專利名稱：核酸配基組芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸配基的生物芯片檢測(cè)技術(shù)，尤K:涉及一種采用配體和配基作用原理，通過固載相關(guān)系列特異性寡核苷酸配 基，并行集成捕捉混合物中靶分子配體，再對(duì)靶分子配體實(shí)施定性和定量檢 測(cè)的核酸配基組芯片；本發(fā)明同時(shí)涉及一種核酸配基組芯片的制備和使用。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)是近年來興起的一項(xiàng)綜合性的高技術(shù)，它以微機(jī)電系統(tǒng)技 術(shù)和生物技術(shù)為依托，將生命科學(xué)研究中的許多不連續(xù)過程(如樣品制備、々-:化反應(yīng)、檢測(cè)等步驟)集成并移植到一塊普通郵票大小的芯片上去，并使 這^分散的過程連續(xù)化、微型化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量生物信息進(jìn)行快速、并行處理.的耍求。1-:物芯片概念的提出受到了計(jì)算機(jī)芯片的啟發(fā)。狹義的生物芯片是指包塊在固相載體(如硅片、玻璃和塑料等)上的高密度DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等 微陣列芯片，如cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列和蛋白質(zhì)微陣列等。這些微 陣列由生物活性物質(zhì)以點(diǎn)陣的形式有序地固定在固相載體上形成。在一定的 條件f進(jìn)行生化反應(yīng)，將反應(yīng)結(jié)果用化學(xué)熒光法、酶標(biāo)法、電化學(xué)法顯示， 然后用專用的生物芯片掃描儀或電子信號(hào)檢測(cè)儀采集數(shù)據(jù)，最后通過專門的 計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。廣義的生物芯片是指任何能對(duì)生物分子進(jìn)行快速 并行處理和分析的微型固體薄型器件。自從1991年福多爾(S.P.A.Fodor)等人提出DNA芯片至今，以DNA 芯片為代表的生物芯片技術(shù)已經(jīng)得到了快速的發(fā)展。生物芯片則是在很小幾 何尺度的表面積上，裝配一種或集成多種生物活性，僅用微量生理或生物采 樣，即可以同時(shí)檢測(cè)和研究不同的生物細(xì)胞、生物分子和DNA的特性，以 及它們之間的相互作用，獲得生命微觀活動(dòng)的規(guī)律。生物芯片可以粗略地分 為細(xì)胞芯片、蛋白質(zhì)芯片(生物分子芯片)和基因芯片(即DNA芯片)等 兒類，都有集成、并行和快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。隨著人類基因工程的發(fā)展，基因芯片(即DNA芯片)得到迅速的發(fā)展。 DNA芯片又稱為寡核苷酸陣列或雜交陣列分析，它是根據(jù)DNA雙螺旋原理 而發(fā)展的核酸鏈間分子雜交的技術(shù)。它的基本結(jié)構(gòu)是在芯片表面能夠制備成 千上萬的基因單元作為配基，對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行篩選。待測(cè)基因通過PCR擴(kuò)增 技術(shù)得到數(shù)量放大，再進(jìn)行熒光標(biāo)記，使其在篩選過程中產(chǎn)生可識(shí)別的熒光 發(fā)射或光譜轉(zhuǎn)移。此熒光信號(hào)被熒光顯微鏡檢出，達(dá)到基因識(shí)別的目的。將 已知的DNA (探針)和未知的核酸序列之間的一方以有序的陣列固定到載玻 片或硅片上，再與熒光標(biāo)記的另一方進(jìn)行雜交。當(dāng)熒光標(biāo)記的--方在DNA 芯片上發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)序列時(shí)即發(fā)生雜交，雜交的結(jié)果以熒光和模式識(shí)別分析來檢 測(cè)。DNA芯片技術(shù)可以快速分析大量的基因信息，從而使生物醫(yī)學(xué)工作者可 以研究并收集基因表達(dá)和變異信息。目前國(guó)內(nèi)外已有公司生產(chǎn)并銷售的DNA 芯片有兩類， 一類是在芯片上原位合成待測(cè)的寡核苷酸，再與熒光標(biāo)記的 DNA探針放在一起，當(dāng)DNA探針雜交到寡核苷酸陣列上后，互補(bǔ)序列通過 熒光掃描確定。該寡核苷酸陣列格式可用于檢測(cè)變異，在基因中定位目標(biāo)區(qū) 域，和基因表達(dá)的研究，以及確定基因功能。另一類DNA芯片利用微量點(diǎn)樣技術(shù)在芯片上制作互補(bǔ)DNA (cDNA) 陣列再與熒光標(biāo)記的DNA探針雜交。cDNA陣列格式用于快速篩選。如位 于Santa Clara CA的Affymetrix公司生產(chǎn)的GeneChip，含高密度的DNA探 針陣列，可以用于人類基因組中遺傳信息的分析。具特殊用途的DNA探針 陣列可以在人類基因組中快速篩選已知的DNA序列。DNA芯片還可用于監(jiān) 測(cè)不同的人體細(xì)胞和組織基因表達(dá)，以檢測(cè)癌癥或其它疾病所對(duì)應(yīng)的基因的 變化。隨著DNA芯片及雜交技術(shù)的發(fā)展，DNA芯片將有可能直接應(yīng)用于臨 床診斷，藥物開發(fā)和人類遺傳診斷。寡核苷酸芯片的主要原理與cDNA芯片類似，主要通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原 則進(jìn)行雜交，來檢測(cè)對(duì)應(yīng)片段是否存在、存在量的多少。它與cDNA芯片的 本質(zhì)差別在于寡聚核苷酸芯片固定的探針為特定的DNA寡聚核苷酸片段(探 針)，而后者為cDNA?；虮磉_(dá)芯片的兩個(gè)重要參數(shù)是檢測(cè)的靈敏度和特異 性。cDNA芯片由于基因長(zhǎng)短不同以至Tm值各異，眾多的基因在同一張芯 片上雜交，使得雜交條件很難同一，使得傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到 限制。寡聚核苷酸芯片序列選擇經(jīng)過優(yōu)化，利用合成的一定長(zhǎng)度(如20， 30， 70-mer等)的寡核苷酸單鏈探針代替全長(zhǎng)cDNA點(diǎn)樣，制成芯片。其優(yōu)點(diǎn) 無需擴(kuò)增，防止擴(kuò)增失敗影響實(shí)驗(yàn)；減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序 列的基因；雜交溫度均一，提高雜交效率；減少二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，寡核苷酸芯片還可以通過原位合成法制備，而cDNA芯片只能通過后者制備。上述特 點(diǎn)使得寡核苷酸芯片的應(yīng)用日益廣泛。但是當(dāng)寡核苷酸序列較短時(shí)，單一的 序列不足以代表整個(gè)基因，需要用多段序列。蛋白質(zhì)芯片的發(fā)展已經(jīng)經(jīng)歷了約十年的時(shí)間，現(xiàn)己出現(xiàn)了相對(duì)成熟的技 術(shù)，如瑞典的BIACORE的單元芯片，中科院力學(xué)所的多元蛋白質(zhì)光學(xué)芯片 和美國(guó)的SELDI質(zhì)譜芯片等。它們的共同特點(diǎn)都是將生物分子(蛋白和DNA)作為配基，固定在固體芯片表面或表面微單元上，以單一、或面陣、或序列 式。利用生物分子間的特異結(jié)合的自然屬性，待測(cè)分子與配基分子在芯片表 面會(huì)形成生物分子復(fù)合物。然后，檢測(cè)此復(fù)合物的存在與否，達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì) 的探測(cè)、識(shí)別和純化的目的。以上不同技術(shù)的差異僅在探測(cè)方法的不同。 BIACORE技術(shù)利用表面等離子體共振技術(shù)檢測(cè)芯片，進(jìn)行單一蛋白質(zhì)檢測(cè)； 多元蛋白質(zhì)光學(xué)芯片是光學(xué)成象法，可以同時(shí)檢測(cè)多種混合的蛋白質(zhì)；SELDI 技術(shù)則采用質(zhì)譜法，以時(shí)間順序檢測(cè)序列蛋白質(zhì)。指數(shù)級(jí)富集的配基進(jìn)化體系(SELEX技術(shù))是在九十年代初發(fā)展起來的 一種新的組合化學(xué)技術(shù)。它是應(yīng)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)，并結(jié)合PCR體 外擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過幾輪或數(shù)十輪 篩選過程，獲得高親和力、高特異性的核酸配基(aptamer)。它適應(yīng)近代分 子生物學(xué)大規(guī)模、快速、系統(tǒng)篩選的要求，具有較多的優(yōu)點(diǎn)，如庫(kù)容量大、 篩選周期短、適用靶分子范圍廣、篩選的配基與靶分子親和力強(qiáng)，特異性高 等。自1990年Ellington和Gold.首先利用此技術(shù)成功的篩選出有機(jī)染料分子 和噬菌體T4DNA聚合酶的特異配基以來，SELEX技術(shù)得到了迅猛發(fā)展。應(yīng) 用SELEX技術(shù)篩選的靶分子已從開始的一些核酸結(jié)合蛋白如DNA聚合酶、 HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶等，擴(kuò)展到非核酸結(jié)合蛋白如細(xì)胞生長(zhǎng)因子、激素、小肽、 抗體以及ATP、氨基酸等小分子有機(jī)物(如ATP)，甚至金屬離子、糖、有 機(jī)染料，以及完整的細(xì)胞、病毒、孢子等。另外，消減SELEX (subtractive SELEX)可將與兩個(gè)復(fù)合耙中非目的相同靶分子作用的寡核苷酸先行去除， 提高篩選效率，迅速獲得特異適配子的優(yōu)勢(shì)。因此，與其他文庫(kù)篩選技術(shù)相 比，SELEX技術(shù)適應(yīng)范圍更加廣泛。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種利用特異性寡核苷酸配基組結(jié)合配體，對(duì)大量生 物信息進(jìn)行快速、并行集成處理的核酸配基組芯片。
本發(fā)明的另一 目的是提供該核酸配基組芯片的制備方法。 本發(fā)明還有一個(gè)目的，即提供一種利用上述核酸配基組芯片檢測(cè)配體的 方法。木發(fā)明的核酸配基組芯片，是將靶物質(zhì)特異性寡核苷酸配基組集成固定 在載休上制成配基組芯片；其中靶物質(zhì)特異性的寡核苷酸配基組是利用指數(shù) 級(jí)富集的酉己-基進(jìn)化系統(tǒng)(the systematic evolution of ligands by exponential enrichment,簡(jiǎn)寫SELEX)篩選獲得的靶物質(zhì)特異性的寡核苷酸捕捉配基組。 所述寡核苷酸捕捉配基的一端帶有可連接固化配基的活化基團(tuán)，該活化基團(tuán) 通過包被在載體上的鏈霉親和素固定在載體上。所述靶物質(zhì)特異性的寡核苷酸捕捉配基為一段20-40個(gè)堿基的寡核苷酸 片段，其--端帶有固著基團(tuán)，如生物素等，并通過與鏈霉親和素固定在載體 上；另--端形成捕捉配體的配基結(jié)構(gòu)。所述特異寡核苷酸捕捉配基可以為能與配體直接結(jié)合的單鏈DNA。如 ssDNA、 dsDNA或RNA;靶物質(zhì)特異性配體可以是核酸、蛋白質(zhì)、多肽、 有機(jī)染料、ATP、金屬離子類的任何分子。所述載體為硝酸纖維素濾膜、玻片或磁球等。載體可根據(jù)芯片的不同用 途選擇。本發(fā)明核酸配基組芯片的制備方法，是由以下工藝步驟完成① 利用SELEX技術(shù)篩選相關(guān)配體的特異性寡核苷酸配基；② 在載體上包被鏈霉親和素，用封閉液封閉；其中述載體可采用硝酸纖 維素濾膜、玻片或磁球等；封閉液可采用含5%牛血清白蛋白、奶粉PBS等 封閉液。③ 將載體與末端帶有生物素的不同種類和數(shù)量的配基在37'C下共同孵 育30分鐘，然后用洗滌液洗滌三次，洗滌三次，3min/次，即制備成核酸配 基組芯片。其中洗滌液可采用SHCMK(PH7.35)+0.05°/。Tween20。本發(fā)明利用核酸配基組芯片檢測(cè)配體的方法，利用特異寡核苷酸配基組 結(jié)合配體的原理，對(duì)相關(guān)配體的系列標(biāo)志靶分子信息進(jìn)行快速、并行集成處 理，包括①制備檢測(cè)配體將檢測(cè)液與核酸配基組芯片在37'C下共同孵育30分 鐘，用洗漆液洗滌三次，3min/次，然后用洗脫緩沖溶液洗脫下配體，即制備 出配體混合液。洗滌液可采用SHCMK(PH7.35)+0.05%Tween20;所述洗脫 緩沖溶液為SHCMK (PH 7.35) +0. 5%Tween 20。②檢測(cè)將釆集制備的配體混合液用特異序列質(zhì)譜分析鑒定；或用信標(biāo) 配基PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)；或采用激光解析蛋白圖譜進(jìn)行分析。本發(fā)明還可以利用BIACORE技術(shù)，通過核酸配基組芯片進(jìn)行單一蛋白 質(zhì)檢測(cè)；還可用SELDI技術(shù)，以時(shí)間順序檢測(cè)芯片上序列配體的質(zhì)量和數(shù)量。本發(fā)明的特異寡核苷酸配基組是通過SELEX技術(shù)針對(duì)配體篩選出的一 端帶有生物素的一段20-40個(gè)堿基的寡核苷酸片段，可通過與鏈霉親和素固 定在載體上，形成配基組的結(jié)構(gòu)，可捕捉配體。在特異寡核苷酸配基組芯片 中加入檢測(cè)樣品，經(jīng)孵育，使配基捕捉被檢測(cè)配體；再將捕捉的被檢測(cè)配體 用洗脫液洗下來，即并行完成多種配體的集成采集。將采集的配體用特異序 列質(zhì)譜(S叫uence-specific MS/MS)分析鑒定，使配體得到定性和定量檢測(cè)。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、 本發(fā)明的核酸配基組芯片，是利用固載的特異性寡核苷酸配基組對(duì)目 標(biāo)靶物質(zhì)某一特性的所有標(biāo)志性配體實(shí)施集成捕捉，聚集，并通過相關(guān)的檢 測(cè)技術(shù)，完成對(duì)耙物質(zhì)總體性能實(shí)施全面動(dòng)態(tài)檢測(cè)監(jiān)控。2、 本發(fā)明的核酸配基芯片應(yīng)用范圍廣該芯片可識(shí)別的配體范圍，包 括蛋白、酶、非核酸結(jié)合蛋白如細(xì)胞生長(zhǎng)因子、激素、小肽、抗體以及ATP、 氨基酸等小分子有機(jī)物(如ATP)，甚至金屬離子、糖、有機(jī)染料，以及完 整的細(xì)胞、病毒、孢子等。3、 本發(fā)明的核酸配基芯片可重復(fù)使用由于本發(fā)明的配基和配體是非 共價(jià)結(jié)合(是以特異性結(jié)合捕捉集成靶物質(zhì)的方式結(jié)合)，當(dāng)配體從配基和配 體復(fù)合物中分離后，可對(duì)配基重新復(fù)性再次使用。4、 本發(fā)明核酸配基芯片的檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、微量、多樣定性和 定量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，便于多種類、多分子、多靶系統(tǒng)檢測(cè)研究等。5、 本發(fā)明的配基組成靈活適應(yīng)性廣核酸配基芯片利用SELEX技術(shù)篩 選獲得的特異寡核苷酸配基制作而成，核酸配基芯片可針對(duì)不同的目的設(shè)立 配基組，可對(duì)多種類靶分子快速、并行處理。
圖1為5'生物素化的捕捉配基 圖2為配基檢測(cè)機(jī)理圖3為核酸配基芯片和質(zhì)譜聯(lián)用同時(shí)檢測(cè)四種配體的機(jī)理(1 ) peptide from HIV-1 Rev; (2) NS3 protease protein; (3) TAR RNA element of HIV-1; (4) MS2 coat protein為四種捕捉配基固定在載體上，制成 微陣芯片。通過該芯片捕捉集成樣品中的配體，再利用檢測(cè)技術(shù)，如質(zhì)譜; 信標(biāo)配基等方法，對(duì)配體進(jìn)行定性定量。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一酶標(biāo)板核酸配基芯片的制備和檢測(cè)腫瘤的方法第一步制備生物素配基利用SELEX技術(shù)篩選腫瘤標(biāo)志物特異性寡 核苷酸配基，該特異性的寡核苷酸的一端帶有高親合性寡核苷酸配的生物素， 具體如下1 ) peptide from HIV國(guó)l Rev，生物素-5，- GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCC AGUGUGCIJGGAAUUCGGGUCGUUCUUG - 3: 2) NS3 protease protein,生物素-5, GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGU ACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG -3，； 3 ) TAR RNA element of HIV-1 ，生物素-5， - CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAU ACUCGUAGAUACUCGCCGGQ誦3，； 4) MS2 coat protein,生物素-5'GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCACTTCAGGACCAGCGGGTAC GTGGTCAA TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT扁3，。第二歩選擇酶標(biāo)板為載體，并在酶標(biāo)板上包被鏈霉親和素，然后用白 蛋白封閉液封閉酶標(biāo)板。第三步將酶標(biāo)板與上述末端帶有生物素的腫瘤標(biāo)志物特異性寡核苷酸 配基在37。C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，即制備成酶標(biāo)板核酸 配基芯片。第四步制備檢測(cè)配體將檢測(cè)液與上述制備的配基芯片在37'C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，用洗脫緩沖溶液洗脫下配體，即制備出配體混合液。第五步檢測(cè)將上述采集制備的配體混合液用特異序列質(zhì)譜(Sequence-specific MS/MS)分析鑒定，使配體得到定性和定量檢測(cè)。實(shí)施例二磁珠核酸配基芯片的制備和檢測(cè)腫瘤的方法
第一步制備生物素配基禾!J用SELEX技術(shù)篩選腫瘤標(biāo)志物特異性寡 核苷酸配基，該特異性的寡核苷酸的一端帶有高親合性寡核苷酸配的生物素， 具體如下1) peptide from HIV誦1 Rev， 生物素-5，-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCC AGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUG- 3;2) NS3 protease protein,生物素-5， _ GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGU ACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG -3，；3) TAR RNA element of fflV-l，生物素-5， - CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAU ACUCGUAGAUACUCGCCGGG -3，；4) MS2 coat protein, 生物素國(guó)5，GGGAATGGATCCACATCTACGAATTCACTTCAGGACCAGCGGGTAC GTGGTCAA TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT-3，。第二步選擇磁珠為載體，在磁珠上包被鏈霉親和素，并用白蛋白封閉 液封閉磁珠。第三步將包被的磁珠與上述末端帶有生物素的腫瘤標(biāo)志物特異性寡核苷酸配基在37。C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，即制備成磁珠核 酸配基芯片。 一種磁珠可以連接一種配基，配基組芯片可以是由不同種配基 磁珠組組成。第四步制備檢測(cè)配體，將檢測(cè)液與上述制備的配基芯片在37'C下共同 孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，用洗脫緩沖溶液洗脫下配體，即制備出配 體混合液。第五步檢測(cè)，將上述采集制備的配體混合液用特異序列質(zhì)譜(S叫uence-spedfic MS/MS)分析鑒定，使配體得到定性和定量檢測(cè)。實(shí)施例三玻片式核酸配基芯片的制備和檢測(cè)腫瘤的方法第一步制備生物素配基利用SELEX技術(shù)篩選腫瘤標(biāo)志物特異性寡 核苷酸配基，該特異性的寡核苷酸的一端帶有高親合性寡核苷酸配的生物素， 具體如下1) peptide from HIV-1 Rev，
生物素-5，-GCUUGGUACCGAGCUCGGAUCCACGUAGUAACGGGCCGCC AGUGUGCUGGAAUUCGGGUCGUUCUUG- 3; 2 ) NS3 protease protein,生物素-5， - GGGAACUCGAUGAAGCGAAUUCUGUGUAUCCUGUACGCAAGU ACUAGCCAUACAGGCCUAUCUAUCGGAUCCACG -3，；3) TAR RNA element of fflV-l，生物素-5， - CCCGAGCCAGCAUAGCUACGCUAUGGCGUCCCAGACCCAU ACUCGUAGAUACUCGCCGGG -3，；4) MS2 coat protein,生物素-5 ，GGGAATGGATCCACATCTACGAATTC ACTTCAGGACCAGCGGGTAC GTGGTCAA TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT-3，。 第二步選擇玻片為載體，在玻片上包被鏈霉親和素，并用白蛋白封閉 液封閉玻片。第三步將玻片與上述末端帶有生物素的上述末端帶有生物素的腫瘤標(biāo)志物特異性寡核苷酸配基在37'C下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌三次，即制備成玻片核酸配基芯片。第四步制備檢測(cè)配體將檢測(cè)液與上述制備的配基芯片在37'C下共同孵冑'30分鐘，用洗滌液洗滌三次，用洗脫緩沖溶液洗脫下配體，即制備出配休混合液。第五步檢測(cè)將上述制備采集的配體混合液甩特異序列質(zhì)譜(Sequence-specific MS/MS)分析鑒定，使配體得到定性和定量檢測(cè)。
權(quán)利要求
1、一種核酸配基組芯片，其特征在于是將靶物質(zhì)特異性寡核苷酸配基組集成固定在載體上制成配基組芯片；其中靶物質(zhì)特異性的寡核苷酸配基組是由SELEX技術(shù)篩選獲得的靶物質(zhì)特異性的寡核苷酸捕捉配基組；所述寡核苷酸捕捉配基的一端帶有可連接固化配基的活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)通過包被在載體上的鏈霉親和素固定在載體上。
2、 如權(quán)利要求1所述核酸配基組芯片，其特征在于所述靶物質(zhì)特異 性的寡核苷酸捕捉配基為一段20-40個(gè)堿基的寡核苷酸片段，其一端帶有生 物素，并通過鏈霉親和素固定在載體上；另一端形成捕捉配體的配基結(jié)構(gòu)。
3、 如權(quán)利要求1所述核酸配基組芯片，其特征在于所述特異寡核苷酸 捕捉配基為能與配體直接結(jié)合的單鏈DNA或RNA。
4、 如權(quán)利要求1所述核酸配基組芯片，其特征在于所述載體為硝酸纖 維素濾膜、玻片或磁球。
5、 -種核酸配基組芯片的制備方法，是由以下工藝步驟完成① 利用SELEX技術(shù)篩選相關(guān)配體的特異性寡核苷酸配基；② 在載體上包被鏈霉親和素，用封閉液封閉；③ 將載體與末端帶有生物素的不同種類和數(shù)量的配基在37'C下共同孵 俘30分鐘，然后用洗滌液洗滌三次，3min/次，即制備成核酸配基組芯片。
6、 如權(quán)利要求1所述核酸配基組芯片的制備方法，其特征在于步驟① 所述的封閉液為含5X牛血清白蛋白或奶粉PBS封閉液。
7、 如權(quán)利要求1所述核酸配基組芯片的制備方法，其特征在于步驟③ 所述的洗滌液為含0.5% Tween-20的SHCMK (PH 7.35)結(jié)合液。
8、 如權(quán)利要求1所述核酸配基組芯片的制備方法，其特征在于所述載 體為硝酸纖維素濾膜、玻片或磁球。
9、 -種利用核酸配基組芯片檢測(cè)配體的方法，是由以下工藝步驟完成① 制備檢測(cè)配體將檢測(cè)液與配基芯片在37'C下共同孵育30分鐘，用 洗滌液洗滌:三次，3min/次；然后用洗脫緩沖溶液洗脫下配體，即制備出配體 混合液。② 檢測(cè)將采集制備的配體混合液用特異序列質(zhì)譜分析鑒定；或采用信 標(biāo)配基PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)；或采用激光解析蛋白圖譜進(jìn)行分析。
10、如權(quán)利要求9所述利用核酸配基組芯片檢測(cè)配體的方法，其特征在 于步驟①所述的洗滌液為SHCMK(PH7.35)+0.05%Tween20;所述洗脫緩 沖溶液為SHCMK (PH 7.35) +0. 5%Tween 20。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種核酸配基組芯片及核酸配基組芯片的制備和檢測(cè)配體的方法。本發(fā)明的特異寡核苷酸配基組是通過SELEX技術(shù)針對(duì)配體篩選出的一段20-40個(gè)堿基的寡核苷酸片段，其一端帶有生物素等可連接固化配基的活化基團(tuán)，通過與鏈霉親和素固定在載體上，形成配基組的結(jié)構(gòu)，可捕捉配體。在特異寡核苷酸配基組芯片上加入檢測(cè)樣品，經(jīng)孵育，使配基捕捉被檢測(cè)配體，然后將捕捉的被檢測(cè)配體用洗脫液洗下來，即并行完成多種配體的集成采集；采集的配體用特異序列質(zhì)譜(Sequence-specific MS/MS)分析鑒定，使配體得到定性和定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101130814SQ20071001865
公開日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2007年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日
發(fā)明者廖世奇, 王云普 申請(qǐng)人:西北師范大學(xué);甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院;蘭州普利生物技術(shù)開發(fā)有限公司