專利名稱：：一種高山被孢霉及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)花生四烯酸的高山被孢霉及其應(yīng)用。技術(shù)背景花生四烯酸(ArachidonicAcid，簡稱AA，即5,8,11,14-二十碳四烯酸)屬于co-6系列長鏈多不飽和脂肪酸。AA是一種重要的人體必需脂肪酸，是許多二十碳酸衍生物如前列腺素E2(PGE2)、前列環(huán)素(PGl2)、血栓垸A2(TXA2)、白三烯LeukotireneB4(LTB4)和C4(LTQ)的直接前體，這些生物活性物質(zhì)對脂蛋白的代謝、血液流變學(xué)、血管彈性、白細(xì)胞功能和血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用。AA還具有調(diào)節(jié)體內(nèi)多種離子通道作用，維持細(xì)胞膜功能，控制細(xì)胞膜的通透性，維持機體保水性等許多重要的生理功能。同時，AA是構(gòu)成神經(jīng)組織的重要結(jié)構(gòu)脂類，它對嬰幼兒的腦發(fā)育和視力功能至關(guān)重要。它能幫助神經(jīng)系統(tǒng)的信息正常傳遞，增強記憶，對人體視力、大腦功能和協(xié)調(diào)能力起著極為重要的作用。鑒于AA對嬰幼兒生長的重要作用，世界衛(wèi)生組織(WHO)及聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)權(quán)威推薦嬰幼兒每日應(yīng)攝取40毫克AA(以每千克體重計算)，而歐洲和美國已經(jīng)強制要求只有添加AA的嬰兒奶粉方可進入市場進行銷售。AA廣泛存在于動物體中，過去商業(yè)AA主要來源于豬肝和魚油，但含量極低且不穩(wěn)定、開發(fā)費用昂貴，難以滿足社會的需求，特別是奶制品和制藥行業(yè)所需的AA量很大。十年代初期，人們相繼發(fā)現(xiàn)某些絲狀真菌及微藻類含有花生四烯酸。由于微生物具有生長速度快、油脂及AA含量高、發(fā)酵制備工藝比較簡單且不受原料限制等優(yōu)點，利用微生物法生產(chǎn)花生四烯酸成為各國研究的熱點。而篩選得到富含AA的微生物資源是關(guān)鍵。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)花生四烯酸的高山被孢霉。本發(fā)明另一個目的是提供該菌在生產(chǎn)花生四烯酸中的應(yīng)用。一種高山被孢霉(Mo/Y/we//fla/戶/m0，菌株代號為ME-AA01，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCNO:M207067。所述的高山被孢霉，該菌的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基為能提供碳源、氮源的常規(guī)培養(yǎng)基，生長溫度為2528'C。所述培養(yǎng)基中碳源為糖類，其中糖類為葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖中的一種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米漿、牛肉膏中的一種或多種。所述的高山被孢霉，其中所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(每L):土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml。所述的高山被孢霉在生產(chǎn)花生四烯酸中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的高產(chǎn)花生四烯酸的霉菌，菌株代號為ME-AAOl。其形態(tài)為白色菌絲，直徑2-8pm，不產(chǎn)孢子，在PDA培養(yǎng)基28'C培養(yǎng)3天，形成的菌落為圓形，直徑為5cm。經(jīng)鑒定為高山被孢霉(#om'ereWaWpj'/a)。該菌株在038。C均能生長，2528'C為最適生長溫度，但產(chǎn)AA的最適溫度為23°C。在23'C下，搖瓶發(fā)酵67天菌株產(chǎn)生的AA可達最大值。ME-AA01菌株在培養(yǎng)液的pH39范圍內(nèi)均可生長，并產(chǎn)生花生四烯酸。適宜生長及生成AA的pH為5~7。ME-AA01菌株適合液體生長，可以通過發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，具有占用空間小，生產(chǎn)規(guī)模較易控制等特點，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。ME-AA01菌株生命力強，對營養(yǎng)要求簡單，生長范圍寬，生產(chǎn)的菌油AA含量高，且易于提取，具有很好的發(fā)展前景。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)AA的保藏編號為CCTCCNO:M207067的高山被孢霉菌株，利用該菌株進行搖瓶發(fā)酵，AA產(chǎn)量最高可達10g/l，產(chǎn)率高達1.54g/l/d，比目前世界最高水平的日本HigashiyamaK等人報道的菌株MoW/we〃aa/p/朋1S-4(L3gl"d")和韓國HwangBH等人報道的MoW/eW/aa^'"aDSA-12(1.5gl"d")都要高。高山被孢霉ME-AA01菌株的獲得不但為我國AA生產(chǎn)增加一個新品種，更重要的是該菌種可通過液體發(fā)酵罐工業(yè)化生產(chǎn)，因此，該發(fā)明必將對我國的AA工業(yè)產(chǎn)生積極的推動作用。保藏信息本發(fā)明的高山被孢霉Mort/erc//fla/p/"aME-AA01己于2007年5月14日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行了保藏，保藏中心地址為武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼430072。保藏編號為CCTCCNO:M207067。具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例1菌株最佳生長的溫度及pH范圍的測定ME-AA01菌株培養(yǎng)液包含質(zhì)量體積比的下列物質(zhì)葡萄糖6%，酵母膏0.4%，KH2PO40.2%，其余為水。接種量10%。溫度設(shè)為20°C、23°C、、28'C4個梯度，考察溫度時不調(diào)pH。pH值設(shè)3、5、7、94個酸堿度，溫度取25'C。分別在第4天，第5天，第6天，第7天取樣一次，測干重，及用氣質(zhì)聯(lián)用測AA含量，分析最適溫度及pH，以及干重、AA產(chǎn)量達到最大的時間。實驗結(jié)果(見表l)表明ME-AAOl菌株在pH39范圍內(nèi)均可生長，但pH為3時菌體產(chǎn)生的AA量非常少，且生長很差。菌株在pH57生長最好，且AA產(chǎn)量最高。菌株生長最旺盛的溫度為2528'C，但AA產(chǎn)量最高的溫度為23'C。表1ME-AA01菌株在不同pH及不同溫度、不同時間時干重和產(chǎn)AA情況<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2ME-AA01菌株的實驗室培養(yǎng)PDA培養(yǎng)基土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml。121°C滅菌20分鐘，倒入試管制成斜面，冷卻后接入ME-AAOl菌株，28'C培養(yǎng)5天，將菌絲接入搖瓶活化培養(yǎng)。搖瓶活化培養(yǎng)基包含質(zhì)量體積比的下列物質(zhì)葡萄糖3%，酵母膏0.6%，KH2P040.3%，NaN030.3%，MgS04.7H200.05%,其余為水，pH7.0，裝液量250ml的搖瓶裝入50ml的活化培養(yǎng)基，120rpm，25°C，活化3天。再將活化后的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量250ml的搖瓶裝入50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10%v/v，125rpm，23°C，發(fā)酵6.5天。發(fā)酵培養(yǎng)基包含質(zhì)量體積比的下列物質(zhì)葡萄糖8%，酵母膏0.6%，KH2PO40.3%，其余為水，pH7。結(jié)果干重17.8g/l;AA4.2g/l。實施例3利用ME-AAOl菌株進行搖瓶發(fā)酵菌種活化將高山被孢霉菌種ME-AA01接于PDA斜面28'C培養(yǎng)5天。種子活化培養(yǎng)5天的PDA斜面用無菌水洗下菌絲，接入搖瓶活化。搖瓶活化培養(yǎng)基包含質(zhì)量體積比的下列物質(zhì)葡萄糖3%，酵母膏0.6%,KH2P040.3%，NaN030.3%,MgS(V7H200.05%,其余為水，pH7.0，裝液量250ml的搖瓶裝入50ml的活化培養(yǎng)基，120rpm，25°C，活化3天。發(fā)酵培養(yǎng)將活化后的種子接入發(fā)酵搖瓶進行發(fā)酵。裝液量250ml的搖瓶裝入50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10。/。v/v，溫度23。C，pH7.0，轉(zhuǎn)速130rpm,周期6.5天。發(fā)酵培養(yǎng)基包含質(zhì)量體積比的下列物質(zhì)葡萄糖10%、酵母膏1.0%、KH2PO40.3%、NaN030.3%、MgS04'7H200.05%、泛酸鈣0.1%以及微生素C0.02%，其余為水。發(fā)酵結(jié)果干重35.3g/l;AA10g/1。權(quán)利要求1、一種高山被孢霉(Mortierellaalpina)，菌株代號為ME-AA01，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCNOM207067。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高山被孢霉，其特征在于該菌的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基為能提供碳源、氮源的常規(guī)培養(yǎng)基，生長溫度為2528'C。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的高山被孢霉，其特征在于所述培養(yǎng)基中碳源為糖類，其中糖類為葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖中的一種或多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母膏、玉米漿、牛肉膏中的一種或多種。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的高山被孢霉，其特征在于所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。5、權(quán)利要求l所述的高山被孢霉在生產(chǎn)花生四烯酸中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種高山被孢霉及其應(yīng)用。該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNOM207067。利用該菌株進行發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸，產(chǎn)量最高可達10g/l，產(chǎn)率高達1.54g/l/d。該菌株可用于工業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸。文檔編號C12P7/40GK101113410SQ20071002500公開日2008年1月30日申請日期2007年7月9日優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日發(fā)明者任路靜,欣劉,霜李,肖愛華,南胡,金明杰,和黃申請人:南京工業(yè)大學(xué)