專利名稱：：嘌呤核苷磷酸化酶、腺苷脫氨酶、5’核苷酸酶的聯(lián)合生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于診斷酶制劑領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種來自于芽孢桿菌(&j"7/m平，ACCC10741)的嘌呤核苷磷酸化酶(PurineNucleosidePhosphorylase,PNP，酶學(xué)分類號為EC2.4.2.1)的生產(chǎn)工藝，該酶對肌苷有專一的底物特異性而對腺苷和次黃苷酸沒有底物特異性，可用于測定血清腺苷脫氨酶(AdenosineDeaminase,以下簡稱為ADA)和5'-核苷酸酶(5'-Nucleotidase,以下簡稱為5'-NT)的活性。本工藝可高效大量產(chǎn)生嘌呤核苷磷酸化酶，同時產(chǎn)生用于制備診斷試劑盒質(zhì)控品的腺苷脫氨酶和5'-核苷酸酶，可通過純化工藝逐一分離，經(jīng)冷凍干燥后得到終產(chǎn)品。技術(shù)背景嘌呤核苷磷酸化酶(PurineNucleosidePhosphorylase,PNP，以下簡稱為PNP)，該酶根據(jù)底物特異性不同催化如下通用反應(yīng)嘌呤核苷(PurineNucleoside)+磷酸(Pi)>核糖-l-磷酸(a-D-Ribose-1-phosphate)+嘌呤(Purine)。血清中的ADA為反映肝損傷的敏感指標(biāo)，5'-NT的測定主要用于肝膽疾病的診斷及肝膽疾病與其他疾病的鑒別診斷，因而這兩者是臨床常做的生化檢驗(yàn)項(xiàng)目。PNP在ADA和5'-NT的酶學(xué)檢測中起到非常重要的作用。檢測機(jī)理如下1)腺苷脫氨酶腺苷+&0~^肌苷(Inosine，次黃苷)+氨肌苷(Inosine)+磷酸(Pi)PM>>次黃嘌呤(Hypoxanthine)+核糖-1-磷酸(Ribose1-phosphate)2)5'-核苷酸酶次黃苷酸(Inosine5'-Mon叩hosphateDisodiumSalt,IMP)+H205'—>肌苷+磷酸(Pi)肌苷(Inosine)+磷酸(Pi)~^次黃嘌呤(Hypoxanthine)+核糖-1-磷酸兩者產(chǎn)生的次黃嘌呤都在XOD的作用下產(chǎn)生H202，最后偶聯(lián)Trinder氏反應(yīng)，比色測定Hypoxanthine+2H20+202咖>Uricacid+2H202<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>此法靈敏度高，線性范圍寬，試劑穩(wěn)定性好。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對該法進(jìn)行了深入的研究并加以改良，使之廣泛地應(yīng)用于臨床。目前ADA和5'-NT商品化試劑盒多采用該法。在圖1中可以看到微生物嘌呤代謝過程中，PNP(EC2.4.2.1)可以作用于多種底物，例如腺苷(Adenosine),次黃嘌呤(Hypoxanthine)、黃嘌呤(Xanthine)、鳥嘌呤(Guanine),肌苷(Inosine)等。但是從前面所述的試劑盒檢測原理來看，如果PNP對腺苷(Adenosine)或者次黃苷酸(Inosine5'-Mon叩hosphateDisodiumSalt,IMP)有底物特異性，則必然對檢測產(chǎn)生很大的干擾，最終影響試劑盒的準(zhǔn)確度。如圖2所示，腺苷與肌苷在分子結(jié)構(gòu)上的差別非常微小，唯一的區(qū)別是嘌呤環(huán)上的取代基不同腺苷是-NH2取代，而肌苷是-OH取代，因此要求在ADA和5'-NT試劑盒中所使用的PNP有非常好的底物識別性。現(xiàn)階段所報道的PNP來源很多，不同來源的PNP底物特性性差異很大，表1中列舉了不同來源的代表性PNP的底物特異性的不同表l不同來源的代表性PNP比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在過去的研究過程中，也發(fā)現(xiàn)了來自于芽孢桿菌(ftcz7/船)的腺苷脫氨酶(Powell,JoanF.;Hunter,JR.AdenosinedeaminaseandribosidaseinsporesofBacilluscereus.BiochemJ.1956Mar;62(3):381—387.[PubMed])、5'-核苷酸酶(GeraldB.JacobsenandVictorW.Rodwell.ABacillusRibonucleicAcidPhosphodiesterasewithAssociated5'-NucleotidaseActivity.J.Biol.Chem.1972,247:5811-5817)，以及嘌呤核苷磷酸化酶(HLEngelbrecht,HLSadoff.PropertiesofPurineNucleosidePhosphorylasesfromSporesandVegetativeCellsofBacilluscereusandTheirModificationbyOrthophosphateJournalofBiologicalChemistry,1969.244(22):6228-6232)，但對其是否適于在診斷試劑盒中使用沒有報道，也沒有三種酶偶聯(lián)生產(chǎn)工藝的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明在于提供一種芽孢桿菌(Ba"7/M^.)的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，以及腺苷脫氨酶(ADA)和5'-核苷酸酶(5'NT)的生產(chǎn)工藝。為了確定芽孢桿菌(￡aci//Ml$印.)所產(chǎn)的PNP，ADA和5'-NT的酶活大小，采取以下的酶活測定方式1)PNP①原理Inosine+Pi""+Hypoxanthine+a-D-Ribose1-phosphateHypoxanthine+2H20+202->Uricacid+2H202在293nm測定尿酸的生成酶活定義1U為在特定條件下每min產(chǎn)生lumol尿酸所用的酶量②測定試劑A.K-phosphatebufferpH7.7，50mMB.Inosine溶液32mM(將85.8mg的肌苷(MW=268.23)加熱溶解在10ml水中，可以在4度穩(wěn)定存在2周)C.XOD:60ku/l(溶解在A緩沖液中，必須新鮮配制)D.酶液用A溶解③具體操作過程1取下列反應(yīng)液放在37度反應(yīng)K-phosphatebufferpH7.72.7mlInosine溶液0.2mlXOD:0.1ml2.加入0.05ml的酶液3.記錄293nm下，37度反應(yīng)3-4min的反應(yīng)速率線性范圍0.2-lku④酶活計算公式鵬,工/T，，，、AOD/min(AODtest-AODblank)xVtxdfAr^,.^。。酶活(U/ml)=-=AOD/minx4.88xdf12.5xl.0xVs酶活(U/mg)=(U/ml)xl/CVt:總體積(3.05ml)Vs:酶液樣品體積(0.05ml)12.5:在測定條件下尿酸的摩爾吸光系數(shù)(cmmo1)1.0:光徑長度(cm)df:稀釋倍數(shù)C:溶液中酶濃度2)ADA和5'-NT的測定分別采用北京利德曼生化技術(shù)有限公司的腺苷脫氨酶測定試劑盒-ADA、5'-核苷酸酶測定試劑盒-5'-NT測定酶活。本發(fā)明所生產(chǎn)的PNP符合診斷試劑盒中所采用的工具酶的特殊要求1)專一的底物特異性對肌苷有專一的底物特異性，而不催化腺苷(Adenosine)或者次黃苷酸(Inosine5，-MonophosphateDisodiumSalt)、次黃嘌呤(Hypoxanthine)、黃嘌呤(Xanthine)反應(yīng)，對鳥苷(Guanosine)有部分催化作用，本專利的PNP底物特異性見表2:表2.來源于芽孢桿菌(Sac;7/"〃p.)PNP底物特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2)在較寬pH值范圍內(nèi)有良好的適應(yīng)性由于不同使用者pH值需要不同，有可能使用在偏酸性的MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸，緩沖范圍pH5.46.8]緩沖液中，也有可能使用在偏堿性的硼酸緩沖液(borate,緩沖范圍pH8.5~10.0)中，因此要求所使用的工具酶必須能在較寬的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定性比較好。圖3為本發(fā)明中PNP在不同pH緩沖液中，30度水浴放置16小時后測定的相對酶活，圖4為將同一份樣品在不同pH測活體系中的相對酶活曲線，從中可以看出該酶的pH穩(wěn)定性(pHStability)范圍為pH6.0—9.0(30°C,16hr)，最適pH(OptimumpH)為7.5—8.0。3)熱穩(wěn)定性好商品化的診斷試劑盒，雖然要求保存在4度環(huán)境中，但是往往因?yàn)檫\(yùn)輸，檢驗(yàn)使用過程以及周圍環(huán)境的溫度變化，試劑盒中的成分至少應(yīng)該能夠承受45度的高溫而不喪失活性，因此要求診斷工具酶有較好的熱穩(wěn)定性。圖4為本發(fā)明中PNP酶液(15ku/l，K-phosphate，pH7.7)在不同的溫度下放置30min后測定其相對活性曲線，從圖4可以看出該酶溫度穩(wěn)定性(ThermalStability)良好，在45度以下半個小時可保持95%以上的活性。4)溫度依賴性符合試劑盒需要由于血清ADA和5'NT的測定實(shí)驗(yàn)是在人體的生理溫度下進(jìn)行的，因此要求商品化診斷試劑盒中的成分在37度又較高的生理活性。圖5為該酶的溫度依賴性測定結(jié)果。從圖5可以看到該酶的最適溫度(OptimumTemperature)范圍為55-60'C，但在37度時的活性為最高活性的60%以上，完全符合診斷試劑盒的要求。本發(fā)明工藝可同時生產(chǎn)PNP、ADA和5'NT。具體的生產(chǎn)工藝如下1)本專利中適合于芽孢桿菌(5^7/w平)生長的培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基(包括蛋白胨、酵母粉、NaCl)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(包括牛肉膏，蛋白胨，NaCl)、硝酸鹽肉湯培養(yǎng)基(包括牛肉浸出物，蛋白胨，示蛋白胨，硝酸鉀)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入0.1-2%的肌苷作為誘導(dǎo)物，必要時加入微量元素提供菌體生長的需要。該菌種的生長溫度為25~37°C，最佳培養(yǎng)溫度為30-32。C。培養(yǎng)基的pH—般為68.5，最適pH在7.2左右。本專利中的芽孢桿菌為比較好氧的菌種，發(fā)酵罐空氣流速為10201/tnin,攪拌速度150~350rpm/min，培養(yǎng)18-40小時后，離心所得到的培養(yǎng)基，收集菌體。2)將菌體懸浮于磷酸鉀緩沖液中。加入溶菌酶，37°C,lh，使用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)菌，離心得到上清。加入210。/。硫酸鏈霉素或者pH7.5的飽和硫酸精蛋白溶液直至沒有沉淀產(chǎn)生，離心得到上清。加入30-50%硫酸銨(一級硫酸銨沉淀)去除大部分雜蛋白，在獲得的上清中繼續(xù)加入硫酸銨至終濃度為75-85%(二級硫酸銨沉淀)，離心得到沉淀，復(fù)溶。3)采取離子交換或者疏水層析使ADA從復(fù)溶液中分離得到ADA組分，使用凝膠過濾收集第一峰得到5'-NT組分，收集第二峰得到PNP組分。采用疏水層析純化時，每個步驟純化收率見表3，PNP最終收率在5Qn/。左右。表3來源于芽孢桿菌(￡oc,7/mjjp.)的PNP純化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>粗酶液3404052000.152100%硫酸魚精蛋白沉淀3281052460.160101%一、二級硫酸銨沉淀882.533803.8365%疏水層析53.65304256.790%Octylsephsrose4fastflow凝膠過濾50.04258651.6785%SephactylS-200HR4)通過冷凍干燥得到終產(chǎn)品，產(chǎn)品呈白色粉末狀，在此過程中需要加入凍干保護(hù)劑。在-20'C保存可以穩(wěn)定12個月將進(jìn)口商品酶與自制PNP凍干品同時配制ADA和5'NT測定試劑盒，按照商品化試劑盒檢驗(yàn)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照商品化試劑盒產(chǎn)品說明書在自動生化儀上，測定以下幾個指標(biāo)試劑的空白速率(PNP中如果混有ADA、5'NT，則空白速率會增加)、測定準(zhǔn)確度(在質(zhì)控的靶值范圍內(nèi)ADA質(zhì)控靶值30±5u/l，5'NT質(zhì)控靶值40.0±7.2u/l)，42度加速三天穩(wěn)定性(質(zhì)控血清的數(shù)值變化在±20%范圍之內(nèi))。結(jié)果表明(表4):自制的PNP在性能上完全可以與進(jìn)口產(chǎn)品相當(dāng)，各項(xiàng)指標(biāo)完全符合試劑盒要求。表4.對照與自制酶制劑配入試劑盒的性能對比<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例l:PNP發(fā)酵工藝發(fā)酵培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基蛋白胨10g/1、酵母粉5g/1、NaCllOg/1(固體培養(yǎng)基加入瓊脂1%)pH7.0誘導(dǎo)培養(yǎng)基葡萄糖2g/l、酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、尿素lg/l、NaNO30.5g/l，NaC15g/l、MgSO40.5g/l、K2HP042g/l、肌苷5g/l1)菌種制備(一級種子)將保藏的芽孢桿菌接在LB固體培養(yǎng)基上，pH值為7.0，3(TC培養(yǎng)15-24小時長出單菌落。2)搖瓶培養(yǎng)(二級種子)將一級種子單菌落接種于含200mlLB培養(yǎng)基的IL三角瓶中，在3(TC，和不斷攪拌通氧條件下培養(yǎng)8-15小時，取樣在紫外分光光度計上測定菌體密度600nm的吸光度值，OD6。。達(dá)到0.8-1.2之間進(jìn)行下一步驟。3)30L發(fā)酵罐培養(yǎng)(三級種子)取二級種子按照1%接種量接入含有15LLB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，攪拌速度180r/min，通氣量2.0m3/11，30度培養(yǎng)8h。4)300L發(fā)酵罐培養(yǎng)取三級種子，接入含有200L有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，攪拌速度200rpm/min,通氣量200mVh，培養(yǎng)時間24-30小時，600nm的吸光度值在15-18之間結(jié)束發(fā)酵。其中菌體密度OD6QQ測定發(fā)酵液經(jīng)合適倍數(shù)的稀釋后，用紫外分光光度計在600nm處測其光吸收值和稀釋倍數(shù)的乘積即發(fā)酵液的菌體密度(OD,)。實(shí)施例2:PNP，ADA和5，-NT的純化工藝1)發(fā)酵后的發(fā)酵液200L利用連續(xù)流離心機(jī)離心得到菌體，使用IOL濃度為50mM，pH7.7磷酸鉀緩沖液重懸菌，加入200g溶菌酶攪拌混勻，37'C溫育l-2h。2)使用高壓勻漿機(jī)(壓力800mbar),循環(huán)兩次，破碎細(xì)菌，高速冷凍離心機(jī)8000卬m，離心15min去除菌體，得到胞內(nèi)粗酶液9.8L。3)在粗酶液中加入pH7.5的飽和硫酸精蛋白溶液直至沒有沉淀產(chǎn)生，4度8000rpm離心15分鐘去除沉淀得到9.8L上清，邊攪拌邊加入3077g硫酸銨(50%,314g/l)—該操作在4度冷室中進(jìn)行，離心同上步驟獲得上清9.7L。在獲得的上清中繼續(xù)加入2625g硫酸銨至終濃度為85%(250g/l)，離心得到沉淀。用IOL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.7)復(fù)溶沉淀，離心，上清液過0.22ym的膜作為下一步純化的樣品。4)疏水層析分離ADA層析填料Octylsephsrose4fastflow;層析柱BPG100/500(其中裝柱體積為1CV——柱體積)A.平衡緩沖液PBS+1M(NH4)2S04B.洗脫緩沖液①PBS+0.6M(NH4)2S04;②PBS其中PBS緩沖液(pH7.27.4):NaCl137mM，KC12.7mM，Na2HP044.3mM，KH2P041.4mM用A平衡層析柱，IOL樣品上樣，用A平衡2《V，緩沖液B-①洗脫2CV，收集離子強(qiáng)度大于60mAU的洗脫峰l，然后用緩沖液B-②洗脫1CV，收集大于30mAU的洗脫峰2。洗脫峰1中存在大部分的PNP和5'-NT，洗脫峰2中得到ADA。5)凝膠過濾分離5'-NT層析填料SephacrylS-200HR;層析柱COLUMNXK50/100(其中裝柱體積為1CV)平衡、洗脫緩沖液PBS用PBS平衡柱，5。/。CV上樣，繼續(xù)用PBS洗脫，收集大于30mAU第一個洗脫峰l，收集大于60mAU的洗脫峰2。在洗脫峰1得到5'-NT，洗脫峰2中得到PNP。實(shí)施例3.PNP,ADA和5，-NT的凍干將上例中純化所得的ADA和5'-NT酶液，加入2%甘露醇和10%NaCl進(jìn)行凍干，PNP酶液中加入2%甘露醇凍干，凍干收率為85%。凍干酶制劑在-20'C保存可以穩(wěn)定12個月。實(shí)施例4.PNP在診斷試劑盒中的適用性檢驗(yàn)ADA以及5'-NT測定試劑盒配方如表5，表6。表5.腺苷脫氨酶試劑盒配方<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將配制好的對照試劑和自配酶試劑，在日立7060自動生化儀上定標(biāo)得到試劑的空白速率(S,)，檢測ADA以及5'-NT質(zhì)控各三次，求其均值。新配制的試劑在7060上定標(biāo)并測定質(zhì)控的數(shù)值，記錄Si。放入42'C溫箱，3天后用試劑檢測質(zhì)控數(shù)值，檢測前不需重新定標(biāo)。圖1足微牛物體內(nèi)的嘌呤代謝途徑圖圖2是腺-tf和肌昔的分子結(jié)構(gòu)圖圖3是PNP的pH穩(wěn)定性圖(15ku/l溶解在不問pH的緩沖液中，在30度放置16h，測定酶活)(30'C.16hr-treatmentwith50mMbuffersolution:pH4.0-6.0，acetate:pH6.0-9.0,K扁phosphate;pH9.0-10.0,borate)圖4是PNP的pH活性圖(37'C,5min-reactionin50mMbuffersolution:pH4.0-7.0,acetate;pH6.5-8.5-K-phosphate;pH8.0-9.0，Tris-HCl:pH8.5-10.5.borate.)圖5是PNP的溫度穩(wěn)定性圖(30min-treatmentwWi50mMK-phosphatebuffer,pH7.7.enzymeconcentration:15U/ml)圖6是PNP的溫度依賴性圖(5min-reatcionin50mMK-phosphatebuffer,pH7.7)權(quán)利要求1.通過實(shí)驗(yàn)室間交流，本實(shí)驗(yàn)室獲得一株芽孢桿菌(Bacillussp.，ACCC10741)，在特定的培養(yǎng)生產(chǎn)工藝下，得到一種應(yīng)用在血清腺苷脫氨酶(AdenosineDeaminase，ADA)和5’-核苷酸酶(5’-Nucleotidase，5’-NT)商品化檢測試劑盒中所使用的工具酶——嘌呤核苷磷酸化酶(PurineNucleosidePhosphorylase，PNP)。該酶特異性的作用于肌苷(Inosine)，而對腺苷(Adenosine)和次黃苷酸(Inosine5′-MonophosphateDisodiumSalt，IMP)沒有底物特異性，因此可在血清ADA和5’-NT測定試劑盒中使用。2.權(quán)利1中的芽孢桿菌在發(fā)酵過程中不但可以產(chǎn)生嘌呤核苷磷酸化酶，同時還可以得到腺苷脫氨酶和5>-核苷酸酶，根據(jù)這三個酶分子量、等電點(diǎn)等蛋白性質(zhì)的不同，利用凝膠過濾、離子交換、疏水層析等蛋白質(zhì)分離純化手段，將其逐一分離，這就在得到主產(chǎn)物——嘌呤核苷磷酸化酶的同時，獲得了腺苷脫氨酶以及5'-核苷酸酶。該過程工藝簡單，周期短，最大的程度利用副產(chǎn)物，有很高的經(jīng)濟(jì)效益。3.按權(quán)利1所述的嘌呤核苷磷酸化酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征如下1)將權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌接在LB固體培養(yǎng)基上，LB固體培養(yǎng)基的成分有蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂、pH值為7.0-7.2、在高壓滅菌鍋(120'C，0.15MPa)中滅菌20分鐘，30'C培養(yǎng)15-24小時長出單菌落。2)將單菌落轉(zhuǎn)接到種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，罐中培養(yǎng)基成分有一定的碳、氮配比的蛋白胨與酵母粉、NaCl、MgS04、KH2P04，K2HP04,pH值為7.0-7.2，在高壓滅菌鍋(120°C，0.15MPa)中滅菌20分鐘。在30'C，和不斷攪拌通氧條件下培養(yǎng)，取樣在紫外分光光度計上測定600nm的吸光度值，00600達(dá)到0.81.2之間進(jìn)行下一步驟。3)按照1~5%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基成分包括一定量的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、尿素、NaN03，NaCl、MgS04、KH2P04,K2HP04以及誘導(dǎo)物肌苷，培養(yǎng)條件同步驟2，培養(yǎng)時間18-26個小時，600nm的吸光度值在15~18之間結(jié)束發(fā)酵(設(shè)發(fā)酵液體積為V)。4.按權(quán)利2所述的嘌呤核苷磷酸化酶純化生產(chǎn)工藝，其特征如f:1)權(quán)利3中發(fā)酵后的發(fā)酵液按照常規(guī)方法得到菌體，使用濃度為磷酸鉀緩沖液(0.1V體積)重懸菌體，加入溶菌酶，37'C溫育l-2h。其中磷酸鉀緩沖液的濃度為20-50mM，pH值為6.8-7.8，溶菌酶的終濃度為10~150mg/ml發(fā)酵液。2)使用高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)菌，4度下10000rpm離心20min去除菌體，得到胞內(nèi)粗酶液。3)在粗酶液中加入硫酸鏈霉素或者硫酸魚精蛋白等去除核酸雜質(zhì)，離心步驟同步驟2),使用硫酸銨沉淀進(jìn)行初步分離，離心得到沉淀，復(fù)溶。4)采取離子交換或者疏水層析使腺苷脫氨酶從復(fù)溶液中分離，得到腺苷脫氨酶，使用凝膠過濾收集第一峰得到5'核苷酸酶，收集第二峰得到嘌呤核苷磷酸化酶。5)通過冷凍干燥最終得到終產(chǎn)品，產(chǎn)品成白色粉末狀，在此過程中需要加入凍干保護(hù)劑。在-20'C保存可以穩(wěn)定12個月。嘌呤核苷磷酸化酶成品在腺苷脫氨酶以及5'-核苷酸酶測定試劑盒中使用完全符合各項(xiàng)性能指標(biāo)。全文摘要血清腺苷脫氨酶和5’-核苷酸酶生化診斷試劑盒中所用的嘌呤核苷磷酸化酶對底物特異性有著特殊的要求。本發(fā)明旨在提供一種生產(chǎn)符合該要求的嘌呤核苷磷酸化酶，以及偶聯(lián)生產(chǎn)腺苷脫氨酶和5’-核苷酸酶的發(fā)酵純化工藝。采用這種生產(chǎn)工藝，從一步發(fā)酵中獲得三種有用的酶制劑，工藝簡單，周期短，最大的程度利用副產(chǎn)物，有很高的經(jīng)濟(jì)效益，嘌呤核苷磷酸化酶使用在腺苷脫氨酶以及5’-核苷酸酶測定試劑盒中，完全符合各項(xiàng)性能指標(biāo)。文檔編號C12N1/20GK101289646SQ20071009830公開日2008年10月22日申請日期2007年4月19日優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日發(fā)明者(請求不公開姓名)申請人:北京邁迪卡科技有限公司