專利名稱：規(guī)?；ハx病原線蟲活體高倍培殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于林業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種規(guī)?；ハx病原線蟲活體 高倍培殖方法。
技術(shù)背景如今，地下害蟲和隱蔽性害蟲防治主要采用化學(xué)藥劑，但是該方 法易造成人畜中毒，還會(huì)污染環(huán)境。并且多次防治成本高，害蟲還容 易產(chǎn)生抗藥性。隨著人們對(duì)食品安全性要求的提高，以及對(duì)化學(xué)藥劑 可能給生態(tài)環(huán)境帶來潛在危機(jī)的考慮，篩選可替代化學(xué)藥劑的生物防治制劑成為迫切需要。當(dāng)今已篩選出蘇云金桿菌(fe"77^ t力〃n'"^7'e/ 5^'51)、 白僵菌 (SeawKeria 力r。"卵ia )、 綠僵菌 (,e^rh'w'咖朋iso/ h'ae)等作為生物防治制劑，但防治一些地下害 蟲和隱蔽性害蟲效果不是很理想。而昆蟲病原線蟲 (&to節(jié)/ az^^e/7j'c Afefflat^/e)是昆蟲的?；纳蕴鞌场Ｒ郧秩?期蟲態(tài)(即三齡線蟲IJ)隨寄主食物或從昆蟲的肛門、氣孔、節(jié)間 膜進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，隨后釋放其攜帶的共生細(xì)菌，這些共生細(xì)菌迅速繁 殖，使寄主昆蟲患敗血癥于48小時(shí)之內(nèi)死亡。昆蟲病原線蟲是一種 很有潛能的生物防治因子。當(dāng)今世界上有許多國(guó)家，如美國(guó)、澳大利 亞、新西蘭、德國(guó)、埃及等國(guó)家都投入大量的人力、物力研究利用這 種線蟲，致力于將線蟲產(chǎn)品銷售到世界各地。1994年據(jù)Lisansky & Coombs統(tǒng)計(jì)，在發(fā)達(dá)國(guó)家的生物農(nóng)藥市場(chǎng)中，昆蟲病原線蟲這種新 型殺蟲劑的市場(chǎng)銷售額僅次于工業(yè)蘇云金芽胞桿菌，已經(jīng)成功地應(yīng)用 于防治林木、果樹、觀賞園林等隱蔽性害蟲和盆栽作物、經(jīng)濟(jì)作物、 蔬菜和牧草、草坪等地下害蟲。所以昆蟲病原線蟲這種新型生物殺蟲 劑具有廣闊的應(yīng)用前景，但所用線蟲數(shù)量極少，不能滿足市場(chǎng)需求。 因?yàn)槔ハx病原線蟲能夠大量培養(yǎng)繁殖，所以可以將其推廣應(yīng)用。
雖然傳統(tǒng)的ffhite trap法繁殖得到的線蟲侵染力較高，但其規(guī)模遠(yuǎn) 遠(yuǎn)滿足不了當(dāng)今市場(chǎng)的需求，廣東昆蟲研究所韓日疇采用人工離體繁 殖的方法，美國(guó)生產(chǎn)線蟲的發(fā)酵罐已從5升、20升到Biosys公司生 產(chǎn)斯氏線蟲15000升，生產(chǎn)異小桿線蟲7500升的規(guī)模，雖然線蟲產(chǎn) 量較高，但其致病力有所下降。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種規(guī)?；ハx病原線蟲活體高倍培殖方 法，是規(guī)?；罅扛弑痘铙w繁殖昆蟲病原線蟲，達(dá)到林業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中 生物防治蟲害的良好效果。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)已有的離體繁殖， 改為活體繁殖，使線蟲對(duì)林業(yè)害蟲的致病力明顯增強(qiáng)，并且產(chǎn)量與效 率較高，成本低，質(zhì)量好，防治效果明顯提升。本發(fā)明采用培養(yǎng)介質(zhì)接種侵染期線蟲后與寄主昆蟲混合裝入繁 殖袋中，將繁殖袋置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，將 得到大量的昆蟲病原線蟲。a.介質(zhì)與繁殖袋質(zhì)地篩選寄主昆蟲采用黃粉蟲，培養(yǎng)介質(zhì)選用價(jià)格便宜的蛭石。蛭石用自來水浸泡，洗干凈，然后在6(TC烘箱 中烘干至恒重。侵染前期準(zhǔn)備.把1Kg蛭石裝在布袋中浸泡在蒸餾水桶中，完全 浸泡之后，取出布袋，掛起來，曬干直至布袋上不滴水，再稱布袋的 重量，計(jì)算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量。侵染將線蟲懸液，配成一定濃度的線蟲懸浮液。將一定濃度的線蟲懸浮液噴在蛭石上，使蛭石完全濕透，沒有水溢出為宜。布袋是17X26cm大小，布料質(zhì)地有尼龍、純棉，設(shè)侵染每頭末 齡黃粉蟲的異小桿線蟲劑量為50條IJ、斯氏線蟲100條IJ。結(jié)果繁 殖袋采用純棉布制作的線蟲產(chǎn)量是尼龍袋的5倍。b.培養(yǎng)介質(zhì)不滅菌寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a 步，結(jié)果培養(yǎng)介質(zhì)不滅菌的線蟲產(chǎn)量高于滅菌的1.25倍，所以考慮 到繁殖效率培養(yǎng)介質(zhì)不必滅菌。c. 繁殖袋不用翻動(dòng)寄主昆蟲、培養(yǎng)介質(zhì)處理和侵染劑量同a 步，結(jié)果繁殖袋翻動(dòng)與不翻動(dòng)的線蟲產(chǎn)量相當(dāng)，所以繁殖袋也不必翻動(dòng)。d. 侵染劑量篩選寄主昆蟲與培養(yǎng)介質(zhì)混合比例、收獲時(shí)間、繁殖袋大小進(jìn)行正交組合試驗(yàn)，寄主昆蟲和培養(yǎng)介質(zhì)處理同a步，結(jié) 果寄主昆蟲(黃粉蟲)與培養(yǎng)介質(zhì)(蛭石)混合比例是三比二；異小桿線蟲侵染劑量是800條侵染期線蟲/克黃粉蟲(斯氏線蟲侵染劑量 是1600條侵染期線蟲/克黃粉蟲)；繁殖袋大小選用17X26cm;異小 桿線蟲的收獲時(shí)間是培養(yǎng)12天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次， 培養(yǎng)15天時(shí)再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次(斯氏線蟲的收獲時(shí) 間是培養(yǎng)10天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養(yǎng)13天時(shí)再 次收獲，將布袋浸泡并收獲3次)；e. 收獲方法優(yōu)化收獲后將線蟲懸浮液沉淀，移去上清液后再 用放在瓷盤上的面巾紙過濾除去雜質(zhì)，可保持線蟲原有的致病力，并 且壽命比不過濾儲(chǔ)存的線蟲延長(zhǎng)6倍。f. 規(guī)?；a(chǎn)選擇以上篩選出的最佳培養(yǎng)參數(shù)，將繁殖袋懸掛在25"C裝有空調(diào)的房間里，每天觀察懸在繁殖袋上的彈簧秤的讀 數(shù)，以監(jiān)控繁殖袋的失水量，當(dāng)失水達(dá)到50%時(shí)，應(yīng)用蒸餾水噴濕布 袋。最終獲取繁殖倍數(shù)高、質(zhì)量好的線蟲。g.所用儀器設(shè)備DHP-9162A恒溫培養(yǎng)相(天津泰斯特)、 30405359相差顯微鏡(麥克奧迪)、S633069冷光源解剖鏡(麥克奧 迪)、Z18400微量移液器(上海)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明是黑龍江省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目"丘陵黑土區(qū)水土保持林構(gòu)建與流域綜合治理技術(shù)研究"(編號(hào)GA06B302-3 )中的部分內(nèi)容。 我們于2006年3月至2007年6月在黑龍江省水土保持科學(xué)研究所 二龍山生態(tài)試驗(yàn)站按以上步驟進(jìn)行了規(guī)?；囼?yàn)性生產(chǎn)，供試樹種3 個(gè)，分別是小黑楊、:樟子松、落葉松。所有苗木均為1年生實(shí)生苗。 生產(chǎn)中獲取了昆蟲病原線蟲活體最佳高倍繁殖方法的成功，可解決 線蟲數(shù)量少不能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的難題，經(jīng)過試驗(yàn)防治地下害蟲效 果達(dá)到80%以上，既獲得了經(jīng)濟(jì)效益，又獲得了生態(tài)效益。本發(fā)明的使用材料分布廣，價(jià)格便宜，可降低成本。廣泛應(yīng)用于 盆栽作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、牧草、草坪等地下害蟲防治和果樹、觀 賞園林等林木上隱蔽性害蟲防治，本發(fā)明將進(jìn)一步提高昆蟲病原線蟲 的產(chǎn)量和質(zhì)量，促進(jìn)我國(guó)生物防治的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.一種規(guī)?；a(chǎn)昆蟲病原線蟲活體高倍培殖方法，其特征在于改目前的離體繁殖為活體繁殖，其步驟如下a.介質(zhì)與繁殖袋質(zhì)地篩選寄主昆蟲采用黃粉蟲，培養(yǎng)介質(zhì)選用價(jià)格便宜的蛭石，蛭石用自來水浸泡，洗干凈，然后在60℃烘箱中烘干至恒重；侵染前期準(zhǔn)備把1Kg蛭石裝在布袋中浸泡在蒸餾水桶中，完全浸泡之后，取出布袋，掛起來，曬干直至布袋上不滴水，再稱布袋的重量，計(jì)算蛭石含水量，即蛭石完全浸透所需水量；侵染將線蟲懸液，配成一定濃度的線蟲懸浮液，將一定濃度的線蟲懸浮液噴在蛭石上，使蛭石完全濕透，沒有水溢出為宜；布袋是17×26cm大小，布料質(zhì)地選用純棉，設(shè)侵染每頭末齡黃粉蟲的異小桿線蟲劑量為50條IJ、斯氏線蟲100條IJ；b.培養(yǎng)介質(zhì)不滅菌；c.繁殖袋不用翻動(dòng)；d.侵染劑量篩選寄主昆蟲與培養(yǎng)介質(zhì)混合比例、收獲時(shí)間、繁殖袋大小進(jìn)行正交組合試驗(yàn)，寄主昆蟲和培養(yǎng)介質(zhì)處理同a步，寄主昆蟲(黃粉蟲)與培養(yǎng)介質(zhì)(蛭石)混合比例為三比二；異小桿線蟲侵染劑量是800條侵染期線蟲/克黃粉蟲或斯氏線蟲侵染劑量是1600條侵染期線蟲/克黃粉蟲；繁殖袋大小選用17×26cm；異小桿線蟲的收獲時(shí)間是培養(yǎng)12天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養(yǎng)15天時(shí)再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次，斯氏線蟲的收獲時(shí)間是培養(yǎng)10天時(shí)開始收獲，將布袋浸泡并收獲5次，培養(yǎng)13天時(shí)再次收獲，將布袋浸泡并收獲3次；e.收獲方法優(yōu)化收獲后將線蟲懸浮液沉淀，移去上清液后再用放在瓷盤上的面巾紙過濾除去雜質(zhì)；f.規(guī)?；a(chǎn)選擇以上篩選出的最佳培養(yǎng)參數(shù)，將繁殖袋懸掛在25℃裝有空調(diào)的房間里，每天觀察懸在繁殖袋上的彈簧秤的讀數(shù)，以監(jiān)控繁殖袋的失水量，當(dāng)失水達(dá)到50％時(shí)，應(yīng)用蒸餾水噴濕布袋。
全文摘要
本發(fā)明屬于林業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種規(guī)?；ハx病原線蟲活體高倍培殖方法。改目前的離體繁殖為活體繁殖，明顯提高了對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲的致病能力，并且產(chǎn)量與效率較高，成本低，質(zhì)量好，防治效果明顯提升。本發(fā)明的使用材料分布廣，價(jià)格便宜，可降低成本。廣泛應(yīng)用于林木、果樹、觀賞園林等隱蔽性害蟲防治和盆栽作物、經(jīng)濟(jì)作物等地下害蟲防治上，本發(fā)明將進(jìn)一步提高昆蟲病原線蟲產(chǎn)量和質(zhì)量，促進(jìn)我國(guó)生物防治的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N1/10GK101157893SQ200710056058
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者于澤波, 劉洪家, 王玉璽, 解運(yùn)杰, 陳祥偉, 馬光波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所