專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種檢測(cè)膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，通過(guò)同時(shí)檢測(cè)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因(ABCA1)、載脂蛋白B基丙(APOB)、載脂蛋白E基因(APOE)和脂蛋白脂酶基因(LPL)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估個(gè)體膽問(wèn)醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)。
背景技術(shù)：
：膽固酵是體內(nèi)最豐富的固醇類(lèi)化合物，它既作為細(xì)胞生物膜的構(gòu)成成分，又是類(lèi)闊醉類(lèi)激素、膽汁酸及維生素D的前體物質(zhì)。因此對(duì)于大多數(shù)組織來(lái)說(shuō)，保證膽固醇的供給，對(duì)維持其代謝平衡是十分重要的。膽固醇廣泛存在于全身各組織中，其中約l/4分布在腦及神經(jīng)組織中，占腦組織總重跫的2%左右。肝、腎及腸等內(nèi)臟以及皮膚、脂肪組織亦含較多的膽固醇，每100g組織中約含200至500mg，以肝為最多，而肌肉較少，腎上腺、卵巢等組織膽固醇含量可高達(dá)1%-5%，但總量很少。生物體有非常精細(xì)的機(jī)制以調(diào)控膽固醇代謝平衡，但當(dāng)膽固醉代謝出現(xiàn)障礙時(shí)，來(lái)S膳食的膽固醇不能從血液中被迅速代謝，當(dāng)體內(nèi)總膽固醇過(guò)高，超過(guò)合成生物膜、膽汁酸及類(lèi)固醇激素等的需要時(shí)，將造成血中膽問(wèn)醇濃度過(guò)高，常會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、阿爾海默氏病及膽結(jié)石等的發(fā)生。膽固醇代謝異常會(huì)造成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因(ABCA1)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病密切相關(guān)。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)蛋白是一種整合膜蛋白，它以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)和HDL生成的起始步驟中起重要作用，被稱(chēng)作RCT守門(mén)人。核受體PPARs、LXRs和FXR對(duì)abcal蛋白的表達(dá)具有調(diào)控作用。人體50種組織中存在有ABCA1mRNA,在胰、肝、肺、腎上腺和胎兒組織中ABCA1表達(dá)水平最高，ABCA1功能障礙將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)大量的膽固醇沉積而成為泡沫細(xì)胞，繼而浸潤(rùn)血管壁，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究。經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診的冠心病病例224例，為江蘇省人民醫(yī)院、無(wú)錫市第一人民醫(yī)院住院患者，同一地區(qū)正常對(duì)照248例。分別以PCR-RFLP和PIRA-PCR對(duì)abcal第219密碼子G—A(Arg219Lys)和第883G—A(Met883Ile)密碼子多態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，比較不同基因型與個(gè)體血脂水平和冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果吸煙、高血壓和高血糖是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與攜帶219RR基因型者比較，攜帶至少1個(gè)219K等位基因者(即RK和KK基因型)冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)顯著降低59X(OR-0.41,95%CI=0.27-0.61)。而兩位點(diǎn)聯(lián)合作用分析發(fā)現(xiàn)攜帶219RR,883MM或883MI基因型者比較，攜帶其他組合基因型的個(gè)體冠心病患者風(fēng)險(xiǎn)降低61%((=0.39,95%CI-O.26-0.60)。另外，對(duì)照組中攜帶219K等位基因血清HDL-C水平顯著髙于219K非攜帶者(p=0.37)，提示Arg219Lys位點(diǎn)的多肽改變主要通過(guò)改變HDL-C水平影響個(gè)體冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)。ABCA1的R219K可能與中國(guó)漢族人群冠心病遺傳易感性有關(guān)，血清高密度脂蛋白可能是其作用靶點(diǎn)。膽固醇代謝異常還會(huì)造成高脂血癥。由f脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常使血漿中一種或兒種脂質(zhì)高于正常稱(chēng)為高脂血癥，可表現(xiàn)為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥或兩者兼有，即混合型高脂血癥。目前科學(xué)研究已知，載脂蛋白B(APOB)、載脂蛋白E(APOE)和脂蛋白脂酶(LPL)三種基因與高脂血癥有密切關(guān)系。載脂蛋白B(APOB)蛋白是乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。可以形成低密度脂蛋白膽固醇，通過(guò)肝臟細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體LDLR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用將脂質(zhì)代謝的殘余物進(jìn)行清除。已有的研究發(fā)現(xiàn)APOB基因上的多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的改變而引起的基因結(jié)構(gòu)變化可能導(dǎo)致編碼的載脂蛋白apoB和膽固醇結(jié)合后的脂蛋白復(fù)合物與肝臟細(xì)胞上的低密度脂蛋白受體結(jié)合能力下降，導(dǎo)致低密度脂蛋A膽固醇類(lèi)在血漿中聚積，無(wú)法被排出體外，發(fā)生高脂血癥。嚴(yán)重者可對(duì)血管的正常運(yùn)作產(chǎn)生阻礙，引起動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病。通過(guò)一系列的關(guān)聯(lián)性分析研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白B基因XbaI位點(diǎn)上T等位基因，在一定程度上影響體內(nèi)脂質(zhì)代謝,是血脂增高的內(nèi)在易感因素。載脂蛋白E(APOE)是一個(gè)主要的乳糜微粒的輔基蛋白，可以與肝臟細(xì)胞或者周?chē)?xì)胞上的受體結(jié)合。ApoE蛋白對(duì)于甘油三酯蛋白的正常代謝是非常重要的。APOE基因的缺陷可能導(dǎo)致由T-乳糜微粒和極低密度脂蛋白無(wú)法被正常清除而引發(fā)的血清膽同醇和甘油三酯的升高，進(jìn)而引發(fā)家族性的3脂蛋白異?；蛘逫II型高脂蛋白血癥。此外apoE蛋白還能夠調(diào)節(jié)e淀粉樣肽的沉淀以及神經(jīng)元t蛋白的過(guò)磷酸化，對(duì)微管蛋白的固定、細(xì)胞的再生等都有很重要的作用。ApoE基因多態(tài)性影響血脂的代謝水平，ApoE2和ApoE4攜帶者對(duì)血脂的作用程度與年齡相關(guān)。而E2亞型可能更多得發(fā)展成為III型高脂血癥，而E4亞型則可能與V型高脂血癥關(guān)系更為密切。脂蛋白脂酶(LPL)對(duì)富含甘油三酯的脂蛋白(如乳糜微粒和極低密度脂蛋白VLDL)的清除來(lái)說(shuō)，是一個(gè)重要的組織酶。在LPL的催化下，甘油三酯在毛細(xì)血管和組織之間的界面上水解，產(chǎn)生脂肪酸供組織攝取。ApocII是LPL的激活劑，而ApoCIII則是抑制劑。LPL的缺陷可以產(chǎn)生家族性的I型高乳糜微粒血癥(I型高脂蛋白血癥)，而酶活性的不足會(huì)導(dǎo)致V型高脂蛋白血癥。分折了來(lái)自四川地區(qū)的152例高脂(fa癥患者和128例血脂正常者的脂蛋白酯酶基因內(nèi)含子8Hindm多態(tài)性、HDL亞類(lèi)組成及相對(duì)百分含量。結(jié)果顯示高脂血癥組H+H+基因型頻率顯著高于對(duì)照組，而其他兩種基因型頻率顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。此外在兩組中H+H+基因型者，血清TG明顯高于H-H-者，apoB100、TG/HDL-C比值也明顯高于H-H-者(p<0.05)。高脂血癥患者H+H+基因型小顆粒的preP1-HDL、HDL3b相對(duì)含量多于H-H-者，大顆粒的HDL2a、HDL2b相對(duì)含量少于H-H-者；正常對(duì)照組H+H+基因型HDL3c多于H-H-者，而HDL2a少于H-H-者，其差異均顯著(p〈0.05)。因此認(rèn)為中國(guó)人高脂血癥患者脂蛋白酯酶基因Hindm酶切位點(diǎn)多態(tài)性與HDL亞類(lèi)的組成相關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心頒布的《中國(guó)人口健康服務(wù)基因位點(diǎn)認(rèn)證規(guī)程》，對(duì)與膽固醇代謝異常易感相關(guān)基因位點(diǎn)的支持文獻(xiàn)、分子生物學(xué)機(jī)理研究、中國(guó)人群適用性等進(jìn)行綜合分析評(píng)估后，ABCA1基因上rs2230806號(hào)SNP位點(diǎn)、APOB基因上rs693號(hào)SNP位點(diǎn)、APOE基K上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)、LPL基因上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)和rs285號(hào)SNP位點(diǎn)通過(guò)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心認(rèn)定，可用于檢測(cè)評(píng)估膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)。基于ABCA1、AP0B、AP0E、LPL基因上這6個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性可用來(lái)評(píng)估個(gè)體膽固醉代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)ABCA1基因上rs2230806號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)APOB基因上rs693號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)LPL基因上rs320號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)LPL基因上rs285號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)APOE基因上rs429358號(hào)與rs7412號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括TaQ酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水等)；PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、去離子水等)；DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDyemix,EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)這6個(gè)SNP位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這6個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類(lèi)引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO:1和2、3和4、5和6、7和8、9和10所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這五對(duì)引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)ABCA1、AP0B、LPL基因上這4個(gè)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢瀾出這4個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。設(shè)計(jì)這類(lèi)探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO:11和12、13和14、15和16、17和18所示序列的Taqnian探針對(duì)。特異性熒光探針對(duì)可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光Taqman探針對(duì)不限干這四對(duì)探針，所有可用于焚光定量PCR法檢測(cè)這4個(gè)SNPs位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本試劑盒中所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)APOE基因上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出這2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。設(shè)計(jì)這類(lèi)引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQIDNO:19所示序列的DNA測(cè)序引物。DM測(cè)序引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的DNA測(cè)序引物不限于這條引物，所有可用于DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA測(cè)序引物均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括-1.熒光定量PCR反應(yīng)套裝10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液4nl，25mMdNTP混合液0.4^1,25raMMgC12溶液2.4^1，5units/plTaqDNA聚合酶0.l^il,20MM特異性引物對(duì)每條引物各0.225nl，10MM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25nl，去離子水2L3nl。2.PCR反應(yīng)套裝10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5pl，25鱺dNTP混合液0.2^1，25raMMgCh溶液1.5nl,5units/jilTaqDNA聚合酶0.125(xl，20nMAPOE基因特異性引物對(duì)每條引物各0.25^1，去離子水19.175^1。3.PCR產(chǎn)物純化套裝lunits/^ilSAP酶O.75jil,10units/filExol酶0.375^1,去離子水3.875pl。4.測(cè)序反應(yīng)套裝25%BigDyemix3.2fiMDNA測(cè)序引物1^1，125mMEDTA溶液1^1,謹(jǐn)乙醇溶液15nl,70*乙醇溶液30nl,HIDI溶液8jil，去離子水2jd。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用步驟l:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針對(duì)有義引物l:5，-TGTGCAATGGATCAAAATCAG-3'(SEQIDNO:1)反義引物l:5'-GTGAGCAAGTCTACTCAC-3'(SEQIDNO:2)有義引物2:5'-GGCTCACATGAAGGCCAAATTC-3，(SEQIDNO:3)反義引物2:5'-AGTTCCTGCTGAATGTCCATTTGAT-3'(SEQIDNO:4)有義引物3:5'—AATTCAATGTCTCTTC-3'(SEQIDNO:5)反義引物3:5'-AGAACAACAACAAAA—3'(SEQIDNO:6)有義引物4:5'-AGGGTGAGATTCCAAGATAA-3，(SEQIDNO:7)反義引物4:5'-CAAGCAAATGACTAAAGAGAA-3'(SEQIDNO:8)帶VIC熒光基團(tuán)探針l:5'_ACCAAgGGAGAA_3，(SEQIDNO:11)帶FAM熒光基團(tuán)探針l:5'-ACCAAaGGAGAAA-3'(SEQIDNO:12)帶VIC熒光基團(tuán)探針2:5'-TGTATCTTCTAGgGTCTCTC-3，(SEQIDNO:13)帶FAM熒光基團(tuán)探針2:5'-TGTATCTTCTAGaGTCTCTC-3，(SEQIDNO:14)帶VIC熒光基團(tuán)探針3:5'-TTTAGcAGCTGT-3'(SEQIDNO:15)帶FAM熒光基團(tuán)探針3:5'-TTTAGtAGCTGTG-3'(SEQIDNO:16)帶VIC熒光基團(tuán)探針4:5'_GGATTTAAAGCgTTT-3'(SEQIDNO:17)帶FAM熒光基團(tuán)探針4:5'-AGGATTTAAAGCtTT-3，(SEQIDNO:18)有義引物l,反義引物l、帶VIC熒光基團(tuán)探針1、帶FAM熒光基團(tuán)探針l特異地針對(duì)檢測(cè)ABCAl基因上rs2230806號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團(tuán)探針2、帶FAM熒光基團(tuán)探針2特異地針對(duì)檢測(cè)APOB基因上rs693號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團(tuán)探針3、帶FAM熒光基團(tuán)探針3特異地針對(duì)檢測(cè)LPL基因上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物4，反義引物4、帶VIC熒光基團(tuán)探針4、帶FAM熒光基團(tuán)探針4特異地針對(duì)檢測(cè)LPL基因上rs285號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；4個(gè)SNPs位點(diǎn)分別進(jìn)行4次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為總體積10nl，包含濃度為20ng/nl的DM模板2nl、10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0.lpl25福dNTP混合液、0.6pl25raMMgCL溶液、0.025^1(5units/Vl)TaqDNA聚合酶、20一的有義引物和反義引物各0.225M1、10一的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25jil，去離子水5.325nl。在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5(TC、2分鐘，95'C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，6(TC、l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟3:PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)套裝，其中，含有下列引物對(duì)有義引物5'-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGGA-3'(SEQIDNO:9)反義引物5'-ACAGMTTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3'(SEQIDNO:10)反應(yīng)的體系為總體積25nl，包含濃度為12.5ng/Vl的DNA模板lpl、10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5^1，25mMdNTP混合液0.2nl,25mMMgC12溶液1.5jxl,5units/nlT叫DNA聚合酶(U25nl，20jxMAPOE特異性引物對(duì)每條引物各0.25fd，去離子水19.175nl。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C、12分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C、30秒，60'C、30秒，72C、30秒，然后進(jìn)行72'C、10分鐘。步驟4:PCR產(chǎn)物純化使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化套裝，反應(yīng)體系為總體積25fil，包含步驟3中PCR產(chǎn)物20^1,lunits/nlSAP酶0.75^1,10units/nlExol酶0.375nl，去離子水3.875nl。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37C、15分鐘，72'C、20分鐘。步驟5:DNA測(cè)序反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)套裝，其中，含有下列APOE基因的DNA測(cè)序引物-DNA測(cè)序引物5，-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGG-3'(SEQIDNO:19)反應(yīng)的體系為總體積5nl，包含步驟4中PCR純化產(chǎn)物lpl，25。/。BigDyemixlpl，3.2nMDNA測(cè)序引物lpl，去離子水2nl。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98°C、2分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的96'C、30秒，55"、30秒，60X:、4分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入125mMEDTA溶液lpl和100%乙醇溶液15^1，f室溫下沉淀15分鐘在4'C以3650轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30nl,以3650轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8fd，放入測(cè)序儀中。步驟6:基因型分析熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的服務(wù)步驟l:DNA提取由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔釆樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DM抽提。步驟2:基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者基因組DNA的ABCA1基因上rs2230806號(hào)SNP位點(diǎn)、APOB基因上rs693號(hào)SNP位點(diǎn)、LPL基因上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)和rs285號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，對(duì)APOE基因上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行DNA測(cè)序檢測(cè)，確定這6個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。步驟3:個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的分析通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者SNPs基因型的分析，出具個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明了被檢測(cè)者膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說(shuō)明和解讀個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)分析報(bào)告單。序列表〈110>上海主健生物工程有限公司<120>—種檢測(cè)膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒<160>19<210>1<211〉21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1TGTGCAATGGATCAAAATCAG21<210>2<211〉18<212〉鵬<213〉人工序列<220><223〉引物<400〉2GTGAGCAAGTCTACTCAC18<210〉3<211〉22<212〉■<213〉人工序列<220〉<223〉引物<棚〉3GGCTCACATGAAGGCCAAATTC22〈210〉4<211〉25<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>引物<德4AGTTCCTGCTGAATGTCCATTTGAT25<210>5<211〉16〈212>腿<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉5AATTCAATGTCTCTTC16<210>6<211>15<212>DM<213>人工序列〈220〉<223〉引物<400>6AGAACAACAACAAAA15<210>7<211>20<212>腿<213〉人工序列<220><223>引物〈400〉7AGGGTGAGATTCCAAGATAA20<210>8〈211〉21<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223>引物<400>8CAAGCAAATGACTAAAGAGAA2L<210>9<211>24<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223>引物〈400〉9TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGGA24<210〉10<211〉26〈212>■<213〉人工序列<220><223>引物<400>10ACAG緩TCGCCCCGGCCTGGTACAC26<210>11<211>12<212>鵬<213〉人工序列<220><223>探針<400>11ACCAAgGGAGAA12<210>12〈211>13<212>DNA<213〉人工序列<220><223>探針<400>12ACCAAaGGAGAAA13<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><2U>15<212>腿<213〉人工序列<220〉<223>探針<400>17GGMTTAAAGCgTTT15<210>18<211〉15<212>隨<213>人工序列<220>〈223〉探針<400>18AGGATTTAAAGCtTT15<210〉19<211〉23<212〉DM<213>人工序列<220〉<223>引物<400〉19TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGG2權(quán)利要求1.一種檢測(cè)個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因(ABCA1)上rs2230806號(hào)SNP位點(diǎn)、載脂蛋白B基因(APOB)上rs693號(hào)SNP位點(diǎn)、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)和rs285號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、檢測(cè)載脂蛋白E基因(APOE)上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物隊(duì)及DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDyemix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在T:所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)二磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因(ABCA1)上rs2230806號(hào)SNP位點(diǎn)、載脂蛋白B基因(APOB)上rs693號(hào)SNP位點(diǎn)、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)和rs285號(hào)SNP位點(diǎn)、載脂蛋白E基因(APOE)上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這6個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因(ABCAl)上rs2230806號(hào)SNP位點(diǎn)、載脂蛋白B基因(APOB)上rs693號(hào)SNP位點(diǎn)、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)和rs285號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這4個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)APOE基因上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出這2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于-:所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQIDNO:l和2、3和4、5和6、7和8、9和10所示序列的引物對(duì)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選SA有SEQIDNO:11和12、13和14、15和16、17和18所示序列的Taqman探針對(duì)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在T:所含的DNA測(cè)序引物選S具有SEQIDNO:19所示序列的引物。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1)熒光定量PCR反應(yīng)套裝10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液4fil，25mMdNTP混合液0.4jil,25mMMgC12溶液2.4jil,5unitsAilTaqDNA聚合酶0.1^1，20MM特異性引物對(duì)每條引物各0.225jxl,lOpM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25nl，去離子水21.3nl。2)PCR反應(yīng)套裝IOXPCR反應(yīng)緩沖液2.5^1，25mMdNTP混合液0.2^1，25mMMgC12溶液1.5^1，5units/nlT叫DNA聚合酶0.125^1，20nM特異性引物對(duì)每條引物各0.25n1,去離子水19.175nl。3)PCR產(chǎn)物純化套裝lunits/nlSAP酶0.75nl，10units/nlExol酶0.375pl，去離子水3.875^1。4)測(cè)序反應(yīng)套裝25%BigDyemixlnl，3.2fiMDNA測(cè)序引物125mMEDTA溶液1^1，100%乙醇溶液15nl,70%乙醇溶液30nl，HIDI溶液8pl，去離子水2nl。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因(ABCA1)上rs2230806號(hào)SNP位點(diǎn)、載脂蛋白B基因(APOB)上rs693號(hào)SNP位點(diǎn)、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)和rs285號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、檢測(cè)載脂蛋白E基因(APOE)上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物隊(duì)及DNA測(cè)序引物、熒光定量PCR常規(guī)組件、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的ABCA1、APOB、LPL、APOE基因上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估個(gè)體膽固醇代謝異常易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101240328SQ200710037178公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者馮哲民,鄒祖燁申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司