專利名稱：一種通路克隆入門載體及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種通路克隆(Gateway)技術的入門載體，特別是含有光誘導型啟動子(PrbcS)和GFP的Gateway入門載體，本發(fā)明還涉及該入門載體的構(gòu)建及應用。
背景技術：
啟動子是基因表達調(diào)控的重要元件，在數(shù)量和質(zhì)量上調(diào)控基因的表達。植物基因工程中常用的啟動子按其作用方式及功能可分為組成型啟動子和器官特異型啟動子。在植物轉(zhuǎn)基因操作中，最常用的一種啟動子是來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，這種啟動子在植株被CaMV感染期間，指導35S RNA合成，在植物的很多組織中都能高效表達(Odell等，1985；Nature，313810-812)，大多數(shù)的研究認為CaMV35S在植物中的表達模式為組成型，它不需要任何誘導作用，也沒有很強的器官組織特異性，用CaMV35S驅(qū)動的基因表達產(chǎn)生的目標蛋白定位于細胞質(zhì)中，因此CaMV35S是組成型啟動子，目前商業(yè)化能提供的植物表達載體都是含有CaMV35S啟動子的質(zhì)粒。用報告基因的研究結(jié)果表明CaMV35S的表達在根中最強，在莖、葉片、花和果實中較弱(Jefferson等，1987；EMBO，63901-3907)，因此要用CaMV35S實現(xiàn)目的基因在植物地上部分的器官如葉片中高水平表達同時使所表達的目的蛋白定位到細胞器如葉綠體中是不可能的。
1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表達量最大的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)的含量占植物細胞中可溶性蛋白的40-50％。Rubisco的小亞基(rbcS)由細胞核基因編碼，控制rbcS基因表達的啟動子為光誘導型啟動子(PrbcS)，在PrbcS的5’上游調(diào)控區(qū)有光應答元件，此外在該啟動子中還有將rbcS定位到葉綠體基質(zhì)的信號肽序列，PrbcS的表達有很強的組織特異性，需要光信號的誘導，在莖中有低水平的表達，在葉片中的表達最強(Sugita et al.，1987，MGG，209247-256)。用報告基因的研究結(jié)果表明在葉片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍，因此PrbcS是一種很強的光誘導型啟動子(Jefferson等，1987；EMBO，63901-3907)，在科研工作中PrbcS常被用來實現(xiàn)目的基因在葉片中的高水平表達和目的蛋白在葉綠體中的定位。
Invitrogen公司根據(jù)λ噬菌體基因組和大腸桿菌基因組之間的位點專一性重組的分子機制開發(fā)了一套分子克隆新技術，即通路克隆(Gateway)技術，Gateway技術的BP反應體系是根據(jù)λ噬菌體基因組和大腸桿菌基因組之間的整合機制設計出來的，BP反應是利用PCR產(chǎn)物產(chǎn)生Gateway的入門克隆方法之一。Gateway技術的LR反應體系是根據(jù)λ噬菌體基因組從大腸桿菌的基因組中切離的機制設計出來的，利用Gateway的LR反應可以構(gòu)建目的基因的表達載體。利用限制性內(nèi)酶和連接酶構(gòu)建質(zhì)粒載體時需要對DNA進行切割并回收目標片斷，然后用連接酶連接，這是一種費時間又費錢的工作。由于連接產(chǎn)物中被連接成功的質(zhì)粒含量不高，因此要求用于轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率非常高，才能獲得目的基因的克隆。農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化操作使用的表達載體都是分子量很大的質(zhì)粒載體，用大分子量的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細胞時轉(zhuǎn)化效率會降低很多，因此用限制性內(nèi)酶和連接酶構(gòu)建大的質(zhì)粒載體時，即使感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率非常高，成功的幾率還是很低的。用Gateway技術構(gòu)建質(zhì)粒載體時不需要利用限制性內(nèi)酶和連接酶，它只需要把兩種質(zhì)粒DNA混合并加入DNA整合或切離所需要的蛋白質(zhì)就能完成新質(zhì)粒的構(gòu)建，因此可以節(jié)省很多時間。但是目前Invitrogen公司開發(fā)的Gateway技術體系中沒有植物表達載體，而比利時的VIB/Gent公司開發(fā)的Gateway植物表達載體用的啟動子都是CaMV35S，這就極大地限制了Gateway技術在植物基因工程操作中的應用。葉片是植物的光合作用器官，在葉綠體中有很多的代謝途徑，如果要使目的基因在葉片中獲得高水平表達，用PrbcS控制目的基因的表達往往會獲得理想的結(jié)果。利用Gateway的BP反應可以產(chǎn)生Gateway的入門克隆，但是在實踐操作中本申請人發(fā)現(xiàn)使用這種技術操作的PCR產(chǎn)物片斷較大時成功的幾率不高。Invitrogen公司還開發(fā)了另外兩種產(chǎn)生Gateway入門克隆的方法，其中之一是TOPO克隆技術，但是這種技術的成本較高，如果PCR產(chǎn)物片斷較大時成功的機率也不高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通路克隆(Gateway)技術的入門載體，該載體含有光誘導型啟動子(PrbcS)和GFP報告基因，同時提供本發(fā)明載體在構(gòu)建含有光誘導型啟動子(PrbcS)的目的基因入門克隆質(zhì)粒中的應用和在利用通路克隆技術的LR反應構(gòu)建目的基因光誘導型植物表達載體中的應用，以及該載體的構(gòu)建方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案 通路克隆入門質(zhì)粒載體，其中含有綠色熒光蛋白GFP基因，還含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亞基基因的光誘導型啟動子(PrbcS)。
所述通路克隆入門質(zhì)粒載體為pENTR-2B*-PrbcS-*T-GFP，還含有Gateway的LR反應所需的attL1和attL2序列。
上述的的載體中綠色熒光蛋白GFP基因可用其它基因代替。
上述通路克隆入門質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP，由下述方法構(gòu)建而成 (1)用限制性內(nèi)切酶SphI將pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等構(gòu)建并提供，Sugita etal.，1987，MGG，209247-256)中的rbcS-3C切割出來，再用連接酶重新連接不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間載體pUC118-PrbcS-T； (2)利用一對互補引物NcoI5和NcoI3，通過點突變技術在pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入NcoI位點產(chǎn)生中間載體pUC118-PrbcS-*T； (3)利用一對互補引物HindIII5和HindIII3，通過點突變技術把Gateway的入門載體pENTR-2B多克隆位點中的XmnI位點改為HindIII產(chǎn)生中間載體pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切開pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割產(chǎn)生的啟動子DNA片斷PrbcS-*T，用連接酶把pENTR*和PrbcS-*T連接起來獲得中間載體pENTR*-Prbcs-*T； (4)以pGFP為模板，用GFP基因上下游特異性引物擴增GFP基因，獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆于T載體pUCm-T中，獲得中間載體pUCm-T-GFP； (5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收載體pENTR*-PrbcS-*T片斷和GFP基因片斷，用連接酶連接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，獲得入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
本發(fā)明的通路克隆入門質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP的構(gòu)建方法為 (1)用限制性內(nèi)切酶SphI將pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等構(gòu)建并提供，Sugita etal.，1987，MGG，209247-256)中的rbcS-3C切割出來，再用連接酶重新連接不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間載體pUC118-PrbcS-T； (2)利用一對互補引物NcoI5和NcoI3，通過點突變技術在pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入NcoI位點產(chǎn)生中間載體pUC118-PrbcS-*T； (3)利用一對互補引物HindIII5和HindIII3，通過點突變技術把pENTR-2B多克隆位點中的XmnI位點改為HindIII產(chǎn)生中間載體pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切開pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割產(chǎn)生的啟動子DNA片斷PrbcS-*T，用連接酶把pENTR*和PrbcS-*T連接起來獲得中間載體pENTR*-Prbcs-*T； (4)以pGFP為模板，用GFP基因上下游特異性引物擴增GFP基因，獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆于T載體pUCm-T中，獲得中間載體pUCm-T-GFP； (5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收載體pENTR*-PrbcS-*T片斷和GFP基因片斷，用連接酶連接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，獲得入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
本發(fā)明的通路克隆入門質(zhì)粒載體在構(gòu)建含有光誘導型啟動子(PrbcS)序列的目基因入門克隆質(zhì)粒中的應用；以及在利用通路克隆技術的LR反應構(gòu)建目的基因光誘導型植物表達載體中的應用。
本發(fā)明利用限制性內(nèi)酶和連接酶的技術把PrbcS啟動子和GFP報告基因插入到Gateway入門載體pENTR-2B的多克隆位點中，獲得一個含有光誘導型啟動子(PrbcS)序列和GFP報告基因的Gateway入門載體，用其他目的基因替換該載體中的GFP基因，通過Gateway的LR反應就能快速地構(gòu)建目的基因的光誘導型植物表達載體，在所獲得的表達載體中目的基因的表達受PrbcS的控制。
本發(fā)明使用的光誘導型啟動子(PrbcS)是從番茄的基因組中分離出來的rbcS-3C的啟動子，是一個由HindIII切割產(chǎn)生的1.7kb的DNA片斷，已經(jīng)亞克隆于pUC118中(Sugita et al.，1987，MGG，209247-256)，該亞克隆的質(zhì)粒載體名稱為pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(圖1)。
本發(fā)明采用Gateway的入門載體pENTR-2B(圖2)為基本骨架構(gòu)建一個含有光誘導型啟動子(PrbcS)序列的Gateway入門載體。本發(fā)明使用的報告基因GFP來自Invitrogen公司的pGFP中的GFP(圖4)。
在構(gòu)建該入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP時，首先用限制性內(nèi)切酶SphI將pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出來，然后用連接酶重新連接不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間載體pUC118-PrbcS-T(圖1)。
為了能夠建由啟動子PrbcS控制，表達的目的蛋白能定位在葉片細胞質(zhì)中的目的基因的植物表達載體，本發(fā)明還利用一對互補引物(圖1)，通過點突變技術在pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入NcoI位點產(chǎn)生中間載體pUC118-PrbcS-*T。
本發(fā)明還利用一對互補引物(圖2)，通過點突變技術把pENTR-2B多克隆位點中的XmnI位點改為HindIII產(chǎn)生中間載體pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切開pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割產(chǎn)生的啟動子DNA片斷PrbcS-*T，用連接酶把pENTR*和PrbcS-*T連接起來獲得中間載體pENTR*-Prbcs-*T(圖3)。
以pGFP為模板，用GFP基因上下游特異性引物擴增GFP基因，獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆于T載體pUCm-T中，獲得中間載體pUCm-T-GFP(圖4)。
用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收載體pENTR*-PrbcS-*T片斷和GFP基因片斷，用連接酶連接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，獲得入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP(圖6)。
圖1中間載體pUC118-PrbcS-*T的構(gòu)建策略 用SphI把pUC118-Prbcs-rbcS-3c中的rbcS-3C切除，并使載體自連接形成pUC118-Prbcs-T，通過點突變技術在葉綠體定位序列的起始密碼子附近相入Ncol位點。
圖2中間載體pENTR*-2B的構(gòu)建策略 通過點突變技術把pENTR2B多克隆位點中的Xmnl改變?yōu)镠indIII。
圖3中間載體pENTR*-Prbcs-*T的構(gòu)建策略 把PrbcS-T亞克隆于pENTR2B*中產(chǎn)生pENTR*-Prbcs-*T。
圖4GFP基因的TA克隆策略 以pGFP為模板通過PCR擴增GFP基因并亞克隆于T載體中。
圖5GFP基因的核苷酸序列和TA克隆 A電泳檢測GFP的PCR產(chǎn)物。1,500bp DNA Maker；2-4，GFP的PCR產(chǎn)物。BpUCm-T-GFP質(zhì)粒的電泳檢測。1，正對照(分子量為3.4kb的質(zhì)粒)；2～4，pUCm-T-GFP質(zhì)粒。CpUCm-T-GFP質(zhì)粒的酶切檢測。1,500bpDNA Maker；2-4，用PstI酶切pUCm-T-GFP質(zhì)粒。
圖6入門載體pENTR*-Prbcs-*T-GFP的構(gòu)建策略 把GFP亞克隆于pENTR*-Prbcs-*T中產(chǎn)生pENTR*-Prbcs-*T-GFP。
圖7pENTR*-Prbcs-*T-GFP的構(gòu)建 ApENTR*-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒的電泳檢測。1-2，pENTR*-PrbcS-*T-GFP；3正對照(分子量為4.7kb的質(zhì)粒)。BpENTR*-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒的酶切檢測。1-2，用SphI和BamHI酶切pENTR*-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒；3DNA Marker。CpENTR*-PrbcS-*T-GFP的PCR檢測。1-2，以pENTR*-rbcS-*T-GFP為模板用引物GFP5和GFP3擴增到的PCR產(chǎn)物；3，正對照(以pUCm-T-GFP質(zhì)粒為模板擴增到的PCR產(chǎn)物)；4，DNA Marker。
圖8通過Gateway的LR反應產(chǎn)生pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的策略； 圖9pK2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建 A電泳檢測pK2-35S-PrbcS-*T-GFP。1-2，pK2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒；3，正對照(分子量為12.5kb的質(zhì)粒)。BpK2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒的酶切檢測。1，DNA Maker；2，用HindIII和EcoRI酶切pK2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒；3，用HindIII和EcoRI酶切pENTR*-PrbcS-*T-GFP；4，用HindIII和EcoRI酶切pK2GW7。CPCR檢測pK2-35S-PrbcS-*T-GFP。1，DNA Maker；2-4，以pk2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒為模板，用引物attB1和GUS3擴增到的PCR產(chǎn)物。
圖10GUS基因的擴增與TA克隆策略 圖11GUS基因的核苷酸序列與TA克隆 A電用檢測GUS基因的PCR產(chǎn)物。1，DNA Makerer；2-4，GUS基因的PCR產(chǎn)物。B電泳檢測pUCm-T-GUS質(zhì)粒。1，正對照(分子量為4.7kb的質(zhì)粒)；2-3，pUCm-T-GUS質(zhì)粒。CpUCm-T-GUS質(zhì)粒的酶切檢測。1，λDNA/HindIII；2-3，用SphI和BamHI酶切pUCm-T-GUS質(zhì)粒。
圖12用GUS基因替換pENTR*-PrbcS-*T-GFP中的GFP產(chǎn)生pENTR*-Prbcs-*T-GUS的策略 圖13入門克隆pENTR*-Prbcs-*T-GUS的構(gòu)建 A電泳檢測pENTR*-PrbcS-*T-GUS。1-2，pENTR*-PrbcS-*T-GUS；3正對照(分子量為6.2kb的質(zhì)粒)。
BpENTR*-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒的酶切檢測。1，DNA Maker；2-3，用HindIIII和BamHI酶切pENTR*-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒。CPCR檢測pENTR*-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒。1-3，以pENTR*-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒為模板，用引物GUS5和GUS3擴增到的PCR產(chǎn)物；4DNA Maker。
圖14通過Gateway的LR反應產(chǎn)生pK2-35S-Prbcs-T-GUS的策略 圖15pK2-35S-Prbcs-T-GUS質(zhì)粒的構(gòu)建 A電泳檢測pK2-35S-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒。1-3，pK2-35S-PrbcS-*T-GUS；4正對照(分子量為14kb的質(zhì)粒)。BPCR檢測pK2-35S-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒。1，DNA Maker；2-4，以pK2-35S-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒為模板，用引物GUS5和GUS3擴增得到的PCR產(chǎn)物。CpK2-35S-PrbcS-T-GUS質(zhì)粒的酶切檢測。1，λDNA/HindIII；2-4，用pstI酶切pK2-35S-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒。
圖16GFP的組成型和誘導型植物表達載體 圖17GUS的組成型和誘導型植物表達載體 圖18農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌落的PCR檢測 AGFP的農(nóng)桿菌菌落PCR產(chǎn)物。1，DNA Maker；2，轉(zhuǎn)化pPZP211-PrbcS-*T-GFP的農(nóng)桿菌；3，轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的農(nóng)桿菌；4，轉(zhuǎn)化pK2-35S-GFP的農(nóng)桿菌。BGUS的農(nóng)桿菌菌落PCR產(chǎn)物。1，正對照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物)；2，轉(zhuǎn)化pPZP211-PrbcS-*T-GUS的農(nóng)桿菌；3，轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GUS的農(nóng)桿菌；4，轉(zhuǎn)化pK2-35S-GUS的農(nóng)桿菌；5，DNA Maker。
圖19GFP基因轉(zhuǎn)基因愈傷組織的熒光觀察 A轉(zhuǎn)化pPZP211-PrbcS-*T-GFP的天竺葵葉柄(誘導型表達)。B轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的天竺葵葉柄。C轉(zhuǎn)化pK2-35S-GFP的天竺葵葉柄(組成型表達)。D轉(zhuǎn)化pPZP211-PrbcS-GFP的煙草葉盤(誘導型表達)。E轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的煙草葉盤。F轉(zhuǎn)化pK2-35S-GFP的煙草葉盤(組成型表達)。G對照煙草(未經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的葉盤)。H對照天竺葵(未經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的葉柄)。
圖20GFP在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況和轉(zhuǎn)錄水平檢測 A用PCR(引物為GFP5和GFP3)檢測GFP在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況。1，DNA marker；2wt(未轉(zhuǎn)基因的野生型植物)；3-5組成型表達株系；6-8，轉(zhuǎn)pK2-35S-PrbcS-*T-GFP煙草株系；9-11誘導型表達株系；12正對照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物)。BRT-PCR(引物為GFP5和GFP3)檢測GFP在轉(zhuǎn)基因煙草中的轉(zhuǎn)錄水平。1，DNA markerIII；2，wt(未轉(zhuǎn)基因的野生型)；3，組成型表達株系；4-5，轉(zhuǎn)pK2-35S-PrbcS-*T-GFP煙草；6，誘導型表達株系；7正對照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物)。CGFP組成型表達的RT-PCR檢測(引物為attB1和GFP3)。1，正對照(以pK2-35S-GFP質(zhì)粒為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物)；2-3，轉(zhuǎn)化pK2-35S-GFP煙草株系；4，DNA marker。D轉(zhuǎn)pK2-35S-PrbcS-*T-GFP煙草GFP組成型表達轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR檢測(引物為attB1和GFP3)。1，DNA marker；2～4，引物為attB1和GFP3；6～8PCR引物為rbcS5和GFP3；5和9，正對照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GFP質(zhì)粒為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物)。
圖21GUS在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況和轉(zhuǎn)錄水平檢測 AGUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況的PCR檢測(引物為GUS5和GUS3)。1，DNA marker；2～4，轉(zhuǎn)pK2-35S-PrbcS-*T-GUS煙草株系；5wt(未轉(zhuǎn)基因的野生型)；6正對照(以pK2-35S-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒為模板擴增得到的PCR產(chǎn)物)。BRT-PCR(引物為GUS5和GUS3)檢測GFP在轉(zhuǎn)基因煙草中的轉(zhuǎn)錄水平。1，DNA marker；2-3，轉(zhuǎn)pK2-35S-PrbcS-*T-GUS煙草株系；4，正對照；5wt。
圖22轉(zhuǎn)基因植物的GUS染色分析 Awt(未轉(zhuǎn)基因的野生型葉片)；B轉(zhuǎn)pK2-35S-GUS的葉片；C轉(zhuǎn)pPZP211-PrbcS-*T-GUS的葉片； D轉(zhuǎn)pK2-35S-PrbcS-*T-GUS的葉片。
圖23GFP和GUS基因表達水平的定量分析 A轉(zhuǎn)GFP天竺葵植株葉片的GFP熒光定量分析；B轉(zhuǎn)GUS煙草植株葉片的GUS定量分析。
具體實施例方式 下面結(jié)合附圖用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明。
本發(fā)明下述實施例中所用到的試劑與儀器為 試劑主要為分子生物學實驗試劑，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。
本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、中間載體pUC118-T-PrbcS的構(gòu)建 用質(zhì)粒抽提試劑盒(博大泰克)純化(按試劑盒說明書操作)pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等構(gòu)建并提供，Sugita et al.，1987，MGG，209247-256)，用限制性內(nèi)切酶SphI(Fermentas)將pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體pUC118-PrbcS-T和rbcS-3C片段，回收4.6kb的載體pUC118-PrbcS-T，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接(按試劑盒說明書操作)不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間載體pUC118-PrbcS-T(圖1)，用連接反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，用SphI進行酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生一條4.6kb條帶，選出連接成功的質(zhì)粒載體pUC118-PrbcS-T，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。
實施例2、利用點突變技術在中間載體pUC118-T-PrbcS中引入NcoI位點 以純化質(zhì)粒pUC118-Prbcs-T為模板，根據(jù)葉綠體定位序列設計一對用于點突變的互補引物(NcoI5和NcoI3，圖1)，委托TaKaRa合成。在點突變反應混合液中加入25ng的純化質(zhì)粒pUC118-PrbcS-T作為模板，同時加入125ng的點突變引物NcoI5和NcoI3、1μldNTP(2.5mM)，5μl的10×KOD反應Buffer和1μl的KOD聚合酶(日本東洋紡)，加雙蒸水使反應終體積為50μl。在PCR儀上于95℃加熱30秒，然后按照95℃、30秒，55℃、1分鐘，68℃、10分鐘的程序進行15個循環(huán)的反應，最后在68℃延長反應10分鐘，合成含突變位點的子鏈。反應完成后把反應混合液置于冰上冷卻2分鐘，向反應混合液加入1μl的限制性內(nèi)切酶Dpn I(10U/μl)和5μl的Dpn I反應緩沖液，于37℃保溫1小時，降解不含突變位點的母鏈。用反應混合液轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，用NcoI(Fermentas)進行酶切檢測，突變成功的質(zhì)粒可被NcoI切開并在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生一條4.6kb的條帶，選出突變成功的質(zhì)粒載體pUC118-PrbcS-*T，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。在pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入NcoI位點后，為構(gòu)建由啟動子PrbcS控制，表達的目的蛋白定位在葉片細胞質(zhì)中的目的基因的植物表達載體奠定基礎。
實施例3、利用點突變技術把Gateway的入門載體pENTR-2B多克隆位點中的XmnI改變?yōu)镠indIII 以純化質(zhì)粒pENTR-2B(購自invitrogen公司)為模板，根據(jù)XmnI附近的序列設計一對(HindIII5和HindIII3)用于點突變的互補引物(圖2)，委托上海申能博采合成。在點突變反應混合液中加入25ng的純化質(zhì)粒pENTR-2B作為模板，同時加入125ng的點突變引物HindIII5和HindIII3、1μldNTP(2.5mM)，5μl的10×KOD反應Buffer和1μl的KOD聚合酶(日本東洋紡)，加雙蒸水使反應終體積為50μl。在PCR儀上于95℃加熱30秒，然后按照95℃、30秒，55℃、1分鐘，68℃、10分鐘的程序進行15個循環(huán)的反應，最后在68℃延長反應10分鐘，合成含突變位點的子鏈。反應完成后把反應混合液置于冰上冷卻2分鐘，向反應混合液加入1μl的限制性內(nèi)切酶Dpn I(10U/μl)和5μl的Dpn I反應緩沖液(晶美)，于37℃保溫1小時，降解不含突變位點的母鏈。用反應混合液轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，用HindIII(晶美)進行酶切檢測，突變成功的質(zhì)?？杀籋indIII切開并在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生一條3.5kb的條帶，選出突變成功的質(zhì)粒載體pENTR*-2B，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。
實施例4、中間載體pENTR*-Prbcs-*T的構(gòu)建 用HindIII和EcoRI切開純化的質(zhì)粒載體pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，回收pENTR*-2B被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR*(2.3kb)及pUC118-PrbcS-*T被切割產(chǎn)生的啟動子DNA片斷PrbcS-*T(1.7kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTR*和PrbcS-*T產(chǎn)生中間載體pENTR*-Prbcs-*T(圖3)。用連接反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，用HindIII和SphI雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生兩條帶，一條為2.3kb的載體帶，另一條為1.7kb的插入片段PrbcS-*T。選出連接成功的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。
實施例5、GFP基因的擴增與TA克隆 以純化質(zhì)粒pGFP為模板，根據(jù)GFP基因序列(圖5)設計一對(GFP5和GFP3)特異性引物(圖4)，委托北京博邁德公司合成。在PCR反應混合液中加入20ng的純化質(zhì)粒pGFP作為模板，同時加入75ng的特異性引物GFP5和GFP3、4μldNTP(2.5mM)，5μl的10×Extaq反應Buffer和0.25μl的Extaq(5U/μl)聚合酶(日本寶生物)，加雙蒸水使反應終體積為50μl。在PCR儀上于94℃加熱2分鐘，然后按照94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、1分鐘的程序進行30個循環(huán)的反應，最后在72℃延長反應10分鐘，擴增GFP基因。反應完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離GFP的PCR擴增產(chǎn)物(圖5A)，回收GFP基因的DNA片斷，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接GFP基因的DNA片斷和上海申能博采的T載體pUCm-T，獲得GFP基因的TA克隆質(zhì)粒pUCm-T-GFP(圖4)。用反應混合液轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖5B)，在T載體pUCm-T的兩個多克隆位點中都有PstI，但在GFP基因中沒有這一酶切位點，因此選用PstI(晶美)對重組質(zhì)粒進行酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒可被PstI切開并在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生一條2.7kb的載體帶和一條0.7kb的GFP基因條帶(圖5C)，選出連接成功的質(zhì)粒載體pUCm-T-GFP，用GFP基因上下游特異性引物GFP5和GFP3進行PCR檢測，都能擴增出一條0.7kb的條帶，再次確認是連接成功的質(zhì)粒，然后重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pUCm-T-GFP。
實施例6、Gateway入門克隆載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP的構(gòu)建 用SphI和BamHI切開純化的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP(圖6)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pENTR*-PrbcS-*T被切割后產(chǎn)生的載體片斷(4.0kb)及pUCm-T-GFP被切割產(chǎn)生的GFP基因的DNA片斷(0.7kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTR*-PrbcS-*T和GFP基因的DNA片斷產(chǎn)生入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP(圖6)。用連接反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖7A)，用SphI(Fermentas)和BamHI(Fermentas)雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生兩條帶，一條為4.0kb的載體帶，另一條為0.7kb的GFP片段(圖7B)。選出連接成功的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP，用GFP上下游的特異性引物GFP5和GFP3進行PCR檢測，都能擴增出一條0.7kb的GFP條帶(圖7C)，確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
實施例7、GFP基因植物表達載體的構(gòu)建 通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-*T-GFP亞克隆到植物表達載體pK2GW7(Gateway的目的載體，購自比利時VIB/Gent公司)中(圖8)。具體的做法是用質(zhì)粒抽提試劑盒純化Gateway的目的載體pK2GW7，在Gateway的LR反應體系中加pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pK2GW7各150ng，1ul LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen)，混均于25℃反應過夜，通過整合酶的作用把PrbcS-*T-GFP整合到pK2GW7中獲得GFP的植物表達載體質(zhì)粒pK2-35S-PrbcS-*T-GFP(圖8)。用反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落，從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖9A)，用HindIII(Fermentas)和EcoRI(Fermentas)雙酶切檢測，整合成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生三條帶，第一條為9.6kb的載體帶，第二條為2.4kb的PrbcS-*T-GFP片段，第三條為0.4kb的P35S啟動子帶(圖9B)。選出整合成功的質(zhì)粒載體pK2-35S-PrbcS-*T-GFP，用attB1位點的特異性引物attB1和GFP基因下游特異性引物GFP3進行PCR檢測，能擴增出一條2.4kb的PrbcS-*T-GFP條帶(圖9C)，確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。pK2GW7攜帶的篩選標記基因為卡那霉素抗性基因(Km)，這樣可用加有Km的平板篩選轉(zhuǎn)基因植物。
實施例8、GUS基因的擴增與TA克隆 為了驗證入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP的應用價值，用另一個報告基因GUS替換pENTR*-Prbcs-*T-GFP中的GFP，通過這種方法快速構(gòu)建GUS的植物表達載體，然后通過GUS染色觀察它的表達水平。以純化質(zhì)粒pENTR-GUS(購自Invitrogen)為模板，根據(jù)GUS基因序列(圖11)設計一對(GUS5和GUS3)特異性引物(圖10)，委托賽百盛合成。在PCR反應混合液中加入20ng的純化質(zhì)粒pENTR-GUS作為模板，同時加入75ng的特異性引物GUS5和GUS3、4μldNTP(2.5mM)，5μl的10×Extaq反應Buffer和0.25μl的Extaq(5U/μl)聚合酶(日本寶生物)，加雙蒸水使反應終體積為50μl。在PCR儀上于94℃加熱2分鐘，然后按照94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、2分鐘的程序進行30個循環(huán)的反應，最后在72℃延長反應10分鐘，擴增GUS基因。反應完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離GUS的PCR擴增產(chǎn)物(圖11A)，回收GUS基因的DNA片斷，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接GUS基因的DNA片斷和上海申能博采的T載體pUCm-T，獲得GUS基因的TA克隆質(zhì)粒pUCm-T-GUS(圖10)。用反應混合液轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，篩選Amp抗性重組子菌落，從Amp抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖11B)，用SphI(Fermentas)和BamHI(Fermentas)進行雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)?？杀籗phI和BamHI切開并在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生二條帶，一條為2.7kb的載體帶，令一條為1.8kb的GUS帶(圖11C)，選出連接成功的質(zhì)粒載體pUCm-T-GUS，用GUS基因上下游特異性引物進行PCR檢測，再次確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pUCm-T-GUS。
實施例9、Gateway入門克隆載體pENTR*-PrbcS-*T-GUS的構(gòu)建 用SphI(Fermentas)和BamHI(Fermentas)切開純化的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pUCm-T-GUS，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段(圖12)，從凝膠中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR*-PrbcS-*T(4.0kb)及pUCm-T-GUS被切割產(chǎn)生的GUS基因的DNA片斷(1.8kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTR*-PrbcS-*T和GUS基因的DNA片斷產(chǎn)生入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GUS(圖12)。用連接反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖13A)，用HindIII(Fermentas)和BamHI(Fermentas)雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生兩條帶，一條為2.3kb的載體帶，另一條為3.5kb的插入片段PrbcS-*T-GUS(圖13B)。選出連接成功的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GUS，用GUS基因上下游特異性引物進行PCR檢測(圖13C)，再次確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-*T-GUS。
實施例10、GUS基因植物表達載體的構(gòu)建 通過Gateway技術的LR反應把PrbcS-*T-GUS亞克隆到植物表達載體pK2GW7(Gateway的目的載體，購自比利時VIB/Gent公司)中。具體的做法是用質(zhì)粒抽提試劑盒純化Gateway的目的載體pK2GW7，在Gateway的LR反應體系中加pENTR*-PrbcS-*T-GUS和pK2GW7各150ng，1μl LRClonase II Enzyme Mix(Invitrogen)，混均于25℃反應過夜，通過整合酶的作用把PrbcS-*T-GUS整合到pK2GW7中獲得GUS的植物表達載體質(zhì)粒pK2-35S-PrbcS-*T-GUS(圖14)。用反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落，從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖15A)，用GUS上下游的特異性引物GUS5和GUS3進行PCR檢測(圖15B)。選出整合成功的質(zhì)粒載體pK2-35S-PrbcS-*T-GUS，用PstI(Fermentas)酶切檢測，整合成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生二條帶，一條為9.6kb的載體帶，第二條為3.5kb的PrbcS-*T-GUS片段(圖15C)，能擴增出一條1.8kb的GUS條帶，確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。
實施例11、GFP基因植物組成型表達和誘導型表達載體的構(gòu)建 為了能比較用本發(fā)明方法構(gòu)建出來的GFP基因的植物表達載體的表達效率與GFP基因的組成型表達和誘導型表達的差異，還構(gòu)建了GFP基因的植物組成型表達載體和誘導型表達載體。具體的做法是以pGFP為模板，用高保真的KOD聚合酶(日本東洋紡)通過PCR(94℃、30秒，55℃、30秒，68℃、1分鐘的程序進行30個循環(huán)的反應)擴增GFP基因，用瓊脂糖凝膠電泳分離回收GFP的PCR產(chǎn)物，利用TOPO克隆技術亞克隆于pENTR/SD/D-TOPO(購自Invitrogen公司)載體中獲得GFP的Gateway入門克隆載體pENTR-GFP，通過Gateway的LR反應使入門克隆載體pENTR-GFP和pK2GW7發(fā)生整合作用，用GFP替換pK2GW7中的GW7獲得GFP基因的組成型表達載體pK2-35S-GFP(圖16)，在該載體中GFP的表達受組成型啟動子CaMV35S的控制。用HindIII和BamHI切開純化的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pPZP211(Hajdukiewicz等構(gòu)建并提供，Hajdukiewicz et al.，Plant Mol.Biol.25，989(1994))，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后產(chǎn)生的DNA片斷PrbcS-*T-GFP(2.4kb)及pPZP211被切割產(chǎn)生的載體DNA片斷(8.5kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接載體DNA片斷和PrbcS-*T-GFP的DNA片斷產(chǎn)生GFP基因的誘導型表達載體pPZP211-PrbcS-*T-GFP(圖16)。用連接反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe，100μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落，從抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒PZP211-PrbcS-*T-GFP。
實施例12、GUS基因植物組成型表達和誘導型表達載體的構(gòu)建 同樣為了能比較用本發(fā)明方法構(gòu)建出來的GUS基因的植物表達載體的表達效率與GUS基因的組成型表達和誘導型表達的差異，還構(gòu)建了GUS基因的植物組成型表達載體和誘導型表達載體。具體的做法是通過Gateway的LR反應使入門克隆載體pENTR-GUS(購自Invotrogen)和pK2GW7發(fā)生整合作用，用GUS替換pK2GW7中的GW7獲得GUS基因的組成型表達載體pK2-35S-GUS(圖17)，在該載體中GFP的表達受組成型啟動子CaMV35S的控制。用HindIII(Fermentas)和BamHI(Fermentas)切開純化的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GUS和pPZP211，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pENTR*-PrbcS-*T-GUS被切割后產(chǎn)生的DNA片斷PrbcS-*T-GUS(3.5kb)及pPZP211被切割產(chǎn)生的載體DNA片斷(8.5kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接PrbcS-*T-GUS和載體DNA片斷產(chǎn)生GUS基因的誘導型表達載體pPZP211-PrbcS-*T-GUS(圖17)。用連接反應混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe，100μg/ml)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落，從抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒pPZP211-PrbcS-*T-GUS。
實施例13、用GFP和GUS基因的植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-GFP、pPZP211-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-PrbcS-*T-GUS、pK2-35S-GUS、pPZP211-PrbcS-*T-GUS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的電擊杯和200歐姆，2.5kV/0.2cm的參數(shù)進行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，迅速加入0.5mlSOC培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中；28℃，200rpm搖床培養(yǎng)3-5h；室溫下，7500rpm離心1min，棄大部分上清，保留100μl將細胞懸??；把農(nóng)桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe，50μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落放入20μl ddH2O中，98℃處理15分鐘后取出10μl農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應的模板。用GFP和GUS基因上下游特異性引物作PCR檢測，轉(zhuǎn)化成功的菌落均能擴增出0.7kb的GFP(圖18A)和1.8kb的GUS基因條帶(圖18B)，經(jīng)菌落PCR確認的轉(zhuǎn)化子菌落用于轉(zhuǎn)化植物。
實施例14、用含有GFP和GUS基因植物表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物 挑取攜帶有pK2-35S-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-GFP、pPZP211-PrbcS-*T-GFP、pK2-35S-PrbcS-*T-GUS、pK2-35S-GUS、pPZP211-PrbcS-*T-GUS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含Spe，100μg/ml)，180rpm，28℃培養(yǎng)24h，待菌液OD600至1.0左右，離心10min(3000rpm)，沉淀菌體。再用10ml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心10min(3000rpm)，沉淀菌體。重復以上操作2～3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的OD600值為0.5。選取兩種容易轉(zhuǎn)化的植物煙草和天竺葵作轉(zhuǎn)化試驗。制備煙草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)和天竺葵(Pelargonium sp.frensham)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，用葉柄法轉(zhuǎn)化天竺葵，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，進一步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，把天竺葵的葉柄切成小段，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15-20min，用無菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS1(MS+NAA02.1μg/ml+BAPO.02μg/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽誘導培養(yǎng)基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml)上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50μg/ml)的MS培養(yǎng)基上進行根的誘導。
實施例15、GFP的熒光觀察 待煙草葉盤和天竺葵葉柄在MS4培養(yǎng)基上生長1-2周后，選取部分用GFP的表達載體轉(zhuǎn)化的煙草葉盤和天竺葵葉柄產(chǎn)生的愈傷組織，放置于載玻片上，使用連續(xù)變倍體視顯微鏡觀察GFP的表達情況。先用顯微鏡光源觀察愈傷組織(明場)的生長情況并拍照。然后關掉光源，使用紫外燈(便攜式紫外燈)照射愈傷組織觀察(暗場)愈傷組織中的GFP亮點并拍照。結(jié)果觀察到用本發(fā)明的方法構(gòu)建的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-GFP(圖19C和F)轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的愈傷組織和用pK2-35S-GFP(圖19B和E)及pPZP211-PrbcS-*T-GFP(圖19A和D)轉(zhuǎn)化植物后產(chǎn)生的愈傷組織一樣有GFP的熒光(圖19)，熒光的亮度一樣，說明用載體pK2-35S-PrbcS-*T-GFP轉(zhuǎn)化植物組織后可以實現(xiàn)GFP基因的正常表達，未轉(zhuǎn)化的煙草葉盤和天竺葵葉柄產(chǎn)生的愈傷組織在同樣的條件下觀察沒有GFP的熒光(圖19G和H)。
實施例16、GFP和GUS基因在轉(zhuǎn)基因植物的插入情況和轉(zhuǎn)錄水平的檢測 為了確認從轉(zhuǎn)化的煙草葉盤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實含有GFP基因和GUS基因，用PCR方法對篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組稱取植物葉片100mg左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入900μl預熱到65℃的2×CTAB緩沖液(Tris-HCl pH 7.5100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2％)，65℃度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500μl氯仿-異戊醇混合液(24∶1)搖勻，4℃離心10min(7500rpm)后轉(zhuǎn)移上清至1.5ml EP管；再次加入500μl氯仿-異戊醇混合液(24∶1)搖勻，4℃離心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10體積3MpH5.2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4℃離心20min(12000rpm)；棄上清，用75％乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA。以植物基因組DNA為模板，用GFP基因和GUS基因上下游特異性引物作PCR檢測，成功轉(zhuǎn)入GFP基因的植株均能擴增出0.7kb的GFP條帶(圖20A)，成功轉(zhuǎn)入GUS基因的植株均能擴增出1.8kb的GUS條帶(圖21A)。經(jīng)PCR確認的轉(zhuǎn)基因植株用于RT-PCR分析。
為了考察在含有GFP基因和GUS基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系中GFP基因和GUS基因的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)基因植物中抽取總RNA，反轉(zhuǎn)綠成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測GFP基因和GUS基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水平。采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA，取植物嫩葉約0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0.2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min(12000rpm)，轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0.5ml異丙醇，混勻室溫放置10min，4℃離心10min(12000rpm)，棄上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃離心5min(7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。使用RevertAidTM M-MuLVReverse Transcriptase Kit(Fermentas)進行cDNA的合成，取植物總RNA約0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC處理水補足至10μl，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65℃加熱5min，冰浴10min，加入反應混合物9μl(5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1MDTT 2μl，RNA酶抑制劑1μl)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25℃保溫2min，加入1μl RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25℃保溫20min，然后42℃保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用GFP和GUS基因上下游特異性引物作PCR，成功轉(zhuǎn)入GFP的植株均能擴增出0.7kb的GFP(圖20B)，成功轉(zhuǎn)入GUS基因的植株均能擴增出1.8kb的GUS條帶(圖21B)，證明GFP和GUS基因可以在轉(zhuǎn)基因植物中成功地轉(zhuǎn)錄。經(jīng)RT-PCR確認的轉(zhuǎn)基因植株用于GFP的定量分析和GUS的染色分析。由于在pK2-35S-PrbcS-*T-GFP中有35S啟動子，用一個位于35S轉(zhuǎn)錄起始點下游的引物(attB1)和位于PrbcS啟動子內(nèi)部的另一個引物(rbcS5)及GFP3引物作RT-PCR分析，考察轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的轉(zhuǎn)基因植物中是否有GFP的組成型轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果證明只有在轉(zhuǎn)化pK2-35S-GFP的轉(zhuǎn)基因煙草中有GFP的組成型轉(zhuǎn)錄物(圖20C)，而在轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的煙草中沒有GFP的組成型轉(zhuǎn)錄物(圖20D)，說明在該載體中的35S啟動子沒有作用，而只有誘導型啟動子PrbcS起作用。
實施例17GUS的染色分析 GUS的染色分析按照(Zhao等，2001；Science，291306-309)的方法進行，選取在無菌條件下于MS培養(yǎng)基上生長的煙草植株的第三張(自上往下數(shù))葉片浸入GUS染色液(80mM硫酸鈉鹽緩沖液(pH7.0)，0.4mM亞鐵氰化鉀，0.4mM鐵氰化鉀，8mMEDTA，0.05％ Triton-100，0.8mg/ml X-Gluc，20％甲醇)中，抽真空30min，37℃保溫過夜，去除GUS染色液，加入75％乙醇，37℃脫色3小時，重復2～3次。結(jié)果觀察到用本發(fā)明的方法構(gòu)建的植物表達載體pK2-35S-PrbcS-*T-GUS(圖22D)轉(zhuǎn)化煙草葉盤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株葉片和用pPZP211-PrbcS-*T-GUS(圖22C)轉(zhuǎn)化煙草葉盤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株的葉片一樣，GUS的染色范圍很廣，著色的程度很深，說明在用載體pK2-35S-PrbcS-*T-GUS轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中GUS基因的表達水平可以達到誘導型表達的水平，用pK2-35S-GUS轉(zhuǎn)化煙草葉盤產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植株的葉片僅有很少的部位能染上色(圖22B)，再次證明用組成型啟動子很難實現(xiàn)目的基因在葉片中的高水平表達，沒有轉(zhuǎn)染的煙草葉片沒有著色(圖22A)。
實施例18GFP的定量分析和GUS的定量分析 通過GFP熒光定量分析可以更準確地了解GFP在轉(zhuǎn)基因植物葉片中的表達水平，具體的做法是取1g新鮮煙草葉片，加入1ml蛋白抽提液(50mM Tris-HCl pH7.5，10％甘油，10mM β-巰基乙醇，1mMPMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)，2mMEDTA，10％PVP(polyvinylpyrrolidone))，研磨。于12000rpm，4℃，離心25min，取上清。用Bradford方法測定植物上清中的蛋白質(zhì)濃度。取1mg蛋白樣品加入純水到終體積2ml，使用熒光分光光度計(發(fā)射光488nm，吸收光510nm)測定510nm處的吸收峰值。結(jié)果說明在轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GFP的轉(zhuǎn)基因植物葉片中GFP的熒光強度與轉(zhuǎn)化pPZP211-PrbcS-*T-GFP的轉(zhuǎn)基因植物相似，是轉(zhuǎn)化pK2-35S-GFP的植物2-3倍(圖23A)。
通過GUS定量分析可以更準確地了解GUS在轉(zhuǎn)基因植物葉片中的表達水平，GUS的定量分析按照(Jefferson等，1987；EMBO，63901-3907)的方法進行，具體做法是稱取新鮮煙草葉片組織0.5-1g，在液氮中磨碎植物組織，加入100ul抽提緩沖液(50mM 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，10mMEDTA，0.1％ Triton X-100，0.1％十二烷基肌酸鈉，10mM β-巰基乙醇)。15000rpm離心5min 4℃，轉(zhuǎn)移上清，用Bradford方法測定上清液中蛋白質(zhì)的濃度。在新的EP管中加入100μg蛋白質(zhì)溶液和assay buffer(1mM MUG(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronic acid)，37℃保溫)到終體積為200ul，混勻。在0時刻，取出20μl混合液加入180μl 0.2M stop Buffer(0.2M Na2CO3)終止反應此時為計為T0。其余混合物37℃保溫，在12小時時刻，取出20μl加入180μl 0.2M stopBuffer終止反應此時計為T12。用熒光分光光度計(BIO-RAD VersaFlourTMFluorometer)確定MU(Methylumbelliferone)的濃度(發(fā)射光365nm，吸收光455nm)。用1mM MU按10μM，1μM，500nM，100nM，50nM，10nM(分別加入0.2M Na2CO3)梯度制備MU的標準曲線。結(jié)果說明在轉(zhuǎn)化pK2-35S-PrbcS-*T-GUS的轉(zhuǎn)基因植物葉片中GUS的活性與轉(zhuǎn)化pPZP211-PrbcS-*T-GUS的轉(zhuǎn)基因植物相似，是轉(zhuǎn)化pK2-35S-GUS的植物1-2倍(圖23B)。
權利要求
1、通路克隆入門質(zhì)粒載體，其中含有綠色熒光蛋白GFP基因。
2、權利要求1的載體，其中還含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亞基基因的光誘導型啟動子(PrbcS)。
3、權利要求1或2的載體，所述載體是如圖6所示的pENTR*-PrbcS-*T-GFP載體。
4、權利要求1或2的載體，其中綠色熒光蛋白GFP基因可用其它基因代替。
5、權利要求1的載體，由下述方法構(gòu)建而成
(1)用限制性內(nèi)切酶SphI將pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出來，再用連接酶重新連接不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間載體pUC118-PrbcS-T；
(2)利用一對互補引物NcoI5和NcoI3，通過點突變技術在pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入NcoI位點產(chǎn)生中間載體pUC118-PrbcS-*T；
(3)利用一對互補引物HindIII5和HindIII3，通過點突變技術把Gateway的入門載體pENTR-2B多克隆位點中的XmnI位點改為HindIII產(chǎn)生中間載體pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切開pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割產(chǎn)生的啟動子DNA片斷PrbcS-*T，用連接酶把pENTR*和PrbcS-*T連接起來獲得中間載體pENTR*-Prbcs-*T；
(4)以pGFP為模板，用GFP基因上下游特異性引物擴增GFP基因，獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆于T載體pUCm-T中，獲得中間載體pUCm-T-GFP；
(5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收載體pENTR*-PrbcS-*T片斷和GFP基因片斷，用連接酶連接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，獲得入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
6、通路克隆入門質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP的構(gòu)建方法
(1)用限制性內(nèi)切酶SphI將pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出來，再用連接酶重新連接不含rbcS-3C的載體DNA片斷，產(chǎn)生一個中間載體pUC118-PrbcS-T；
(2)利用一對互補引物NcoI5和NcoI3，通過點突變技術在pUC118-PrbcS-T的葉綠體定位序列起始密碼處引入NcoI位點產(chǎn)生中間載體pUC118-PrbcS-*T；
(3)利用一對互補引物HindIII5和HindIII3，通過點突變技術把pENTR-2B多克隆位點中的XmnI位點改為HindIII產(chǎn)生中間載體pENTR*-2B，然后用HindIII和EcoRI切開pENTR*-2B和pUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR*及pUC118-PrbcS-*T被切割產(chǎn)生的啟動子DNA片斷PrbcS-*T，用連接酶把pENTR*和PrbcS-*T連接起來獲得中間載體pENTR*-Prbcs-*T；
(4)以pGFP為模板，用GFP基因上下游特異性引物擴增GFP基因，獲得的PCR產(chǎn)物亞克隆于T載體pUCm-T中，獲得中間載體pUCm-T-GFP；
(5)用SphI和BamHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pUCm-T-GFP，回收載體pENTR*-PrbcS-*T片斷和GFP基因片斷，用連接酶連接PENTR*-PrbcS-*T和GFP，獲得入門載體pENTR*-PrbcS-*T-GFP。
7、權利要求1至6的通路克隆入門質(zhì)粒載體在構(gòu)建含有光誘導型啟動子(PrbcS)的目的基因入門克隆質(zhì)粒中的應用。
8、權利要求1至6的通路克隆入門質(zhì)粒載體在通過通路克隆技術的LR反應構(gòu)建目的基因光誘導型植物表達載體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種通路克隆(Gateway)技術入門質(zhì)粒載體(Entry vector)，該載體含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亞基基因的光誘導型啟動子(PrbcS)和綠色熒光蛋白(GFP)報告基因。本發(fā)明還公開上述載體的構(gòu)建方法和應用，通過該載體可以利用通路克隆技術快速構(gòu)建目的基因的光誘導型植物表達載體，實現(xiàn)目的基因在植物葉片中的高水平表達，目的基因的表達受光強度的調(diào)節(jié)，所表達的目的蛋白可以定位到葉綠體或細胞質(zhì)中。
文檔編號C12N15/82GK101302530SQ20071006642
公開日2008年11月12日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權日2007年12月5日
發(fā)明者陳麗梅, 李昆志, 莉 馬, 宋中邦, 胡清泉 申請人:昆明理工大學