專利名稱：一種檢測(cè)少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒， 通過同時(shí)檢測(cè)載脂蛋白E基因(AP0E)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、瘦素(LEP)編碼基因和過氧化物酶體增生 激活受體y基因(PPARy)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評(píng)估少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)。
背景技術(shù)：
肥胖癥是一種熱量代謝障礙，攝入熱量超過消耗的熱量，引起體內(nèi)脂肪積聚過多所致。 一般認(rèn)為超過 按身高(長(zhǎng))所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體重20%即為肥胖。目前，我國(guó)小兒肥胖癥發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，已從5%以下提 高到1(^以上，單純肥胖癥發(fā)病率達(dá)5%-8%。少兒肥胖與許多成年期慢性病如高血壓、高血脂、糖尿病、 動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病有非常密切關(guān)系，肥胖導(dǎo)致這些疾病的患病率和死亡率急劇上升，使人群健 康水平下降。因此，正確認(rèn)識(shí)少兒肥胖癥，從少兒期著手預(yù)防和治療肥胖癥十分重要。少兒肥胖病因主要有攝入熱量過多；運(yùn)動(dòng)過少熱量消耗少；遺傳影響；神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)；內(nèi)分泌代謝 失調(diào)；心理因素。近年來對(duì)肥胖癥的遺傳基因研究甚多，人類肥胖屬于多基因遺傳，遺傳在肥胖發(fā)病中起 一個(gè)易發(fā)作用，與其他發(fā)病因素相互作用。已知，編碼載脂蛋白E (APOE)、脂蛋白脂酶(LPL)、瘦素(LEP) 和過氧化物酶體增生激活受體y (PPARy)的四種基因與少兒肥胖有密切關(guān)系。APOE是一個(gè)主要的乳糜微粒的輔基蛋白，可以與肝臟細(xì)胞或者周圍細(xì)胞上的受體結(jié)合，對(duì)于甘油三酯 蛋白的正常分解代謝是非常重要的。APOE蛋白最常見的三種亞型為AP0E2, -E3和-E4，分別由三種單倍 型e2、 e3、 E4構(gòu)成。這三種亞型在氨基酸編碼序列上的差異主要在兩個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)A為第130號(hào)氨基 酸殘基，位點(diǎn)B為第176號(hào)氨基酸殘基。其中E3亞型是最為常見的亞型，被定義為APOE基因的野生型。 Cysl30Arg對(duì)應(yīng)的SNP為rs429358，堿基變化為T471C;Cysl76Arg對(duì)應(yīng)的SNP為rs7412，堿基變化為T609C。 Sanghera DK等通過對(duì)一組9-10歲女童樣本的研究發(fā)現(xiàn)，APOE遺傳多態(tài)性對(duì)血脂水平及肥胖程度和血脂 水平的關(guān)系有明顯影響。向偉等采用改良的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法分析肥胖及健康 少兒APOE基因型，也發(fā)現(xiàn)單純型肥胖少兒有APOE基因多態(tài)性的變化。張曉等檢測(cè)了 324名8 12歲單純 肥胖少兒的血脂,測(cè)量體重和身高,計(jì)算BMI,同時(shí)使用多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)他們的APOE基因型，發(fā)現(xiàn)APOE基 因多態(tài)性可能對(duì)單純肥胖少兒BMI與血脂的關(guān)系有一定影響。LPL基因編碼脂蛋白脂酶，該酶在心臟、肌肉和脂肪組織中進(jìn)行表達(dá)，以同型二聚體蛋白的形式行使 功能，其分子生物學(xué)的作用包括兩部分， 一部分為甘油三脂的水解酶作用，另一部分則是受體介導(dǎo)的脂蛋 白內(nèi)吞作用的橋梁。LPL蛋白上的位點(diǎn)突變不僅與脂蛋白代謝、血脂水平密切相關(guān)，而且還與個(gè)體的肥胖 易感性有關(guān)。脂蛋白脂酶LPL在體內(nèi)主要參與脂質(zhì)代謝通路，作為催化酶催化極低密度脂蛋白或者低密度 脂蛋白的水解。rs320位點(diǎn)是位于LPL基因第8號(hào)內(nèi)含子的多態(tài)，由T到G的改變使原有的HindIII酶切 位點(diǎn)消失。Jemaa等對(duì)236例法國(guó)巴黎肥胖患者(162例女性和74例男性，實(shí)測(cè)體重〉12(W理想體重)LPL 基因多態(tài)性的分析顯示，HindlII多態(tài)性與BMI相關(guān)(P〈0.05)，而且此基因的變異使個(gè)體肥胖易感性增加。 李蓉等在2003年通過研究發(fā)現(xiàn)，肥胖組H+H+基因型者腰圍、VA等反映中心性肥胖的測(cè)量指標(biāo)顯著高于非 H+H+基因型者，說明LPL基因Hirid III多態(tài)性與肥胖人群脂肪的向心性聚積有關(guān)系。瘦素(L印tin)又稱脂肪抑制素，為肥胖基因(如ob)所編碼的蛋白質(zhì)。瘦素是一種由脂肪組織分泌 的多肽，參與體內(nèi)多個(gè)能量代謝過程。其受體位于下丘腦和脂肪細(xì)胞等靶細(xì)胞的膜上；后者擁有相應(yīng)的信 號(hào)傳導(dǎo)體系，是一個(gè)龐大的受體家族。瘦素通過瘦素受體，發(fā)揮以下廣泛生理功能抑制食欲，減少攝食; 改變自主神經(jīng)活動(dòng)，增加代謝率，促使體溫上升，減少脂肪儲(chǔ)存；降低血槳葡萄糖含量，使胰島素分泌下 降，體重和體內(nèi)能量?jī)?chǔ)存下降，避免肥胖、胰島素抵抗、糖尿病和不育；與特異性運(yùn)輸?shù)鞍捉Y(jié)合，向下丘 腦傳遞體脂信息，調(diào)動(dòng)一系列神經(jīng)一體液因素，調(diào)節(jié)能量代謝，使體脂和體重被控制在相對(duì)恒定的水平上。 rsl3306517是位于ob基因的一個(gè)G132A多態(tài)，引起ob基因編碼的蛋白25位Gln同義替換，可能與瘦素 的活性有重要的相關(guān)性，從而與個(gè)體的肥胖程度相關(guān)。2000年0hshiro Y等對(duì)日本人群的研究發(fā)現(xiàn)，在 53例肥胖個(gè)體中，瘦素25CAG等位基因的出現(xiàn)頻率明顯髙于132例非肥胖個(gè)體，因此認(rèn)為瘦素基因25CAG 等位基因可能與肥胖癥的發(fā)生有關(guān)，推斷其也許會(huì)成為日本人群甚至世界人群肥胖癥易感性的一個(gè)新的遺傳標(biāo)志。吳華等在一項(xiàng)瘦素基因突變與少兒肥胖癥的研究中對(duì)197例漢族少兒，其中正常體重組68例， 輕度肥胖組81例，中/重度肥胖組48例，進(jìn)行了分析。研究結(jié)果顯示在正常體重組與中/重度肥胖組之間 Codn25位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率的分布差異均存在顯著性(P^.000， P=0.001);瘦素基因 Codn2S(CAA/CAG)突變與漢族少兒的中/重度肥胖存在相關(guān)性，該基因變異對(duì)漢族少兒肥胖易感性的影響可 能存在肥胖程度的差異。PPARy全稱過氧化物瞎體增生激活受體y,編碼的蛋白屬于核受體過氧化物酶體增生激活受體亞家 族。PPAR家族成員目前主要發(fā)現(xiàn)了三種亞型a、 S、 Y三種亞型。PPARy編碼的蛋ft為y亞型，主要 負(fù)責(zé)脂類的分化代謝以及糖、脂代謝等。rs1801282是位于第三號(hào)染色體上PPAR y基因上的一個(gè)C/G多態(tài)， 引起PPARy基因編碼的蛋白第12個(gè)氨基酸由Pro(P)變?yōu)锳la(A)。在國(guó)外多個(gè)群體，超過2000對(duì)的肥胖 病例對(duì)照的研究中發(fā)現(xiàn)，PPARY2基因上的A12P多態(tài)與肥胖相關(guān)的多個(gè)指數(shù)如fflO、腰臀比等都有相關(guān)， 提示該多態(tài)位點(diǎn)是重要的肥胖發(fā)生相關(guān)位點(diǎn)。Bearaer對(duì)高加索肥胖人群的調(diào)杏中發(fā)現(xiàn)，A12單倍型具有更 高的體重指數(shù)，并認(rèn)為該位點(diǎn)可能與人類多因素導(dǎo)致的肥胖綜合癥相關(guān)。張德峰等人對(duì)石家莊地區(qū)體檢人 群中抽取104例非肥胖個(gè)體及104例肥胖個(gè)體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)肥胖個(gè)體中PPAR y 2基因有Alal2突變是導(dǎo) 致血清瘦素分泌增高、肥胖癥發(fā)生有密切關(guān)系的遺傳因素之一。魯謹(jǐn)?shù)纫訮CR2RFL,P測(cè)定232例中國(guó)人群 的過氧化物增殖物活化受體y 22 ( PPARy22)基因型,發(fā)現(xiàn)肥胖組(130例)中，攜帶等位基因Alal2者體重 指數(shù)(BMI)、臀圍和尿酸均顯著高于Pro純合子組，且該多態(tài)性與BMI獨(dú)立相關(guān)。提示該多態(tài)性與中國(guó)人 群超重和肥胖相關(guān)。發(fā)明內(nèi)容根據(jù)國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證中心頒布的《中國(guó)人口健康服務(wù)基因位點(diǎn)認(rèn)證規(guī)程》，對(duì)與 少兒肥胖易感性相關(guān)的基因位點(diǎn)的支持文獻(xiàn)、分子生物學(xué)機(jī)理研究、中國(guó)人群適用性等進(jìn)行綜合分析評(píng)估 后，AP0E基因上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)、LPL基因上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)、LEP基因上 rsl3306517號(hào)SNP位點(diǎn)和PPAR"y基因上rsl801282號(hào)SNP位點(diǎn)通過國(guó)家生物基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)估認(rèn)證 中心認(rèn)定，可用于檢測(cè)評(píng)估少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)?；贏POE、 LPL、 LEP、 PPARY基因上這5個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性可用來評(píng)估少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的基 礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)APOE基因上rs429358號(hào)與rs7412號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物； 檢測(cè)LPL基因上rs320號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 檢測(cè)LEP基因上rsl3306517號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 檢測(cè)PPARy基因上rsl801282號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子 水等)。PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水等)； PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP,、 Exo I酶、去離子水等)；DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去離子 水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)這5個(gè)SNP位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這5個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA 片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ IDNO: l和2、 3和4、 5和6、 7和8所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的 技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這四對(duì)引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)LPL、 LEP、 PPAI^基因上這3個(gè)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通 過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這3個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù) 人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 9和10、 11和12、 13和14所示序列的Taq腿n 探針對(duì)。特異性熒光探針對(duì)可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光Ta聊an探針對(duì)不限于這三對(duì)探針，所有可用于熒光定量PCR法檢測(cè)這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的探針均在 本發(fā)明范圍內(nèi)。本試劑盒中所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)AP0E基因上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)而 設(shè)計(jì)，能通過DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出這2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。設(shè)計(jì)這類引物是本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 15所示序列的DNA測(cè)序引物。DNA 測(cè)序引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的DNA測(cè)序引物不限丁這條 引物，所有可用于DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)這2個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA測(cè)序引物均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括1. 熒光定量PCR反應(yīng)套裝10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液3pl，25mM dNTP混合液0.3 nl，25mM MgC12溶液1. 8fil，5units/nl Taq DNA聚合酶0.075^1,2(MJ特異性引物對(duì)每條引物各0,225nl，IO幽特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25pl，去離子水15.975jxl。2. PCR反應(yīng)套裝10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5^1，25diM dNTP混合液0.2fil,25mM MgCL溶液1.5^1，5units/>I Taq DNA聚合酶0. 125fil,20nM APOE基因特異性引物對(duì)每條引物各0.25nl，去離子水19. 175(il。3. PCR產(chǎn)物純化套裝 lunits/ftl SAP酶O. 75^1, lOunits/pd Exol酶0.375^1， 去離子水3. 875^1。4. 測(cè)序反應(yīng)套裝25% BigDye mix 1^1， 3.2nM DNA測(cè)序引物ljil， 125mM EDTA溶液1^1, 應(yīng)乙醇溶液15nl, 70%乙醇溶液30nl， HIDI溶液8fil. 去離子水2jil。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針對(duì):有義弓l物l: 5' - AGGGTGAGATTCCAAGATAA -3'(SEQ ID NO:1)反義引物1: 5' - CAAGCAAATGACTAAAGAGAA -3'(SEQ ID NO:2)有義引物2: 5' - TCTATGTCCAAGCTGTG -3'(SEQ ID NO:3)反義引物2: 5' - GGGTTTTGGTGTCATC -3'(SEQ ID NO:4)有義引物3: 5' _ AACTCTGGGAGATTCTC-3'(SEQ ID NO:5)反義引物3: 5' - TATCAGTGAAGGAATCG -3'(SEQ ID NO:6)帶VIC熒光基團(tuán)探針1: 5' - GGATTTAAAGCgTTT -3'(SEQ ID NO:9)帶FAM熒光基團(tuán)探針1: 5' - AGGATTTAAAGCtTT -3'(SEQ ID NO:10)帶VIC熒光基團(tuán)探針2: 5' - ATCCAaAAAGTCCA-3'(SEQ ID NO:11)帶FAM熒光基團(tuán)探針2: 5' - TCCAgAAAGTCCA-3'(SEQ ID NO:12)帶VIC熒光基團(tuán)探針3: 5' - GACcCAGAAAG -3'(SEQ ID NO:13)帶FAM熒光基團(tuán)探針3: 5' - GACgCAGAAAG -3'(SEQ ID NO:14)有義引物l，反義引物l、帶VIC熒光基團(tuán)探針1、帶FAM熒光基團(tuán)探針l特異地針對(duì)檢測(cè)LPL基因上 rs320號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團(tuán)探針2、帶FAM熒光基團(tuán)探針2特異地針對(duì)檢測(cè)LEP基因上 rsl3306517號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團(tuán)探針3、帶FAM熒光基團(tuán)探針3特異地針對(duì)檢測(cè)PPARy基因 上rsl801282號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；3個(gè)SNPs位點(diǎn)分別進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為總體積1(^1,包含濃度為 20ng/nl的DM模板2nl、 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. lpl 25威dNTP混合液、0.6pl 25mM MgCl2 溶液、0.025jd (5unitsAd) Taq DNA聚合酶、20(iM的有義引物和反義引物各0. 225jil、 10一的帶VIC 熒光探針和帶FAM熒光探針各0. 25jil,去離子水5. 325fil 。在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5(TC、 2分鐘，95'C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的 95'C、 30秒，6(TC、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟3: PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)套裝，其中，含有下列引物對(duì) 有義引物5' - TAAGCTTGCACGGCTGTCCMGGA -3' (SEQ ID NO: 7) 反義引物5' - ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC -3' (SEQ ID NO: 8) 反應(yīng)的體系為總體積25nl,包含濃度為12.5ng/nl的DNA模板lpl、 10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5nl，25mM dNTP混合液0.2^1， 25mMMgC12溶液1.5pl， 5units/nl Taq DNA聚合酶0.125nl, 20fiM APOE特異性引 物對(duì)每條引物各0,25nl，去離子水19.175nl。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C 、 12分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94'C 、 30秒，60 'C、 30秒，72TC、 30秒，然后進(jìn)行72"C、 10分鐘。步驟4: PCR產(chǎn)物純化使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化套裝，反應(yīng)體系為總體積25jil，包含步驟3中PCR產(chǎn)物20nl， lunits/fil SAP酶O. 75nl， lOunits/nl Exol酶0.375)xl,去離子水3. 875nl 在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37'C、 15分鐘，72'C、 20分鐘。步驟5: DNA測(cè)序反應(yīng)使用檢淵試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)套裝.其中，含有下列APOE基因的DNA測(cè)序引物DNA測(cè)序引物5' - TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGGA -3' (SEQ ID NO: 15) 反應(yīng)的體系為總體積5nl，包含步驟4中PCR純化產(chǎn)物lfil, 25% BigDye mix lfil， 3.2pM DNA測(cè)序 引物lul,去離子水2nl。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98。C、2分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的96'C 、30秒，55°C、 30秒，60°C、 4分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液1^1和100%乙醇溶液15fil,于室溫下沉淀15分鐘；在4°C以3650 轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30^1,以3650轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘， 輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8nl，放入測(cè)序儀中。步驟6:基因型分析熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)DM測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.進(jìn)行少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的服務(wù) 步驟l: DNA提取由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮 細(xì)胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)APOE基因上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行DNA測(cè)序 檢測(cè)，對(duì)被檢測(cè)者基因組DNA的LPL基因上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)、LEP基因上rsl3306517號(hào)SNP位點(diǎn)、PPAR丫 基因上rsl801282號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定這5個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。步驟3:少兒青春期肥胖易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的分析通過對(duì)被檢測(cè)者SNPs基因型的分析，出具少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了 被檢測(cè)少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說明和解讀少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)分析報(bào)告 單。序列表<110〉上海主健生物工程有限公司<120〉 一種檢測(cè)少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒<160〉 15<210> 1 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 <400> 1AGGGTGAGAT TCCAAGATAA 20<210> 2 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 <400> 2CAAGCAAATG ACTAAAGAGA A 21 <210〉 3<211> 17 <212> ■ <213>人工序列<220><223>引物 〈400> 3TCTATGTCCA AGCTGTG 17〈210〉 4 <211> 16 <212>腿 <213>人工序列<220><223>引物 <400> 4GGGTTTTGGT GTCATC l(;<210> <211> <212> <213>517 DNA人工序列<220><223>引物 <400〉 5AACTCTGGGA GATTCTC 17<210> <211> <212> <213>617■人工序列<220><223>引物 <400〉 6TATCAGTGAA GGAATCG 17<210> <211〉 <212〉 <213>724 腿人工序列<220><223>引物 < 7TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 24<210〉 8 <211> 26 <212> ■ <213〉人工序列<220><223>引物<400〉 8ACAGAATTCG CCCCGGCCTG GTACAC 2 6<210〉 <211〉 <212> <213>915DNA人工序列<220〉<223>探針 <400〉 9GGATTTAAAG CgTTT ]_5<210> 10 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列<220><223〉探針 <400> 10AGGATTTAAA GCtTT 15<210> 11 <211> 14 <212〉 DNA <213>人工序列<220〉<223>探針 <400〉 UATCCAaAAAG TCCA 14<210〉 <211〉 <212〉 〈213>1213 DNA人工序列<220><223〉探針 <柳〉12TCCAgAAAGT CCA 13〈210〉 <211> <212〉 <213>13 11 DNA人工序列<220>〈223〉探針 〈衡13GACcCAGAAA G 11<210> <211> <212> <213>14 11 DNA人工序列<220>〈223>探針 <400> 14GACgCAGAAA G 11<210> <211〉 <212〉 <213〉15 24 DM人工序列<220>〈223〉引物 <柳〉15TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 2權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)載脂蛋白E基因(APOE)上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物、檢測(cè)脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)、瘦素(LEP)基因上rs13306517號(hào)SNP位點(diǎn)和過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARγ)基因上rs1801282號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)載脂蛋白E基因(APOE) 上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)、瘦素(LEP) 基因上rsl3306517號(hào)SNP位點(diǎn)和過氧化物酶體增生激活受體y (PPAR y )基因上rsl801282號(hào)SNP位點(diǎn)， 能特異性擴(kuò)增出包含這5個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)脂'蛋白脂酶基因 (LPU上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)、瘦素(LEP)基因上rsl3306517號(hào)SNP位點(diǎn)和過氧化物,體增生激活受體y(PPAR y )基因上rsl801282號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這3個(gè)SNPs位 點(diǎn)基因型的Taqraan探針對(duì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測(cè)序引物是指針對(duì)APOE基因上rs429358 號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出這2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA 測(cè)序引物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQIDNO: 1和2、 3 和4、 5和6、 7和8所示序列的引物對(duì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQIDNO: 9和10、 11和12、 13和14所示序列的Taqman探針對(duì)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的DNA測(cè)序引物選自具有SEQ ID NO: 15所示 序列的引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) 熒光定量PCR反應(yīng)套裝10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液3pl， 25mMdNTP混合液0.3^1, 25mMMgC12 溶液1.8^, 5units/nl Taq DNA聚合酶0.075^1, 20MM特異性引物對(duì)每條引物各0.225^1， 10nM特異 性熒光探針對(duì)每條探針各0.25jxl，去離子水15.975nl。2) PCR反應(yīng)套裝IOXPCR反應(yīng)緩沖液25mMdNTP混合液0.2一， 25mMMgC12溶液1.5^1, 5units/nlTaqDNA聚合酶0.125nl, 20nM特異性引物對(duì)每條引物各0.25^1，去離子水19.175pl。3) PCR產(chǎn)物純化套裝lunits/nl SAP酶0.75^1， 10units/n！ Exol酶0.375^1，去離子水3.875nl。4) 測(cè)序反應(yīng)套裝25% BigDye mix 1^1, 3.2nMDNA測(cè)序引物1^1, 125mM EDTA溶液lpl， 100% 乙醇溶液15^1, 70。/。乙醇溶液30jil， HIDI溶液8[il，去離子水2^1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)載脂蛋白E基因(APOE)上rs429358號(hào)SNP位點(diǎn)和rs7412號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物、檢測(cè)脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320號(hào)SNP位點(diǎn)、瘦素(LEP)基因上rs13306517號(hào)SNP位點(diǎn)和過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARγ)基因上rs1801282號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測(cè)序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時(shí)檢測(cè)與少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的APOE、LPL、LEP、PPARγ基因上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評(píng)估少兒肥胖遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101240327SQ20071003717
公開日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2007年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司