專利名稱：一種大豆異黃酮苷元高效清潔制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能性大豆異黃酮的制備方法，具體地說涉及一種大豆異黃酮苷元 的酶法制備方法，更具體地說是提供一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)染料木黃酮和黃豆苷元的方 法。
背景技術(shù)：
人們對大豆及其制品的營養(yǎng)作用和保健功效研究的深入，發(fā)現(xiàn)大豆除了含有豐富的 蛋白質(zhì)和油脂外，還含有許多有益的生物活性物質(zhì)，如大豆磷脂、大豆低聚糖、大豆皂苷 和大豆異黃酮等。在這些生物活性物質(zhì)中，大豆異黃酮因具有明顯的生物學(xué)活性已越來越 引起社會(huì)和學(xué)術(shù)界的普遍關(guān)注，成為近年來世界各國科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。近期研究結(jié)果表 明大豆異黃酮具有較強(qiáng)的生理功能，具有抗腫瘤，尤其是對與激素有關(guān)的腫瘤如乳腺癌 和前列腺癌有顯著的抑制作用，對血管的防護(hù)作用、抗氧化活性和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，并能
治療和預(yù)防心腦血管疾病。大豆異黃酮共有12種異構(gòu)體，主要以游離型的甙元(aglycon) 和結(jié)合型的糖苷(glucosides)兩種形式存在，天然狀態(tài)下的大豆異黃酮主要以糖甙形式存 在，占總量的97%-98%,甙元占總量的2%-3%。研究發(fā)現(xiàn)，糖苷形式的大豆異黃酮不具 有最佳的生理活性狀態(tài)，須在大豆異黃酮糖苷酶的作用下轉(zhuǎn)化成甙元形式才能被吸收而發(fā) 揮藥效。由此可見，把大豆異黃酮糖苷型及糖苷衍生物轉(zhuǎn)化成苷元形式，是提高其生物 利用率的前提。
目前制備大豆苷元的方法主要有化學(xué)合成法、酸堿水解方法和酶水解法。其中以 代替許多化學(xué)轉(zhuǎn)化過程存在的高溫、高壓、耗水、高污染、苛刻及有害條件、非特異性反 應(yīng)等缺點(diǎn)，前兩種存在對甙元破壞性大，污染大，目的性差等缺點(diǎn)；
酶是一種生態(tài)型高效催化劑，具有高效、安全、生態(tài)和環(huán)保等特點(diǎn)，能夠在反應(yīng)條 件溫和的生態(tài)條件下發(fā)揮高效、專一、環(huán)保、減少設(shè)備投資、提高生產(chǎn)效率等作用，實(shí) 現(xiàn)工業(yè)過程，為社會(huì)提供更健康、安全、高效、綠色的產(chǎn)品。因此，酶水解法是大豆異 黃酮提取及轉(zhuǎn)化的理想途徑。
綜合目前己有的酶法制備大豆異黃酮苷元方法，其主要包括以下步驟
(1) 以大豆異黃酮粉、脫脂豆粕或大豆糖蜜為原料制備大豆異黃酮糖苷提取物
(2) 外加大豆異黃酮糖苷水解酶，所用的大豆異黃酮糖苷水解酶包括葡萄糖苷酶、 葡萄糖酸酶、半乳葡萄糖苷酶、生物乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等(Shen， et al 1998:
Bryan, BarbaraA et al 2002: Tsuruhami， Kazutakaet al 2003)，大豆β-葡萄糖苷酶以及 從天然食用原料(香菇、金針菇、小麥種子、小麥芽、大麥種子或大麥芽)中提取水解酶 液；使用的微生物包括黑曲霉、米曲霉、乳克魯威氏酵母、假絲酵母、大肥菇菌和脆壁克 黑曲霉以及高溫耗氧霉菌；
(3) 在30-75℃下保溫l-48小時(shí)；
(4) 經(jīng)再進(jìn)行離心固液分離，沉定物經(jīng)低溫干燥得到大豆異黃酮苷元，或用乙醇、 正丁醇、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯或與它們有相近特性的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，蒸去有機(jī) 溶劑，真空干燥，得富含染料木黃酮和黃豆苷元干粉產(chǎn)品。
這些方法由于存在著所用酶穩(wěn)定性差、純度低、操作復(fù)雜、收率低、生產(chǎn)成本較高、 有機(jī)溶劑殘留造成環(huán)境污染等問題，因此都未能得到廣泛的應(yīng)用。
科學(xué)研究表明游離形式的大豆異黃酮水溶性最差，基本不溶于水，而葡萄糖苷型一 般易溶于水，但大豆中含量最高的染料木苷genistin則難溶于水，但在70-90℃時(shí)其溶解 度隨著溫度的升高而顯著增加。本發(fā)明利用上述溶解特性，開發(fā)出一種大豆異黃酮苷元高效清潔制備方法。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有酶法制備大豆異黃酮苷元的不足，本發(fā)明提供了一種高效清潔的制備方法。本發(fā)明方法是針對大豆異黃酮糖苷和苷元的溶解特性，將耐高溫的(3-葡萄糖苷酶用 于大豆異黃酮的提取工藝中，即添加耐高溫β-葡萄糖苷酶于大豆粉漿且在70-90℃下保溫 3-5小時(shí)，使水溶性大豆異黃酮在從大豆粉溶出的同時(shí)被去糖基而轉(zhuǎn)化為不溶性的有效成 分苷元，這樣用80%乙醇直接提取離心所得沉淀即可得到大豆異黃酮苷元。因耐高溫β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性高，所得殘液中酶殘余活性和有效成分可回用。由于在從大豆粉溶出的水溶性大豆異黃酮不斷地被轉(zhuǎn)化為不溶性的苷元，這樣在固相大豆粉與水相間保持一定濃度差而有利于水溶性大豆異黃酮不斷從大豆粉溶出。
所述的大豆異黃酮苷元的高效清潔制備方法，其步驟如下
步驟1:向脫脂大豆粉或大豆豆粕加入適量水或緩沖液配制料液，邊攪拌邊加熱，控制溫度在60-90℃，pH5-7;
步驟2:向上述料液中加入β-葡萄糖苷酶，繼續(xù)保溫低速攪拌進(jìn)行酶水解反應(yīng)，然后固液分離所得沉淀物備用，上清液用作下批提取的配料用水；
步驟3:向上述沉淀物中加入與大豆異黃酮苷元相似相溶的有機(jī)溶劑，邊攪拌邊提取，然后抽濾去渣，濾液進(jìn)一步經(jīng)真空濃縮得到大豆異黃酮苷元產(chǎn)品。
上述方法步驟l中所述大豆豆粕或脫脂大豆粉是來自油廠的下腳料大豆豆粕，也可以是將大豆經(jīng)粉碎和去油后所得的脫脂大豆粉；為了提高大豆異黃酮收率，脫脂大豆粉經(jīng)噴
射液化處理效果最佳；為了達(dá)到較好的效果，所用配料水含有20%乙醇，料水比推薦為 1:3-10 (w/v);本發(fā)明所述的緩沖液推薦檸檬酸緩沖液(pH5-7)。
上述方法步驟2中，所述的(3-葡萄糖苷酶，可由現(xiàn)有技術(shù)制得，本發(fā)明推薦使用耐熱 性P-葡萄糖苷酶，所說的耐熱性是指在酶最適溫度在6(TC以上，優(yōu)選海棲熱袍菌P-葡萄 糖苷酶。其水解條件，根據(jù)所選用的(3-葡萄糖苷酶的特性而定，推薦水解溫度控制在60-90℃。酶用量優(yōu)選500-1000 (U/g大豆豆粕或脫脂大豆粉)。
本發(fā)明方法中所述步驟3中可以向沉淀物中加入與大豆異黃酮苷元相似相溶的有機(jī)溶 劑，如乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、乙醚、二氯甲烷，進(jìn)行萃取，但從產(chǎn)品用于食品或藥品 安全性考慮，本發(fā)明推薦使用乙醇，至于乙醇濃度和用量，推薦使用濃度等于或高于75% 的乙醇，用量為沉淀物的3-10倍體積，如果在80℃下提取效果更佳。
本發(fā)明針對大豆異黃酮的溶解特性，采取邊提取邊轉(zhuǎn)化的方法，以改原有先提取大豆 異黃酮然后再將其生物轉(zhuǎn)化成苷元的兩步法，將高耐熱性P-葡萄糖苷酶用于大豆異黃酮 的熱提取工藝中，直接利用大豆豆粕或脫脂大豆粉制備大豆異黃酮苷元，使原料中的大 豆異黃酮邊抽提邊轉(zhuǎn)化，避免初始底物的濃度過高對酶催化的抑制作用，大大加快反應(yīng)速 度，提高酶水解效率，是目前最直接有效的途徑。與現(xiàn)有的酶法提取相比，該法生產(chǎn)周 期短、操作簡單、收率高、成本低、無污染。
本發(fā)明中所說的P-葡萄糖苷酶的制備可以由產(chǎn)P-葡萄糖苷酶的嗜熱微生物液體發(fā)酵 方法制得，例如，海棲熱袍菌Thermotoga manritima、 Thermotoga manritima、解 糖纖維素菌 Caldicellulosiruptor sacchrolyticus 嗜乙醇菌 Thermoanaerobacter ethanolicus熱梭菌Clodicellulosiruptor thermocellum可從美國菌種收藏中心購買，上述微 生物發(fā)酵產(chǎn)生的B-萄糖苷酶可以經(jīng)熱處理或分子篩及離子交換色譜制備成部分純化的 酶液。
本發(fā)明中提及的耐熱性P-葡萄糖苷酶還可通過利用基因重組技術(shù)將嗜熱微生物中的 p-葡萄糖苷酶基因表達(dá)在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞構(gòu)建基因工程菌來制備[參見薛業(yè)敏等人.海棲 熱袍菌極耐熱性葡萄糖醛酸酶基因的高效表達(dá)和重組酶純化.生物工程學(xué)報(bào)，2004, 22 (4): 554-560和李衛(wèi)芬等人多粘芽孢桿菌(5-葡聚糖酶特性及其基因克隆，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè) 與生命科學(xué)版)2004, 30 (3) :331- 335)
經(jīng)驗(yàn)證，采用本發(fā)明的方法，與未加酶處理的脫脂大豆粉中大豆異黃酮成分相比較， 染料木苷和黃豆苷水解效率可達(dá)98%以上(見圖2、圖3)，大豆異黃酮苷元的釋放率高， 大大提高了生產(chǎn)效率。由于酶法制備大豆異黃酮苷元，具有高效、專一，反應(yīng)條件溫和的 優(yōu)勢，因此，整個(gè)加工過程作用條件溫和，不使用酸堿等化學(xué)物質(zhì)，能耗低，污染小，操 作簡單易控，同時(shí)產(chǎn)物易純化，產(chǎn)品保持天然品質(zhì)；由于所用原料為來源廣泛的油廠下腳
料大豆豆粕，大大降低生產(chǎn)成本，同時(shí)酶解后的豆渣仍然可以用于醬油生產(chǎn)原料、飼料蛋 白添加劑以及環(huán)保材料，整個(gè)工藝過程不給環(huán)境帶來任何污染和廢物，具有重要的經(jīng)濟(jì)效 益和社會(huì)效益。
圖l是制備大豆異黃酮苷元的工藝流程示意圖。
圖2是未加酶處理的脫脂大豆粉中大豆異黃酮成分的HPLC圖譜。
色譜條件色譜柱Agilent HC-C18 (4.6mmx250mm ID， 5nm);柱溫30°C;流動(dòng)相A為0.1。/。磷酸水溶液，B為乙睛10。/。-35。/。；流速0.8mL/min;檢測波長260nm;進(jìn)樣量為20nL。以保留時(shí)間定性，以峰面積定量，以外標(biāo)法計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)樣品購于Sigma公司。其中保留時(shí)間12.1min為黃豆苷，保留時(shí)間20.0min為染料木苷，保留時(shí)間21.0min為丙二酰黃豆苷，保留時(shí)間29.0min為丙二酰染料木苷，保留時(shí)間33.5min為黃豆素，保留時(shí)間46.4min為染料木素。
圖3是酶處理后脫脂大豆粉中大豆異黃酮成分的HPLC圖譜。色譜條件同上，其中保留時(shí)間32.7min為染料木素，保留時(shí)間46.0min為黃豆素。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的含義。
下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例 只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
實(shí)施例l: P-葡萄糖苷酶的制備
本發(fā)明中的P-葡萄糖苷酶的制備可以海棲熱袍菌rtewwtoga w^vY/ma (具體操作參 考Yu Jiang， Qing Zhou, Kang Wu， Xiangqian Li， and Weilan Shao. A highly efficient method for liquid and solid cultivation of the anaerobic hyperthermophilic eubacterium 7Tzer附o/oga m^Wwa. F￡M5"M/cro6/o/2006， 259: 254-259)在含1.0%葡萄糖，0.5 g。/o酵母粉，2.7 % NaCl的培養(yǎng)基中，在溫度8(TC充C02和N2條件下靜置培養(yǎng)8 -10 h后收集細(xì)胞并破碎， 離心取上清液并用65%飽和度的硫酸銨沉淀酶蛋白，然后用0.02 M、 pH5.5磷酸緩沖液透 析后凍干即得P-葡萄糖苷酶。
實(shí)施例2:
如圖1所示的流程，具體操作如下 (1)將無霉變大豆去雜后磨成80目的大豆粉，然后用正己烷抽提去脂肪，獲得脫脂大豆粉；
(2) 將脫脂大豆粉，按料水比1:4溶于pH6.2 lOOmM磷酸鈉緩沖液，邊攪拌邊加 熱至溫9(TC加入800U/g海棲熱袍菌P-葡萄糖苷酶，保溫并低速攪拌3小時(shí)
(3) 所得酶解液經(jīng)離心分離，沉淀物用10倍體積80。/。乙醇8(TC下提取2h，然后抽 濾去渣，濾液進(jìn)一步經(jīng)真空冷凍干燥，所得產(chǎn)品采用HPLC高壓液相色譜檢測其中大豆 異黃酮的成分見圖3; HPLC分析條件色譜柱Agilent HC-CI8 (4.6mmx250mm ID， 5nm); 柱溫30°C;流動(dòng)相A為0.1。/。磷酸水溶液，B為乙睛10。/。-35。/。；流速0.8mL/min;檢 測波長260nm;進(jìn)樣量為20pL。以保留時(shí)間定性，以峰面積定量，以外標(biāo)法計(jì)算。標(biāo) 準(zhǔn)樣品購于Sigma和公司。
實(shí)施例3:與實(shí)施例l基本相同，不同之處在于所用原料為購于國內(nèi)生物技術(shù)公司的 大豆豆粕。采用料水比1:3將豆粕溶于pH 5檸檬酸緩沖液配制料液。
實(shí)施例4:與實(shí)施例l基本相同，不同之處在于所用原料為醬品廠用作醬油生產(chǎn)的大 豆豆粕，磷酸鈉緩沖液pH7。
實(shí)施例5:與實(shí)施例l基本相同，不同之處在于以大豆異黃酮粉為原料；采用料水比 1:10將豆粕溶于檸檬酸緩沖液配制料液；步驟2所得沉淀物直接低溫干燥后即可得到大豆
異黃酮苷元。
實(shí)施例6:與實(shí)施例l基本相同，不同之處在于所用的P-葡萄糖苷酶是解糖纖維素
菌CflW/ce〃w/o^wptor ^cc/w7"o/y"cm p-葡萄糖苷酶，反應(yīng)溫度80°C， pH 5.5下保溫5小 時(shí)，酶量為500U/g。
實(shí)施例7:與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于所用的P-葡萄糖苷酶是多粘芽孢菌 5ac,7/w戶(ym;/;ca (3-葡萄糖苷酶，反應(yīng)溫度60°C ， pH 5.0，下保溫10小時(shí)，酶量為1000U/g。
實(shí)施例8:與實(shí)施例l基本相同，不同之處在于步驟3中向沉淀物中加入3倍體積的 80%乙醇進(jìn)行提取。
實(shí)施例9:與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于步驟3中向沉淀物中加入8倍體積的 75%乙醇進(jìn)行提取。
實(shí)施例10:與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于步驟3中用乙酸乙酯、丙酮、正丁 醇、乙醚或二氯甲烷進(jìn)行萃取。
權(quán)利要求
1、一種大豆異黃酮苷元清潔高效制備方法，包括以下步驟步驟1向脫脂大豆粉或大豆豆粕加入適量水或緩沖液配制料液，邊攪拌邊加熱，控制溫度在60-90℃，pH5-7；步驟2向上述料液中加入β-葡萄糖苷酶，繼續(xù)保溫低速攪拌進(jìn)行酶水解反應(yīng)，然后固液分離所得沉淀物備用，上清液用作下批提取的配料用水；步驟3向上述沉淀物中加入與大豆異黃酮苷元相似相溶的有機(jī)溶劑，邊攪拌邊提取，然后抽濾去渣，濾液進(jìn)一步經(jīng)真空濃縮得到大豆異黃酮苷元產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的大豆異黃酮苷元清潔高效制備方法,其特征在于，所述步驟l 中配制料液的料水比為1:3-10。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆異黃酮苷元清潔高效制備方法,其特征在于,所述步驟2 中向配制料液加入耐熱性P-葡萄糖苷酶進(jìn)行酶水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度控制在60-90'C，酶用 量為500-1000 (U/g大豆豆粕或脫脂大豆粉)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的大豆異黃酮苷元清潔高效制備方法，其特征在于,其中所說的 耐熱性|3-葡萄糖苷酶是海棲熱袍菌P-葡萄糖苷酶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的大豆異黃酮苷元清潔高效制備方法，其特征在于，所述的步驟3中所說的與大豆異黃酮苷元相似相溶的有機(jī)溶劑，是乙醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的大豆異黃酮苷元清潔高效制備方法,其特征在于，所述步驟3中向酶解后的沉淀物加入3-10倍體積乙醇進(jìn)行抽提。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的大豆異黃酮苷元清潔高效制備方法,其特征在于,所述的乙 醇是濃度等于或高于75。/。的乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種大豆異黃酮苷元的清潔高效制備方法，其步驟包括將脫脂大豆粉或大豆豆粕溶解于水或緩沖液配制料液，向該料液中加入β-葡萄糖苷酶進(jìn)行水解，然后向酶解后的沉淀物加入乙醇進(jìn)行提取、抽濾去渣，濾液經(jīng)真空濃縮得到大豆異黃酮苷元產(chǎn)品。本發(fā)明以改原有先提取大豆異黃酮后將其生物轉(zhuǎn)化成苷元的兩步法，將耐熱性β-葡萄糖苷酶用于大豆異黃酮的熱提取工藝中，直接利用大豆豆粕或脫脂大豆粉制備大豆異黃酮苷元，使原料中的大豆異黃酮邊熱抽提邊轉(zhuǎn)化，避免初始底物的濃度過高對酶催化的抑制作用，大大加快反應(yīng)速度，提高酶水解效率，與現(xiàn)有的酶法提取相比，生產(chǎn)周期短、操作簡單、收率高、成本低、無污染，所得產(chǎn)品用于食品或藥品安全。
文檔編號C12P17/02GK101200744SQ20071019116
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者于瑾瑾, 彭靜靜, 薛業(yè)敏 申請人:南京師范大學(xué)