專利名稱：一株對多菌靈具有高抗活性的黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株對多種農(nóng)藥具有抗性的黑曲霉菌株，由于該菌株經(jīng)誘變后，獲得穩(wěn)定遺傳的、對多種常用農(nóng)藥具有抗性的特征，同時并未在殺線蟲能力方面表現(xiàn)下降，可用于植物寄生線蟲的生物防治，尤其與多種農(nóng)藥混配防治番茄根結(jié)線蟲病。
具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1黑曲霉ANUV90對多菌靈的敏感性及穩(wěn)定性 將黑曲霉ANUV90接種于含50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml多菌靈有效成分的含藥PDA培養(yǎng)基平板，一定時間后，測量菌落大小。將誘變后獲得抗藥性的突變體菌株接種到不含多菌靈的正常PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行10代，測定誘變后黑曲霉抗藥性的遺傳穩(wěn)定性。
抗藥培養(yǎng)基的制作將50％多菌靈可濕性粉劑先溶于0.1mol/L稀鹽酸中，配成含藥有效成分3750μg/mL(0.375g藥劑+100mL無菌水即得到3750μg/mL)母液，梯度稀釋成濃度為0.375μg/mL，37.5μg/mL，375μg/mL，3750μg/mL，然后分別取1mL加入體積為75mLPSA培養(yǎng)基中滅菌，制成濃度分別為0、0.05μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL含藥培養(yǎng)基平板。到入直徑為9cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿15mL冷卻后備用，以無藥劑的PSA培養(yǎng)基為對照(CK)，每處理重復(fù)四次。
黑曲霉ANUV90在高達(dá)1000μg/mL多菌靈處理濃度(該濃度經(jīng)換算遠(yuǎn)大于多菌靈田間使用濃度)下仍可正常生長，各多菌靈濃度處理與對照處理的正常黑曲霉菌落生長狀況無顯著差異，甚至某些濃度水平(如濃度為500μg/mL)表現(xiàn)出一定程度上促進(jìn)ANUV90的生長，與原菌株AN相比，黑曲霉ANUV90對多菌靈極為不敏感，其抗藥性提高了近1000多倍(表1，表2)。
表1黑曲霉AN在不同濃度多菌靈處理下菌落生長半徑(mm)的比較
表中數(shù)據(jù)為AN生長2d后的測定值 表2ANUV90在不同濃度多菌靈處理下菌落生長半徑(mm)的比較
表中數(shù)據(jù)為ANUV90培養(yǎng)2d后的測定值 黑曲霉ANUV90繼代培養(yǎng)10代后對多菌靈不同濃度處理與對照AN菌落生長狀況無顯著差異，表明ANUV90對多菌靈的高度抗藥性可以穩(wěn)定遺傳(表3)。
表3黑曲霉ANUV90繼代培養(yǎng)10代后對不同濃度多菌靈處理下菌落生長半徑(mm)的比較
表中數(shù)據(jù)為ANUV90在無藥培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)10代2d后的測定值 實(shí)施例2黑曲霉ANUV90菌體特征 通過顯微鏡40倍下觀察誘變前后菌株菌絲形態(tài)，通過掃描電鏡觀察孢子形態(tài)，并拍照。
黑曲霉ANUV90在相同40倍光學(xué)顯微鏡下可看出抗藥性突變株的菌絲要比原菌株要狹細(xì)一些，很可能是紫外輻射變異的結(jié)果，掃描電鏡觀察ANUV90孢子形態(tài)與文獻(xiàn)資料中AN孢子形態(tài)無明顯差別，僅稍顯不規(guī)整(附
圖1左圖為AN的菌絲形態(tài)，中圖為ANUV90的菌絲形態(tài)，右圖為掃描電鏡下ANUV90孢子頭形態(tài))。
實(shí)施例3黑曲霉抗藥性突變菌株ANUV90與常用化學(xué)藥劑的兼容性 常用殺菌劑(克露、百菌清、甲基托布津、代森錳鋅、甲霜靈、霜溜溜、乙霉威)、殺蟲劑(敵殺死)、除草劑(乙草胺、莠去津)、植物生長調(diào)節(jié)劑(赤霉素)制成含藥有效成分濃度分別為0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的PSA培養(yǎng)基，以不含藥為對照。制好平板后，用直徑為5mm的無菌的打孔器獲得黑曲霉菌株及黑曲霉抗藥性突變菌株的菌片將其接于含藥PSA培養(yǎng)基上。在25℃下恒溫培養(yǎng)，2天后記錄菌落擴(kuò)展情況，用十字交叉法測量菌落的直徑。
PSA培養(yǎng)基馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊膠20g、水1000mL。
除乙霉威以外，AN與ANUV90兩菌株與多數(shù)殺菌劑、除草劑、其它供試藥劑的兼容性并沒有明顯差異，而且基本都是在低濃度條件下對菌株影響微弱，極個別農(nóng)藥甚至對ANUV90有一定促進(jìn)作用(說明這些微量農(nóng)藥可為ANUV90菌株生長提供營養(yǎng)物質(zhì))，但總體上隨著藥劑濃度的增大而兩菌株菌落直徑都逐漸變?。黄渲信c殺菌劑代森錳鋅、甲霜靈，除草劑莠去津，殺蟲劑敵殺死和植物生長調(diào)節(jié)劑赤霉素有良好的兼容性，說明兩菌株均可與這些化學(xué)藥劑混合復(fù)配使用。
表4 AN與ANUV90在不同藥劑不同濃度處理下的菌落直徑
實(shí)施例4 ANUV90發(fā)酵液殺線蟲活性 將ANUV90的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，即馬鈴薯200g；葡萄糖20g；瓊脂17g；水1000mL。25℃培養(yǎng)10d，獲得試管種。
再將試管種接種到250mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為(重量百分比)蔗糖(2.83％)、硫酸銨(1.367％)、K2HPO4(0.064％)、MgSO4·7H2O(0.182％)、KCl(0.996％)、FeSO4(0.02％)，余下為水，pH6.5。25℃～28℃下，搖床轉(zhuǎn)速以150r·min-1～200r·min-1、發(fā)酵240h。將發(fā)酵液配成不同的倍數(shù)進(jìn)行殺線蟲藥效試驗(yàn)。
在特制凹面小皿中放入100μL不同濃度滅菌濾液，后放入50條左右北方根結(jié)線蟲J2，以無菌水為對照，三次重復(fù)，分別在12h、24h、48h計(jì)算J2的相對死亡率。(公式如下)
在12h、24h、48h這三個時間，測定相同濃度的誘變前后菌株發(fā)酵濾液對線蟲的致死率無明顯差異(附圖2黑曲霉AN與ANUV900原液12、24、48小時對根結(jié)線蟲致死率動態(tài)比較)。
實(shí)施例5 ANUV90抗藥性的分子機(jī)制 供試菌株黑曲霉(AN)，黑曲霉抗藥性菌株(ANUV90) 1.樣品制備 用滅菌打孔器在PSA平板上打出供試菌株的菌餅，然后用鑷子夾取菌餅放入PS(馬鈴薯汁與蔗糖)培養(yǎng)液中，于180r/min振蕩25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，一周后取出，用雙層紗布過濾菌絲，無菌蒸餾水反復(fù)沖洗3次后，用濾紙將菌絲表面水分充分吸干，放入50℃-55℃烘箱中烘干至適宜的狀態(tài)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
2.基因組DNA的提取 本項(xiàng)試驗(yàn)采用尿素提取法(劉少華等，2005)將0.5g研磨好的ANUV90烘干菌絲加入10mL尿素提取液(7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HCl pH8.0、62.5mmol/L Nacl、1％SDS)，搖勻，轉(zhuǎn)入離心管中，以轉(zhuǎn)速12000r/min，高速冷凍離心5min，取上層清液，重復(fù)一次。
將上清夜轉(zhuǎn)移入另一新管中，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(體積比＝25∶24∶1)溶液，用力振蕩數(shù)次搖勻，再放入冷凍離心機(jī)，以轉(zhuǎn)速12000r/min，離心5min，取上清液到一新管中加入等體積的異丙醇和1/10體積3mol/L的NaAc(pH＝5.2)，-20℃靜置30min，以12000r/min再離心5min，棄上清液，倒置使管壁液體流盡，用70％乙醇、無水乙醇洗滌沉淀，室溫放置干燥5-10min，溶于200μL雙蒸水中，加入RNaseA(10μg/μL)2μL，37℃水浴30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 引物用B1和B3由上海生工(Sangon)合成，序列分別為 B1 5’A (AG) AT (CT) ACCCA (CT) TC (CT) CT (CT) GGTGGTGG 3’ B3 5’CTCCAT (CT) TC (AG) TCCAT (ACT) CC (CT) TC (AG) CC 3’ 接以供試菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增β-微管蛋白基因。
50μL反應(yīng)體系中含100ng基因組DNA模板，5L 10×bufer(10mmoL/L Tris-HCl，50mmoL/L KCl)，MgCl2 2mmol/L，Taq DNA聚合酶1U(上海Promga)，dNTP 0.2mmol/L，引物各0.5μmol/L。
反應(yīng)條件為94℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 1min，65℃ 2min，72℃ 2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min結(jié)束。
PCR產(chǎn)物在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳檢測，溴化乙錠(EB)染色30min，置凝膠于ImageMaster紫外成像系統(tǒng)上觀察并拍照(附圖3 AN與ANUV總DNA和β-微管蛋白基因擴(kuò)增片斷電泳圖譜)。
4.序列同源性分析與突變位點(diǎn)的比較 用引物B1、B3對擴(kuò)增產(chǎn)出直接進(jìn)行測序，采用VectorNTI Suit9對AN與ANUV90堿基和氨基酸序列比較分析。
5.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測定及AN與ANUV90菌株β-微管蛋白基因片段比對分析將PCR擴(kuò)增片斷直接交上海Sangon公司測序，通過B1和B3引物對黑曲霉AN與ANUV90菌株的β-微管蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得相同長度的DNA片段(附圖3)，雙向測序后經(jīng)拼接，確定上述菌菌株的β-微管蛋白基因片段長度為854bp，通過Blast與黑曲霉同屬的典型模式菌株Aspergillus nidulans(benA)的β-微管蛋基因序列比對核苷酸同源性為92.3％。因此進(jìn)一步證實(shí)，這兩個片段可分別明確為黑曲霉AN與ANUV90編碼β-微管蛋白基因。測序片段結(jié)果表明，AN與ANUV90兩菌株核苷酸序列個別位點(diǎn)不同，在81位A突變成C，而導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了變化，AN的26位谷氨酸(Glu)替換成天冬氨酸(Asp)(E→D)，該位點(diǎn)可能是突變位點(diǎn)中的一個，從而導(dǎo)致了ANUV90在生物學(xué)特性上抗藥性的產(chǎn)生(附圖4黑曲霉ANUV90的β-微管蛋白DNA序列與原始AN菌株比較差異及推斷的氨基酸變化，1 AN總DNA；2 ANUV90總DNA；3 AN的β-微管蛋白基因；4 ANUV90的β-微管蛋白基因；5 ANUV90的β-微管蛋白基因；M DNAMaker)。
該菌株ANUV90的分類命名為黑曲霉Aspergillus niger，已于2007年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.2234。
通過篩選獲得對多菌靈具有較高穩(wěn)定抗性的黑曲霉菌株ANUV90，該菌株同時對番茄根結(jié)線蟲有一定的生物活性，對多種化學(xué)藥劑具有穩(wěn)定抗性；經(jīng)序列測定、比對表明，基因序列中編碼β-微管蛋白基因發(fā)生定位點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致了ANUV90在生物學(xué)特性上抗藥性的產(chǎn)生。該菌株這一特點(diǎn)使得其可與多數(shù)常用農(nóng)藥可協(xié)同混配使用防治多種有害生物，為解決生防菌株田間防效不穩(wěn)定問題提供一條途徑，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明為一株對多菌靈具有抗藥性的真菌菌株，該菌株ANUV90為黑曲霉Aspergillusniger，已于2007年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.2234。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉，其特征為該菌的發(fā)酵液對多菌靈具有穩(wěn)定抗性，對番茄根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)具有一定的毒殺活性。
3.本發(fā)明涉及的黑曲霉ANUV90菌株所具有的抗藥性為經(jīng)紫外誘變后發(fā)生編碼β-微管蛋白基因在81位由A突變成C，而導(dǎo)致變化產(chǎn)生對多菌靈的高抗活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1及權(quán)利要求2所述的黑曲霉ANUV90菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物防治中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1及權(quán)利要求2所述的黑曲霉在植物寄生線蟲尤其是番茄根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)防治方面的應(yīng)用。
6.一種殺線蟲制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求3所述的真菌本身或其代謝物作為活性成分。
7.按照權(quán)利要求5所述的方法形成的產(chǎn)品可以是水劑、粉劑或膠懸劑，施用方法可以采用拌種、種子包衣、灌根和土壤處理等各種方法。
全文摘要
本發(fā)明中涉及的是一株誘變獲得的對多菌靈具有高度穩(wěn)定抗性的黑曲霉菌株ANUV90，該菌株比原始出發(fā)菌株AN對多菌靈的抗性提高1000倍。黑曲霉ANUV90在高達(dá)1000μg/mL有效成分多菌靈處理濃度下仍可正常生長，該菌株的發(fā)酵液同時具有殺線蟲活性。經(jīng)檢測，誘變前后的菌株在菌落形態(tài)等特征無明顯差異，同時對番茄根結(jié)線蟲具有一定的生物活性，分析突變菌株抗藥性分子機(jī)制初步研究結(jié)果表明編碼β-微管蛋白基因發(fā)生定點(diǎn)突變，導(dǎo)致了ANUV90在生物學(xué)特性上抗藥性的產(chǎn)生。本發(fā)明中具體涉及的細(xì)菌菌株已于2007年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2234，分類命名Aspergillus niger。該菌株這一特點(diǎn)使得其可與多數(shù)常用農(nóng)藥可協(xié)同混配使用防治多種有害生物，為解決生防菌株田間防效不穩(wěn)定問題提供一條途徑，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/14GK101182469SQ20071015802
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者段玉璽, 陳立杰, 王媛媛, 寧 楊, 朱曉峰 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)