一種高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌mp-2及其產(chǎn)生的海洋微生物酯酶的制作方法

專利名稱：：一種高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌mp-2及其產(chǎn)生的海洋微生物酯酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海洋微生物領(lǐng)域，特別是從渤海海域底泥中篩選分離獲得的一種高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2及其產(chǎn)生的海洋微生物酯酶。技術(shù)背景微生物酯酶來(lái)源于自然界的微生物，在自然界中能產(chǎn)生酯酶的微生物資源有陸源生物和海洋微生物，陸源微生物例如從黃石公園溫泉得到的一株耐熱的極端微生物Thermusaquaticus，該菌株培養(yǎng)溫度為80°C，DongG等人從Thermusaquaticus中分離出的胞外堿性磷酸酯酶最適溫度為7580°C;從Thermotaganeaplitana分離純化得到胞內(nèi)堿性磷酸酯酶最適溫度為85'C。ThermusSp.FD3041是國(guó)內(nèi)溫泉分離得到的一株棲熱菌，培養(yǎng)溫度為70°C。得到的胞內(nèi)堿性磷酸酯酶FD2TAP，最適溫度是70°C。Pyrococcusabyssi是從深海火山中分離得到的異養(yǎng)古細(xì)菌，最適生長(zhǎng)溫度是100°C，得到胞內(nèi)堿性磷酸酯酶的最適溫度為70t:等。然而現(xiàn)有陸源微生物酯酶常因耐酸、耐堿或耐熱性能差，應(yīng)用范圍受到很大限制，因此尋找具有特殊性質(zhì)的微生物酯酶及其產(chǎn)生菌株受到世界各國(guó)的高度重視，已成為該領(lǐng)域關(guān)注的中心之一。海洋環(huán)境中的微生物資源十分豐富，而且由于海洋環(huán)境條件的獨(dú)特性，包括高鹽、高壓、低營(yíng)養(yǎng)、低溫等，造就了海洋微生物有別于陸生微生物的許多特異性，海洋環(huán)境微生物及其所產(chǎn)生的酶也相應(yīng)具有一些特殊的性質(zhì)，尤其海洋微生物酯酶具有更為獨(dú)特的生理功能和廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。此外，海洋微生物不易培養(yǎng)、形態(tài)多樣且在保藏和移種過(guò)程中很容易死「"等，導(dǎo)致對(duì)于它們種類區(qū)分的困難，不利于海洋微生物研究和開(kāi)發(fā)的深入，因此若從海洋環(huán)境中定向分離各種特殊性質(zhì)酯酶的產(chǎn)生菌，構(gòu)建一個(gè)酯酶產(chǎn)生菌的菌種庫(kù)，具有極大的實(shí)用性。目前迫切需要開(kāi)發(fā)達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠和良好經(jīng)濟(jì)性的選育分離手段和方法，以便能分離得到有用微生物菌株，為海洋微生物資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。與此同時(shí)，需要建立--些簡(jiǎn)單、方便、易于操作的分類鑒定方法對(duì)海洋微生物進(jìn)行分析，使人們?cè)谝欢ǔ潭壬细茖W(xué)、更精確、更快速地找到海洋分離物的分類地位，為海洋微生物資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。目前，大分子rRNA已成為一個(gè)分子指標(biāo)，廣泛地用干各種微生物的遺傳和分子差異的研究，加上大量已知微生物的DNA都已被測(cè)定并輸入國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)，成為微生物鑒定分類非常有用的參照系統(tǒng)，從而可以通過(guò)對(duì)未知微生物DNA序列的測(cè)定和比較分析，達(dá)到以其進(jìn)行快速、有效的鑒定分類的目的。微生物酯酶是一種重要的工業(yè)酶類，涉及到酯合成、內(nèi)酯合成、酯交換、多肽合成、立體異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化和拆分等催化反應(yīng)，酯酶催化不需要輔酶且具有反應(yīng)條件溫和、方法簡(jiǎn)便、催化活性高、選擇性強(qiáng)、產(chǎn)物易于分離、易于回收等優(yōu)點(diǎn)。因此廣泛應(yīng)用于食品r:業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、H用化工業(yè)、軍事和生物防護(hù)等領(lǐng)域。尤其嗜熱酯酶的高溫反應(yīng)活性，以及對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，使它在食品、醫(yī)藥、制革、石油丌采及廢物處理等方面都有廣泛的應(yīng)用潛力。図際上自九十年代初到現(xiàn)在，相繼丌發(fā)出中溫酯酶、高溫堿性酯酶、中溫堿性酯酶等，但酯酶的酶學(xué)性質(zhì)仍無(wú)法滿足現(xiàn)代工業(yè)的需求。因此從海洋中篩選出具有獨(dú)特酶學(xué)性質(zhì)的海洋微生物酯酶，實(shí)為微生物酯酶開(kāi)發(fā)的一大進(jìn)歩，并將會(huì)對(duì)酶制劑工業(yè)帶來(lái)新的生機(jī)和活力。從上世紀(jì)七十年代，國(guó)外就開(kāi)始對(duì)產(chǎn)酯酶海洋細(xì)菌進(jìn)行了篩選，但未見(jiàn)有關(guān)海洋微生物產(chǎn)酯酶制備和性質(zhì)方面的報(bào)道(M.Chandrasekaran,1997)。我國(guó)海洋微生物酯酶研究起歩較晚，僅有楊從發(fā)等人從海水，海泥海洋生物的消化道分離到堿性酯酶產(chǎn)生菌(楊從發(fā)，2000)。但由于海洋微生物存在海水培養(yǎng)和酯酶分離純化困難等問(wèn)題，限制了海洋酯酶在制備與應(yīng)用方面的進(jìn)一歩開(kāi)發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在不足。經(jīng)發(fā)明人長(zhǎng)期從事海洋微生物酶學(xué)T.程的開(kāi)發(fā)研究及篩選菌株的基礎(chǔ)研究中，丌發(fā)出快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠和良好經(jīng)濟(jì)性相結(jié)合的選存分離手段，從而提供一株高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2及其產(chǎn)生的海洋微生物酯酶。本發(fā)明提供的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2，是從渤海海底淤泥中篩選分離獲得的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌Bacillussp.MP-2(簡(jiǎn)稱菌株MP-2)，于2007年6月9R保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)這CCTCCNo:M207078。本發(fā)明提供的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2的形態(tài)特征形態(tài)特征菌株MP-2的菌落表面光滑，紅褐色，半透明，邊緣整齊，有樹(shù)根狀隆起；細(xì)胞桿狀，大小為(0.3-().8)nmx(2.0-3.0)nm，二分裂法繁殖，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜，菌株革蘭色染色為陽(yáng)性，偶爾能觀察到橢圓形的芽孢，芽孢中生，芽孢囊無(wú)明顯膨大。培養(yǎng)特征嚴(yán)格好氧，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上中度生長(zhǎng)，菌落平、光滑、黃灰色、無(wú)可溶性色素；假若表面潮濕可以活躍擴(kuò)展，邊緣不整齊。在葡萄糖瓊脂平板上生長(zhǎng)較厚，可變成皺褶。核酸序列于說(shuō)明書(shū)未頁(yè)菌株MP-2及其從GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)集的相關(guān)屬種構(gòu)建的以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖18)將其與從GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)集的芽孢桿菌屬相關(guān)菌株的16SrDNA序列進(jìn)行比較。從所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以明顯看出，菌株MP-2與本屬一個(gè)有效發(fā)表種地衣芽孢桿菌(a/zY'/w"〖/o，/.s')形成個(gè)單獨(dú)的分支，16SrDNA序列同源性達(dá)97。/。。該分支與K它兒種芽抱桿菌聚成一群，其中菌株MP-2與JS.//C/^訓(xùn)/W7^,S，^/fc的同源性分別為%.3%，95.0%，發(fā)育關(guān)系較近。細(xì)菌分類學(xué)家普遍認(rèn)為當(dāng)16SrRNA序列同源性高于97。/。，"J—以認(rèn)為是屬內(nèi)的同種，低于93%-95%則可能為屬外成員。并且該菌株與地衣芽孢桿菌的形態(tài)特征、生理生化特征沒(méi)有較大差異且與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別做陰陽(yáng)性對(duì)照。因此，菌株MP-2為芽孢桿菌(5"d腸sp.MP-2)。菌株MP-2篩選自深海底泥；能在4t:-5(rC生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度3(TC;并且通過(guò)耐鹽頭'驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改菌株能在0e/。-9。/。NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)最適鹽濃度為4%。因此依據(jù)海洋微生物的定義，結(jié)合本菌株的來(lái)源、低溫適應(yīng)性、鹽耐受性，認(rèn)為該菌株為海洋細(xì)菌。'j陸棲細(xì)菌相比，海洋細(xì)菌普遍耐鹽，最適鹽度在2%-5%，可以利用耐鹽度篩選真正的海洋細(xì)菌。生理生化特性菌株MP-2的生理生化特性，列于表1，特征地衣芽孢桿菌菌株MP-2菌體大小(微米)().50.9x230.30.8x2~3革蘭氏染色V+孢囊膨大-—芽孢主要位置中生中生芽孢形狀橢圓或柱狀橢圓伴抱晶體一—鞭毛周生周生運(yùn)動(dòng)性十+厭氧生長(zhǎng)+-接觸酶十+氧化酶d+V-P++硝酸鹽還原+檸檬酸鹽利用+H2S產(chǎn)?！胚岙a(chǎn)生--水解:淀粉++明膠+產(chǎn)酸:D-葡萄糖+D-阿拉伯糖+-D-t露醇++D-木糖++葡萄糖產(chǎn)氣(-)—--50°C—+2%Na(:l+5%Na(:l++7%NaCl十pH5.5—+pH7.0f+pHlO.OND+注+，卯-100%的菌株為陽(yáng)性；-，90-100%的菌株為陰性；d，11-89%的菌株為陽(yáng)性；V，在一個(gè)菌株內(nèi)性質(zhì)不穩(wěn)定；ND，未測(cè)定。通過(guò)對(duì)菌株MP-2形態(tài)特征、生理生化特征以及16SrDNA序列進(jìn)行的多相分類研究，發(fā)現(xiàn)該菌株具有典型的芽孢桿菌屬的形態(tài)學(xué)特征。16SrDNA序列與本屬菌株序列同源性都很高，其中與本屬中的地衣芽孢桿菌的序列同源性達(dá)97%，結(jié)合地衣芽孢桿菌的形態(tài)特征、生理生化特征且與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別做陰陽(yáng)性對(duì)照，將菌株MP-2定為芽孢桿菌(Sad腸sp.MP-2)。菌株MP-2的發(fā)酵培養(yǎng)菌株MP-2的生長(zhǎng)曲線對(duì)菌株MP-2進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基葡萄糖1%，NaC10.5%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，每隔2h取樣，在550nm處測(cè)定菌懸液的OD值，其OD曲線(即生長(zhǎng)曲線)如圖2所示。由圖2可知，菌株MP-2由接種到第4h處于延滯期，細(xì)胞的生理狀態(tài)從衰退變?yōu)榛謴?fù)，即將生長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目并不增加從第4h到第6h處于加速期，這期間細(xì)胞最初的分裂已經(jīng)進(jìn)行，并目.細(xì)胞數(shù)目丌始增加；從第6h到第12h為指數(shù)生長(zhǎng)期，此期間細(xì)胞的同化作用大于異化作用，代謝旺盛，處于積極的生長(zhǎng)的狀態(tài)，細(xì)胞成分平衡發(fā)展；從第12h到第16h細(xì)胞處于減速時(shí)期，細(xì)胞分裂后狀態(tài)不變而停止生長(zhǎng)，16h后處于穩(wěn)定期，同化作用與異化作用基本保持平衡。菌株MP-2發(fā)酵曲線由圖3可知，菌株MP-2在032h，酯酶活性幾乎沒(méi)有提高，從36h后，酯酶活力迅速上升，在56h達(dá)到最大值。培養(yǎng)基組成的影響碳源對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶的影響根據(jù)本章基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成，以相應(yīng)碳源代替葡萄糖，按照培養(yǎng)方法進(jìn)行活化，隔時(shí)取樣，對(duì)葡萄糖、蔗糖、E米粉、花生粕、可溶性淀粉，棉籽等碳源在不同的濃度下做單因素試驗(yàn)圖4。通過(guò)對(duì)碳源篩選，發(fā)現(xiàn)-些農(nóng)副產(chǎn)品能夠很好促進(jìn)酯酶的生產(chǎn)。其中以花生粕效果最佳，花生粕是天然培養(yǎng)基成分，含有細(xì)胞所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分，因此對(duì)產(chǎn)酶提高是碳源和其它營(yíng)養(yǎng)成分的綜合作用，且價(jià)格低廉，適宜作為工業(yè)發(fā)酵的培養(yǎng)基原料。與之相比，培養(yǎng)基中僅含葡萄糖時(shí)，酯酶產(chǎn)量較低。根據(jù)以往文獻(xiàn)和資料顯示，葡萄糖一般是碳源中最容易利用的糖。因此以葡萄糖為碳源時(shí)，可能由于微生物很快將碳源消耗盡，且菌體密度迅速增大導(dǎo)致?lián)u瓶中溶氧不足，從而導(dǎo)致酯酶的產(chǎn)量下降。因此在工業(yè)生產(chǎn)酯酶時(shí)，在供氧條件的前提下，可以考慮葡萄糖和花生粕共同作為微生物培養(yǎng)基中的碳源。通過(guò)優(yōu)化配比，從而達(dá)到快速利用的碳源和緩慢利用碳源的優(yōu)化組合，這樣即可以迅速使微生物達(dá)到一定的生長(zhǎng)密度，同時(shí)又保證有充足的碳源可用于酯酶的合成又不至于加劇發(fā)酵過(guò)程中的供氧負(fù)擔(dān)。氮源對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶的影響用相應(yīng)的氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的牛肉膏在不同濃度下做無(wú)機(jī)氮源、有機(jī)氮源以及復(fù)合氮源包括蛋白陳、豆餅粉、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、尿素等對(duì)菌株MP-2進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。氮源作為培養(yǎng)基中的主要成分，用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物，常用的氮源分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。氮源篩選結(jié)果(圖5)所示培養(yǎng)基中添加有機(jī)氮源時(shí)，酯酶產(chǎn)量明顯優(yōu)于培養(yǎng)基中只含無(wú)機(jī)氮源情況，其中以豆餅粉與硫酸銨相組合的復(fù)合氮源效果最佳且價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛而成為理想發(fā)酵原料，與有機(jī)氮源相比，硫酸銨和尿素不適宜單獨(dú)作為培養(yǎng)基的氮源。無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶的影響將常見(jiàn)的無(wú)機(jī)鹽的代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的相應(yīng)成分作余屬離子對(duì)菌株MP-2的產(chǎn)酶試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。山圖6看出，MgS04和KH2P04在濃度0.05%對(duì)菌株MP-2的產(chǎn)酶有較大的促進(jìn)作用CaCl2對(duì)產(chǎn)酶幾乎沒(méi)有影響，但隨著濃度的增加對(duì)產(chǎn)酶具有抑制作用；而FeS04、ZnS04、CuS04、PbCl2等無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶具有抑制作用，其中ZnS04、PbCl2的抑制尤為明顯。由此可知，濃度為0.05。/。的MgSO4和KH2PO4兩種無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶效果最佳。酯類、脂肪酸脂、結(jié)構(gòu)類似物及表面活性劑對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶的影響將不同種類與數(shù)量的酯類、脂肪酸酯、結(jié)構(gòu)類似物及表面活性劑添加到培養(yǎng)基中(詳見(jiàn)圖7)，接種培養(yǎng)后測(cè)定酯酶活力。山圖7分析可知，當(dāng)添加0.8(v/v)的花生油和Tween-80(聚環(huán)氧乙烷失水山梨糖醇單油酸酯)時(shí)，相對(duì)酶活有所提高；添加三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯、Tween-20(聚環(huán)氧乙烷失水山梨糖醇單月桂酸酯)時(shí)，則對(duì)產(chǎn)酶幾乎沒(méi)有影響，當(dāng)添加橄欖油時(shí)，對(duì)產(chǎn)酶有明顯的抑制作用。山此可見(jiàn)，添加誘導(dǎo)物的種類和數(shù)量對(duì)產(chǎn)酶有明顯影響，菌株MP-2所產(chǎn)酶可能為誘導(dǎo)酶。培養(yǎng)條件初始pH對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶的影響將pH6.07.5的Na2HPO4-檸檬酸，pH88.5甘氨酸-NaOH的緩沖液作為培養(yǎng)基的初始pH，接種培養(yǎng)后測(cè)定酯酶活力，相對(duì)酶活如圖8。山圖8可知，以培養(yǎng)基初始pH為7.0時(shí)菌株MP-2產(chǎn)酶最好，相對(duì)酶活力達(dá)到最大值。接種量對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶的影響以3.0%，4.0%，5.0%，6.0%，7.0%和8.0%的接種量在相同的條件下培養(yǎng)后測(cè)其酶活，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，接種量對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶影響較顯著，以6.0%的接種量為最佳。培養(yǎng)溫度和時(shí)間對(duì)菌株MP-2產(chǎn)酶的影響分別在25'C，30°C，32°C,35"四種不同溫度下，從一開(kāi)始培養(yǎng)起每隔4h進(jìn)行取樣測(cè)定酶活，得出在四種不同溫度及不同培養(yǎng)時(shí)間下的酶活變化曲線，如圖10所示。由圖10可知，當(dāng)反應(yīng)溫度較高時(shí)(30°C)，可能由于加快酶促反應(yīng)，而導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵周期縮短，但同時(shí)由于溫度的提高導(dǎo)致酯酶比較容易失活或者培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分迅速消耗，從而導(dǎo)致酯酶發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的穩(wěn)定期較短。當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)(25°C)，可能由于菌體生長(zhǎng)緩慢，酯酶生產(chǎn)的達(dá)峰時(shí)間拖后，整個(gè)發(fā)酵周期延長(zhǎng)，并且脂肪酶的產(chǎn)量下降。因此，過(guò)低和過(guò)高的溫度對(duì)于脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)均不適宜。因此30x:為最佳產(chǎn)酶溫度，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響很顯著，在40-48h之間，酶活達(dá)到最高。對(duì)產(chǎn)酶有顯著影響(PO.05)的因素為花生粕，豆餅粉和接種量。其中花生粕對(duì)產(chǎn)酶呈現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)，豆餅粉和接種量呈現(xiàn)正效應(yīng)，其他因素的變化對(duì)產(chǎn)酶的影響不顯著。山各因素效應(yīng)得出，欲要提高酶活力，應(yīng)提高豆餅粉濃度，延長(zhǎng)種齡，降低花生粕濃度。當(dāng)花生粕濃度在0.751.25%，豆餅粉濃度在2~3%,接種量濃度在5~7%之間，酯酶活力最高。當(dāng)濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致酯酶活力下降。菌株MP-2產(chǎn)酯酶發(fā)酵的最佳條件花生粕0.9%;豆餅粉2.29%;(NH4)2SO40.2%;KH2PO40.1%;K2HPO40.1%;MgSO40.05%;Tween800.8%;花生油0.8%;pH為7.0;發(fā)酵溫度30。C;種齡12h;接種量5.98%。在此條件F，優(yōu)化后酶活力山258.8U/mL提高到318.2U/mL。海洋微生物酯酶(簡(jiǎn)稱酯酶)的酶學(xué)性質(zhì)海洋微生物酯酶最適作用溫度由圖11可知，該酯酶在60t:時(shí)酶活性最高，在50'C到70'c之間相對(duì)酶活保持在80%之間，高f70'C或低于50'C時(shí)則酶活呈下降趨勢(shì)，在4'C和100'C時(shí)相對(duì)酶活只能維持在25。/。。由此可知，酯酶最適作用溫度范圍507(TC，在60。C表現(xiàn)出了最高活性，為最適作用溫度。酯酶最適作用pH所謂酶的最適作用pH就是指酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值，并且高于或低于某一pH值，酶促反應(yīng)速度都會(huì)降低。各種酶的最適pH各不相同，而且有時(shí)隨著底物的不同而各異。在2.512范圍內(nèi)，向酶反應(yīng)體系中分別添加相差1個(gè)單位pH的Na2HP04-檸檬酸(pH2.58)，甘氨酸—NaOH緩沖液(pH812)，測(cè)定了酶在不同pH緩沖體系下的活性。結(jié)果如圖12所示山圖12可知當(dāng)pH為10時(shí)的酶相對(duì)活性最高，為酯酶的最適作用pH，但當(dāng)pH2.59時(shí)酶活只能維持在70%以下，認(rèn)為主要原因是由于pH值引起的酸堿度變化對(duì)酶-底物或酶-底物的中間物的電離情況發(fā)生變化，使酶蛋白質(zhì)出現(xiàn)不可逆變性。就此酶而言，反應(yīng)介質(zhì)的pH變化影響到酯酶與底物對(duì)硝基苯磷酸酯的結(jié)合，使得曲線呈現(xiàn)倒"V"型，說(shuō)明介質(zhì)的pH變化對(duì)該酯酶酶活有很強(qiáng)的作用。酯酶的熱穩(wěn)定性酯酶溶于pH10的NaOH-甘氨酸的緩沖液中，置于不同溫度(470°C)下，恒溫水浴處理2h，每隔20min取樣，迅速冷卻，測(cè)定其殘余酶活，以不經(jīng)處理的酶活為100%，其余折合成剩余酶活力的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果于圖13由圖13可知，在經(jīng)恒溫水浴處理2h后，酯酶在440"酶活能保持80%以上，5060'C酶活仍能維持在60。/。以上，表明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。酯酶的pH穩(wěn)定性酯酶溶于不同pH(212)的緩沖液中，置于4'C下，保溫48h后，再將酶液調(diào)回到最適pH10，以最適反應(yīng)pH10下保溫所得的酶活力為100%，其余折合成剩余酶活力的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果于圖14。從圖14可以看出，酯酶置于4'C卜"，保溫48h后，在pH29酶活只能保持30%以卜'，而在pH10酶活性維持在70%以h，表明在pH10該酶較穩(wěn)定屬于堿性酶。金屬離子對(duì)酯酶活性的影響在酯酶測(cè)活體系中加入各種金屬離子，并保持測(cè)活反應(yīng)體系中金屬離子濃度為0.01mol/L，以緩沖液作對(duì)照于60'C、pH10測(cè)定酯酶活性，結(jié)果于圖15。山圖15可知<:02+，Li+對(duì)酶具有激活作用，012+對(duì)酯瞎的活力沒(méi)有顯著影響，而C」+、Pb2+、Ag+、Mn2—、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+對(duì)酯酶的活性有抑制作用?；瘜W(xué)試劑對(duì)酯酶的影響酯酶溶液中加入各種化學(xué)試劑，并保持試劑的濃度為10mmol/LSDS(十二烷基硫酸鈉)、1mol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)、10mmol/L半胱氨酸、10mmol/LEDTA、10%尿素、10%Tween-20、10%Tween-80、以緩沖液為對(duì)照于常溫下靜置30min,于60。C、pH10測(cè)定酯酶相對(duì)活性，結(jié)果于圖16山圖16可知，SDS,EDTA，Tween-20對(duì)酯酶的抑制效果顯著。此外，當(dāng)酯酶溶液中加入IOmmol/L的EDTA時(shí)，酯酶的活性被抑制到4.91%，由此可推測(cè)該酯酶的活性中心可能含有金屬離子。金屬螯合劑EDTA對(duì)耐熱堿性磷酸酯酶有抑制作用。酯酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性酯酶溶于有機(jī)溶劑，在常溫卜_反應(yīng)4h，經(jīng)過(guò)濾后揮發(fā)除去有機(jī)溶劑測(cè)其酶活，以酶的pH10的緩沖液為對(duì)照，結(jié)果于圖17。由圖17可知，常見(jiàn)有機(jī)溶劑中除了二甲基亞砜對(duì)酶活的抑制作用顯著外，其他有機(jī)溶劑對(duì)酶活幾乎無(wú)影響，其中l(wèi)H己烷對(duì)酶活影響最小。說(shuō)明此酶對(duì)常見(jiàn)有機(jī)溶劑的具有良好的耐受力。酯酶對(duì)底物選擇性的研究將酯酶作用于具有不同的碳鏈長(zhǎng)度、不同的飽和度及不同的分支程度的甘油三酯。取-定的酶液與1mmol/L各種酯的水溶液或乳化液混勻放入反應(yīng)器中，采用氫氧化鈉滴定法和分光光度計(jì)法測(cè)定酯酶活力，以/>NPP為底物的酶活為100%，其余折合成剩余酶活力的百分?jǐn)?shù)結(jié)果于表2。表2酯酶對(duì)底物的選擇性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>對(duì)底物的選擇性是酯酶的-個(gè)重要的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)不同碳原子數(shù)的各種甘油酯的水解時(shí)發(fā)現(xiàn)，該酯酶的水解活力隨底物中脂肪酸鏈長(zhǎng)的增長(zhǎng)而活力下降。短碳鏈的甘油酯如三醋酸甘油酯、三丁酸甘油酯及乙酸乙酯的相對(duì)酶活較高，分別為66.5%、45.8%和56.9%，但對(duì)長(zhǎng)碳鏈的高級(jí)脂肪酸脂如18碳三油酸甘油酯不水解，眾所周知，橄欖油是判斷脂肪酶酶活的最佳底物之一，該酯酶對(duì)橄欖油催化活力最低，不表現(xiàn)出酶活，說(shuō)明脂肪酶和酯酶存在底物的差異性。通過(guò)上述對(duì)該酯酶的基本性質(zhì)的研究表明最適作用溫度范圍5070'C，在6(TC表現(xiàn)出了最高活性，屬于耐熱酶；當(dāng)pH為10時(shí)的酶活性最高，為酯酶的最適作用pH，屬于堿性酶，其pH值作用范圍比較窄；酯酶在經(jīng)恒溫水浴處理2h后，在44(TC酶活能保持80%以上，5060'〇酶活仍能維持在60%以上，表明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性；酯酶置于4'C下，保溫48h后，在pH29酶活只能保持30y。以下，而在pH10酶活性維持在70%以上，表明在pH10該酶較穩(wěn)定。通過(guò)金屬離子、化學(xué)試劑、有機(jī)溶劑對(duì)酯酶活性影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明Co2+，Li+對(duì)酶具有激活作用，Ca2+對(duì)酯酶的活力沒(méi)有顯著影響，而C一+、Pb2+、Ag+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+對(duì)酯酶的活性有抑制作用；SDS，EDTA，非離子表面活性劑Tween-20對(duì)酯酶的抑制效果顯著；常見(jiàn)有機(jī)溶劑中除了二甲基亞砜對(duì)酶活的抑制作用顯著外，其他有機(jī)溶劑對(duì)酶活幾乎無(wú)影響，其中正己烷對(duì)酶活影響最小。說(shuō)明此酶對(duì)常見(jiàn)有機(jī)溶劑的具有良好的耐受力。通過(guò)對(duì)該酯酶的底物選擇性的研究表明以p-NPP為底物的酶活為100。/。，短碳鏈的計(jì)油酯如三醋酸甘油酉旨、三」'酸甘油酯及乙酸乙酯的相對(duì)酶活較高，分別為66.5%、45.8%和56.9%，但對(duì)長(zhǎng)碳鏈的高級(jí)脂肪酸脂如18碳三油酸甘油酯和橄欖油不表現(xiàn)活性。說(shuō)明該酯酶的水解活力隨底物中脂肪酸鏈長(zhǎng)的增長(zhǎng)而活力下降。本發(fā)明提供的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2及其產(chǎn)生海洋微生物酯酶被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化工、食品、能源及環(huán)保等領(lǐng)域。圖l為菌株MP-2的電鏡照片(3000X)圖2為菌株MP-2的生長(zhǎng)曲線圖3為菌株MP-2的發(fā)酵曲線圖4為碳源對(duì)酯酶產(chǎn)量的影響(圖示l.葡萄糖2.蔗糖3.玉米粉4.花生粕5.可溶性淀粉6.棉籽餅粉)圖5為氮源對(duì)酯酶產(chǎn)量的影響(圖示1.蛋白胨2.豆餅粉+硫酸鈸3.酵母膏4.牛肉膏5.豆餅粉6.硫酸銨7.尿素)圖6為無(wú)機(jī)鹽對(duì)酯酶產(chǎn)量的影響(圖示l.空白對(duì)照2.氯化鈣3.硫酸鎂4.磷酸二氫鉀5.硫酸鐵6.硫酸銅7.氯化鋇8.硫酸鋅9.氯化鉛)圖7為酯類、脂肪酸、結(jié)構(gòu)類似物及表面活性劑對(duì)酯酶產(chǎn)量的影響(圖示l.空白對(duì)照2.花生油3.玉米油4.豆油5.葵花油6.橄欖油7.吐溫-808.吐溫-209.三丁酸甘油酯10.三油酸甘油酯)圖8為初始PH對(duì)酯酶產(chǎn)量的影響圖9為接種量對(duì)酯酶產(chǎn)量的影響圖10為溫度對(duì)酯酶產(chǎn)量的影響圖11為溫度對(duì)酯酶活力的影響圖12為PH對(duì)酯酶活力的影響圖13為酯酶的熱穩(wěn)定性圖14為酯酶的PH穩(wěn)定性圖15為金屬離子對(duì)酯酶活力的影響圖16為化學(xué)試劑對(duì)酯酶活力的影響圖17為酯酶在機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性圖18為菌株MP-2及其從(;enBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)集的相關(guān)屬種構(gòu)建的以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)具體實(shí)施方式本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一歩說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例實(shí)施例l初選將渤海海域底泥1克加入裝有20mL無(wú)菌水的250mL三角瓶中(內(nèi)放數(shù)十粒玻璃珠)，振蕩均勻后用移液管吸5mL懸浮液加入盛有25mL富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30"C卩，200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。篩選細(xì)菌富集48h，霉菌富集96h，再移取5mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。如此重復(fù)3次，然后進(jìn)行平板稀釋分離。培養(yǎng)基的組成葡萄糖1.0;牛肉膏1.0;蛋白胨1.0;NaC10,5;調(diào)pH至7.0。初篩平板培養(yǎng)基的組成初篩細(xì)菌培養(yǎng)基+三醋酸甘油酯1.0(V/V)(均經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器除菌后加入)+瓊脂2.0。富集過(guò)的培養(yǎng)液涂布在初篩平板上，放入恒溫培養(yǎng)箱中，30'C培養(yǎng)，相隔24h定期的觀察結(jié)果。采用涂布法操作，將具有變色透明圈的菌落選出，細(xì)菌挑至細(xì)菌斜面培養(yǎng)基上保存，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)將初篩的菌株接入裝有25mL復(fù)篩培養(yǎng)基的三角瓶中，在30。C下，200r/min，進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)36h，霉菌培養(yǎng)72h。在4'C下，15000r/min離心培養(yǎng)后的發(fā)酵液，得上清液即為粗酶液。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖1.0;牛肉膏1.0;蛋白胨1.0;NaC10.5;i周pH:至7.0。將上述發(fā)酵培養(yǎng)液打孔注入裝有溴甲酚紫的檢測(cè)培養(yǎng)基平板中，于30'C恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)，以p-Npp(對(duì)硝基苯棕櫚酸酯)為底物進(jìn)行測(cè)活，篩選到一株高產(chǎn)海洋微生物酯酶的菌株MP-2，酶活達(dá)218.6u/ml。經(jīng)鑒定為芽孢桿菌Bacillussp.MP-2。實(shí)施例2將菌株MP-2通過(guò)三角瓶搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度3(TC，種齡12h，接種量5.98%,發(fā)酵培養(yǎng)基花生粕0.9%;豆餅粉2.29%;(NH4)2SO40.2%;KH2PO40.1%;K2HP040.1%;MgSO40.05%;Tween-800.8%;花生油0.8%;pH為7.0。發(fā)酵培養(yǎng)后酶活力高達(dá)318.2u/ml。序列表<110〉中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所<120>—種高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2及其產(chǎn)生的海洋微生物酯酶<160>1<210>1<211〉1417<212>DNA<213>芽孢桿菌(Bacillussp.MP-2)<400>15,-tgcgtgtcgagcggactgatgggagcttggtccctgatgttgtcggcggtcggttgagta60acacgtgtataacctgcctggaagactggtataactccgggaaaccggcgctaataccgg120atgcttgattgaaccgcatggttcaattataaaaggtggcttttagctaccacttacaga180tggacccgcggcgcattatctagctgctcagttcggctcaccaaggcgacgatgcgtatc240cgacctgagagggtgatcagtctcaatgtcattgacaccttccccagactcctacgggag300gcagcacttaggaatcttccgcaatggatgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtg360atgaaggttttcggatcgtacaactctgttgttaaggaagaacatgtaccgttcgaatat420ctgggtaccttgacggtacctaatctcaaagcctgggctaactacgtgccagcagccgcg480gtaatacgtaggtggtcaagcgttgtcccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcg540gtttottaagtctgatgtgaaagcccccggctcaacccggggagggtcattggaaactgg600ggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagaga660tgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcga720aagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgc780taagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctg840gggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtgg900agcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgac960aaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgt1020cagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagt1080tgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggg1140gatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcag1200acaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggat1260cgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgcc1320gcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaac1380acccgaagtcggtgaggtaacctttgagccagccgct141權(quán)利要求1.一種高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2，其特征在于該芽孢桿菌MP-2是從渤海海底淤泥中篩選分離獲得的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌Bacillussp.MP-2，于2007年6月9日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNoM207078。2、根據(jù)權(quán)利要求l的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2，其特征在于該海芽孢桿菌MP-2的形態(tài)特征形態(tài)特征菌株MP-2的菌落表面光滑，紅褐色，半透明，邊緣整齊，有樹(shù)根狀隆起；細(xì)胞桿狀，大小為0.3-0.8pmx2.0-3.0pm，二分裂法繁殖，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜，菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性，偶爾能觀察到橢圓形的芽孢，芽孢中生，芽孢囊無(wú)明顯膨大；培養(yǎng)特征嚴(yán)格好氧，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上中度生長(zhǎng)，菌落平、光滑、黃灰色、無(wú)可溶性色素；假若表面潮濕可以活躍擴(kuò)展，邊緣不整齊；在葡萄糖瓊脂平板上生長(zhǎng)較厚，可變成鈹褶。3、根據(jù)權(quán)利要求l的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2，其特征在于MP-2的核酸序列為測(cè)定菌株MP-2的16SrDNA核苷酸序列全長(zhǎng)為1417bp，序列如下4.根據(jù)權(quán)利要求1的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2，其特征在于生理生化特性為菌株MP-2的生理生化特性，特征地衣芽孢桿菌菌株MP-2菌體大小(微米)0.5~0.9x230,30.8x2'革蘭氏染色V+孢囊膨大--芽孢主要位置中生中生芽孢形狀橢圓或柱狀橢圓伴孢晶體--鞭毛周生周生運(yùn)動(dòng)性++厭氧生長(zhǎng)+-接觸酶++氧化酶d+V-P++硝酸鹽還原++檸檬酸鹽利用++HA產(chǎn)生--吲哚產(chǎn)生--水解:淀粉++明膠++產(chǎn)酸:D-葡萄糖++D-阿拉伯糖+-D-甘露醇++D-木糖++葡萄糖產(chǎn)氣(-)-生長(zhǎng)5°C50°C-+<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注+，90-100%的菌株為陽(yáng)性；-，90-100%的菌株為陰性；d，11-89%的菌株為陽(yáng)性；v，在一個(gè)菌株內(nèi)性質(zhì)不穩(wěn)定；ND，未測(cè)定。種權(quán)利要求l的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2的高產(chǎn)海洋微生物酯酶。全文摘要本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)海洋微生物酯酶的芽孢桿菌MP-2，其特征在于該細(xì)菌MP-2是從渤海海底淤泥中篩選分離獲得的高產(chǎn)海洋微生物酯酶的菌株芽孢桿菌Bacillussp.MP-2，于2007年6月9日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNoM207078，以及高產(chǎn)海洋微生物酯酶，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化工、食品、能源及環(huán)保等領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12N1/20GK101225369SQ200710179288公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2007年12月12日優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日發(fā)明者謐孫,王躍軍,翠袁,郝建華申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所