專利名稱：一種檢測(cè)少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑 盒，通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的S氨基-y酮戊酸脫氡酶基H (ALAD)、基質(zhì)y-羧基谷氨酸蛋白基因(MGP)、維生素D受體基因(VDR)和X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1 (XRCC1)的單核苷 酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)。
背景技術(shù)：
鉛中毒是環(huán)境污染和不良生活習(xí)慣引起、易影響少年兒童健康的一類中毒。由亍少年兒童處于生長(zhǎng)發(fā) 育階段，因其特有的生理特征，容易發(fā)生鉛中毒。鉛中毒會(huì)影響少年兒童的體格生長(zhǎng)和神經(jīng)精神發(fā)育。隨 著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染及不良生活習(xí)慣引起的少年兒童健康問(wèn)題也日顯嚴(yán)重和受到關(guān)注。人體 對(duì)鉛吸收、代謝的程度是由環(huán)境和遺傳體質(zhì)共同決定的，不同的人在相同的環(huán)境下受到鉛的毒害程度是不 同的。因此，遺傳體質(zhì)不同的人應(yīng)對(duì)潛在的鉛中毒環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)需要采取不同的策略。鉛一旦進(jìn)入到體內(nèi)以后，首先與紅細(xì)胞結(jié)合，然后轉(zhuǎn)移到骨骼當(dāng)中而沉積下來(lái)，在體內(nèi)80%_90%的鉛 儲(chǔ)存在骨骼當(dāng)中，而血液中的鉛則隨血流到達(dá)身體的各個(gè)器官，如大腦、肝臟、腎臟、免疫器官等，從而 造成損害，因此表現(xiàn)出的特征是多種多樣的。對(duì)于兒童來(lái)說(shuō)，常見的癥狀主要表現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)和生長(zhǎng)發(fā)育 方面注意力不集中、多動(dòng)，學(xué)習(xí)成績(jī)不好或下降。血鉛水平與智商之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，血鉛水平每升 高10ug/dl智商下降2-3分。有些孩子會(huì)表現(xiàn)出性情、行為問(wèn)題，如脾氣暴躁、愛發(fā)脾氣、啃手指、逃 學(xué)、曠課等。有的孩子則表現(xiàn)出體格生長(zhǎng)發(fā)育受影響(身材瘦小)，鋅、鈣、鐵等微量元素缺乏。還有些 表現(xiàn)出易患感冒、免疫力低下、腹痛、腿痛等。己知，編碼S氨基-Y酮戊酸脫氫酶(ALAD)、基質(zhì)Y-羧基谷氨酸蛋白(MGP)、維生素D受體(VDR) 和X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1 (XRCC1)的四種基因與兒童鉛中毒有密切關(guān)系。S氨基-Y酮戊酸脫氫酶(ALAD)基因編碼的酶是血紅素合成的關(guān)鍵酶之一，其功能是催化兩個(gè)分子 的ALA(delta-aminolevulinate)聚合成卟膽原。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ALAD的表型和基因型在人群中分布的多態(tài) 現(xiàn)象。Potluri等研究發(fā)現(xiàn)，控制ALAD遺傳性狀的基因位點(diǎn)位于染色體9q34，有2個(gè)等位基因(ALAD1和 ALAD2)，后者是導(dǎo)致ALAD缺乏的基因。這兩種等位基因的不同表達(dá)組成了 3種遺傳表現(xiàn)型ALAD1-1、 ALAD1-2和ALAD2-2。雜合子ALAD卜2的S - ALAD活力相當(dāng)于正常人的50%,而ALAD2-2的酶活力僅僅是 正常人的2%。有學(xué)者報(bào)告ALAD基因還影響到鉛在體內(nèi)的分布和毒性,在同樣血鉛水平下攜帶ALAD1-2和 ALAD2-2基因者臏骨和腔骨中鉛水平增高,且對(duì)腎臟的毒性也高于ALAD1-1基因型。基質(zhì)Y-羧基谷氨酸蛋白(MGP)是維生素K依賴性蛋白，存在于骨骼、軟骨、心臟、腎臟和肺等臟器 中。MGP具有抑制鈣離子在軟骨、血管壁和其他軟組織發(fā)生異常沉積的作用，MGP的水平越高則它抑制鈣 離子異常沉積的作用越強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，血清中MGP濃度與該基因的啟動(dòng)子區(qū)(T-138C)，即rsl800802位 點(diǎn)的多態(tài)性密切相關(guān)，在三種基因型中，CC基因型最高、CT基因型次之、TT基因型最低。鉛和鈣均為二 價(jià)陽(yáng)離子，它們有相同的吸收代謝途徑。由于MGP影響鈣的代謝，因此被認(rèn)為能以相似的途徑影響鉛的代 謝。而關(guān)聯(lián)分析研究則證明了這種推測(cè)。2003年，張文眾等為探討基質(zhì)y-羧基谷氨酸蛋白(MGP)基因多 態(tài)性和血鉛水平的關(guān)系,尋找與兒童鉛中毒易感性有關(guān)的基因,測(cè)定了 355名6 12歲的中國(guó)漢族兒童的 血鉛水平。采用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP)分析MGP基因T-138C位點(diǎn)的多態(tài) 性。結(jié)果表明，在鉛污染地區(qū)TT基因型兒童的血鉛水平顯著高于CC基因型兒童(468.24ug/L. vs. 430.31 ng/L, P<0.05)。結(jié)果顯示MGP基因啟動(dòng)子區(qū)T-138C多態(tài)性影響生活在鉛污染環(huán)境中兒童的血鉛水平。 2006年，張文眾等對(duì)345名6-12歲中國(guó)漢族兒童的研究中，再一次肯定了 MGP基因T-138C位點(diǎn)TT基因型是兒童鉛中毒的易感基因。維生素D受體(VDR)編碼維生素D3的核激素受體，該蛋白也是膽石酸的第二受體。VDR屬于轉(zhuǎn)錄調(diào) 控因子，為類固醇激素/甲狀腺類激素受體超家族的成員。該蛋白對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要通過(guò)一系列代謝 反應(yīng)通路，包括免疫反應(yīng)和腫瘤激活通路。該基因的突變會(huì)導(dǎo)致維生素D缺乏引起的徇僂病。已知VDR基 因中有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。其中Bsra I位點(diǎn)(rsl544410)位于VDR基因內(nèi)含子9處，該多態(tài)可能和基因的轉(zhuǎn)錄效率有關(guān)。Fokl位點(diǎn)(rsl0735810)變異使VDR翻譯從第2個(gè)密碼子開始，結(jié)果翻譯出的蛋白質(zhì)少3 個(gè)氨基酸，為424個(gè)氨基酸。T叫I位點(diǎn)(rs731236)位于VDR基因外顯子10處，該多態(tài)可能與基因的轉(zhuǎn) 錄效率有關(guān)。這些位點(diǎn)的變異，都可以導(dǎo)致VDR基因轉(zhuǎn)錄水平下降或影響VDR蛋白的活性。多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研 究證實(shí)，VDR基因與鈣等金屬離子在體內(nèi)的吸收代謝有顯著相關(guān)性。鉛和鈣在體內(nèi)的代謝非常相似而且互 相影響，VDR可以通過(guò)影響鈣代謝，間接影響鉛的吸收。X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因l (XRCC1)編碼的蛋白對(duì)因電離輻射和烷基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到 有效的修復(fù)作用。XRCC1編碼的蛋白與DNA連接酶III、聚合酶e 、多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶交互作用，參與 DNA的堿基切除修復(fù)(Base Excision R印air， BER)通路。研究證實(shí)，鉛接觸可誘發(fā)機(jī)體引起氧化應(yīng)激所 致DNA損傷。XRCC1作為重要的DNA損傷修復(fù)基因，因此與鉛中毒產(chǎn)生一定關(guān)聯(lián)性。在關(guān)聯(lián)分析研究方面 結(jié)果顯示XRCC1 A194W (rsl799782位點(diǎn))的CT+TT在病例組和內(nèi)對(duì)照組的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P〈0.05) , CT+TT基因型能增加鉛中毒的易感性(0R-2. 46, 95% CI=1. 16 5. 21),提示XRCC1基因A194W 的多態(tài)性可能與鉛中毒易感性有關(guān)。發(fā)明內(nèi)容基于S氨基-y酮戊酸脫a酶基因(ALAD)、基質(zhì)y-羧基谷氨酸蛋白基因(MGP)、維生素D受體基因 (VDR)和X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1 (XRCC1)上的5個(gè)SNPs位點(diǎn)多態(tài)性可用來(lái)評(píng)估少兒鉛中毒遺傳易感 風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。 該試劑盒包括檢測(cè)S氨基-y酮戊酸脫氫酶基因上rsl800435號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探 針對(duì)；檢測(cè)基質(zhì)Y-羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探 針對(duì)；檢測(cè)維生素D受體基因上rsl544410號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)維生素D受體基因上rs731236號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；檢測(cè)X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1上rsl799782號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)S氨基-Y酮戊酸脫氫酶基因上rsl800435號(hào)SNP位點(diǎn)、基 質(zhì)Y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP 位點(diǎn)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1上rsl799782號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這5個(gè)SNPs位點(diǎn) 的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: l和2、 3和4、 5和6、 7和8、 9和10所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn) 行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限-丁這五對(duì)引物。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)S氨基-y酮戊酸脫氫酶基因上rsl800435號(hào)SNP位點(diǎn)、 基質(zhì)Y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào) SNP位點(diǎn)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1上rsl799782號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性 檢測(cè)出這五個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選 地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 11和12、 13和14、 15和16、 17和18、 19和20所示序列的Taqman 探針對(duì)。特異性熒光探針對(duì)可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特 異性熒光Taq腿n探針對(duì)不限于這五對(duì)探針，所有可用丁熒光定量PCR法檢測(cè)本發(fā)明中所述用來(lái)評(píng)估骨質(zhì) 疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的五個(gè)SNPs位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括5^1 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液，0.5^1 25mM dNTP混合液，3nl 25mM MgCh溶液，0. 125^1 (5units/Vl) Taq DM聚合酶， 20nM特異性引物對(duì)每條引物各0.225(xl， 10pM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25nl， 去離子水26. 625^1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針對(duì) 有義引物l: 5' - CCCCTCTACCCACACC -3' (SEQ ID NO: 1) -GCGTAGGCCCTCTTCC -3' (SEQ ID NO: 2) GGGAAAACTGCCCACTC -3' (SEQ ID NO: 3) GMGGGTTGGCACTGAAC -3' (SEQ ID NO: 4) GAGCAGAGCCTGAGTATT -3' (SEQ ID NO: 5) TTCCTGGGGCCACAGA -3' (SEQ ID NO: 6) TGGACAGGCGGTCC _3' (SEQ ID NO: 7) CTGGGGTGCAGGAC -3' (SEQ ID NO: 8) TGGACAGGCGGTCCTG -3' (SEQ ID NO: 9) CTGGGGTGCAGGACGC -3' (SEQ ID NO: 10)TGGTGTGAAgCGGCTGGA -3' (SEQ ID NO: 11) TGGTGTGMaCGGCTGGA -3' (SEQ ID NO: 12) MTGACtGTTTGGGM -3' (SEQ ID NO: 13) MTGACcGTTTGG -3， (SEQ ID NO: 14) GGGAATGtGCAGGC -3' (SEQ ID NO: 15) GGAATGcGCAGGC -3， (SEQ ID NO: 16) TGGCCTCgATCAG -3' (SEQ ID NO: 17) TGGCCTCaATCAG -3' (SEQ ID NO: 18) CTTCAGCcGGATCA -3' (SEQ ID NO: 19) TTCTTCAGCtGGATCA -3， (SEQ ID NO: 20) 有義引物l,反義引物l、帶VIC熒光基團(tuán)探針1、帶FAM熒光基團(tuán)探針l特異地針對(duì)檢測(cè)編碼白細(xì)胞 介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團(tuán)探針2、帶FAM熒光基團(tuán)探針2特異地針對(duì)檢測(cè)骨保護(hù)素 TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團(tuán)探針3、帶FAM熒光基團(tuán)探針3特異地針對(duì)檢測(cè)腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性；有義引物4，反義引物4、帶VIC熒光基團(tuán)探針4、帶FAM熒光基團(tuán)探針4特異地針對(duì)檢測(cè)維生素D受 體基因上rsl544410號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性有義引物5，反義引物5、帶VIC熒光基團(tuán)探針5、帶FAM熒光基團(tuán)探針5特異地針對(duì)檢測(cè)維生素D受 體基因上rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)多態(tài)性反義引物l: 5'有義引物2: 5'反義引物2: 5'有義引物3: 5'反義引物3: 5'有義引物4: 5'反義引物4: 5'有義引物5: 5'反義引物5: 5' 帶VIC熒光基團(tuán)探針1: 5'帶FAM熒光基團(tuán)探針1: 5' 帶VIC熒光基團(tuán)探針2: 5' 帶FAM熒光基團(tuán)探針2: 5' 帶VIC熒光基團(tuán)探針3: 5' 帶FAM熒光基團(tuán)探針3: 5' 帶VIC熒光基團(tuán)探針4: 5' 帶FAM熒光基團(tuán)探針4: 5' 帶VIC熒光基團(tuán)探針5: 5' 帶FAM熒光基團(tuán)探針5: 5'5個(gè)SNPs位點(diǎn)分別進(jìn)行5次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為總體積10jil，包含濃度為 20ngAd的DNA模板2nl、 lfd 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 1^1 25mM dNTP混合液、0. 6^1 25mM MgCl2 溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20一的有義引物和反義引物各0. 225^1、 10一的帶VIC 熒光探針和帶FAM熒光探針各0. 25^1 ，去離子水5. 325"。在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50'C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的 恥'C、 30秒，60'C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟3: SNP基因型分析熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.對(duì)人們進(jìn)行少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)的服務(wù) 步驟l: DM提取由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮 細(xì)胞的DNA抽提。步驟2:基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者基因組DNA的編碼白細(xì)胞介素6基因上rsl800795號(hào)SNP位點(diǎn)、 骨保護(hù)素TNFRSF11B基因上rs2073618號(hào)SNP位點(diǎn)、腫瘤壞死因子-a基因上rsl800629號(hào)SNP位點(diǎn)、維生 素D受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)位點(diǎn)分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定這五個(gè)SNPs位點(diǎn)的基 因型。步驟3:少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的分析通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者SNPs基因型的分析，出具少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明 了被檢測(cè)者骨質(zhì)疏松癥易感遺傳風(fēng)險(xiǎn)的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說(shuō)明和解讀少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn) 分析報(bào)告單。序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120> —種檢測(cè)少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒<勝20<210> 1 <211〉 16 〈212〉, <213>人工序列<220>〈223〉引物 <400〉 1CCCCTCTACC CACACC 16<210〉 2 <211〉 16 <212〉腿 <213>人工序列<220〉<223〉引物. <400〉 2GCGTAGGCCC TCTTCC 16<210〉 3 <211〉 17 <212> DNA <213>人工序列<220><223>引物 <400> 3GGGAAAACTG CCCACTC 17<210〉 4 <211> 18 <212> ■ <213>人工序列<220>200710037176. 4<223>引物 <■ 4GAAGGGTTGG CACTGAAC<210> 5 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列〈220><223>引物 <400> 5GAGCAGAGCC TGAGTATT<210> 6 <211> 16 〈212〉 DM <213〉人工序列<220〉<223>引物 <400> 6TTCCTGGGGC CACAGA<210〉 7 <211〉 14 <212〉 DNA <213〉人工序列<220><223〉引物 <揚(yáng)7TGGACAGGCG GTCC<210> 8 <211> 14 <212〉鵬 <213>人工序列<220><223>引物說(shuō)明書第6/9頁(yè)181816〈400》CTGGGGTGCA GGAC<210〉 9 <211> 16 <212>隨 <213>人工序列<220><223>引物 <400〉 9TGGACAGGCG GTCCTG<210> 10<21D 16〈212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉引物 <400〉 10CTGGGGTGCA GGACGC<210〉 11 <211> 18 <212〉 DNA 〈213〉人工序列<220〉<223〉探針 催〉11TGGTGTGAAg CGGCTGGA<210〉 12<211> 18<212> DNA <213>人工序列<220><223>探針 < 12TGGTGTGAAa CGGCTGGA說(shuō)明書第7/9頁(yè)141616189<210〉 13 〈211> 16 <212> DNA <213>人工序列〈220〉<223>探針 <400〉 13AATGACtGTT TGGGAA 16<210> 14 <211> 13 〈212> DNA 〈213>人工序列<220><223>探針 <400> 14AATGACcGTT TGG 13<210> 15 <211〉 14 <212〉腿 〈213〉人工序列<220〉<223>探針 <400> 15GGGAATGtGC AGGC "<210> 16<211> 13<212> ■ <213>人工序列〈220>〈223〉探針 〈400〉 16GGAATGcGCA GGC 13 <210> 17<211> 13 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探針 <400> 17TGGCCTCgAT CAG 13<210> 18 <211> 13 <212> DNA <213〉人工序列<220> <223>探針■> 18TGGCCTCaAT CAG 13〈210〉 19<211〉 14<212〉 DNA <213〉人工序列<220〉<223〉探針 <400> 19CTTCAGCcGG ATCA 14<210> 20 <211〉 16 <212> DNA <213>人工序列<220〉<223>探針 < 20TTCTTCAGCt GGATCA 1權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其特征在于包括同時(shí)檢測(cè)δ氨基-γ酮戊酸脫氫酶基因上rs1800435號(hào)SNP位點(diǎn)、基質(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白基因上rs1800802號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rs1544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1上rs1799782號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)S氨基-y酮戊酸脫氫 酶基因上rsl800435號(hào)SNP位點(diǎn)、基質(zhì)Y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體 基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1上rsl799782號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)， 能特異性擴(kuò)增出包含這5個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)S氨基-Y酮戊酸 脫氫酶基因上rsl800435號(hào)SNP位點(diǎn)、基質(zhì)y -羧基谷氨酸蛋白基因上rsl800802號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D 受體基因上rsl544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1上rsl799782號(hào)SNP位點(diǎn)而 設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這五個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的T叫man探針對(duì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQIDNO: l和2、 3 和4、 5和6、 7和8、 9和IO所示序列的引物對(duì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO: 11和 12、 13和14、 15和16、 17和18、 19和20所示序列的Taqman探針對(duì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括5nl IOX熒光定量PCR反 應(yīng)緩沖液、0. 5nl25mMdNTP混合液、3jil 25mMMgCl2溶液、0.125^1 (5units/nl) TaQDNA聚合酶、20pM 特異性引物對(duì)每條引物各0. 225^1、 l(HiM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25^1、去離子水26.625|il。本 試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括同時(shí)檢測(cè)δ氨基-γ酮戊酸脫氫酶基因上rs1800435號(hào)SNP位點(diǎn)、基質(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白基因上rs1800802號(hào)SNP位點(diǎn)、維生素D受體基因上rs1544410號(hào)和rs731236號(hào)SNP位點(diǎn)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1上rs1799782號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估少兒鉛中毒遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101240326SQ20071003717
公開日2008年8月13日 申請(qǐng)日期2007年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司