長過程中進(jìn)行熱激誘導(dǎo)，使耐熱β-葡萄糖醛酸酶得到超量表達(dá)；(4)收集細(xì)胞，破壁并離心獲得粗酶液；(5)對上述粗酶液中的重組酶進(jìn)行純化得到純化的重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，上述步驟(1)中所說的耐 熱p-葡萄糖醛酸酶基因，是從海棲熱袍菌(T7zemzo/oga mw衍wa)中提取基因 組DNA，通過PCR擴(kuò)增獲得。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的基因誘變方法是對海棲熱袍菌的e-葡萄糖醛酸酶的基因設(shè)計(jì)改變基因內(nèi)部堿基的突變引物為，弓i物1: 5' -aggagatataaacatggtaagaccgcaacgaaa-3 ，， 弓i #勿2: 5 ， -tcttgtcaacaattaacaggtcattggatcatgg-3 ，，以耐熱e -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒為模板進(jìn)行定點(diǎn)誘變，得到優(yōu)化的耐熱p -葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的大腸桿 菌是大腸桿菌菌株K12或其衍生菌株。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，大腸桿菌菌株K12的衍生 菌株是JM109， BL21或DH5a。
6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中所述的純化方法是破碎細(xì)胞后，75-c處理ih，離心得到的重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶。
7. 權(quán)利要求i-6之一所述的方法，制備得到的重組耐熱e-葡萄糖醛酸酶作為催化劑，催化甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸的反應(yīng)。
全文摘要
一種制備重組極耐熱性β-葡萄糖醛酸酶的方法，其制法是將耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因插入表達(dá)載體pHsh，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒；其次是對基因進(jìn)行誘變，改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)，得到優(yōu)化的耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒；然后將耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)?；騼?yōu)化的耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到基因工程菌，并通過熱激誘導(dǎo)，使β-葡萄糖醛酸酶得到超量表達(dá)；最后收集細(xì)胞，破壁，離心后得到粗酶液，進(jìn)一步純化后得到純酶。本發(fā)明首次使用表達(dá)載體pHsh對耐熱β-葡萄糖醛酸酶的基因進(jìn)行高效表達(dá)，并首次將重組的耐熱β-葡萄糖醛酸酶應(yīng)用于甘草次酸的制備。
文檔編號C12P7/42GK101250539SQ20081001877
公開日2008年8月27日 申請日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者卓 王, 裴建軍, 邵蔚藍(lán) 申請人:南京師范大學(xué)