專利名稱：固體-液體交替培養(yǎng)誘導(dǎo)雜交鵝掌楸液體懸浮細(xì)胞體胚高頻發(fā)生與植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬林業(yè)中的通過組織培養(yǎng)的植物再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固體-液 體交替培養(yǎng)誘導(dǎo)雜交鵝掌楸液體懸浮細(xì)胞體胚高頻發(fā)生與植;昧再生技術(shù)。
二背景技術(shù)：
鵝掌楸，又稱馬褂木、鴨腳木、九層皮、楓荷樹等，是木蘭科(M3gwoL/flceae) 鵝掌楸屬("n'omfe"Aow)的植物。該屬現(xiàn)在僅存兩種， 一種是分布于我國中、北 亞熱帶地區(qū)(從東部的浙江、福建延伸到西南部的云南、中越邊界)的中國鵝掌楸 (丄.cW打erae [Hemsl.] Saxg.),另 一 種是分布于美國東部的北美鵝掌杯火 (L. tulipifera L.)。鵝掌楸屬植物在被子植物分類地位中處于較原始的位置。雖 然分布區(qū)廣，但目前多呈小群體分布。其中分布于中國境內(nèi)的鵝掌楸已被列為國 家二級(jí)5令稀瀕危保護(hù)樹種。
中國鵝掌楸干形通直、樹形美觀；葉形奇特，葉片寬大，微凹，兩側(cè)有一裂 片，先端截形，葉形儼然如中國古裝馬褂一般，故俗稱馬褂木；春天枝條頂端開 淡黃色大型花朵，其狀如杯似碗，光燦悅目，觀賞價(jià)值高；果實(shí)圓錐形，亦極美 觀。該樹種對(duì)二氧化硫和氯氣有較強(qiáng)的抗性，廣泛用于園林綠化。另外，鵝掌楸 屬植物木材淡紅褐色，紋理通直，色澤美觀，結(jié)構(gòu)細(xì)密，材質(zhì)輕軟，刨面光潔， 適合于用作膠合板、紙漿、家具以及室內(nèi)裝飾用材，也可用于建筑、造船等，經(jīng) 濟(jì)價(jià)值極高，因此也是重要的用材樹種。
作為世界珍稀名貴觀賞風(fēng)景樹的北美鵝掌楸，同樣樹姿挺秀，葉形美麗，樹 形端正，樹序整齊，花大而美。老齡樹枝條平展，或微向下垂。每屆花期，瓊英 壓樹，翠帷覆地，綺麗優(yōu)雅。
葉培忠[1899 1978]教授于1963年首次選用中國鵝掌楸和北美鵝掌楸為親本進(jìn) 行正、反交組合人工雜交，育成種間雜種雜交鵝掌楸(丄.cW"erae[Hemsl.] Sarg. x￡. 加/z^fera L. 和Z. 似/z) i/^m L. x丄.c/ 'werae [Hemsl.] Sarg); 1970年 開始進(jìn)行雜交鵝掌楸正、反交組合苗木栽培對(duì)比。試驗(yàn)表明，種間雜交后代具有 明顯的雜交優(yōu)勢，不僅樹形比親本更加通直，花葉更加幽麗，媲美眾芳，俯視眾 卉，而且生長也更加迅速。如栽植于浙江富陽中國林科院亞林所的雜交鵝掌楸， 25年生時(shí)樹高達(dá)21m，胸徑達(dá)63.7cm;另據(jù)北京市園林局將雜交鵝掌楸作城市 行道樹試種，在北京地區(qū)表現(xiàn)出耐寒性強(qiáng)，生長迅速的特點(diǎn)；同時(shí)該樹種無其他 樹種果毛、花絮飛散造成的空氣污染之弊。因此，林業(yè)上對(duì)優(yōu)質(zhì)雜交鵝掌楸苗木 的需求相當(dāng)迫切。
但鵝掌楸的天然結(jié)實(shí)率很低，親本和雜交新種均僅有1%左右，有性繁殖能 力差；鵝掌楸的扦插技術(shù)要求很高，扦插周期長、成活率低，無性繁殖困難。因 此，目前的種苗繁殖技術(shù)無法滿足大面積植樹造林的需要。
體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其植林再生技術(shù)是20世紀(jì)90年代形成的高新林業(yè)生物技 術(shù)的重要內(nèi)容之一，可用于優(yōu)良品種的大規(guī)模工業(yè)化繁殖和用于遺傳轉(zhuǎn)化體系的 建立。體細(xì)胞胚，是指二倍體或單倍體細(xì)胞在未經(jīng)性細(xì)胞融合的過程，模擬合子 胚發(fā)生的各個(gè)階段而發(fā)育形成一個(gè)新的個(gè)體的形態(tài)發(fā)生和重建過程。在正常情況 下有些植物的珠心組織或助細(xì)胞也可自發(fā)產(chǎn)生體細(xì)胞胚。在大量的組織培養(yǎng)過程 中，許多離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織和器官，形成類似胚的結(jié)構(gòu)。這種經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā) 生而形成的在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)被稱之為體細(xì)胞胚或胚狀 體。無性胚狀體可以像有性胚那樣在一定的條件下發(fā)育成完整的植抹。胚狀體按 其來源可分為兩類 一類是由普通植物孢子體的各種器官的二倍體體細(xì)胞產(chǎn)生而 來，通常稱為體細(xì)胞胚；另一類是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的胚 狀體，通常筒稱為花粉胚，可發(fā)育成單倍體植抹，但一般必須進(jìn)行染色體加倍才 能正常開花結(jié)實(shí)。另外，在一些植物中也可從胚乳培養(yǎng)得到胚狀體，但未能成功 地由胚狀體發(fā)育成植抹。朱微認(rèn)為胚狀體的定義包括三點(diǎn)含義
1. 胚狀體是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于在組織培養(yǎng)范圍內(nèi)使用，區(qū)別于無融 合生殖的胚；
2. 胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚；
3. 胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過程，區(qū)別于與組織培養(yǎng)中分化的芽體。 l卯2年Haberlandt提出植物細(xì)胞的全能性觀點(diǎn)，即每一個(gè)細(xì)胞都能不斷分
裂，進(jìn)而形成完整的植林.Steward(1958)和Reincrt(1959)差不多同時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng) 的胡蘿卜根細(xì)胞產(chǎn)生一種與胚相似的結(jié)構(gòu)，并觀察到由這種結(jié)構(gòu)長成完整的植 抹。從而證明Haberlandt關(guān)于細(xì)胞全能性概念的正確性。此后，植物學(xué)家對(duì)此進(jìn) 行了廣泛的研究，并已在許多植物中利用不同的器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn) 行培養(yǎng)得到了體細(xì)胞胚。成功獲得體細(xì)胞胚的有棵子植物、雙子葉植物和單子葉 植物。林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究始于20世紀(jì)七十年代后期，八十年代后期迅速 發(fā)展，并獲得極大成功。全世界目前已有40多種木本植物獲得了體細(xì)胞胚，尤 其是用常規(guī)無性繁殖技術(shù)很難生根的針葉樹的體胚發(fā)生取得了令人矚目的進(jìn)展。 據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，已從冷杉屬、落葉松屬、云杉屬、松屬、黃杉屬和北美紅杉屬的至 少20種不同的針葉樹的外植體誘導(dǎo)成功了體細(xì)胞胚。在闊葉樹種上，柳屬、楊 屬、栗屬、檀香屬、楓香屬、鵝掌楸屬、榛屬、櫟屬、板栗屬、山茶屬、桉樹 屬、七葉樹屬、柑橘屬、柚木、可可、油橄欖、橡膠、泡桐等20多個(gè)樹種的組 織培養(yǎng)中觀察到體細(xì)胞胚胎發(fā)生或獲得再生植抹。其中，美國的惠豪公司、國際
紙業(yè)公司、維斯瓦庫公司和加拿大的一些公司、新西蘭林業(yè)研究中心等已分別將 火炬松、挪威云杉、花旗松和輻射松等樹種的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和植抹再生應(yīng)用于生 產(chǎn)實(shí)踐。僅新西蘭一家公司就形成了年產(chǎn)200萬抹輻射松體細(xì)胞胚再生植抹的能 力。中國科學(xué)院于1988年以華北云杉為實(shí)驗(yàn)材料，將幼胚產(chǎn)生的愈傷組織誘導(dǎo) 出的體細(xì)胞胚胎發(fā)育成小苗。黑龍江農(nóng)大(1993)進(jìn)行黑穗醋粟末受精胚珠培養(yǎng)， 成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎和植林。四川農(nóng)大王米力等(1996)用尾葉桉種子下胚軸誘導(dǎo) 體細(xì)胞胚胎發(fā)生，獲得根苗齊全的再生植林。南京林業(yè)大學(xué)施季森、陳金慧等 (一種雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植林再生技術(shù)CNZL 02112948.7)用雜交鵝
掌楸未成熟胚通過固體培養(yǎng)的方式，成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，得到完整的植 抹。
目前研究人員誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生主要利用植物體的各種器官，如根、莖、 葉、花、果實(shí)、種子、子房中的胚珠、雄蕊的花絲、花藥及花粉等。但 S. Merkle(1996)認(rèn)為，樹木的胚性培養(yǎng)只能來源于種子或幼苗，合子胚或種子的 發(fā)育程度是很重要的，在許多樹種的研究中表明，未成熟種子比成熟種子或幼苗 有更高的誘導(dǎo)潛能。
組織培養(yǎng)誘導(dǎo)脫分化都主要通過2.4-D來誘導(dǎo)。在多篇文獻(xiàn)中報(bào)道2， 4-D能 抑制胚狀體的產(chǎn)生和發(fā)育，因此在誘導(dǎo)脫分化后必須降低或去掉2, 4-D,胚性細(xì) 胞才能正常發(fā)育.HaLperin(1970)取胡蘿卜的葉柄切段，培養(yǎng)于添加不同激素成 分的瓊脂培養(yǎng)基上，然后移至不加任何激素的基本培養(yǎng)基上(僅有無機(jī)鹽、蔗糖及 維生素B1)，以檢查對(duì)胚狀體形成的影響。結(jié)果表明
1. 促進(jìn)胚性愈傷組織增殖的培養(yǎng)及其激素成分并不促進(jìn)胚狀體的分化； 去除培養(yǎng)基申的2， 4-D,則使胚狀體形成；加入BA，組織增殖速度 增加，但抑制了轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基上后胚狀體的形成，并且一旦胚狀體原始 細(xì)胞形成后，BA對(duì)其發(fā)育成胚狀體毫無影響。
2. 加入赤霉素，完全抑制其后胚狀體的分化。
3. 細(xì)胞增殖過程中的激素環(huán)境對(duì)下 一 步器官分化有著明顯的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2, 4-D通過改變細(xì)胞內(nèi)源IAA代謝而起作用，在水稻的早期
胚性愈傷組織中，用ELISA酶聯(lián)免疫分析證明胚性細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)伴有較高的內(nèi)源 IAA水平，并且在胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)換時(shí)期添加外源1AA對(duì)胚性細(xì)胞出現(xiàn)有一定誘導(dǎo)效 果。
滲透劑在林木體胚發(fā)生的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用。總的說來，滲透劑都 是高度水合性的多羥基分子，包括單糖、多糖、己糖醇和環(huán)多醇。環(huán)多醇是六碳 環(huán)的鞋基復(fù)合物，較常用的環(huán)多醇有肌醇及其立體異構(gòu)體肌醇等。蔗糖和葡萄糖 是常用的兩種糖類滲透劑，山梨醇、D-甘露醇和半乳糖醇的直鏈醇形式、乙二醇 如聚乙二醇和聚丙二醇也可用作滲透劑。唐巍(1998)在火炬松的胚性愈傷組勢誘 導(dǎo)和植林再生的研究中，加入9000mg/L肌醇提高滲透壓，以促進(jìn)后期胚的發(fā) 育。黃健秋(1995)將馬尾松的早期原胚轉(zhuǎn)至含9000mg/L肌醇的DCR培養(yǎng)基 上，形成后期原胚?？梢姡w胚形成過程中適當(dāng)提高滲透壓可促進(jìn)體胚形成。
在植物組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和誘導(dǎo)器官發(fā)生相比具有顯著的特
點(diǎn)
1. 具有兩極性在體細(xì)胞胚發(fā)生早期就具有胚根和胚芽兩極，胚性細(xì)胞 分裂多為不均等分裂，形成頂細(xì)胞和基細(xì)胞，其后有較小的頂細(xì)胞繼 續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，而較大的基細(xì)胞進(jìn)行少數(shù)幾次分裂成為胚柄 部分，在形態(tài)上具有明顯的極性。
2. 存在生理隔離體細(xì)胞胚形成后與母體植物或外植體的維管束系統(tǒng)聯(lián) 系較少，即出現(xiàn)所謂生理上的隔離現(xiàn)象。胚性細(xì)胞細(xì)胞壁加厚，與其 它細(xì)胞分開，周圍細(xì)胞處于解體狀態(tài)，表明體細(xì)胞胚與合子胚相似， 從一開始就是完整的植物體的雛形。
3. 遺傳相對(duì)穩(wěn)定通過體細(xì)胞胚形成的再生植林的變異性小于器官發(fā)生 途徑形成的再生植抹，因?yàn)橹挥心切┪唇?jīng)過畸變的細(xì)胞或變異較少的 細(xì)胞團(tuán)才能形成體細(xì)胞胚，實(shí)現(xiàn)全能型表達(dá)。
4.重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特征植物組織培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生的幾種方式， 雖然都是植物細(xì)胞全能性的具體表現(xiàn)，但體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑是細(xì)胞 全能型表達(dá)最完全的一種方式，它不僅表明植物體細(xì)胞具有全套遺傳 信息，而且重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的進(jìn)程。
植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑可歸納為兩種直接途徑與間接途 徑。直接途徑就是從外植體某些部位直接誘導(dǎo)脫分化出體細(xì)胞胚，如槐樹子葉在 切口處產(chǎn)生愈傷組織的同時(shí)，在子葉組織中分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚。間接途徑通過脫 分化形成愈傷組織后，再從愈傷組織的某些細(xì)胞分化出體細(xì)胞胚。大多凝:植物的 體細(xì)胞胚胎發(fā)生多通過間接途徑進(jìn)行，在愈傷組織中某些體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì) 胞、胚性細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚以及不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚，如經(jīng)過球 形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚而發(fā)育成小苗。
體細(xì)胞胚胎發(fā)生由于能在更短的時(shí)間內(nèi)得到更多的無性繁殖體，以及獲得更 大的遺傳增益，并且由于體胚發(fā)生培養(yǎng)物也是分離原生質(zhì)體的重要來源，可用于 林木的遺傳轉(zhuǎn)化以及體細(xì)胞雜交研究，在理論與應(yīng)用研究中具有重要的作用。利 用懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整等顯著特點(diǎn)，同 時(shí)可以節(jié)約大量的試驗(yàn)場地，縮短培養(yǎng)時(shí)間，因而特別適合植物的大量繁殖。由 于易在體外培養(yǎng)，并且可以比較體外非合子胚與種子的合子胚的異同，所以廣泛 用于研究植物體的生長發(fā)育過程。在基因工程研究中，將分離到的基因?qū)雴蝹€(gè) 胚性細(xì)胞中，由這個(gè)胚性細(xì)胞長成植林的組織中，就含有整合進(jìn)去的基因。
目前有關(guān)植物組織培養(yǎng)技術(shù)的各類文獻(xiàn)中，除美國有北美鵝掌楸 (丄衍owfe"t/ro" &/z ra L.)組培相關(guān)專利技術(shù)的報(bào)導(dǎo)外和陳金慧通過固體培養(yǎng)誘 導(dǎo)出雜交鵝掌楸(丄/r/omfe"^oa /^6n'力體細(xì)胞胚胎的相關(guān)專利技術(shù)的報(bào)導(dǎo)外，尚未 見有雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的成套技術(shù)發(fā)表。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，尋找新的雜交鵝掌楸組織培養(yǎng)方法，實(shí)現(xiàn)雜交鵝掌楸苗木 的更大規(guī)模、短周期和高效生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案為 一種固體-液體交替培養(yǎng)誘導(dǎo)雜交鵝掌楸液體懸浮 細(xì)胞體胚高頻發(fā)生與植抹再生方法，其特征在于采集人工雜交授粉發(fā)育的雜交 鵝掌楸聚合翅果，在無菌條件下，分離球形期至子葉期的未成熟合子胚，按以下 順序和條件進(jìn)行"^秀導(dǎo)、培養(yǎng)獲得雜交鵝掌杯Mi才朱
a. 胚性愈傷誘導(dǎo)階段，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用1/2MS基本培養(yǎng)基；
b. 胚性愈傷組織的增殖階段，培養(yǎng)基采用1/2MS基本固體培養(yǎng)基；
c. 胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞系的建立和預(yù)增殖階段，培養(yǎng)基采用MS基本液體 培養(yǎng)基；
d. 胚性懸浮細(xì)胞的增殖階段，培養(yǎng)基采用MS基本液體培養(yǎng)基；
e. 胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段，培養(yǎng)基采用MS改良液體培養(yǎng)
基；
f. 體細(xì)胞胚發(fā)育階段，培養(yǎng)基采用MS改良固體培養(yǎng)基；
g. 體胚植抹再生階段，培養(yǎng)基采用MS改良固體培養(yǎng)基。
除體胚植林再生階段可直接使用MS改良固體培養(yǎng)基以外，不同培養(yǎng)階段使 用的不同形態(tài)培養(yǎng)基中，還可加入適當(dāng)?shù)奶砑觿唧w添加物質(zhì)和用量如下
a. 胚性愈傷誘導(dǎo)階段1/2MS基本培養(yǎng)基，附加濃度為0.4-5.0 mg/L的 2， 4-D, 0-0.6 mg/L的6-千胺基噤呤，500 ~ 1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪 蛋白和1 ~5mg/L的維生素C,調(diào)pH為5.7;
b. 胚性愈傷組織的增殖階段，采用1/2 MS基本固體培養(yǎng)基，附加濃度為0 0.5 mg / L的2， 4-D, 0 ~ 0.25mg / L的6-千胺基噪呤，500 ~ lOOOmg / L的天然 復(fù)合物水解酪蛋白和L 5mg/L的維生素C,調(diào)pH為5.7;
c. 胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞系的建立和預(yù)增殖階段，采用MS基本液體培養(yǎng) 基，附力口蔗糖25~60g/L， 0 2.5mg/L的2， 4-D, 0 ~ 0.25mg/L的6-節(jié)胺基 嘌呤，500 ~ lOOOmg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1 ~ 5 mg/L的維生素C,調(diào) pH為5.7;
d. 胚性懸浮細(xì)胞的增殖階段，采用MS基本液體培養(yǎng)基，附加濃度為1.0 ~ 10. Omg/L的ABA, 0~5.0mg/L的GA,蔗糖20~60g/L, 500 ~ lOOOmg/L 的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1 ~ 5 mg/L的維生素C,調(diào)pH為5.7;
e. 胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段，采用MS改良液體培養(yǎng)基，附加 濃度為1.0 ~ lO.Omg / L的ABA, 0 ~ 5.0mg / L的GA，蔗糖20 ~ 60g/L, 1 ~ 5mg /L的維生素C,調(diào)pH為5.7;
f. 體細(xì)胞胚發(fā)育階段，采用MS改良固體培養(yǎng)基，附加濃度為1.0~10.0mg/ L的ABA, 0 ~ 5.0mg / L的GA，蔗糖20 ~ 60g/L, 1 ~ 5mg / L的維生素C,瓊脂 5g/L, 調(diào)pH為5.7。
附MS基本培養(yǎng)基(Murashing and Skoog medium)標(biāo)準(zhǔn)配方
NH4N031650 mg/1
KN031900 mg/l
CaCl2 2H20440 mg/1
MgS04 7H20370 mg/1
KH2P04170 mg/1
KI0.83 mg/1
H3B036.2 mg/1
MnS04 . H2016.9 mg/1
ZnS04 7H208.6 mg/1
Na2Mo04 ■ 2H200.25 mg/1
CuS04 5H200.025 mg/1
CoCl2 6H200.025 mg/1
FeS04 7H2027.8 mg/1
Na2-EDTA37.3 mg/1
肌醇100 mg/1
煙酸0.5 mg/1
鹽酸硫胺素0.1 mg/1
鹽酸吡咳醇0.5 mg/1
甘氨酸2 mg/1
在該標(biāo)準(zhǔn)配方中添加使用肌醇50 mg/L，即可獲得MS基本固體培養(yǎng)基； 在該標(biāo)準(zhǔn)配方中添加使用KN03 1000 mg/L,即可獲得MS改良固體培養(yǎng)基;
在該標(biāo)準(zhǔn)配方中添加使用肌醇100 mg/L,即可獲得MS基本液體培養(yǎng)基； 在該標(biāo)準(zhǔn)配方中添加使用KN03 1000 mg/L, CaNO3 500 mg/L，即可獲得MS改 良液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是極大的提高了雜交鵝掌楸的再生效率 和繁殖系數(shù)，為工業(yè)化快速繁殖雜交鵝掌楸苗木提供了一種新方法。
四
圖1為在預(yù)增殖階^:懸浮細(xì)胞的狀態(tài)；
圖2為在胚性懸浮細(xì)胞增殖和產(chǎn)生階段懸浮細(xì)胞的形態(tài)，其中a為胚性細(xì)胞
開始橫向和縱向分裂，極性形成，b為胚性細(xì)胞開始分裂；
圖3為在胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段懸浮細(xì)胞的狀態(tài)； 圖4為在體細(xì)胞胚發(fā)育階段的狀態(tài)，下部兩個(gè)小圖為局部放大圖； 圖5為體細(xì)胞胚胎的再生植;眛，其中a為移栽前的試管苗，b為移栽后的露地苗。
五具體實(shí)施例方式
未成熟胚的制耳又方法
選定父、母本優(yōu)良植抹。四月底到五月初，在盛花期的母林上選擇花冠頂端 微微松動(dòng)、雌蔬柱頭布滿粘液和晶螢亮點(diǎn)而即將開放的花蕾、剝開花瓣去雄，然 后用鑷子從父本花朵上夾下雄蕊，從上到下輕輕觸動(dòng)雌蕊柱頭，直到柱頭上涂滿 一層金黃色的花粉為止，最后將花瓣合攏。授粉兩個(gè)月后(7月盛夏時(shí))收集聚 合翅果。
將采下的聚合翅果于4。C條件下低溫冷藏10天，剖開且剪去種翅。用洗潔精 清洗種子，以除去其表面的油污，自來水沖洗30分鐘，蒸餾水沖洗3次，75% 的乙醇處理40秒，0.1%的氯化汞處理4分鐘，無菌水沖洗4次。無菌狀態(tài)下， 剝?nèi)シN皮獲得未成熟胚，將未成熟胚接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
a. 胚性愈傷誘導(dǎo)階段
未成熟胚接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后進(jìn)入胚性愈傷誘導(dǎo)階段，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS基 本培養(yǎng)基，附加激素是濃度分別為2， 4-D0.5-4.0mg/L。添加500-1200mg/L的 天然復(fù)合物水解酪蛋白。維生素C5mg/L,蔗糖4%,瓊脂0.65%，滅菌前將誘 導(dǎo)培養(yǎng)基(下同)調(diào)至pH 5.7, 121。C高溫、高壓滅菌16分鐘，培養(yǎng)溫度23-27°C,黑暗條件下培養(yǎng)，每二十天繼代培養(yǎng)一次。
b. 胚性愈傷組織的增殖階段
階段a胚性愈傷組織，l / 2MS基本固體培養(yǎng)基，附加濃度為0-0.5 mg / L的 2, 4-D, 0~0.25mg/L的6-節(jié)胺基嘌呤，500 ~ 1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪 蛋白和l~5mg/L的維生素C，調(diào)pH為5.7;暗培養(yǎng)溫度為23-25 。C，培養(yǎng)時(shí) 間10-14天;
c. 胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞系的建立和預(yù)增殖階段
將獲得的胚性愈傷組織放入50mL MS基本液體培養(yǎng)基，蔗糖濃度控制為 25~60g/L,附加濃度為0~2.5mg/L的2, 4-D， 0~0.25mg/L的6-芐胺基嘌 呤，500 ~ 1 000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1-5 mg/L的維生素C的培 養(yǎng)基中，滅菌前將培養(yǎng)基調(diào)至pH 5.7;搖床轉(zhuǎn)速為70-100 r.p.m，暗培養(yǎng)溫度為 23-25°C,培養(yǎng)時(shí)間10~14天;
附圖1為在預(yù)增殖階段懸浮細(xì)胞的狀態(tài)。
d. 胚性懸浮細(xì)胞的增殖和產(chǎn)生階段
將c階段獲得的懸浮細(xì)胞沉淀后，棄上清液，懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入MS基本液體培 養(yǎng)基，附加濃度為1.0 ~ 10. Om9/L的ABA， 0~5.0mg/L的GA,蔗糖20 ~ 60g/L, 500~ 1 OOOmg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1-5 mg/L的維生素C的 培養(yǎng)基中，滅菌前將培養(yǎng)基調(diào)至pH 5.7;搖床轉(zhuǎn)速為70-100 r.p.m,暗培養(yǎng)溫度為 23-25°C,培養(yǎng)時(shí)間10~14天;
附圖2為在胚性懸浮細(xì)胞增殖和產(chǎn)生階-歐懸浮細(xì)胞的形態(tài)。
e. 胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段
把d階段獲得的懸浮細(xì)胞沉淀后，棄上清液，懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入MS改良液體培 養(yǎng)基；附加濃度為1.0~10.0mg/L的ABA, 0~5.0mg/L的GA,蔗糖20 ~ 60g/L, 1 ~ 5mg/L的維生素C,滅菌前將pH調(diào)至pH 5.7; 搖床轉(zhuǎn)速為70-100 r.p.m, 暗培養(yǎng)溫度為23-25°C,培養(yǎng)時(shí)間10 ~ 14天；
附圖3為在胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段懸浮細(xì)胞的狀態(tài)。
f. 體細(xì)胞胚發(fā)育階段
e階段的懸浮細(xì)胞沉淀后，棄上清液，將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入MS改良固體培養(yǎng)基； 附加濃度為1.0 ~ lO.Omg / L的ABA， 0 ~ 5.0mg / L的GA,蔗糖20 ~ 60g/L， 1 ~ 5mg/L的維生素C,滅菌前將pH調(diào)至pH 5.7,瓊脂5g/L;暗培養(yǎng)溫度為23-25 °C;球形胚形成以后，轉(zhuǎn)入MS改良培養(yǎng)基使其繼續(xù)發(fā)育，球形胚經(jīng)過近兩個(gè) 月，依次經(jīng)過球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚階段，直至得到體細(xì)胞胚。
附圖4為在體細(xì)胞胚發(fā)育階段的狀態(tài)。
g. 體胚植林再生階段
將獲得的體細(xì)胞胚放入MS改良固體培養(yǎng)基中在正常光照培養(yǎng)條件下繼續(xù)培 養(yǎng)，且降低蔗糖濃度為25g/L,直至體細(xì)胞胚萌發(fā)再生成植林。 附圖5為體細(xì)胞胚胎的再生檔j朱。
h. 移苗定植階段
體胚發(fā)芽后，瓶苗長至2厘米高，且根葉發(fā)達(dá)時(shí)，從瓶中取出；洗去幼苗根 部培養(yǎng)基，植入主要由珍珠巖構(gòu)成的基質(zhì)中。移苗后一周內(nèi)濕度保持在95~ 100 %, —個(gè)月內(nèi)的管理要特別細(xì)致，注意濕度與溫度的協(xié)調(diào)。移苗后一個(gè)星期，即 可按常規(guī)苗木栽培工藝進(jìn)行定植。
采用本發(fā)明提供的的方法，由于胚性懸浮細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖潛力大，繁殖效 率可在" 一 種雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植林再生技術(shù)(CNZL
02112948.7)，，單純依靠體細(xì)胞胚再生植抹的基礎(chǔ)上提高200%以上，為大規(guī)模、 快速繁殖雜交鵝掌楸提供了 一種更為高效的方法。
權(quán)利要求
1.一種固體-液體交替培養(yǎng)誘導(dǎo)雜交鵝掌楸液體懸浮細(xì)胞體胚高頻發(fā)生與植株再生方法，其特征在于采集人工雜交授粉發(fā)育的雜交鵝掌楸聚合翅果，在無菌條件下，分離球形期至子葉期的未成熟合子胚，按以下順序和條件進(jìn)行誘導(dǎo)、培養(yǎng)獲得雜交鵝掌楸植株a.胚性愈傷誘導(dǎo)階段，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用1/2 MS基本培養(yǎng)基；b.胚性愈傷組織的增殖階段，培養(yǎng)基采用1/2 MS基本固體培養(yǎng)基；c.胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞系的建立和預(yù)增殖階段，培養(yǎng)基采用MS基本液體培養(yǎng)基；d.胚性懸浮細(xì)胞的增殖階段，培養(yǎng)基采用MS基本液體培養(yǎng)基；e.胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段，培養(yǎng)基采用MS改良液體培養(yǎng)基；f.體細(xì)胞胚發(fā)育階段，培養(yǎng)基采用MS改良固體培養(yǎng)基；g.體胚植株再生階段，培養(yǎng)基采用MS改良固體培養(yǎng)基。
2. 如權(quán)利要求1所述的固體-液體交替培養(yǎng)誘導(dǎo)雜交鵝掌楸液體懸浮細(xì)胞體胚 高頻發(fā)生與植林再生方法，其特征在于不同培養(yǎng)階段使用的不同形態(tài)培養(yǎng)基中， 還可加入適當(dāng)?shù)奶砑觿?，具體添加物質(zhì)和用量如下a. 胚性愈傷誘導(dǎo)階段1/2MS基本培養(yǎng)基，附加濃度為0.4-5.0 mg/L的 2, 4-D, 0~ 0.6 mg/L的6-千胺基噪呤，500~ 1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪 蛋白和1 ~5mg/L的維生素C，調(diào)pH為5.7;b. 胚性愈傷組織的增殖階段，釆用1/2 MS基本固體培養(yǎng)基，附加濃度為0~ 0.5 mg/L的2， 4-D, 0 ~ 0.25mg/L的6-卡胺基噪呤，500 ~ lOOOmg/L的天然 復(fù)合物水解酪蛋白和L-5mg/L的維生素C，調(diào)pH為5.7;c. 胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞系的建立和預(yù)增殖階段，采用MS基本液體培養(yǎng) 基，附力口蔗糖25~60g/L, 0 2.5mg/L的2， 4-D, 0 ~ 0.25mg/L的6-卡胺基 噪呤，500~ 1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1 ~5 mg/L的維生素C，調(diào) pH為5.7;d. 胚性懸浮細(xì)胞的增殖階段，采用MS基本液體培養(yǎng)基，附加濃度為1.0 ~ 10. Omg/L的ABA, 0~5.0mg/L的GA,蔗糖20~60g/L, 500~ 1000mg/L 的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1 ~ 5 mg/L的維生素C,調(diào)pH為5.7;e. 胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段，采用MS改良液體培養(yǎng)基，附加 濃度為1.0~ 10.0mg/L的ABA， 0 ~ 5.0mg/L的GA,蔗糖20 60g/L， 1 ~ 5mg /L的維生素C，調(diào)pH為5.7;f. 體細(xì)胞胚發(fā)育階^R，采用MS改良固體培養(yǎng)基，附加濃度為1.0~10.0mg/ L的ABA, 0~5.0mg/L的GA,蔗糖20 ~ 60g/L， 1 ~ 5mg/L的維生素C,瓊脂 5g/L, 調(diào)pH為5.7。
全文摘要
一種固體-液體交替培養(yǎng)誘導(dǎo)雜交鵝掌楸液體懸浮細(xì)胞體胚高頻發(fā)生與植株再生方法，分離獲得球形期至子葉期的未成熟合子胚后，分別經(jīng)過胚性愈傷誘導(dǎo)階段、胚性愈傷組織增殖階段、胚性愈傷組織懸浮細(xì)胞系的建立和預(yù)增殖階段、胚性懸浮細(xì)胞增殖階段、胚性懸浮細(xì)胞增殖中止和原胚形成階段、體細(xì)胞胚發(fā)育階段和體胚植株再生階段后，高效獲得雜交鵝掌楸再生植株。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101112177SQ200710131250
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月7日 公開號(hào)200710131250.9
發(fā)明者席夢利, 施季森, 李火根, 邊黎明, 陳金慧, 偉 龍 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)