專利名稱：一種提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法
一種提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法技術(shù)領(lǐng)域一種提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，本發(fā)明改進(jìn)了產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的 微生物的培養(yǎng)條件，涉及聚乙烯醇生物降解技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,簡稱PVA)是一種人工合成的水溶性髙分子 化合物，在紡織工業(yè)中，PVA可用于織物上漿，經(jīng)紗用PVA上槳后粘合力大， 成膜力高，膜柔軟強(qiáng)韌，不發(fā)生化學(xué)變化及腐敗。在紡織前處理過程中，經(jīng)PVA 上漿的棉織物必須經(jīng)過退漿處理，以增強(qiáng)其吸水性。傳統(tǒng)的退漿方法是使用 7(K9(TC的熱水在棉織物表面進(jìn)行洗脫，有時(shí)使用氧化劑如NaBr02等。這樣不 僅水耗、能耗大，而且在此過程中，必須嚴(yán)格控制操作條件，否則會因高溫和 氧化作用對棉纖維造成損傷；更為嚴(yán)重的是其對環(huán)境所產(chǎn)生的負(fù)面影響紡織 廠排出的廢水中含有大量的PVA和氧化劑，由于PVA的可生化性較差 (BOD/COD=0.07)，進(jìn)入水體后大大增加了紡織廢水處理的難度。隨著人們對紡織工業(yè)清潔生產(chǎn)的關(guān)注，研究者們考慮能否在退漿工藝中就 實(shí)現(xiàn)對PVA的生物降解，即將PVA降解酶廠運(yùn)用于紡織工業(yè)的退漿工藝。如果 能在退槳工段就實(shí)現(xiàn)對PVA的生物降解，不僅能大大減少PVA廢水的排放，還 能避免化學(xué)退漿過程中高溫和氧化造成的棉纖維損傷。實(shí)現(xiàn)對PVA生化降解的關(guān)鍵在于篩選到能夠高效降解PVA的微生物，但與 能夠降解其它脂肪族高聚物的微生物相比，PVA降解菌在種類和分布上要少得 多，并且培養(yǎng)周期長，酶活不高，再加上提取不容易，這些都阻礙了PVA降解 酶在實(shí)際生產(chǎn)上的運(yùn)用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，改進(jìn)了產(chǎn)聚乙 烯醇降解酶的微生物的培養(yǎng)條件，用低聚合度的聚乙烯醇為碳源進(jìn)行微生物培 養(yǎng)，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的用高聚合度的聚乙烯醇為碳源進(jìn)行微生物培養(yǎng)，經(jīng)改進(jìn)后，酶 活有顯著提高。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，以受聚乙烯醇 污染的紡織廠退漿管道的污泥中采集的原始聚乙烯醇降解菌群液的混合菌系，用聚合度500的聚乙烯醇(PVA205)為碳源和誘導(dǎo)物誘導(dǎo)微生物產(chǎn)酶，所產(chǎn)的 聚乙烯醇降解酶用來降解聚合度1700的聚乙烯醇；發(fā)酵培養(yǎng)基PVA205 4-6 g/L，酵母粉2-4 g/L， NaN03 2-3 g/L， K2HP04 1.6g/L， KH2P04 0.2 g/L， MgS04'7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeS04-7H20 0.02 g/L， NaC10.02g/L， pH7.2;發(fā)酵條件旋轉(zhuǎn)式搖床搖瓶培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度3(TC,取保藏 菌種的甘油管接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，發(fā)酵4天；或取 1 mL上一批發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中， 發(fā)酵4天。本發(fā)明內(nèi)容中所用的測定方法1、 PVA含量測定Finley法。原理在硼酸存在時(shí)，PVA與碘作用會產(chǎn)生綠色絡(luò)合物，顏色的深淺可用分 光光度計(jì)測A69。^消光值表示。具體實(shí)驗(yàn)操作為，在50mL的容量瓶中，依次加 入lmL待測PVA溶液，15mL25g/L的硼酸溶液和1.5 mL 0.1 mol/L的l2-KI溶液， 加水至刻度，搖勻，10min后，用lcm比色杯，以空白為參比，在6卯nm處測定 吸光值，以吸光度值大小來表示PVA含量的多少。2、 PVA降解酶總酶活測定將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液15 000 r/min離心10 min，該部分上清液稱為粗酶液。 由于PVA的降解過程是整個(gè)酶系共同作用的結(jié)果，因此研究中測定的酶活為 PVA降解酶系的總酶活。在150mL三角瓶中加入4mL粗酶液禾tl4mL底物(lg/L PVA 1799溶于0.1 mol/LpH7.0磷酸鉀緩沖液中)，將此混合體系于30 'C的水浴搖 床中反應(yīng)3h，分別測反應(yīng)前后反應(yīng)混和液所對應(yīng)的PVA含量的吸光度。每分鐘 吸光度下降0.001定義為一個(gè)酶活單位。3、 細(xì)胞破碎液酶活測定將發(fā)酵液15 000 r/min離心10 min，.離心后的沉淀物溶于磷酸鹽緩沖液(pH 7.0， 0.1mol/L)，體積比約為1:4，用超聲破碎(4。C， 400 W，工作l s，停2s，工 作時(shí)間為15min)并離心收集上清液備用，該部分上清液稱為破碎上清液；破碎 后離心所得沉淀物溶于磷酸鹽緩沖液至原體積，稱為沉淀復(fù)溶液。然后按上述 方法測定各自部分的酶活。試劑實(shí)驗(yàn)用PVA: PVA1799 (聚合度1700，醇解度99.0%); PVA205 (聚合度500， 醇解度88%); PVA1750 (聚合度1750±50，醇解度99.0%);其它試劑藥品均為分 析純。本發(fā)明的有益效果對于產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的微生物培養(yǎng)，普遍的方法是 用聚合度1700左右的聚乙烯醇為碳源和誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)酶，但高聚合度 的聚乙烯醇極易絮凝，影響微生物對聚乙烯醇的降解，進(jìn)而降低酶產(chǎn)量。本發(fā) 明改進(jìn)了培養(yǎng)條件，用聚合度500的聚乙烯醇為碳源培養(yǎng)，適當(dāng)提高聚乙烯醇 的濃度也不會出現(xiàn)絮凝，且所產(chǎn)的酶對高聚合度聚乙烯醇的降解能力比前者有很大提高，為聚乙烯醇降解酶早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
圖l酶活分布圖2PVA 1750不同濃度對降解率和OD6G()值的影響圖3用不同PVA型號培養(yǎng)時(shí)酶活的比較圖4PVA205不同濃度對酶活的影響圖5以PVA205為碳源，不同氮源對酶活的影響圖6酵母粉濃度對酶活的影響圖7添加不同濃度NaNC^或NH4C1對酶活的影響具體實(shí)施方式
菌種以受聚乙烯醇污染的紡織廠退漿管道的污泥中采集的原始聚乙烯醇降解菌群液的混合菌系(ZL200510038224.2)，本實(shí)施方式中的混合菌系選自無 錫市宜興軍達(dá)紡織廠退漿管道的污泥中篩選出的混合菌系。菌株產(chǎn)酶的酶活比較與發(fā)酵條件優(yōu)化，如下述。對照實(shí)施例l.用PVA 1750培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)酶的酶活發(fā)酵培養(yǎng)基PVA1750 1 g/L，酵母粉1 g/L，K2HP04 1.6 g/L，KH2P04 0.2 g/L， MgS04.7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeS04.7H20 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L;pH 7.2。分別測定發(fā)酵上清液、破碎上清液和沉淀復(fù)溶液的酶活，結(jié)果如圖l所示。 可以看出菌系所產(chǎn)的PVA降解酶胞內(nèi)外都有分布，但在這三部分中胞外PVA降 解酶所占的比重較大(53%)，發(fā)酵48小時(shí)PVA降解酶活最大，為0.133 U/mL， 此后胞內(nèi)、外PVA降解酶酶活都在降低，72小時(shí)時(shí)，胞內(nèi)酶活已降為O，但胞 外酶活為0.09U/mL。如果提高培養(yǎng)基中PVA 1750的濃度，菌體生長量和PVA降解率卻隨之下降， 如圖2所示。由于高醇解度PVA含有大量親水性羥基，在強(qiáng)烈搖動條件下容易發(fā) 生分子內(nèi)或分子間氫鍵締合，造成分子聚合成凝膠團(tuán)。培養(yǎng)液中PVA濃度增加會 導(dǎo)致溶液粘度的增加，從而造成培養(yǎng)基的溶氧量小于細(xì)胞生長代謝的需要量， 阻礙了菌體的生長和產(chǎn)酶。此時(shí)測發(fā)酵上清液酶活，酶活并沒有太大變化，而 且測定酶活過程中底物中的PVA1799會發(fā)生絮凝，影響酶活結(jié)果。實(shí)施例l.用PVA205培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)酶的酶活發(fā)酵培養(yǎng)基PVA205 1 g/L，酵母粉1 g/L， K2HP04 1.6 g/L， KH2P04 0.2 g/L， MgS04.7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L，F(xiàn)eS04.7H20 0.02 g/L，NaCl 0.02 g/L;pH 7.2?；虬l(fā)酵培養(yǎng)基PVA250 4g/L，蛋白胨2g/L， K2HP04 1.6 g/L, KH2P04 0.2 g/L， MgSO4.7H2O0.5g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeS04.7H20 0.02 g/L， NaC10.02g/L; pH7.2。只測發(fā)酵上清液的酶活(胞外酶)，結(jié)果如圖3所示。用lg/LPVA1750和lg/LPVA205培養(yǎng)，酶活相差不大，但用4g/LPVA205培養(yǎng)時(shí)不僅發(fā)酵液沒有絮凝， 酶活也大大提高，酶活為0.69U/mL是用l g/LPVA1750培養(yǎng)時(shí)(酶活位O. 133 U/mL)的5.18倍。實(shí)施例2.培養(yǎng)基優(yōu)化用PVA205為碳源進(jìn)行微生物培養(yǎng)，優(yōu)化培養(yǎng)基碳、氮源的濃度，以期望提 高酶活，如下所述。(1) 氮源優(yōu)化以4g/LPVA205為碳源，考察含氮量相同的有機(jī)氮和無機(jī)氮(以3 g/L的酵 母粉為基準(zhǔn))的酶活。結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，以酵母粉為氮源時(shí)酶活 最高。考察不同酵母粉濃度對酶活的影響，結(jié)果如圖6所示，酵母粉濃度為3g/L 時(shí)酶活最高。(2) 最適碳源濃度的確定考察不同PVA205濃度的酶活，結(jié)果如圖4所示，可知PVA205濃度為4-6 g/L，酶活均較高，以4g/L時(shí)酶活最高。(3) 復(fù)合氮源的酶活考察復(fù)合氮源的酶活，由圖5可知，無機(jī)氮源中NaN03和NH4C1對酶活貢 獻(xiàn)最大，當(dāng)PVA205濃度為4 g/L，酵母粉濃度為3g/L時(shí)，添加不同濃度的NaN03 或NH4C1,考察酶活，結(jié)果如圖7。由圖7可知添加2-3 g/L的NaN03能大大提高酶活；添加2 g/L時(shí)，酶活為 1.06U/mL，比無添加時(shí)的酶活提高了52%。比用1 g/L PVA1750培養(yǎng)時(shí)提高了 8.15倍。優(yōu)化后最適的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為PVA205 4-6g/L，酵母粉2-4g/L， NaN03 2-3g/L， K2HP04 1.6 g/L， KH2P04 0.2 g/L， MgS04.7H20 0.5 g/L， CaCl2 0.05 g/L， FeSO4.7H2O0.02g/L， NaC10.02g/L; pH7.2。發(fā)酵條件旋轉(zhuǎn)式搖床搖瓶培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)溫度30°C 。取保藏菌 種的甘油管接入裝有30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，發(fā)酵4天；或取1 mL 上一批發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，發(fā)酵 4天。
權(quán)利要求
1、一種提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，其特征是以受聚乙烯醇污染的紡織廠退漿管道的污泥中采集的原始聚乙烯醇降解菌群液的混合菌系，用聚合度500的聚乙烯醇為碳源和誘導(dǎo)物誘導(dǎo)微生物產(chǎn)酶，所產(chǎn)的聚乙烯醇降解酶用來降解聚合度1700的聚乙烯醇；發(fā)酵培養(yǎng)基PVA 205 4-6g/L，酵母粉2-4g/L，NaNO3 2-3g/L，K2HPO4 1.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.05g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g/L，NaCl 0.02g/L，pH7.2；發(fā)酵條件旋轉(zhuǎn)式搖床搖瓶培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度30℃，取保藏菌種的甘油管接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，發(fā)酵4天；或取1mL上一批發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液接入裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，發(fā)酵4天。
全文摘要
一種提高聚乙烯醇降解酶酶活的方法，屬于聚乙烯醇生物降解技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明改進(jìn)了產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的微生物的培養(yǎng)條件，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是用聚合度1700左右的聚乙烯醇為碳源和誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)酶，但高聚合度的聚乙烯醇極易絮凝，影響微生物對聚乙烯醇的降解，進(jìn)而影響產(chǎn)酶。本發(fā)明改進(jìn)了培養(yǎng)條件，用聚合度500的聚乙烯醇為碳源培養(yǎng)，適當(dāng)提高聚乙烯醇的濃度不會出現(xiàn)絮凝，并對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，所產(chǎn)的酶對高聚合度聚乙烯醇的降解能力比前者有很大提高，約提高8.15倍。
文檔編號C12N9/00GK101220352SQ20081001872
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者堵國成, 牛海燕, 堅(jiān) 陳 申請人:江南大學(xué)