專利名稱：：一種用于腫瘤局部介入治療的tat-peⅲ融合蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種融合蛋白，更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEIH融合蛋白。同時(shí)，本發(fā)明還涉及一種所述TAT-PEID融合蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。放療、化療等常規(guī)治療方法在治療腫瘤的同時(shí)也殺傷正常細(xì)胞，副作用極大。腫瘤的生物治療是不同于手術(shù)、放療和化療的一種全新的腫瘤治療方法，不僅可以克JJgj改療、化療手段的上述缺點(diǎn)，而且能夠顯著提高治療效果，因此受到醫(yī)學(xué)研究人員的廣泛關(guān)注。利用免疫毒素進(jìn)行導(dǎo)向治療是生物治療的一個(gè)重要途徑。免疫毒素是可以識(shí)別和選擇性破壞某些特定細(xì)胞功能的一類融合蛋白，由靶向區(qū)和細(xì)胞毒區(qū)兩部分組成。靶向區(qū)多為抗體或細(xì)胞因子，細(xì)胞毒區(qū)多選擇銅綠假單胞菌外毒素A(/^eiw/湖o加s3er收/oosaexotoxinA，PE)的部分片段。PE是分子量為66KD的單鏈蛋白質(zhì)，通it^"延伸因子-2的ADP-核糖基化抑制真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是自然界存在的毒性最強(qiáng)的分子之一，殺細(xì)胞作用遠(yuǎn)高于化學(xué)抗癌藥物，因此，免疫毒素是目前研究最多的導(dǎo)向藥物。PE由613個(gè)M酸組成，含有三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域Ia區(qū)是細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)，Ib區(qū)具有連接調(diào)節(jié)作用，n區(qū)是跨膜轉(zhuǎn)位區(qū)，m區(qū)是酶活性區(qū)。常用于構(gòu)建免疫毒素的PE片段是PE40(Ia區(qū)缺失)和PE38(Ia及部分Ib缺失)。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所Hhara等構(gòu)建了一種微型免疫毒素，分子中僅含TGFot和PE的ID區(qū)(PEm)，對(duì)表達(dá)TGF受體的細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒活性，并對(duì)荷瘤小鼠具有明顯的紳瘤消退效應(yīng)，表明PEm也能有效地用于構(gòu)建免疫毒素。免疫毒素作為一種新型治療藥物具有廣闊的應(yīng)用前景，但是在臨床應(yīng)用中仍然面臨許多挑戰(zhàn)。首先，免疫毒素的穿透性有待提高，尤其在實(shí)體瘤的治療中，藥物的穿透性至關(guān)重要。其次，研制免疫毒素時(shí)應(yīng)盡量控制其分子大小，減小免疫毒素的分子量。單克隆抗體是構(gòu)建免疫毒素時(shí)最常用的導(dǎo)向分子，但完整的單抗分子量大，通常有150KD左右；即便近年經(jīng)過改進(jìn)的單鏈抗體，分子大小也有25KD左右。因此，為克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性，在現(xiàn)有導(dǎo)向治療的研究基礎(chǔ)上，若能構(gòu)建一種既保留免疫毒素的高細(xì)胞毒性、又具有很強(qiáng)穿透性的小分子物質(zhì)，再借助現(xiàn)代把向治療技術(shù)直接作用于腫瘤組織，無疑對(duì)增強(qiáng)腫瘤治療效果，減輕全身毒副作用都具有重要意義。穿膜肽(penetratin)是近年發(fā)現(xiàn)的一類具有細(xì)胞生物膜穿透功能的小分子肽類物質(zhì)，其中來源于人類免疫缺陷病毒HIV-1Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain,PTD)能夠高效穿過生物膜的結(jié)構(gòu)域，將與其共價(jià)連接的多肽、蛋白質(zhì)及DNA等分子跨膜導(dǎo)入幾乎所有的組織和細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很高而且對(duì)細(xì)胞沒有損傷。Tat蛋白PTD的核心序列由11個(gè)M酸組成，其序列為YGRKKRRQRRR，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的TatPTD最短的序列，其轉(zhuǎn)導(dǎo)能力不比全長(zhǎng)Tat序列差。Schwarze等研究發(fā)現(xiàn)TatPTD可介導(dǎo)相對(duì)分子量15KD~200KD的蛋白從細(xì)^卜向細(xì)胞內(nèi)直接跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，表明TatPTD具有廣鐠的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。原發(fā)性肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，我國(guó)每年死于肝癌約11萬(wàn)人，占M^^肝癌死亡人數(shù)的45%。對(duì)于不能手術(shù)切除的中晚期肝癌，介入治療是目前最好的治療方法?，F(xiàn)用各種肝癌介入治療藥物或由于在胂瘤組織內(nèi)擴(kuò)散差，或由于局部殺毒力不強(qiáng)等缺點(diǎn)，只適合于小肝癌，較大肺瘤效果往往不佳，尋找合適的局部介入治療藥物是近來肝癌治療研究的一個(gè)方向。介入治療技術(shù)提高藥物治療耙向性，對(duì)于目前尚無根治方法的惡性腫瘤，介入治療可將幾種最有效的抗癌藥搭配在一起，通過導(dǎo)管技術(shù)找到腫瘤的供養(yǎng)動(dòng)脈，把抗癌藥和栓塞劑直接注入腫瘤組織，發(fā)揮最大的抗腫瘤作用，對(duì)全身毒副作用小，同時(shí)將腫瘤的供血血管阻塞，4吏腫瘤失去血供"餓死".本發(fā)明所述TAT-PEHI融合蛋白，作為介入治療抗癌藥物，可用于包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的局部^h入治療。所述TAT-PEffl融合蛋白保留了免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的高殺傷活性，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、分子量小的優(yōu)點(diǎn)，克服了免疫毒素的局限性，用于介入治療，可以避免TAT-PEm融合蛋白在治療過程中對(duì)正常組織細(xì)胞的損害。同時(shí)也能有效解決免疫毒素穿透性弱的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEffl融M白，它由人類免疫缺陷病毒的TATPTD與銅綠假單胞菌外毒素A的m區(qū)組成。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEm融合蛋白的制備方法，將TatPTD與PEffl融合制得。本發(fā)明的目的還在于提供一種栽體為pQE-TAT-PEm的重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供了一種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEffl融合蛋白，它由人類免疫缺陷病毒的TATPTD與銅綠假單胞菌外毒素A的m區(qū)組成。HIV-1AY358073抹TAT蛋白PTD序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為tatggcaggaagaagcgaagacagagacgaaga。在這11個(gè)AJ^酸中，有6個(gè)精氨酸(R)，兼顧精氨酸在HIV-1和E.Coli的使用偏嗜性，將HIV-1AY358073林TAT蛋白PTD序列中兩個(gè)精氨酸的使用密碼cga替換為cgt;,氨酸外，其余5個(gè)氨基酸的密碼使用情況均不含有大腸埃希菌(E.Coli)的稀有密碼子，可以保留原核苷酸序列。因此，我們用于構(gòu)建pQE-TAT-PEIH重組質(zhì)粒的HIVTatPTD的核苷酸序列為tatggcaggaagaagcgtagacagagacgtaga。本發(fā)明提供的用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEDI融合蛋白具有SEQIDNO:1所示的M酸序列。本發(fā)明還提供一種編碼上述用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEffl融合蛋白的DM序列，其具有SEQIDNO:2所示的序列或者編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡(jiǎn)并性的序列。本發(fā)明提供了一種TAT-PEm融合蛋白的制備方法，將TatPTD與PEIH融合制得。包含下列步驟確定人類免疫缺陷病毒的TATPTD氨基酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列；選擇加在TatPTD兩側(cè)的甘氨酸的密碼子；擴(kuò)增同時(shí)含有TatPTD和PEni片斷的目的基因。其中，用于構(gòu)建pQE-TAT-PEm重組質(zhì)粒的HIVTatPTD的核苷酸序列優(yōu)選為tatggcaggaagaagcgtagacagagacgtagsu優(yōu)選的甘氨酸的密碼子為ggc。優(yōu)選的目的基因長(zhǎng)度為729bp。優(yōu)選的擴(kuò)增方法為使用PCR方法。本發(fā)明提供了一種表達(dá)目的蛋白的重組質(zhì)粒，即pQE-TAT-PEm。優(yōu)選利用尸rall、Wfldm酶切位點(diǎn)，將目的基因克隆于原核表達(dá)載體pQE-31中制得.更優(yōu)選經(jīng)位于PEm目的片段5'端的戶WI和3'端的#//2dm雙酶切，即為線性化的pQE-TAT栽體，還可用于克隆其它的目的片段。本發(fā)明將來源于人類免疫缺陷病毒HIV-1Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain,PTD)與銅綠假單胞菌外毒素A的m區(qū)(PEffl)融合，構(gòu)建pQE-TAT-PEffl重組質(zhì)粒，經(jīng)表達(dá)、純化得到具有抑瘤活性的TAT-PE冚融合蛋白。TAT融合蛋白系統(tǒng)是一種很好的蛋白傳送工具，打破了蛋白質(zhì)通常只能通過細(xì)M面受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將所攜帶的生物信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)的旨，在臨床應(yīng)用大分子藥物治療腦血管疾病、腫瘤疾病中具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)也能有效解決免疫毒素穿透性弱的問題。本發(fā)明利用TAT介導(dǎo)蛋白質(zhì)的方法，將TatPTD的編碼基因與外源蛋白基因連接，表達(dá)融合蛋白，所得到的TAT-PEm融合蛋白不僅保留了TAT原有的穿透力，而且不影響外源蛋白的活力。本發(fā)明采用MTT法測(cè)定了TAT-PEffl融合蛋白的體外抑瘤活性，結(jié)果表明TAT-PEin融合蛋白對(duì)B16細(xì)胞具有明確的細(xì)胞毒作用；同時(shí)建立小鼠B16黑色素瘤模型，檢測(cè)TAT-PEm融合蛋白的體內(nèi)抑瘤活性，其結(jié)果顯示TAT-PEOI融合蛋白具有一定的抗腫瘤作用。本發(fā)明所述TAT-PEffl融合蛋白，可用于包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的局部介入治療。所述TAT-PEm融合蛋白保留了免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的高殺傷活性，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、分子量小的優(yōu)點(diǎn)，克服了免疫毒素的局限性。用于介入治療，可以避免TAT-PEffl融合蛋白在治療過程中對(duì)正常組織細(xì)胞的損害。圖1表示pQE-TAT-PEHI重組質(zhì)粒構(gòu)建圖；圖2A表示TAT-PEffl-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，其中1.1kbDNAMarker(1000(f250bp);2.TAT-PEHI-PCRproducts;圖2B表示pQE-TAT-PEffl重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，其中1.1kbDMMarker(1000(T250bp);2.pQE-TAT-PEIH經(jīng)A/I/W/2dffl雙酶切；圖3表示pQE-TAT-PEm重桑贈(zèng)粒構(gòu)建的測(cè)序峰圖；圖中1.pQE-31栽體序列，從左向右依次為翻*始密碼ATG,RGS'6xHis標(biāo)簽；2.酶切位點(diǎn)酶切后補(bǔ)平的序列；3.戶rall酶切位點(diǎn)酶切后的序列；4.甘氨酸序列；5.HIVTatPTDll個(gè)氨基酸的g序列；6.甘氨酸序列；7.尸WI酶切位點(diǎn)序列；8.PEffl的序列；圖4表示IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pQE-TAT-PEDI陽(yáng)性重組子的SDS-PAGE分析；其中，1:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2-5:pQE-TAT-PEffl質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后；6:pQE-31載體誘導(dǎo)后；圖5表示TAT-PEffl融合蛋白的親和層析(Ni-NTAresin)純化，圖中1，throughpeakofsample;2，elutionpeakwithbuffer圖6表示TAT-PEHI融合蛋白親和層析純化的SDS-PAGE電泳，圖中1:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；2:PQE-31載體誘導(dǎo)后；3:pQE-TAT-PEHI誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；4:TAT-PEIH融合蛋白親和層析穿過峰；5、6:TAT-PEffl融合蛋白親和層析^J^;圖7表示MTT比色法測(cè)定TAT-PEID融合蛋白對(duì)B16細(xì)胞的影響；具體實(shí)施方式試劑與材料一、質(zhì)粒、菌抹與細(xì)胞林表達(dá)質(zhì)粒pQE-31為德國(guó)Qiagen公司同名產(chǎn)品，pUCm-T載體為上海生工產(chǎn)品，重組了PE全長(zhǎng)基因的pQE-PE重組質(zhì)粒由本室構(gòu)建，大腸埃希菌JM109以及B16黑色素瘤細(xì)胞抹由本室保存。二、主要試劑試劑名稱戶"iS;rTaqDNA聚合酶T4DNA連接酶(T4DNALigase)T4DMDNA多聚酶(T4DNAPolymerase)Ni-NTA親和樹脂(Ni-NTAagarose)笨甲基磺酰氟(PMSF)還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)小牛血清DMEM培養(yǎng)液胰酶(trypsin)四甲基偶氮唑鹽(MTT)二甲基亞砜(DMS0)丙三醇(甘油)試劑來源美國(guó)MBI公司曰本Takara公司日本Takara公司日本Tak:ara公司曰本Takara公司美國(guó)Promega公司美國(guó)MBI公司德國(guó)Qiagen〃>司上海生工美國(guó)Amresco分裝成都哈里/>司美國(guó)Gibco7^司美國(guó)BI0S0URCE公司美國(guó)BBI公司成都科龍化工試劑廠北京紅星化工廠Hoechst33342染料北京晶美生物公司>^丙啶(PI)北京晶美生物公司實(shí)施例一、pQE-TAT-PEID重組質(zhì)粒的分子i殳計(jì)1.在將HIVTatPTD核心序列的11個(gè)皿酸轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的核苷酸序列時(shí)，要兼顧HIV的密碼子使用偏嗜性，并且排除大腸埃希菌的稀有密碼子，以利于HIVTatPTD在大腸埃希菌中的正確高t良達(dá)。同時(shí)，在TAT11個(gè)氨基酸的兩側(cè)各加l個(gè)甘氨酸，以保證鍵的自由旋轉(zhuǎn)(freebondrotation)。(l)HIVTatPTD11個(gè)氨基酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列的確定在NCBI網(wǎng)站，查找到多個(gè)HIV-l分離株的基因序列，其中，AY358073的TAT蛋白PTD的a酸序列為YGRKORQRRR，與用于穿膜的TATPTD序列完全一致。HIV-lAY358073林TAT蛋白PTD序列對(duì)應(yīng)的核苷^f列為tatggcaggaagaagcgaagacagagacgaaga。在這11個(gè)#^酸中，有6個(gè)精氨酸(R)，其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為第3、6、7、9、10、ll位的氨基酸；兼顧精氨酸在HIV-l和E.的使用偏嗜性，將HIV-1AY358073林TAT蛋白PTD序列中兩個(gè)精氨酸(第6、10位)的使用密碼cga替換為cgt;除精氨酸外，其余5個(gè)氨基酸的密碼使用情況均不含有大腸埃希菌(E.fo//)的稀有密碼子，可以保留原核苷酸序列。因此，用于構(gòu)建pQB-TAT-PElH重組質(zhì)粒的HIVTatPTD的核苷酸序列為Utggcaggaagaagcgtagacagagacgtagae(2)加在TATPTD兩側(cè)的甘氨酸的密碼子選擇兼顧甘氨酸在HIV-l和E.的使用偏嗜性，選擇ggc作為甘氨酸的使用密碼。2.根據(jù)GenBank公布的PE^S序列，針對(duì)PE的HI區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物。在上游引物的5端依次引入保護(hù)M(CAT)、,wn酶切位點(diǎn)(CAG'CTG)、與HIVTatPTD核心序列的11個(gè)^酸相對(duì)應(yīng)的g序列、戶WI酶切位點(diǎn)(CTGCA，G)，設(shè)計(jì)的上游引物長(zhǎng)度達(dá)74bp，序列為PTW:5，-CATCAGCTGGCTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGAGGCCTGCAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGAC-3，。下游引物為P2，序列為5，"GCGCAAGCTTCAGTTACTTCAGG-3，。5，端引入#//^111酶切位點(diǎn)，i殳計(jì)的引物委托上海生工生物工程z^司合成。3.為了減少目的蛋白中的外源序列，通常盡量選用載體多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)來克隆目的片段，pQE-31多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)分別是勘iI和W/3dffl。經(jīng)DMStar軟件分析，#//3dDI在擬插入的目的片段PE邁中沒有切點(diǎn)，可用；勘/aHI在PEm中有切點(diǎn)，因此不能直接^f吏用，為此，^研究擬先用勘iaHI對(duì)pQE-31進(jìn)行酶切，再用T4DNAPolymerase補(bǔ)平粘端，與經(jīng)過平端酶UV〃n)酶切的目的片段進(jìn)行連接，以克隆目的片段。4.利用/Vi/n、#//7dm酶切位點(diǎn)，將目的基因克隆于原核表達(dá)栽體pQE-31中，重組質(zhì)粒^^名為pQE-TAT-PEIII。5.pQE-TAT-PEIH重組質(zhì)粒經(jīng)位于PEffl目的片段5，端的A,I和3，端的#//dHI雙酶切后，即為線性化的pQE-TAT載體，還可用于克隆其它的目的片段。實(shí)施例二、PCR擴(kuò)增同時(shí)含有TatPTD和PEHI的目的基因1.PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收反應(yīng)體系如下pQE-PE重組質(zhì)粒模板PTAT(8.3nmol/L)2plP2(6.7,l/L)2pldNTPs(每個(gè)2.5咖ol/L)1^1&r時(shí)DNA聚合酶(5U/fU)0.5pl10xPCRbuffer5ji125mol/LMgCl24^150%甘油5plDMSO2.5plddH20_27plTotal50[ilPCR反應(yīng)糾94匸，2min;94€,40sec，—48t:，40sec，—72匸，lmin，2個(gè)循環(huán)；94X:，40sec，—58t:，40sec，—72t:，lmin，20個(gè)循環(huán)；72ClOmin。電泳證實(shí)擴(kuò)增出了與預(yù)期大小相符的目的片段后，采用膠回收試劑盒回收純化目的片段，-20匸保存?zhèn)溆?。在PCR擴(kuò)增的上游引物中，引入了TatPTD的g序列，通過PCR擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)TatPTD和PEHI片段目的基因的融合結(jié)論以pQE-PE重組質(zhì)粒為;j^板，用5'端引入HIVTatPTD核心序列的P麗和5'端引入W/7dffl酶切位點(diǎn)的P2為引物，進(jìn)4亍PCR擴(kuò)增反應(yīng)，1%瓊脂糖,電泳顯示，在700bp左右有一清晰條帶，與設(shè)計(jì)的片段大小(729bp)相符(見圖2-1)。實(shí)施例三、pUCm-T-TAT-PEin重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.pUCm-T載體與TAT-PEIHPCR產(chǎn)物的連接反應(yīng)pUCm-T栽體lplPCR產(chǎn)物(TAT-PEm)3pl10xbufferforT4DNALigaseT4DNALigase(5U/pl)lplPEG4000lpl<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>反應(yīng)條件16*C，16h，—65*C，10min。2.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化;^埃希菌JM109取5pl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到lOOjilJM109感受態(tài)細(xì)胞中，取200nl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布LB(AMP)平板(表面涂布X-gal和IPTG)，37t:孵育18h。3.篩選陽(yáng)性重組子從轉(zhuǎn)化平板上隨，取8個(gè)白色菌落,分別接種于3mlLB(AMP)液體培養(yǎng)基，37"C振搖培養(yǎng)18h。堿裂解法少量提取質(zhì)粒，用ZVtfII、A'/2dffl進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系如下質(zhì)?！?pl/Vtfll(12U/V1)0.5plW/3dm(15U/jU)0.5ji110xMbuffer_Total10pl反應(yīng)條件371C,3h。酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖皿電泳分析，同時(shí)對(duì)篩選到的重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測(cè)序鑒定。實(shí)施例四、pQg-TAT-PEHl重組質(zhì)粒的構(gòu)建(參見圖1)1.I酶切pQE-31質(zhì)粒及酶切產(chǎn)物回收pQE-31質(zhì)粒的勘滷I酶切反應(yīng)體系pQE-31質(zhì)粒67jil勘/rflI(萌nl)5pl10xbuffer_8plTotal80jU反應(yīng)條件37"C，3h。采用1%瓊脂糖^^電泳、膠回收試劑盒回收上述pQE-31經(jīng)勘/aHI酶切線性化質(zhì)粒，回收產(chǎn)物溶于30pl(idH20中，于-20lC保存?zhèn)溆谩?.3'突出端補(bǔ)平反應(yīng)體系如下pQE-31/^jzflI線性4t質(zhì)粒30^15xbuffer8^1dNTPs(每個(gè)2.5腸1/L)1.5plT4■Polymerase_0.8^1Total40.3pl混勻后置于PCR儀中，反應(yīng)務(wù)fr:20min，—70匸，10tnin。采用1%瓊脂糖粉艮電泳、膠回收試劑盒回收補(bǔ)平的pQE-31/勘成I線性化質(zhì)粒，回收產(chǎn)物溶于25plddH20中，于-20匸M備用。3.#//3d邁酶切及酶切產(chǎn)物回收反應(yīng)體系如下補(bǔ)平的PQE-31/勘isHI線性化質(zhì)粒25jUW/Jdm(15U/nl)2pl10xMbuffer_^Total30jil反應(yīng)條件37C,3h。采用l4瓊脂糖皿電泳、膠回收試劑盒回收上迷pQE-31經(jīng)勘irfU及#//3dm酶切的線性化質(zhì)粒，回收產(chǎn)物溶于20plddHz0中，于-20x:絲備用。4.pUCm-T-TAT-PEHI重組質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)反應(yīng)體系如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>反應(yīng)條件37匸，3h。采用1%瓊脂糖:^電泳、回收產(chǎn)物溶于20plddH20中，于-20r絲備用。5.雙酶切產(chǎn)物連接反應(yīng)反應(yīng)體系如下pQE-31片段TAT-PEm片段T4DNALigase(5U/pl)10xbufferforT4DNALigase膠回收試劑盒回收純化，6|il1.6"Total16.6fil混勻后置于PCR儀中，反應(yīng)條件16"C，16h，—65"C,10min。6.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109取10nl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到lOOjilJM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB(AMP)平板，37t:孵育18h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。7.陽(yáng)性重組子的篩選、鑒定^L轉(zhuǎn)化平板上的菌落，接種于4ml含AMP的LB液,養(yǎng)基中，37t:振搖培養(yǎng)18h，堿裂解法少量提取質(zhì)粒，用戶WI、jW/3dm進(jìn)行酶切鑒定，同時(shí)對(duì)篩選到的重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測(cè)序鑒定。結(jié)論pQE-TAT-PEm重組質(zhì)粒雙酶切及核苷酸測(cè)序鑒定將TAT-PEHI的PCR純化產(chǎn)物與pUCm-T載體連接，篩選到的陽(yáng)性pUCm-T-TAT-PEm重組質(zhì)粒經(jīng)戶ran/#/'/3dHI雙酶切后、回收純化，與經(jīng)勘通I酶切、3，突出端補(bǔ)平、#//dm酶切的pQE-31質(zhì)粒片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，，菌落，提取質(zhì)粒DNA,用/W/3dm進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖皿電泳，結(jié)果見圖2-2。由圖可見，陽(yáng)性重組質(zhì)?？汕谐鲱A(yù)期大小片段(理論值為645bp)。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測(cè)序，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒的序列和閱讀框均正確，與我們最初的分子設(shè)計(jì)完全吻合(見圖3)。實(shí)施例五、目標(biāo)蛋白的放大表ii^包涵體制備依照小規(guī)模培養(yǎng)法，各種成分按比例增加到2000ml,用LB培養(yǎng)基對(duì)pQE-TAT-PEffl/JM109工程菌進(jìn)行培養(yǎng)和表達(dá)，以擴(kuò)大產(chǎn)量。按如下方法制備包涵體1.8000rpm離心收集表達(dá)菌體，每升培養(yǎng)物可產(chǎn)生3~4g濕細(xì)胞沉淀。按每克細(xì)胞沉淀加3mlbufferA充分混懸細(xì)菌，13000g離心10min。2.將沉淀重懸于IO倍體積的bufferA中，加入8jillOOmmol/LPMSF。在冰浴中超聲破菌，i爻置條件為工作3sec，間歇2sec,全程40min，取樣涂片，用顯^t^^L察破菌情況.3.超聲結(jié)束后，加TritonX-l00，使終濃度為0.1°/。，混勻，4X:靜置30min。4.13000g離心lh。棄上清，將沉淀重懸于3倍體積的bufferA中。5.13000g離心10min。將沉淀重懸于3倍體積的bufferA中。6.13000g離心20min。將沉淀重懸于9倍體積含0.1%p-巰基乙醇的bufferB中，4X:冰箱放置2h,不時(shí)搖動(dòng)以溶解包涵體。將裂菌液上清及沉淀溶解液上清取樣行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)論pQE-TAT-PEHI重組質(zhì)粒在JM109中的誘導(dǎo)表達(dá)將pQE-TAT-PEm重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109，篩選到了表達(dá)穩(wěn)定的pQE-TAT-PEm/JM109工程菌。將篩選到的陽(yáng)性工程菌pQE-TAT-PEIII/JM109過夜培養(yǎng)后，次日按l:50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至A6。。《0.6，加入IPTG至終濃度為100pmol/L,37X:誘導(dǎo)表達(dá)5h,取適量的表達(dá)菌行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4所示，從圖中可見陽(yáng)性重組子在約27kDa處有一條蛋白帶，此蛋白與推測(cè)的融合蛋白分子量大小相符，為序列正確的陽(yáng)性重組子表達(dá)產(chǎn)物。實(shí)施例六、TAT-PEHI融合蛋白的親和層析純化1.用Qiagen公司的Ni-NTA純化系統(tǒng)，采用pH皿的方法對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行親和層析純化。2.取2ml填料，離心去掉保存液，并用bufferB(pH8.0)洗滌兩次，再用其重懸填料，然后裝柱，采用bufferB平衡柱子，取經(jīng)0.22,濾膜過濾的TAT-PEin包涵體溶解液上清3ml上樣，續(xù)以bufferC(pH6.3)沖洗雜蛋白，待UV值回歸基線后，用bufferD(pH4.5)洗脫目標(biāo)融合蛋白，收集UV>0.05的峰，最后用bufferB凈化平衡柱子。將上述各步留取的樣品作SDS-PAGE電泳分析。結(jié)論TAT-PEHI融合蛋白的Ni-NTA親和柱層析從親和層析純化圖譜(圖5)可見，加入pH4.5的bufferD后，出現(xiàn)一洗脫峰；SDS-PAGE電泳顯示(圖6)，在親和層析穿過峰中無目標(biāo)蛋白質(zhì)存在，洗脫峰中含分子量約27kD的蛋白質(zhì)，與TAT-PEm融合蛋白理論分子量相符，說明在載量范圍內(nèi)，親和層析柱可完全捕獲該融合蛋白；且捕獲的融合蛋白純度高，基本無雜蛋白存在，表明采用親和層析可實(shí)現(xiàn)TAT-PEm融合蛋白的一步純化，實(shí)施例七、目標(biāo)蛋白的透析復(fù)性TAT-PEHI融合蛋白的等電點(diǎn)為8.44，在pH9.0的透析液中進(jìn)行復(fù)性。1.調(diào)整親和層析洗脫蛋白的濃度為0.1mg/ml，將稀釋后的變性蛋白溶液裝入預(yù)先處理好的透析袋(截留分子量1.4kD)中。2.將透析袋放入一只裝有400ml透析液I的燒杯中，4"C,攪拌透析3~4h更換新的透析液I，重復(fù)此步驟兩次.3-將透析袋itX400ml透析液n中，4t:,攪拌透析34h。更換新的透析液II，重復(fù)此步驟兩次。4.將透析袋敘400ml0.01mol/L的PBS中，4t:，攪拌透析3-4h。5.將透析袋放入400ml滅菌去離子水中，4t:，攪拌透析3-4h。6.將透析袋中溶液合并，冷凍干燥。用0.Olmol/L的PBS溶解，0.22咖濾膜過濾除菌，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。實(shí)施例八、BCA法測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度將已復(fù)性的蛋白濃縮凍干，TAT-PEIH凍干產(chǎn)物，用0.01mol/L的PBS溶解，0.22um濾膜過濾除菌，從中取2pl加入到98plddH20中，以ddH20為空白對(duì)照調(diào)零，在S腿rtSpec3000分光光度計(jì)上采用BCA法進(jìn)4亍蛋白含量測(cè)定。測(cè)得TAT-PEIH樣品濃度為1.866mg/ml。用該樣品做活性鑒定。實(shí)施例九、TAT-PEm融合蛋白的體外抑瘤活性檢測(cè)(一)MTT法檢測(cè)TAT-PEID融合蛋白的體外抑瘤活性1.細(xì)胞準(zhǔn)備B16細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代與凍存參照《細(xì)胞培養(yǎng)》的方法進(jìn)行。2.MTT檢測(cè)①將B16細(xì)胞以每孔103~1(T個(gè)細(xì)ii^種于96《L^，每孔200pl。培養(yǎng)24h36h后，吸棄上清，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液150n1，再加入不同濃度的TAT-PEffl融合蛋白，每種濃度以及對(duì)照各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔終體積為200yl，于37TC，5義C02孵箱培養(yǎng)36h。②吸棄上清，以PBS洗一遍，每孔加入MTT(5mg/ml)20nl和細(xì)胞培養(yǎng)液180nl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。③吸棄每孔上清，加入150plDMSO，終止培養(yǎng)，輕柔振蕩混勻10min。在680型酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)各孔光吸收值(OD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率表示細(xì)胞存活率(%)-(試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)x10054。一般以細(xì)胞存活率對(duì)藥物濃度對(duì)數(shù)作圖并掩泎圖法求出半數(shù)抑制濃度值UC50)。參見圖7。采用MTT法測(cè)定了TAT-PEm融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外抑瘤活性，結(jié)果表明TAT-PEm融合蛋白對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50值)為21.62ng/ml。(二)TAT-PEffl融合蛋白對(duì)B16細(xì)胞作用的形態(tài)學(xué)檢測(cè)熒光顯微皿察PE分子的細(xì)胞毒功能非常強(qiáng)大，m區(qū)是毒性功能區(qū)，具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，通it^延伸因子-2的ADP-核糖基化抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而多細(xì)胞生物的細(xì)胞死亡存在兩種不同形式細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死。細(xì)胞凋亡在一定情況下可轉(zhuǎn)化為細(xì)胞壞死，但兩者在形態(tài)學(xué)、生化代謝、分子機(jī)制、結(jié)局和意義等方面存在本質(zhì)的區(qū)別。毒素分子通常以細(xì)胞壞死的形式引起細(xì)胞死亡。本文擬采用Hoechst/PI雙染色法來檢測(cè)TAT-PEIH融合蛋白究竟以何種形式引起B(yǎng)16細(xì)胞死亡。染色方法參照MTT實(shí)驗(yàn)的IC50結(jié)果，向一瓶生長(zhǎng)良好的B16細(xì)胞中加入500m12.5mg/ml的TAT-PEffl融合蛋白，37"，5%C02孵箱中培養(yǎng)36h后，800rpm離心5min收集藥物處理細(xì)胞，加入PBS,調(diào)細(xì)胞濃度至1x106以上。從中吸取40pl至1.5mlEp管中，加入35jj1Hoechst(終濃度10mg/ml),37r溫育20~30min;再加入PI3~5n1(終濃度10yg/ml)，4"C靜置10~20min;取一滴于潔凈載玻片上，加蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察。以未經(jīng)TAT-PEffl融合蛋白處理的正常B16細(xì)胞為對(duì)照，同上染色。采用Hoechst/PI雙染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示，未經(jīng)過千預(yù)的正常對(duì)照組僅見極少數(shù)細(xì)胞凋亡或壞死，可能為正常的細(xì)胞程序性死亡或機(jī)械操作引起的壞死。而與TAT-PEffl融合蛋白共稃育36h的B16細(xì)胞可見大量凋亡、壞死，表明TAT-PEDI融合蛋白對(duì)B16細(xì)胞具有明確的細(xì)胞毒作用；結(jié)果顯示，多數(shù)細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)凋亡與壞死，提示死細(xì)胞大多源于凋亡后期的繼發(fā)性壞死。實(shí)施例十、TAT-PE辺融合蛋白的體內(nèi)抑瘤活性檢測(cè)(一)荷瘤動(dòng)物4莫型的建立建立小鼠B16黑色素瘤模型，接種B16黑色素瘤細(xì)胞5x105個(gè)/只的小鼠全部有腫瘤長(zhǎng)出，一周成瘤率100%;荷瘤兩周時(shí)，從40只荷瘤鼠中剔除成瘤不良的10只小鼠，將其余30只荷瘤鼠隨機(jī)分為兩組A組為對(duì)照組，B組為治療組，15只/組。(二)荷瘤小鼠分組、給藥治療A^見察將成功荷瘤的小鼠隨機(jī)分為兩組，15只/組。A組為對(duì)照組植入腫瘤，觀察黑色素瘤的生長(zhǎng)情況。B組為治療組荷瘤兩周后開始給藥，每天一次；參照MTT實(shí)驗(yàn)的IC50結(jié)果，每次向瘤體內(nèi)直接注入TAT-PEIH融合蛋白約70jig。4周后，所有動(dòng)物均處死，取出黑色素瘤，稱取瘤重。實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示。計(jì)算方法為瘤重抑制百分率-(l-試驗(yàn)組瘤重/對(duì)照組瘤重)xl00。/。。中草藥抑制率大于30%，合成藥大于40%，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重復(fù)3次，療效穩(wěn)定，則評(píng)定有一定的抗腫瘤作用。荷瘤兩周后開始給藥。每天一次，每次向瘤體內(nèi)直接注入TAT-PEIH融合蛋白約70yg。給藥時(shí)，對(duì)于直徑小于2cm的肺瘤，細(xì)針穿刺至肺瘤的中心進(jìn)行單點(diǎn)注射即可；而對(duì)于直徑大于2cm的腫瘤，則沿穿刺路徑由i^5L近連續(xù)注射或在兩個(gè)路徑上分別進(jìn)行連續(xù)注射，以盡可能實(shí)現(xiàn)整個(gè)瘤體完全的藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)。治療過程中，未見荷瘤小鼠出現(xiàn)明顯的全身不^A應(yīng)。治療4周后停藥，停藥次日處死小鼠，解剖皮下瘤塊，稱重。實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示。TAT-PEffl蛋白對(duì)BALB/C小鼠黑色素瘤的瘤重抑制百分率-(1_，組瘤重/對(duì)照組瘤重)x100%=52.75%，結(jié)果顯示TAT-PEm融合蛋白具有一定的抗腫瘤作用。序列表<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>—種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEm融合蛋白及制備方法<130〉7P99054-CN<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>〈211><212><213>242PRTTAT-PEm融合蛋白的氨基酸序列<400〉1Met1ArgGlyGluPhe65PheGlyAspArgArgLysGlyArg50ValGlyLysAsp35LeuSerHisHisHisHisHisHisThrAspProGlyArg20Val5ArgGinArgArgSerPheSerLeuGinAlaGlyGlyGlyValTyrTyrHisPheGinVal130Glu115Tyrlie100ProArg85AlaGly70AlaHis55ThrThr40ArgArg25Arg10GlyLeuGinPheGlyThrGinGinLeuGluPheLeuGluAspAlaArgGlyAspProArgSerGinValProArgSer135Gly120SerAla105ArgAsp90LeuAla75LeuGlu60AlaAsn45ArgLeu30TrpTyr15GlyGlyAspThrValGlyTyrValGinSerlieAspAlaTyrGlylieArgAsnAlalieL6UProGlyPhe140Gly125TyrTyr110AlaTrp95AlaVal80ArgGinLeuLeuArgThrSerLeuThr145GlyHisLeuProAlaAlaProGluAlaAla150LeuProLeuArgLeuAsp165GluGlyGlyArgLeuGlu180lieProSerThrGlyGluValGluArgLeu155AlalieThrGlyProGlu170175GlyTrpProLeuAlaGluThrValVal195LeuAspProSerAlaGlyAsp210AlaLeu225LeuLyslieLeu185lieProThrAspPro200lieProAspLysAla190AsnVallie160GluArgGlyProAspTyrAla230Ser215SerGinProArg205GinAlalieSerGlyLys235Glu220ProProArgGluAsp240<210>2〈211>729<212>DNA<213>編碼TAT-PEIII的DNA序列<400〉2atg卿ggatctcaccatcaccatcaccatacggatcctggctatggcaggaagaagcgt60agacagagacgtagaggcctgcagttcctcggcgacggcggcgacgtcagcttcagcacc120cgcggcacgcagaactggacggtggagcggctgctccaggcgcaccgccaactggaggag180cgcggctatgtgttcgtcggctaccacggcaccttcctcgaagcggcgca幼gcatcgtc240ttcggcggggtgcgcgcgcgcagccaggacctcgacgcgatctggcgcggtttctatatc300gccggcgatccggcgctggcctacggctacgcccaggaccaggaacccgacgcacgcggc360cggatccgcEiacggtgccctgctgcgggtctatgtgccgcgctcgagcctgccgggcttc420taccgcaccaigcctgaccctggccgcgccggaggcggcgggcgaggtcgaacggctgatc480ggccatccgctgccgctgcgcctggacgccatcaccggccccgagg鄉(xiāng)a鄉(xiāng)cgggcgc540ctggagaccattctcggctggccgctggccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgatc600cccaccgacccgcgcaacgtcggcggcgacctcgacccgtccagcatccccgacaaggaa660caggcgatcagcgccctgccggactacgccagccagcccggcaaaccgccgcgcgaggac720ctgaagt幼729權(quán)利要求1、一種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白，其特征在于，含有人類免疫缺陷病毒的TATPTD和銅綠假單胞菌外毒素A的III區(qū)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEIH融^"白，其特征在于，組成TAT-PEffl融合蛋白的TATPTD不含有大腸埃希菌E.Coli的稀有密碼子。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白，其特征在于，該TAT-PEIH融合蛋白具有SEQIDNO:1所示的A^酸序列。4、一種編碼權(quán)利要求3所述的用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEID融合蛋白的DM序列，其特征在于其具有SEQIDN0:2所示的序列或者編碼相同蛋白質(zhì)的與其具有遺傳密碼簡(jiǎn)并性的序列。5、一種權(quán)利要求1所述的用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEIH融合蛋白的制備方法，其特征在于，將TatPTD與PEffl融合制得，包含下列步驟確定人類免疫缺陷病毒的TatPTD氨基酸所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列；選4^加在TatPTD兩側(cè)的甘氨酸的密碼子；擴(kuò)增同時(shí)含有TatPTD和PEffl片斷的目的基因。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的TAT-PEffl融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述用于構(gòu)建pQE-TAT-PEm重組質(zhì)粒的HIVTatPTD的核苷酸序列為tatggcaggaagaagcgtagacagagacgtaga。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的TAT-PEDI融合蛋白的制備方法，其特征在于，所選擇的甘氨酸的密碼子為ggc。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的TAT-PE邁融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述目的基因長(zhǎng)度為729bp,9、一種表達(dá)權(quán)利要求5、6、7、8中任一項(xiàng)所迷的目的基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒載體為pQE-TAT-PEEL10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，利用戶w/n、〃/;3dffl酶切位點(diǎn)，將目的基因克隆于原核表達(dá)載體pQE-31中制得。全文摘要本發(fā)明提供一種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白，它由人類免疫缺陷病毒的TATPTD與銅綠假單胞菌外毒素A的III區(qū)組成。本發(fā)明還提供一種用于腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白的制備方法。用本發(fā)明方法所得TAT-PEIII融合蛋白保留了免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的高殺傷活性，同時(shí)具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、分子量小的優(yōu)點(diǎn)，克服了免疫毒素的局限性。用于介入治療，可以避免TAT-PEIII融合蛋白在治療過程中對(duì)正常組織細(xì)胞的損害。文檔編號(hào)C12N15/63GK101125891SQ20071009246公開日2008年2月20日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者歡李,胡曉梅,胡福泉,饒賢才,黃建軍申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)