專利名稱：：一種地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法一種地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于微生物基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。技術(shù)背景地衣芽孢桿菌是生產(chǎn)高溫ot-淀粉酶、堿性蛋白酶、新型抗菌肽、新型生物可降解聚合物(如聚谷氨酸、聚賴氨酸等)的主要菌株。實(shí)現(xiàn)對(duì)其高效遺傳改良將是實(shí)現(xiàn)上述重要工業(yè)產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化的重要保障。然而，無論是地衣芽孢桿菌試驗(yàn)菌株還是工業(yè)菌株，由于有效的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的缺乏，對(duì)其進(jìn)行目標(biāo)導(dǎo)向性遺傳改良是極為困難的和很少能成功的。因此，研究和解決地衣芽孢桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，實(shí)現(xiàn)其遺傳轉(zhuǎn)化，對(duì)定向遺傳改造地衣芽孢桿菌成為高效工業(yè)生產(chǎn)菌種具有極為重要的意義。從自然界獲得的微生物菌種的生產(chǎn)性能往往達(dá)不到商業(yè)開發(fā)價(jià)值，需要對(duì)其進(jìn)行性能改造"~_育種。微生物育種的本質(zhì)是對(duì)微生物菌種進(jìn)行遺傳改良和異源基因的高效表達(dá)。微生物菌種遺傳改良即對(duì)微生物細(xì)胞的遺傳信息的儲(chǔ)存載體即DNA或基因進(jìn)行改變，由此改變其遺傳信息，進(jìn)而改變其生理生化特性，獲得生產(chǎn)性能更好的菌種。基因指的是一段編碼具有特定功能多肽的DNA序列，是遺傳功能作用發(fā)揮的基本單位或功能單位，一個(gè)生物體所有基因的總和為一個(gè)基因組。每個(gè)基因都具有完整的、能夠發(fā)揮其功能的特定結(jié)構(gòu)，即具有特殊的核苷酸(組成基因的化學(xué)物質(zhì)，主要為腺嘌吟(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧疲(C))序列。異源基因主要用分子克隆技術(shù)從其它生物體中獲得。異源基因的表達(dá)也是微生物菌種改良的重要組成部分。微生物菌種育種的方法有多種，如傳統(tǒng)的誘變法、雜交法、原生質(zhì)體融合法，以及現(xiàn)代的分子育種法。分子育種法是現(xiàn)代微生物菌種育種的最主要組成部分。工業(yè)上使用的優(yōu)良菌種有超過90%的菌種是通過分子育種獲得的。分子育種指的是運(yùn)用分子克隆和體外重組等現(xiàn)代技術(shù)直接改變微生物菌種的基因(基因型改變)，由此賦予微生物菌種新的優(yōu)良性狀(表現(xiàn)型改變)。分子克隆和體外重組技術(shù)于1973年建立。其核心或通用過程是運(yùn)用物理、化學(xué)或生物手段將決定微生物菌種特定性狀或指導(dǎo)特定產(chǎn)物合成的基因分離、純化、單克隆化，然后再在限制性酶和連接酶等的作用下重新組合成新的基因，即體外重組；再將此新的基因轉(zhuǎn)移入微生物菌種內(nèi)并讓其發(fā)揮功能。這里的限制性酶系能夠特異性切割DNA特定序列的酶，如來源于大腸桿菌的EcoRI能夠特異性切割DNA分子中的GAATTC序列。這里的連接酶指的是能夠?qū)蓚€(gè)或多個(gè)兩段靠近的DNA分子連接起來，形成一個(gè)新的DNA分子。微生物菌種的分子育種，需要將上述獲得的基因轉(zhuǎn)移入微生物菌種內(nèi)?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)是實(shí)現(xiàn)微生物菌種分子改良的關(guān)鍵技術(shù)之一。實(shí)現(xiàn)為微生物菌種基因轉(zhuǎn)移的方法有感受態(tài)轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、轉(zhuǎn)染法、基因槍法、微注射法等。適合微生物，特別是細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化常用方法主要有感受態(tài)轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電穿孔法等。感受態(tài)轉(zhuǎn)化法是對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的基本方法。此方法是利用大腸桿菌在特定培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件下可以形成攝取外源DNA分子并將其運(yùn)送到其細(xì)胞內(nèi)的特殊生理狀態(tài)(即感受態(tài))，將外源DNA分子與形成了感受態(tài)的大腸桿菌混合一段時(shí)間，在此感受態(tài)下將外源DNA分子吸收并運(yùn)送入其細(xì)胞中。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(諸葛健、王正祥.工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，1994)是實(shí)現(xiàn)若干細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的有效方法。其基本技術(shù)路線是新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌在高滲溶液中用適宜的酶(如溶菌酶)將其細(xì)胞壁(細(xì)菌細(xì)胞膜外側(cè)的結(jié)構(gòu)，主要由多糖和蛋白質(zhì)組成)水解，獲得僅有細(xì)胞膜包圍的原生質(zhì)，即原生質(zhì)體；將制備好的待遺傳轉(zhuǎn)化的DNA分子混入其中，加入適量的轉(zhuǎn)化促進(jìn)劑(如聚乙二醇)，共同孵育一段時(shí)間；將此轉(zhuǎn)化混合物涂布或摻入補(bǔ)加有一定選擇壓力(如抗生素)的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基中進(jìn)行37天的再生培養(yǎng)，讓其重新生長(zhǎng)出細(xì)胞壁(即再生)，并通過抗生素選擇(選擇培養(yǎng))出已經(jīng)獲得外源DNA分子的菌種(即轉(zhuǎn)化子)。電穿孔法(諸葛健、王正祥.工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，1994)是實(shí)現(xiàn)絕大多數(shù)細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的有效方法。其基本技術(shù)路線是新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌與制備好的待遺傳轉(zhuǎn)化的純化DNA分子混合，在電穿孔儀的協(xié)助下，通過瞬間高壓電場(chǎng)的作用力將DNA分子送入細(xì)胞內(nèi)；將此轉(zhuǎn)化混合物涂布或摻入補(bǔ)加有一定選擇壓力(如抗生素)的培養(yǎng)基中進(jìn)行23天的選擇培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化子。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電穿孔法相比較，前者操作復(fù)雜，但不需要特殊儀器，技術(shù)實(shí)現(xiàn)周期長(zhǎng)是其最主要缺點(diǎn)。此外，不是所有細(xì)菌都能通過酶解獲得原生質(zhì)體，也不是所有的細(xì)菌的原生質(zhì)體能夠有效再生。后者操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但需要特殊儀器(電穿孔儀)。幾乎所有的細(xì)菌都可以通過電穿孔法實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。因此，電穿孔法是目前實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法。地衣芽孢桿菌為革藍(lán)氏陽性、內(nèi)生芽孢、好氧型桿菌，廣泛分布于自然界。地衣芽孢桿菌不同菌株間的性能存在較大不同，其中一些菌種已經(jīng)育種成功用于工業(yè)酶制劑、生物聚合材料、藥物生物素等重大產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。它的代表性菌株(實(shí)驗(yàn)菌株)ATCC14580(與DSM13為同一菌株)的基因組已經(jīng)得到解析(VeithBetal,JMolBiotechnol，2004)。實(shí)驗(yàn)菌株與工業(yè)菌株的不同之處是，前者可以帶有多種遺傳標(biāo)記，其特定產(chǎn)品的生產(chǎn)水平一般都很低，主要用于科學(xué)探索中的實(shí)驗(yàn)研究材料，如ATCC14580;后者為經(jīng)過多重育種方法獲得的、主要用于特定工業(yè)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)的生產(chǎn)菌株，如我國(guó)的堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株地衣芽孢桿菌6816。與實(shí)驗(yàn)菌株相比，工業(yè)菌株的遺傳背景一般不清楚，育種過程中也不希望改變其原有的優(yōu)良屬性。地衣芽孢桿菌不具有感受態(tài)形成所必需的全部組份，因而不能象大腸桿菌那樣，通過感受態(tài)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移(VeithBetal,JMolBiotechnol,2004)。實(shí)現(xiàn)其基因轉(zhuǎn)移僅能依靠原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電穿孔法。地衣芽孢桿菌基因組中含有兩個(gè)限制基因轉(zhuǎn)移的I型限制性修飾系統(tǒng)(R-M系統(tǒng))(Ve他Betal，JMolBiotechnol,2004)。R-M系統(tǒng)主要由限制性酶和甲基轉(zhuǎn)移酶兩部分組成，在此R-M系統(tǒng)的作用下，地衣芽孢桿菌基因組DNA的限制性酶切位點(diǎn)被甲基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別并甲基化(修飾)，從而可以防止/免除其限制性酶的剪切；外來DNA分子因未被甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化而被其限制性酶酶切降解。象其它生物體一樣，地衣芽孢桿菌通過這一系統(tǒng)的功能發(fā)揮來保證其遺傳性狀的穩(wěn)定性。經(jīng)過優(yōu)化的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電穿孔法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)地衣芽孢桿菌特定菌株的遺傳轉(zhuǎn)化(XueGPetal，JMicrobiolMethods,1999;徐敏等，無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004;WaschkauBetal,ApplMicrobiolBiotechnol,2007)。但無論是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法或是電穿孔法用于對(duì)地衣芽孢桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化，其遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)是不穩(wěn)定的，通常需要有經(jīng)驗(yàn)的操作者進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)操作。而且，若干地衣芽孢桿菌菌株至今不能實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化(WaschkauBetal，ApplMicrobiolBiotechnol,2007;VaryPSetal，ApplMicrobiolBiotechnol,2007;LeonardCGetal，JBacteriol,1964;Gwi皿DD&ThorneCB,JBacteriol,1964)。限制或障礙地衣芽孢桿菌基因轉(zhuǎn)移的主要原因是地衣芽孢桿菌具有多重I型限制性酶。此外，無感受態(tài)形成和芽孢(微生物細(xì)胞的休眠狀態(tài))形成周期也是限制地衣芽孢桿菌基因轉(zhuǎn)移的重要原因。因此，發(fā)展和建立一種穩(wěn)定的地衣芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)地衣芽孢桿菌工業(yè)菌株的遺傳改良極為重要。有效解決受體菌對(duì)外源DNA分子的降解和排斥的技術(shù)目前報(bào)道的有如下幾種方法。熱處理法滅活產(chǎn)生的限制性酶；先破壞受體菌的限制性系統(tǒng)(即通過基因操作和分子克隆技術(shù)對(duì)其限制性修飾系統(tǒng)中的限制性酶編碼基因進(jìn)行缺失突變)，再實(shí)施基因轉(zhuǎn)移；或?qū)ν庠碊NA分子先進(jìn)行特異性甲基化，再實(shí)施基因轉(zhuǎn)移(MurrayNE,MicrobiolMolBiolRev,2002)。就地衣芽孢桿菌而言，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電穿孔法，可以解決其芽孢形成以及無感受態(tài)生理狀態(tài)出現(xiàn)等對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的限制。刪除地衣芽孢桿菌基因組中的兩個(gè)R-M系統(tǒng)的限制性酶編碼基因，則可以消除限制性酶對(duì)外源基因分子的降解，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)地衣芽孢桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化(WaschkauBetal，ApplMicrobiolBiotechnol,2007)。但從地衣芽孢桿菌R-M系統(tǒng)缺失突變株獲得的質(zhì)粒用于地衣芽孢桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化并沒有明顯優(yōu)勢(shì)(WaschkauBetal，ApplMicrobiolBiotechnol，2007);并且從地衣芽孢桿菌分離和純化質(zhì)粒DNA(微生物分子改良的重要分子材料，其本質(zhì)是能夠獨(dú)立進(jìn)行自主復(fù)制的、存在于染色體外的遺傳物質(zhì))也十分困難。此外，我們不可能對(duì)地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株的R-M系統(tǒng)進(jìn)行缺失突變，因?yàn)檫@樣所獲得的遺傳改良的工業(yè)菌株所具有的遺傳信息將會(huì)十分不穩(wěn)定。為此，研究一種在完全保留工業(yè)菌株的R-M系統(tǒng)完整性的前提下，實(shí)現(xiàn)其基因轉(zhuǎn)移的新方法將是十分重要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是獲得一種在完全保留工業(yè)菌株的R-M系統(tǒng)完整性的前提下，實(shí)現(xiàn)其遺傳轉(zhuǎn)化新方法。在分析地衣芽孢桿菌基因組組成的基礎(chǔ)上，獲得地衣芽孢桿菌R-M系統(tǒng)組成特征，分析和研究其甲基轉(zhuǎn)移酶的特征及其可能的甲基化功能，接著通過分子克隆技術(shù)對(duì)地衣芽孢桿菌的甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因進(jìn)行克隆并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，再將需要轉(zhuǎn)化入地衣芽孢桿菌中的DNA轉(zhuǎn)化入含有地衣芽孢桿菌的甲基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌中進(jìn)行甲基化，最后從大腸桿菌中獲得特異性甲基化的DNA，再用優(yōu)化的電穿孔法，實(shí)現(xiàn)地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明提供了應(yīng)用于地衣芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的體內(nèi)特異性甲基化DNA制備方法；提供了體內(nèi)甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體；提供了運(yùn)用此方法實(shí)現(xiàn)地衣芽孢桿菌工業(yè)菌株遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案一種地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法(1)在轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株前，先在特異性甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，對(duì)待遺傳轉(zhuǎn)化的DNA分子中腺嘌呤(A)堿基進(jìn)行甲基化，由此制備獲得不被地衣芽孢桿菌I型核酸限制性酶分解的甲基化DNA分子；(2)用電穿孔法，將此甲基化的DNA分子遺傳轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，運(yùn)用此方法，地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化率達(dá)到251250個(gè)/ligDNA。DNA分子的甲基化所用的特異性甲基轉(zhuǎn)移酶是運(yùn)用基因克隆技術(shù)獲得的、在大腸桿菌表達(dá)的、地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶；其甲基化方式是，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)外源DNA分子進(jìn)行甲基化，即體內(nèi)甲基化。細(xì)菌培養(yǎng)地衣芽孢桿菌和大腸桿菌于LB培養(yǎng)基(1%酵母膏，1%蛋白胨，0.5%NaCl，pH7.2)，37。C培養(yǎng)l3天。必要時(shí)在培養(yǎng)基中添加100lag/mL氨芐青霉素、50pg/mL四環(huán)素或5嗎/mL卡那霉素。地衣芽孢桿菌DNA甲基化酶基因的克隆和重組大腸桿菌的構(gòu)建分析地衣芽孢桿菌ATCC14580基因組(GenBank登錄號(hào)AE017333;VeithBetal,JMolBiotechnol，2004)，在其基因組存在一種I型地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因。設(shè)計(jì)并化學(xué)合成一對(duì)寡核苷酸引物。再運(yùn)用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)，以地衣芽孢桿菌ATCC14580染色體DNA為模板，以上述寡核苷酸為引物，用戶/wDNA多聚酶(BBI公司)擴(kuò)增出地衣芽孢桿菌DNA特異性甲基化酶編碼基因S/z'-me"將基因別z'-m"克隆入表達(dá)載體pKK223-3(Brosius&Holy，PNAS,1984)的tac啟動(dòng)子下游獲得大腸桿菌表達(dá)重組質(zhì)粒pKK-met;再將重組質(zhì)粒pKK-met轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，獲得重組大腸桿菌Ec(met)。DNA分子體內(nèi)甲基化，是經(jīng)過表達(dá)質(zhì)粒pKK-met，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)的。特異性甲基化DNA分子的體內(nèi)制備將大腸桿菌-地衣芽孢桿菌質(zhì)粒(如pHY300plk(IshiwaH&ShibaharaH,JpnJGenet,1985);pDG-148(StragierPetal,Cell,1988)或pHY-WZX(NiuDD&WangZX,JIndMicrobiolBiotechnol,2007))轉(zhuǎn)化入重組大腸桿菌Ec(met);37。C培養(yǎng)2448h，進(jìn)行體內(nèi)甲基化；用Qiangen公司的純化試劑盒純化大腸桿菌Ec(met)中的甲基化質(zhì)粒；用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌。表達(dá)質(zhì)粒pKK-met是通過將地衣芽孢桿菌中的甲基轉(zhuǎn)移酶基因克隆入pKK223-3的toe啟動(dòng)子下游獲得的。地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株指旳是，能夠合成重要工業(yè)產(chǎn)品工業(yè)酶制劑，生物多聚體或抗生素，并且其合成水平己具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值的地衣芽孢桿菌菌種。地衣芽孢桿菌電穿孔轉(zhuǎn)化接種地衣芽孢桿菌工業(yè)菌株CICIMB2004(王正祥等。應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007;)或CICIMB0204(牛丹丹等。微生物學(xué)報(bào)，2006)于2.5mLLB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接入50mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含0.5mol/L山梨醇的LB培養(yǎng)基)中，于37。C培養(yǎng)至OD柳為0.85-0.95。將菌體在冰水浴中放置10min，于4°C、10000r/min離心5分鐘收集菌體。用預(yù)冷的EP緩沖液(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇和10%甘油)反復(fù)洗滌細(xì)胞4次。將細(xì)胞懸浮于約lmL的預(yù)冷EP緩沖液中。取60iiL菌體分裝于1.5mLEppendorf管中。取1^L質(zhì)粒DNA(50ng/L)，與細(xì)胞混勻，移入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化池，電擊(2000v，5ms)后，加入1mL復(fù)蘇培養(yǎng)基(含0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇的LB培養(yǎng)基)，37°C、80r/min培養(yǎng)3h，然后涂布含卡那霉素(5pg/mL)或四環(huán)素(50pg/mL)的LB平板，于37。C培養(yǎng)23天。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的DNA遺傳轉(zhuǎn)化新技術(shù)，對(duì)地衣芽孢桿菌有效。經(jīng)重組大腸桿菌Ec(met)甲基化的DNA分子具有消除地衣芽孢桿菌R-M系統(tǒng)的限制作用，用此甲基化的DNA可以穩(wěn)定和高效地對(duì)地衣芽孢桿菌工業(yè)菌株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)到251250個(gè)/iugDNA。2、本發(fā)明的DNA甲基化技術(shù)，對(duì)地衣芽孢桿菌具有特異性。3、本發(fā)明的特異性甲基化DNA制備技術(shù)為體內(nèi)完成，具有方便、快捷、高效和廉價(jià)等特點(diǎn)。4、本發(fā)明的應(yīng)用于地衣芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的特異性甲基化DNA的制備為在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)完成，便于DNA分子重組的實(shí)施；同時(shí)，沒有對(duì)地衣芽孢桿菌R-M系統(tǒng)進(jìn)行任何改變，從而保證地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株在經(jīng)此方法獲得特定遺傳改良或修飾后，仍保持對(duì)外源DNA分子入侵的免疫力，即保證地衣芽孢桿菌的遺傳穩(wěn)定性。圖l.pKK-met物理圖譜具體實(shí)施方式實(shí)施例1:地衣芽孢桿菌甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的鑒定與克隆表達(dá)分析及/z'c/2e剛/orm^ATCC14580基因組序列(GenBank登錄號(hào)為AE017333，VeithBetal,JMolBiotechnol，2004)，確定其基因組4169271至4170800區(qū)域存在一個(gè)開放讀框，其編碼基因產(chǎn)物可能為一個(gè)凡/!'Wem/om^特異性I型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。用染色體DNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取染色體DNA，以此DNA為模板，以化學(xué)合成的寡核苷酸metPl5'-TCAGAATTCTGAGGAACACAACCATGGCTGAATT-3'，下劃線部分為五coRI位點(diǎn)，和metP25'-TACGAATTCTCCTAACTTACGCTCTTCCCA-3'，下戈機(jī)部分為五coRI位點(diǎn)，為基因擴(kuò)增引物，在戶/wDNA多聚酶的作用下，通過多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出1.6kb大小的S."c/^m/om^甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因(歷z'-m")。將此PCR產(chǎn)物五coRI酶切，與經(jīng)同樣酶切的pBluescriptIISK(-)(Alting-MeesMA&ShortJM,NuclAcidsRes，1989)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,在含終濃度為100pg/mL的氨芐青霉素的LB平板(酵母膏1%，蛋白胨1%，NaCl0.5%,瓊脂2%)上篩選出轉(zhuǎn)化子。酶切驗(yàn)證得到了重組質(zhì)粒，定名為pSK-met。對(duì)重組質(zhì)粒pSK-met中的m"基因用雙脫氧核苷酸鏈終止法進(jìn)行序列測(cè)定，確認(rèn)其序列的正確性。進(jìn)一步構(gòu)建含及//c/2emybm^甲基轉(zhuǎn)移酶的重組表達(dá)質(zhì)粒pKK-met。其構(gòu)建過程為￡coRI酶切pSK-met，用膠回收試劑盒(Qiagen公司)膠回收1.6kb基因片段，回收純化的朋'-m"基因片段與經(jīng)五coRI酶切的pKK223-3連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在含終濃度為100pg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證得到重組表達(dá)質(zhì)粒pKK-met，相應(yīng)的重組菌命名為Ec(met)。實(shí)施例2:外源DNA分子甲基化重組菌Ec(met)用Sambrook介紹的方法(Sambrooketal，MolecularCloning:ALabManual,1989)制備感受態(tài)細(xì)胞并于-70。C保存。用質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen公司)制備大腸桿菌-地衣芽孢桿菌的穿梭質(zhì)粒pHY300PLK、pDG148-Stu，pHY-WZX。用感受態(tài)法，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入重組菌Ec(met)中，在終濃度100ng/mL氨節(jié)青霉素、50pg/mL四環(huán)素或5嗎/mL卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)分離純化后，在LB培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)2448h，運(yùn)用m"基因的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)化入其中的質(zhì)粒DNA進(jìn)行甲基化。運(yùn)用質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen公司)對(duì)上述轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒DNA分子進(jìn)行分離純化。即制備獲得用于后續(xù)地衣芽孢桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒甲基化DNA分子。實(shí)施例3:特異性甲基化DNA分子用于地衣芽孢桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化接種工業(yè)生產(chǎn)地衣芽孢桿菌菌株B2004或B0204于2.5mL含0.5mol/L山梨醇的LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接入50mL含0.5mol/L山梨醇的LB培養(yǎng)基中，于37。C培養(yǎng)至A,為0.85-0.95。將菌體在冰水浴中放置10min，于4°C、10000r/min離心5分鐘收集菌體。用預(yù)冷的EP緩沖液(0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇和10%甘油)反復(fù)洗滌細(xì)胞4次。將細(xì)胞懸浮于約lmL的預(yù)冷EP緩沖液中。取60pL菌體分裝于1.5mLEppendorf管中。取上述方法制備的甲基化或未甲基化質(zhì)粒DNA(50ng/L)，與細(xì)胞混勻，移入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化池，電擊(2000v,5ms)后，加入lmL復(fù)蘇培養(yǎng)基(含0.5mol/L山梨醇和0.38mol/L甘露醇的LB培養(yǎng)基)，37°C、80r/min培養(yǎng)3h，然后涂布含卡那霉素(5pg/mL)或四環(huán)素(50pg/mL)的LB平板。轉(zhuǎn)化率見表1。運(yùn)用特異性甲基化的DNA轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化率較未甲基化的DNA提高了510倍，達(dá)到251250個(gè)4igDNA。特別是，用未甲基化的DNA不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的幾種地衣芽孢桿菌菌種，用特異性甲基化DNA分子對(duì)地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌種實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是(1)在轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株前，先在特異性甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，對(duì)待遺傳轉(zhuǎn)化的DNA分子中腺嘌呤(A)堿基進(jìn)行甲基化，由此制備獲得不被地衣芽孢桿菌I型核酸限制性酶分解的甲基化DNA分子；(2)用電穿孔法，將此甲基化的DNA分子遺傳轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，運(yùn)用此方法，地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化率達(dá)到25～1250個(gè)/μgDNA。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是DNA分子的甲基化所用的特異性甲基轉(zhuǎn)移酶是運(yùn)用基因克隆技術(shù)獲得的、在大腸桿菌表達(dá)的、地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶；其甲基化方式是，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)外源DNA分子進(jìn)行甲基化，即體內(nèi)甲基化。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是DNA分子體內(nèi)甲基化，是經(jīng)過表達(dá)質(zhì)粒pKK-met，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)的。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是表達(dá)質(zhì)粒pKK-met是通過將地衣芽孢桿菌中的甲基轉(zhuǎn)移酶基因克隆入pKK223-3的toe啟動(dòng)子下游獲得的。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征是地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株指旳是，能夠合成重要工業(yè)產(chǎn)品工業(yè)酶制劑，生物多聚體或抗生素，并且其合成水平已具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值的地衣芽孢桿菌菌種。全文摘要一種地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于微生物基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法，待遺傳轉(zhuǎn)化的DNA分子，先進(jìn)行地衣芽孢桿菌特異性甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的甲基化；特異性甲基化的DNA分子用優(yōu)化的電穿孔法，實(shí)現(xiàn)地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化。運(yùn)用此方法，地衣芽孢桿菌工業(yè)生產(chǎn)菌株的遺傳轉(zhuǎn)化率達(dá)到25～1250個(gè)/μgDNA。特別是，本發(fā)明可以用于現(xiàn)有遺傳轉(zhuǎn)化方法不能實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的地衣芽孢桿菌菌種的遺傳轉(zhuǎn)化。文檔編號(hào)C12N15/75GK101230329SQ200810018458公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2008年2月2日優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日發(fā)明者牛丹丹,王正祥申請(qǐng)人:江南大學(xué)