專利名稱：：一種軍團(tuán)菌培養(yǎng)基及其配制方法以及軍團(tuán)菌試劑盒的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及軍團(tuán)菌檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種軍團(tuán)菌培養(yǎng)基及其配制方法、利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)制成的軍團(tuán)菌試劑盒的使用方法。
背景技術(shù)：
：1977年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)了軍團(tuán)菌及其引起的軍團(tuán)病。此病主要表現(xiàn)為嚴(yán)重肺炎，并有較高的死亡率；目前在美國(guó)占細(xì)菌性肺炎發(fā)病數(shù)的第三位，因此為世界各國(guó)所高度重視；我國(guó)政府衛(wèi)生部也十分關(guān)心軍團(tuán)病的防治工作。但本病難以依靠臨床表現(xiàn)和各種臨床檢査做出診斷，而幾乎完全依賴實(shí)驗(yàn)室的病原檢査方法做出確診，因而很容易漏診、誤診以至于耽誤病人的治療和預(yù)防。因此準(zhǔn)備好并能充分供應(yīng)，能夠被廣大防病醫(yī)療單位接受和常規(guī)使用的軍團(tuán)病檢驗(yàn)產(chǎn)品極為重要。軍團(tuán)菌檢驗(yàn)產(chǎn)品基本可分兩類-(1)從臨床標(biāo)本中培養(yǎng)檢出軍團(tuán)菌；由軍團(tuán)菌培養(yǎng)制備出來的抗原和抗體產(chǎn)品如血清學(xué)微量凝集試劑盒、軍團(tuán)菌分型診斷血清試劑盒和軍團(tuán)菌尿抗原金標(biāo)層析條試劑盒、直接免疫熒光技術(shù)等，都是當(dāng)前軍團(tuán)病診斷的主流產(chǎn)品。(2)軍團(tuán)菌分子生物學(xué)診斷產(chǎn)品如核酸探針、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等。但此類試驗(yàn)因?yàn)樘禺愋?、敏感性、價(jià)格等問題，目前仍僅作為輔助診斷方法，故未納入本系列產(chǎn)品的范圍。由于軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)需要特殊的原料——半胱氨酸、可溶性鐵和多種昂貴的進(jìn)口試劑等，同時(shí)影響其生長(zhǎng)的因素也很多，所以此類軍團(tuán)菌檢驗(yàn)產(chǎn)品的制造要求和成本都很高，故國(guó)內(nèi)至今僅有零星的產(chǎn)品供應(yīng)，且不僅質(zhì)量難以保證也價(jià)格不菲；而進(jìn)口產(chǎn)品常常缺貨，其價(jià)格更加昂貴，故至今國(guó)內(nèi)包括北京、上海等大城市的絕大多數(shù)疾控中心和醫(yī)院，都未能常規(guī)開展此類檢驗(yàn)項(xiàng)目，從而使此問題成為阻礙我國(guó)軍團(tuán)病防治和研究工作進(jìn)一步開展的瓶頸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的技術(shù)問題之一在于提供一種有效、使用方便的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基及其配制方法。本發(fā)明解決的技術(shù)問題之二在于提供一種軍團(tuán)菌檢驗(yàn)試劑盒的使用方法。本發(fā)明解決的技術(shù)問題之一是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的主要成分包含有酵母、ACES、瓊脂、可溶性焦磷酸鐵、酮戊二酸、阿拉伯樹膠、活性炭、碳黑、K0H、L-半胱氨酸、萬古霉素、多黏菌素B、放線菌酮。各成分的含量比為酵母10克、ACES10克、瓊脂15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克、L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素1毫升、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克。按如下方法進(jìn)行配制先將酵母粉10克、ACES10克、瓊脂粉15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸l克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克和去離子水1000毫升充分混勻后并標(biāo)定pH為6.9;然后高壓12rC，取出冷卻到約5(TC;加入經(jīng)0.22y濾膜過濾的含L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素l毫克、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克的5毫升液體；再次充分混勻后傾倒平板即可。本發(fā)明解決的技術(shù)問題之二是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的按如下步驟進(jìn)行A、準(zhǔn)備待測(cè)血清采集被檢者的血液1-2毫升；分離血清后，取血清200微升加入1支清潔小試管中，再加入專用稀釋液600微升混勻使成為1/4稀釋的待測(cè)血清；B、進(jìn)一步稀釋血清取清潔稀釋用塑條1條或清潔小試管6支，于塑條上的6個(gè)孔或6個(gè)小試管中，用加液器各加入專用稀釋液200微升；然后再以待測(cè)血清順次于前5孔或管中做對(duì)倍稀釋，棄去最后的200微升稀釋血清，使各孔或管中200微升被檢血清的稀釋度為1/8，1/16，1/32，1/64和1/128;最后l孔(或管)為無血清對(duì)照；C、用裝上1支200微升吸頭的玻璃套管，于1塊清潔的96(V形)孔板中，先加1滴(約25微升)專用稀釋液于對(duì)照排各孔，然后按低稀釋度到高稀釋度的順序，再分別加1滴于相應(yīng)稀釋血清排各孔；D、分別將裝有1支200微升吸頭的染色抗原瓶(7種)搖勻并倒置，于各孔中滴加l滴染色抗原；最后在板上加一塊玻璃蓋并置于36士rC處，第二天取出觀察結(jié)果。如準(zhǔn)備待測(cè)血清步驟中使用3倍稀釋液時(shí)，可取1份稀釋液加2份滅菌蒸餾水或去離子水并混勻。本發(fā)明改進(jìn)的培養(yǎng)基效果如下表軍團(tuán)菌A在改進(jìn)配方GVPC瓊脂(36°C4日)中的生長(zhǎng)情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*LP1Knoxville(ATCC33153)，LP6Chicago2(ATCC33215)**三次實(shí)驗(yàn)的均數(shù)；LP1X2=4.24，LP6X2=3.94P《0.05在本發(fā)明以上工作的基礎(chǔ)上，為填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白，首次研制和初步建立了除分子生物學(xué)以外的幾乎完整并可長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)的軍團(tuán)菌軍團(tuán)病檢驗(yàn)產(chǎn)品；如各種規(guī)格的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基、微量凝集試劑盒、分型診斷血清試劑盒和軍團(tuán)菌尿抗原金標(biāo)條等；并首次根據(jù)市場(chǎng)用戶的不同需要，創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)和制備了《軍團(tuán)菌成套鑒定試驗(yàn)試劑盒》《軍團(tuán)菌環(huán)境水標(biāo)本培養(yǎng)試劑盒》《軍團(tuán)菌病人標(biāo)本培養(yǎng)試劑盒》等。如此可以不僅進(jìn)一步方便了用戶，也提高了工作質(zhì)量。另外，在保證原有效果的前提下，也首次在《軍團(tuán)菌血清學(xué)微量凝集試劑盒》等多種試劑盒的操作方法中，創(chuàng)新性地少用或不用定量吸管或加液槍而大幅簡(jiǎn)化了方法，從而顯著提高效率，有利于方法的進(jìn)一步推廣。特別是《軍團(tuán)菌尿抗原金標(biāo)層析條試劑盒》是當(dāng)前最簡(jiǎn)便、有效、快速因而最有市場(chǎng)前景的軍團(tuán)病診斷產(chǎn)品具體實(shí)施例方式本發(fā)明的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基是在GVPC瓊脂的原配方中加入阿拉伯樹膠和碳黑，以及用自制的ACES取代進(jìn)口ACES，形成新的質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基。新配方和配制方法為酵母粉10克、ACES10克、瓊脂粉15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸l克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克和去離子水1000毫升充分混勻后并標(biāo)定pH為6.9;然后高壓12rC、取出冷卻到約50°C;再加入經(jīng)0.22y濾膜過濾的含L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素1毫克、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克的5毫升液體；再次充分混勻后傾倒平板。新的培養(yǎng)基上軍團(tuán)菌在漆黑的背景下發(fā)育良好，呈微藍(lán)灰色飽滿閃光的菌落，在菌落特色、菌落大小和菌落數(shù)等方面，均明顯優(yōu)于原有配方配制的培養(yǎng)基；這樣就能夠?yàn)榻⑽覈?guó)自己的質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的軍團(tuán)菌系列檢驗(yàn)產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明參照軍團(tuán)菌檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，重點(diǎn)研制了更適合我國(guó)國(guó)情的簡(jiǎn)化微量凝集試驗(yàn)試劑盒；其使用結(jié)果穩(wěn)定，操作方便。該整套的試劑盒主要包括1、軍團(tuán)菌血清學(xué)微量凝集染色抗原A、中套I(嗜肺I-IO，米克戴德，博杰曼)12瓶(每瓶4毫升)B、中套II(嗜肺l-6，米克戴德)7瓶(每瓶4毫升)C、小套(嗜肺1和嗜肺6)2瓶(每瓶4毫升)2、軍團(tuán)菌陽性對(duì)照血清(抗嗜肺l)3、專用稀釋液1-2種，單倍(IX)和3倍(3X)濃度。4、96孔板(V形孔)附玻板蓋。以中套II為例，在使用本發(fā)明的試劑進(jìn)行臨床菌和環(huán)境菌檢測(cè)時(shí)；1、先準(zhǔn)備測(cè)血清采集被檢者的血液l-2毫升。分離血清后，取血清200微升加入l支清潔小試管(自備)中，再加入專用稀釋液600微升混勻(如使用3倍稀釋液時(shí)，可取1份稀釋液加2份滅菌蒸餾水或去離子水并混勻，下同)，使成為1/4稀釋的待測(cè)血清。2、進(jìn)一步稀釋血清取清潔稀釋用塑條1條或清潔小試管6支(自備)，于塑條上的6個(gè)孔或6個(gè)小試管中，用加液器各加入專用稀釋液200微升(根據(jù)實(shí)際需要可增減，下同)；然后再以待測(cè)血清順次于前5孔(或管)中做對(duì)倍稀釋(反復(fù)抽吸4次)，棄去最后的200微升稀釋血清，使各孔(或管)中200微升被檢血清的稀釋度為1/8，1/16，1/32，1/64和1/128。最后1孔(或管)為無血清對(duì)照。3、用裝上1支200微升吸頭的玻璃套管，于1塊清潔的96(V形)孔板中，先加l滴(約25微升)專用稀釋液于對(duì)照排孔，然后按低稀釋度到高稀釋度的順序，再分別加1滴于相應(yīng)稀釋血清排孔。4、分別將裝有1支200微升吸頭的染色抗原瓶(7種)搖勻并倒置，滴加1滴染色抗原。最后在板上加一塊玻璃蓋并置于36士rC處，第二天(16-24小時(shí))取出觀察結(jié)果。判斷結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是(++以上為陽性)++++:藍(lán)色菌細(xì)胞凝集塊鋪于孔底，邊緣清晰；+++:藍(lán)色菌細(xì)胞凝集塊鋪于孔底，邊緣不清晰；++:部分菌細(xì)胞凝集，邊緣不清晰；+:少數(shù)細(xì)菌凝集，中心未凝集的細(xì)菌堆聚形成藍(lán)色較深的小點(diǎn)-全部未凝集，中心呈藍(lán)色小點(diǎn)。以上是對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施例的描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制；凡依前述說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可得之等效技術(shù)方案，皆屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種軍團(tuán)菌培養(yǎng)基，其特征在于主要成分包含有酵母、ACES、瓊脂、可溶性焦磷酸鐵、酮戊二酸、阿拉伯樹膠、活性炭、碳黑、KOH、L-半胱氨酸、萬古霉素、多黏菌素B、放線菌酮。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基，其特征在于各成分的含量比為:酵母10克、ACES10克、瓊脂15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸1克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克、L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素l毫升、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克。3、一種權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基的配制方法，其特征在于按如下方法進(jìn)行配制先將酵母粉10克、ACES10克、瓊脂粉15克、可溶性焦磷酸鐵0.25克、酮戊二酸l克、阿拉伯樹膠3克、活性炭1.5克、碳黑2克、K0H2.8克和去離子水1000毫升充分混勻后并標(biāo)定pH為6.9;然后高壓121'C，取出冷卻到約5(TC;加入經(jīng)0.22u濾膜過濾的含L-半胱氨酸0.4克、萬古霉素1毫克、多黏菌素B8萬單位、放線菌酮80毫克的5毫升液體；再次充分混勻后傾倒平板即可。4、一種利用權(quán)利要求1所述的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)制成的軍團(tuán)菌試劑盒的使用方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行A、準(zhǔn)備待測(cè)血清采集被檢者的血液1-2毫升；分離血清后，取血清200微升加入1支清潔小試管中，再加入專用稀釋液600微升混勻使成為1/4稀釋的待測(cè)血清；B、進(jìn)一步稀釋血清取清潔稀釋用塑條1條或清潔小試管6支，于塑條上的6個(gè)孔或6個(gè)小試管中，用加液器各加入專用稀釋液200微升；然后再以待測(cè)血清順次于前5孔或管中做對(duì)倍稀釋，棄去最后的200微升稀釋血清，使各孔或管中200微升被檢血清的稀釋度為1/8，1/16，1/32，1/64和1/128;最后l孔(或管)為無血清對(duì)照；C、用裝上1支200微升吸頭的玻璃套管，于1塊清潔的96(V形)孔板中，先加l滴(約25微升)專用稀釋液于對(duì)照排各孔，然后按低稀釋度到高稀釋度的順序，再分別加1滴于相應(yīng)稀釋血清排各孔；D、分別將裝有1支200微升吸頭的染色抗原瓶(7種)搖勻并倒置，于各孔中滴加l滴染色抗原；最后在板上加一塊玻璃蓋并置于36士rC處，第二天取出觀察結(jié)果。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用方法，其特征在于如準(zhǔn)備待測(cè)血清步驟中使用3倍稀釋液時(shí)，可取1份稀釋液加2份滅菌蒸餾水或去離子水并混勻。全文摘要本發(fā)明涉及軍團(tuán)菌檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種軍團(tuán)菌培養(yǎng)基及其配制方法、利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)制成的軍團(tuán)菌試劑盒的使用方法。本發(fā)明的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基是在GVPC瓊脂的原配方中加入阿拉伯樹膠和碳黑，形成新的質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的軍團(tuán)菌培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、使用方便、產(chǎn)品成本低廉；可以廣泛使用于軍團(tuán)菌的檢驗(yàn)等方面。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101100650SQ20071002858公開日2008年1月9日申請(qǐng)日期2007年6月15日優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日發(fā)明者陳長(zhǎng)怡申請(qǐng)人:上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司