Rho蛋白質(zhì)檢測的制作方法

專利名稱：Rho蛋白質(zhì)檢測的制作方法
專利說明Rho蛋白質(zhì)檢測 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明部分地涉及活化Rho蛋白質(zhì)的檢測方法。

背景技術(shù)：
Rho GTP酶是Ras超家族的一類結(jié)構(gòu)和功能獨(dú)特的GTP酶(Wennerberget al.，2005，J.Cell Sci.，118843-846；Takai et al.，2001，Physiol.Rev.，81153-208)。它們參與多種多樣的細(xì)胞功能，包括調(diào)節(jié)肌動蛋白和微管蛋白動力學(xué)、細(xì)胞極性、膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和轉(zhuǎn)錄因子活性(Ridley et al.，1992，Cell，70389-399；Braga et al.，1997，J.Cell Biol.，1371421-1431；和Coso et al.，1995，Cell，811137-1146)。然而，該家族中一些成員(如RhoBTB1，RhoBTB2和RhoH)似乎與經(jīng)典的成員，例如RhoA、Rac1和Cdc42，在功能上關(guān)系并不緊密(Aspenstrom et al.，2004，Biochem J.，377327-337)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)，通過序列同源性來界定Ras超家族GTP酶中的Rho GTP酶是最為明確的。
若對超過150個哺乳動物Ras超家族成員的全部GTP酶功能區(qū)進(jìn)行比對并根據(jù)比對結(jié)果分類形成系統(tǒng)樹，20個Rho蛋白質(zhì)構(gòu)成Ras超家族樹的一個單獨(dú)的分支(Wennerberg et al.，2005，J.Cell Sci.，118843-846)。Rho蛋白質(zhì)在GTP酶域內(nèi)的整體同源性將它們與Ras超家族的其他成員區(qū)分開來。Rho蛋白質(zhì)在GTP酶內(nèi)共有40-95％的同源性，與其他的Ras超家族GTP酶具有30％或更低的同源性。此外，Rho蛋白具有一個這種小GTP酶類的GTP酶特有的基序。該基序稱作Rho插入域(Rho insert domain)，位于小GTP酶域第5β折疊鏈和第4α螺旋之間(Zong et al.，2001，Mol.Cell Biol.，215287-5298)。
因此，如果一種小G蛋白在與其他Ras超家族蛋白進(jìn)行比對時落在Rho分支內(nèi)(例如該蛋白質(zhì)與其他Rho蛋白具有至少40％的同源性)，并含有Rho插入域，則認(rèn)為該小G蛋白是Rho家族蛋白。
已知Rho GTP酶參與許多致病過程——例如轉(zhuǎn)移性侵襲、細(xì)菌和病毒感染和高血壓——的進(jìn)展(Symons，1995，Curr.Op.Biotech.，6668-674；Chenet al.，1996，Science，2742115-2118；和Uehata et al.，1997，Nature，389990-994)。由于它們在基本細(xì)胞功能和致病過程中的多種作用，因此開發(fā)可允許研究人員分析細(xì)胞中Rho GTP酶活性的測定方法吸引了人們大量的興趣。而且，人們在開發(fā)適合于靶向Rho GTP酶或Rho GTP酶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥物發(fā)現(xiàn)高通量篩選的測定方法以及適合于診斷應(yīng)用的測定方法方面投入了很大的興趣。
由Rho GTP酶介導(dǎo)的細(xì)胞活動依賴于GTP酶的活化狀態(tài)。當(dāng)GTP與Rho GTP酶結(jié)合時，它們處于活化狀態(tài)，并且能夠結(jié)合效應(yīng)物并傳遞信號級聯(lián)，引起特定的細(xì)胞響應(yīng)。當(dāng)GDP與Rho GTP酶結(jié)合時，Rho蛋白處于非活化狀態(tài)(Takai et al.，2001，Physiol.Rev.，81153-208)。已經(jīng)開發(fā)出了數(shù)種用于監(jiān)視Rho GTP酶活化狀態(tài)的測定方法。
有一種測定方法稱為Rho效應(yīng)物沉降(pull down)測定法，它最初由Ren等開發(fā)用于RhoA GTP酶(1999，EMBO J.，18578-585)，和由Benard等開發(fā)用于Rac1/Cdc42 GTP酶(1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)，是一種經(jīng)典的、最廣泛使用的測定方法。該方法包括通過結(jié)合在珠子上的效應(yīng)物捕獲活化的Rho GTP酶蛋白質(zhì)，從珠子釋放GTP酶蛋白質(zhì)，分離珠子和釋放GTP酶蛋白質(zhì)，隨后進(jìn)行SDS-PAGE，并通過western印跡對GTP酶蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。該測定方法的重復(fù)性差，因?yàn)樵跍y定執(zhí)行過程中需要多重操作處理，并且靈敏度較低。它也不適合于高通量應(yīng)用(Teusch et al.，2006，Assay and Drug Devel.，4133)。
還有幾種基于細(xì)胞的測定方法，其使用熒光生物探針(bio-probes)檢測活化的Rho GTP酶(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)。此類測定方法中有幾個版本是依靠報道系統(tǒng)監(jiān)視體內(nèi)Rho GTP酶的活化。因此，這些基于細(xì)胞的測定方法并不監(jiān)視GTP酶的實(shí)際內(nèi)源水平(Itoh et al.，2002，Mol.Cell Biol.，226582-6591；Pertz et al.，2006，Nature，4401069-1072；和Vadim et al.，2000，Science，290333-337)?；诩?xì)胞的測定方法的其他版本使用與環(huán)境染料(environmental dye)直接連接的效應(yīng)物域監(jiān)視體內(nèi)內(nèi)源GTP酶的活化。因?yàn)樵谌魏翁囟ㄌ结樕喜贾铆h(huán)保染料都需要大量的分析，而且特定的效應(yīng)物可能不適合于與染料連接，所以任何特定效應(yīng)物的有效性都是不能預(yù)測的(Nalbant et al.，2004，Science，3051615-1619)。而且，因?yàn)樵隗w內(nèi)使用直接效應(yīng)物檢測導(dǎo)致往往識別多于一種GTP酶的探針，所以在這些測定方法中，特異性是一個問題。這類測定方法的另一個問題是外源效應(yīng)物的引入實(shí)際上會改變Rho GTP酶的活化水平，該問題產(chǎn)生了一種在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性的測定方法(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)。
熒光生物傳感器探針也已用于體外測定，但它們的靈敏度非常低。而且，染料會對環(huán)境變化作出響應(yīng)，這也為藥物篩選應(yīng)用帶來了問題(Hahn etal.，美國專利申請6,951,947B2)。
有人報道了一種用于基于酶的Rho活化檢測方法(Chen et al.，2003，J.Biol.Chem.，2782807)。該測定方法利用GST-效應(yīng)物-GBD來親和沉淀活性GTP-Rho。GTP在偶聯(lián)的酶測定中被洗脫并轉(zhuǎn)變成ATP。然后通過螢火蟲熒光素酶法測量ATP。這種測定方法高度依賴于GST沉降測定，因此具有與該測定法相關(guān)的大多數(shù)缺點(diǎn)。而且，因?yàn)樵谶@種方法中不涉及Rho特異的抗體，所以該測定法的特異性有限。
還報道了一種自動化的基于細(xì)胞的Rho活化測定方法(Teusch et al.，2006，Assay and Drug Devel.，4133)。這種測定方法是被開發(fā)用來代替GST沉降測定的，因?yàn)楹笳卟贿m于高通量篩選且重復(fù)性差。該測定法基于Rho調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的能力。因?yàn)榧拥鞍准?xì)胞骨架受多種信號途徑的調(diào)節(jié)，所以這種測定方法的特異性非常有限。
因此，需要有一種簡單、對特定GTP酶蛋白特異、可重復(fù)、靈敏且適合于高通量篩選應(yīng)用的Rho GTP酶活化測定方法。本發(fā)明即是為了這一需要以及其他的方面提供的。
發(fā)明概要 本發(fā)明涉及用于檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過1)使固體支持物與包含活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸，其中固體支持物與活化Rho GTP酶結(jié)合肽連接，并且其中樣品中的活化Rho GTP酶與活化Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合；和2)檢測樣品中活化的Rho GTP酶蛋白質(zhì)，其中在檢測期間活化的Rho GTP酶蛋白質(zhì)保持與固體支持物聯(lián)結(jié)(remainsassociated with the solid support)。在一些實(shí)施方案中，固體支持物是微量滴定板或微陣列。
在一些實(shí)施方案中，該樣品包括含有內(nèi)源活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物。在一些實(shí)施方案中，該樣品包含少于50μg的總蛋白。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞裂解物是從少于105個細(xì)胞制備的。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞裂解物未被澄清。在一些實(shí)施方案中，該樣品包含外源GTP、GDP或GTPγS。
在一些實(shí)施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之前，添加抗原提呈緩沖劑(Antigen Presenting Buffer)。該抗原提呈緩沖劑包括一種或多種能夠減少活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)自固體支持物的損失的化合物或處理。在一些實(shí)施方案中，抗原提呈緩沖劑包括熱變性、尿素處理、戊二醛、乙醇或三氯乙酸，或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，三氯乙酸的最終濃度為大約0.5％至大約15％v/v。
在一些實(shí)施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之前，添加結(jié)合緩沖劑(Binding Buffer)。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合緩沖劑包括水溶性聚蔗糖(ficoll)、葡聚糖或聚乙二醇，或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，該聚乙二醇是PEG 4000或PEG 8000，其終濃度為大約2％至大約40％v/v。
在一些實(shí)施方案中，使用對一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)特異的抗體來檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)是組成型活性突變體。在一些實(shí)施方案中，活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)是RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、或RhoBTB2。
在一些實(shí)施方案中，活化Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合一種或多種活化RhoGTP酶蛋白質(zhì)，且其對活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的親和力是對非活化形式的Rho GTP酶蛋白質(zhì)的親和力的至少2倍高(at least 2 fold higher)。在一些實(shí)施方案中，活化Rho GTP酶結(jié)合肽是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH、WASP或Dia1，或它們的突變體或多聚體。在一些實(shí)施方案中，活化Rho GTP酶結(jié)合肽共價或非共價地連接于固體支持物。在一些實(shí)施方案中，共價連接是二硫鍵連接，非共價連接是GST連接。在一些實(shí)施方案中，活化RhoGTP酶結(jié)合肽是凍干的。
在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對與活化Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量。在一些實(shí)施方案中，使用對一種或多種Rho GTP酶蛋白質(zhì)特異的抗體對活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量。
在一些實(shí)施方案中，活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的檢測是利用吸光度、發(fā)光或熒光來檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽之間的相互作用而進(jìn)行的。
在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使樣品與測試劑接觸，并確定測試劑是否調(diào)節(jié)活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽之間的相互作用。
附圖簡述

圖1A描繪了重組效應(yīng)物-GBD肽的考馬斯染色SDS凝膠。圖1B描繪了野生型和修飾Rho靶蛋白-Cys-GBD的DNA和氨基酸序列。圖1C描繪了選擇性結(jié)合活化RhoA的修飾Rho靶蛋白-Cys的Western印跡分析。
圖2A描繪了使用ROCK板通過發(fā)光測定法檢測活性RhoA所檢測到的RhoA信號。圖2B描繪了使用POSH板通過490nm吸光度檢測活性Rac1所檢測到的Rac1信號。圖2C描繪了使用WASP板通過490nm吸光度檢測活性Cdc42所檢測到的Cdc42信號。
圖3A描繪了用ROCK-GBD馬來酰亞胺板通過發(fā)光測定法檢測到的RhoA信號。圖3B描繪了用POSH-GBD馬來酰亞胺板通過490nm吸光度檢測到的Rac1信號。
圖4描繪的是使用抗RhoA抗體的Western印跡，顯示抗體溫育期間G-LISAGTP酶信號的損失。
圖5A描繪的是顯示用于RhoA G-LISA抗原提呈緩沖劑的開發(fā)的發(fā)光檢測(白色條形顯示GDP信號，灰色條形顯示GTPγS信號)。圖5B描繪的是通過490nm吸光度檢測的Rac1信號，顯示TCA在Rac1POSH G-LISA中作為抗原提呈緩沖劑。
圖6A描繪了通過490nm吸光度檢測的RhoA信號，顯示在結(jié)合緩沖劑的存在下活性RhoA的穩(wěn)定性(SS是血清饑餓樣品--白色條形；鈣蛋白酶抑制劑(Calpeptin)標(biāo)記的RhoA誘導(dǎo)的樣品--灰色條形)。圖6B描繪了通過490nm吸光度檢測到的活性RhoA信號，顯示在結(jié)合緩沖劑的存在下增強(qiáng)的RhoA信號(SS是血清饑餓樣品--白色條形；鈣蛋白酶抑制劑標(biāo)記的RhoA誘導(dǎo)的樣品--灰色條形)。圖6C描繪了通過490nm吸光度檢測到的Rac1信號，顯示結(jié)合緩沖劑對Rac1信號的影響(SS是血清饑餓樣品--白色條形；EGF標(biāo)記的RhoA誘導(dǎo)的樣品--灰色條形)。
圖7A描繪的是用于G-LISA開發(fā)的RhoA及RhoA，B，C單克隆抗體的篩選策略和Western分級。圖7B描繪了圖7A所示單克隆抗體G-LISA篩選的原始數(shù)據(jù)。
圖8描繪了用未澄清的細(xì)胞裂解物在ROCK馬來酰亞胺板上進(jìn)行RhoAG-LISA測定的發(fā)光。
圖9描繪了在G-LISA測定中用非共價效應(yīng)物-GBD板通過490nm吸光度檢測的Rac1信號。
圖10描繪了RhoA G-LISA中細(xì)胞裂解物的滴定，以及GST-Rho靶蛋白-RBD沉降測定的Western印跡結(jié)果。
圖11描繪了G-LISA中組成型活化RhoA滴定的吸光度檢測結(jié)果。
圖12描繪了針對Rac1的沉降測定和G-LISA測定的直接比較。
圖13A描繪了被表皮生長因子(EGF)體內(nèi)活化的Rac1的G-LISA分析。圖13B描繪了被EGF體內(nèi)活化的Cdc42的G-LISA分析。圖13C描繪了利用G-LISA測定的轉(zhuǎn)染分析。
圖14描繪了對凍干的效應(yīng)物-GBD板的延長保存期研究。
圖15描繪了POSH-GBD板在藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中的使用。
實(shí)施方案描述 本發(fā)明提供了一種Rho GTP酶活化測定方法，該方法簡單、對特定GTP酶蛋白質(zhì)具有特異性、可重復(fù)、靈敏、并且適合于與傳統(tǒng)的沉降測定方法相比具有多種優(yōu)勢的高通量篩選應(yīng)用。
如本文所使用的，術(shù)語“大約”是指被修飾的值的大約±5％的范圍。例如，短語“大約10”表示9.5-10.5的范圍。
如本文所使用的，術(shù)語“片段”在指蛋白質(zhì)時，是指小于整體的肽或多肽。在一些實(shí)施方案中，片段包含至少5個、至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、大約5-大約100個、大約5-大約50個、大約5-大約25個、大約100-大約200個、5-100個、5-50個、5-25個、100-200個、不超過200個、不超過100個、不超過75個、不超過50個、或者不超過25個氨基酸殘基?！捌巍边€可稱為蛋白質(zhì)的“部分”。
如本文所使用的，術(shù)語“樣品”是指包含Rho GTP酶蛋白質(zhì)(活化的和/或非活化的)和/或Rho GTP酶結(jié)合肽的組合物。樣品的實(shí)例包括，但不僅限于，血液、細(xì)胞、細(xì)胞裂解物等。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞裂解物被澄清或未被澄清。在一些實(shí)施方案中，樣品包含外源的GTP、GDP或GTPγS。
如本文所使用的，術(shù)語“澄清的”(clarified)是指樣品被清潔(clear)、縮減(reduced)或過濾(filtered)以除去在裂解細(xì)胞時產(chǎn)生的不溶解性物質(zhì)。任何方法均可用于澄清細(xì)胞裂解物，包括但不僅限于，離心、過濾等。
如本文所使用的，短語“Rho GTP酶蛋白質(zhì)”(也稱作“Rho亞家族蛋白質(zhì)”)包括活性蛋白質(zhì)和非活性蛋白質(zhì)二者。當(dāng)GTP與Rho GTP酶蛋白質(zhì)相結(jié)合時，它們處于活性狀態(tài)，能夠結(jié)合效應(yīng)物并傳播信號級聯(lián)，引起特定的細(xì)胞響應(yīng)。當(dāng)GDP與Rho GTP酶蛋白質(zhì)相結(jié)合時，Rho蛋白質(zhì)是非活性的。本發(fā)明的方法可以用于檢測活化的GTP酶蛋白質(zhì)。Rho GTP酶蛋白質(zhì)包括，但不僅限于，RhoA(SEQ ID NO1)，RhoB(SEQ ID NO2)，RhoC(SEQ ID NO3)，RhoD(SEQ ID NO4)，Rnd3(SEQ ID NO5)，Rnd1(SEQ IDNO6)，Rnd2(SEQ ID NO7)，Rif(SEQ ID NO8)，RhoG(SEQ ID NO9)，RhoH(SEQ ID NO10)，Rac1(SEQ ID NO11)，Rac1b(SEQ ID NO84)，Rac2(SEQID NO12)，Rac3(SEQ ID NO13)，Cdc42(SEQ ID NO14)，TC10(SEQ IDNO15)，TCL(SEQ ID NO16)，Wrch-1(SEQ ID NO17)，Wrch-2(SEQ IDNO18)，RhoBTB1(SEQ ID NO19)，和RhoBTB2(SEQ ID NO20)，或者其任何亞群。
“Rho GTP酶結(jié)合肽”或“活化Rho GTP酶結(jié)合肽”(也稱作“Rho亞家族結(jié)合肽”)是能夠結(jié)合活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)或其片段?！癛hoGTP酶結(jié)合肽”并不指GTP或其類似物。“Rho GTP酶結(jié)合肽”在這里還稱作“效應(yīng)物”(effector)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來鑒定保留其結(jié)合活性Rho GTP酶蛋白質(zhì)之能力的Rho GTP酶結(jié)合肽片段。在一些實(shí)施方案中，在本文提供的方法中使用的Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合Rho GTP酶蛋白質(zhì)，且其與Rho GTP酶蛋白質(zhì)的GTP結(jié)合態(tài)的親和力是與Rho GTP酶蛋白質(zhì)的GDP結(jié)合態(tài)的親和力的至少2倍。
在一些實(shí)施方案中，Rho GTP酶結(jié)合肽可以包括小G蛋白效應(yīng)物之氨基酸序列的全部或部分或片段，其中小G蛋白效應(yīng)物例如ROCK1、ROCK2、Citron、DGKθ、移動結(jié)合蛋白(Kinectin)、Dia1、Dia2、Dia3、PLC-ε，蛋白激酶N、Rhophillin、Rho靶蛋白(Rhotekin)、FHOD、p67Phox、PLC-β、POR-1、POSH、Sra-1、突觸小泡磷酸酶(Synaptojanin)-2、Ack1、Ack2、CEP1、CEP2、CEP3、CEP4、CEP5、CIP4、外被體(Coatamer)α、外被體γ、MRCKα、MRCKβ、Pak4、Spec1、Spec2、WASP、N-WASP、IRSp53、IQGAP-1、IQGAP-2、MEKK1、MEKK4、MLK2、MLK3、p70 S6激酶、Pak1、Pak2、Pak3、Pak4、Pak5、Pak6、PI3K(p85亞單位)、PIP5K、PLD-1，或其任何亞群或組合。在一些實(shí)施方案中，Rho GTP酶結(jié)合肽是多聚體化的，從而存在多于一個單位的配體。例如，Rho GTP酶結(jié)合肽可以是二聚體或三聚體化的(3個拷貝)。Rho GTP酶結(jié)合肽還可以具有該蛋白質(zhì)與Rho GTP酶蛋白質(zhì)結(jié)合的序列的4、5、6、7、8、9、或10個拷貝。
如果將某蛋白質(zhì)與其他Ras超家族蛋白質(zhì)進(jìn)行比對時，其落入Rho分支(例如，該蛋白質(zhì)與其他Rho蛋白質(zhì)具有至少40％的同源性)，并且其含有Rho插入域，則認(rèn)為該蛋白質(zhì)是“Rho GTP酶蛋白質(zhì)”。在一些實(shí)施方案中，如果一種小G蛋白質(zhì)與其他Rho蛋白質(zhì)，例如但不僅限于，RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、和/或RhoBTB2具有至少40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、40-99、50-99、60-99、70-99、80-99、85-99、90-99、或95-99％的同源性，則認(rèn)為該小G蛋白質(zhì)是Rho家族蛋白質(zhì)。此外，當(dāng)使用某種方法如保守域發(fā)現(xiàn)工具(conserveddomain finder)表明某種蛋白質(zhì)包含Rho插入蛋白時，則認(rèn)為該蛋白質(zhì)具有Rho插入蛋白。將鑒定為具有Rho插入域的蛋白質(zhì)看作Rho GTP酶蛋白質(zhì)。任何方法或軟件均可用于確定某種蛋白質(zhì)是否包含Rho插入蛋白。作為一個非限制性實(shí)例，可以使用例如“rpsblast”采用默認(rèn)設(shè)置，將蛋白質(zhì)對保守域數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，rpsblast可在例如美國國家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站上找到，其在萬維網(wǎng)上的地址為ncbi“點(diǎn)”nlm“點(diǎn)”nih“點(diǎn)”gov/Structure/cdd/wrpsb“點(diǎn)”cgi。如這里所使用的，對于互聯(lián)網(wǎng)地址，術(shù)語“點(diǎn)”是指“.”。本文提供了Rho GTP酶蛋白質(zhì)的實(shí)例，包括但不僅限于，RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Rac1b、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1、RhoBTB2等。
鑒定蛋白質(zhì)家族成員或同源物的其他方法和實(shí)例包括，但不僅限于下述。有多種蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫可用于分析或鑒定同源蛋白質(zhì)、域和基序。數(shù)據(jù)庫的實(shí)例包括，但不僅限于，簡單模塊構(gòu)架搜索工具(Simple ModularArchitecture Resource Tool，SMART)、比對和HMM蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(Pfam)、人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫(Human Protein Reference Database，HPRD)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man OMIM)、癌癥基因組解剖計劃(Cancer Genome Anatomy Project，CGAP)和Entrez Protein搜索數(shù)據(jù)庫。SMART數(shù)據(jù)庫可以在smart“點(diǎn)”embl-heidelberg“點(diǎn)”de/訪問。Pfam數(shù)據(jù)庫可以通過互聯(lián)網(wǎng)的萬維網(wǎng)在例如sanger“點(diǎn)”ac“點(diǎn)”uk/Software/Pfam/search.shtml進(jìn)行訪問。OMIM是部分為美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)開發(fā)的與疾病相關(guān)的人類遺傳突變數(shù)據(jù)庫。OMIM可通過環(huán)球網(wǎng)在例如ncbi“點(diǎn)”nlm“點(diǎn)”nih“點(diǎn)”gov/Omim/進(jìn)行訪問。CGAP是一個旨在建立破譯癌細(xì)胞分子解剖學(xué)所需的信息和技術(shù)工具的跨學(xué)科計劃。CGAP可以通過互聯(lián)網(wǎng)的萬維網(wǎng)在例如ncbi“點(diǎn)”nlm“點(diǎn)”nih“點(diǎn)”gov/ncicgap/進(jìn)行訪問。Entrez蛋白質(zhì)搜索數(shù)據(jù)庫可以通過互聯(lián)網(wǎng)的萬維網(wǎng)在ncbi“點(diǎn)”nlm“點(diǎn)”nih“點(diǎn)”gov/entrez/query“點(diǎn)”fcgi？db＝Protein進(jìn)行訪問。這些數(shù)據(jù)庫中的一些可能包含完整的或部分的核苷酸或氨基酸序列。近年來，隱藏馬爾可夫模型(HMM)已成為一種用于檢測這些家族成員的關(guān)鍵技術(shù)。Pfam、TIGRFAMs和SMART數(shù)據(jù)庫使用由HMMER軟件包提供的子集(profile)-HMM。TIGRFAMs是人工注解(curated)蛋白質(zhì)家族的集合，由下述各項組成HMMs、多序列比對、注釋、GeneOntology(GO)指配、文獻(xiàn)參考和指向相關(guān)TIGRFAMs、Pfam和InterPro模型的指示。TIGRFAMs包含超家族、亞家族和等價體(equivalog)水平的全長蛋白質(zhì)和短區(qū)域。TIGRFAMs可以通過互聯(lián)網(wǎng)的萬維網(wǎng)在tigr“點(diǎn)”org/TIGRFAMs進(jìn)行搜索和下載。
小G蛋白效應(yīng)物的部分氨基酸序列可以是域，例如Cdc42/Rac相互作用性結(jié)合(CRIB)域、Rho結(jié)合域(RhoBD)、Rho相互作用域(RID)、Rho效應(yīng)物或蛋白激酶C相關(guān)的激酶同源性區(qū)1(HR-1)、三十四肽(tetratricopeptide)重復(fù)單位(TPR)、或血小板白細(xì)胞C激酶底物(Pleckstrin)同源(PH)域。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的Rho GTP酶結(jié)合肽可包含針對Rho GTP酶蛋白質(zhì)的效應(yīng)物或其域。實(shí)例包括，但不僅限于，RhoBD、RID和HR-1域。能夠結(jié)合活化RhoA GTP酶蛋白質(zhì)的RhoBD的一種共有氨基酸序列是SEQ ID NO21。能夠結(jié)合活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的HR-1域的一種共有氨基酸序列是SEQ ID NO22。能夠結(jié)合活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的RID域的一種共有氨基酸序列是SEQ ID NO23。作為RhoA GTP酶蛋白質(zhì)效應(yīng)物的含有RhoBD的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，Citron(SEQ IDNO24)，ROCK 1(SEQ ID NO25)和ROCK 2(SEQ ID NO26)。作為RhoA/B/C GTP酶蛋白質(zhì)的效應(yīng)物的含有HR-1域的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，蛋白激酶N1(SEQ ID NO27)，蛋白激酶N2(SEQ ID NO28)，ROCK 1(SEQ ID NO25)，ROCK 2(SEQ ID NO26)，Rhophilin(SEQ ID NO29)，Rho靶蛋白(SEQ ID NO30)，和Rho靶蛋白2(Rhotekin 2)(SEQ ID NO83)。作為RhoA GTP酶蛋白質(zhì)的效應(yīng)物的含RID域的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，ROCK 1(SEQ ID NO25)和ROCK 2(SEQ ID NO26)。其他作為RhoA GTP酶蛋白質(zhì)效應(yīng)物的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，DGKθ(SEQ ID NO31)，移動結(jié)合蛋白(SEQ ID NO32)，Dia1(SEQ ID NO33)，Dia2(SEQ ID NO34)，MBS(SEQ ID NO82)和PLC-ε(SEQ ID NO35)。
作為RhoB GTP酶蛋白質(zhì)效應(yīng)物的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，Db1(SEQ ID NO93)和p76RBE(SEQ ID NO94)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的Rho GTP酶結(jié)合肽可以包括Rac小G蛋白的效應(yīng)物。充當(dāng)Rac小G蛋白效應(yīng)物的域的實(shí)例包括，但不僅限于，TPR域和PH域。能夠結(jié)合活化Rac小G蛋白的TPR域的一種共有氨基酸序列是SEQ ID NO36。能夠結(jié)合活化Rac小G蛋白的PH域的一種共有氨基酸序列是SEQ ID NO37。作為Rac小G蛋白的效應(yīng)物的含TPR域的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，p67Phox(SEQ ID NO38)。作為Rac小G蛋白的效應(yīng)物的含PH域的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，PLC-β(SEQ IDNO39)。其他作為Rac小G蛋白效應(yīng)物的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，F(xiàn)HOD(SEQ ID NO40)、POR-1(SEQ ID NO41)、POSH(SEQ ID NO42)、Sra-1(SEQID NO43)、PP5磷酸酶(SEQ ID NO85)、肉桂酰(Cinnamolyl)-CoA還原酶(SEQ ID NO86)、UNC-115(SEQ ID NO87)、Wave(SEQ ID NO88)、叢蛋白(Plexin)B1(SEQ ID NO89)、p35(SEQ ID NO90)、Tre17(SEQ ID NO91)、CID(SEQ ID NO92)，和突觸小泡磷酸酶-2(SEQ ID NO44)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的肽可以包含作為Cdc42小G蛋白效應(yīng)物的域?？沙洚?dāng)Cdc42小G蛋白效應(yīng)物的域的實(shí)例包括，但不僅限于，CRIB域。能夠結(jié)合活化Cdc42小G蛋白的一種CRIB域共有氨基酸序列是SEQ ID NO45。作為Cdc42小G蛋白的效應(yīng)物的含CRIB域的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，Ack1(SEQ ID NO46)，Ack2(SEQ ID NO47)，Pak4(SEQ ID NO48)，WASP(SEQ ID NO49)和N-WASP(SEQ ID NO50)。其他作為Cdc42小G蛋白效應(yīng)物的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，CEP1(SEQ IDNO51)，CEP2(SEQ ID NO52)，CEP3(SEQ ID NO53)，CEP4(SEQ IDNO54)，CEP5(SEQ ID NO55)，CIP4(SEQ ID NO56)，外被體α蛋白(SEQ IDNO57)，外被體γ蛋白(SEQ ID NO58)，Dia3(SEQ ID NO59)，MRCKα(SEQID NO60)，MRCKβ(SEQ ID NO61)，Spec1(SEQ ID NO62)和Spec2(SEQID NO63)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的GTP酶結(jié)合肽可以包含同時作為Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效應(yīng)物的域?？沙洚?dāng)Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效應(yīng)物的域的實(shí)例包括，但不僅限于，CRIB域。能夠結(jié)合活化Rac小G蛋白或活化Cdc42小G蛋白的CRIB域的一種共有氨基酸序列是SEQ ID NO45。作為Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白的效應(yīng)物的包含CRIB域的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，MLK2(SEQ ID NO64)、MLK3(SEQ ID NO65)、Pak1(SEQ ID NO66)、Pak2(SEQ ID NO67)、Pak3(SEQ IDNO68)、Pak5(SEQ ID NO69)、Pak6(SEQ ID NO70)、Tre17(SEQ ID NO91)、和Par6(SEQ ID NO71)。其他作為Rac小G蛋白和Cdc42小G蛋白效應(yīng)物的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，IRSp53(SEQ ID NO72)、IQGAP-1(SEQ IDNO73)、IQGAP-2(SEQ ID NO74)、MEKK1(SEQ ID NO75)、MEKK4(SEQID NO76)、p70S6激酶(SEQ ID NO77)和PI3k，p85亞單位(SEQ ID NO78)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所使用的GTP酶結(jié)合肽可以包含同時作為Rac小G蛋白的效應(yīng)物和RhoA小G蛋白的效應(yīng)物的域。作為Rac小G蛋白的效應(yīng)物和RhoA小G蛋白效應(yīng)物的肽的實(shí)例包括，但不僅限于，PIP5K(SEQ ID NO79)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所使用的GTP酶結(jié)合肽可以包含這樣的域，所述域是針對活性形式的Rac小G蛋白、RhoA小G蛋白和Cdc42小G蛋白的結(jié)合蛋白。這類肽的實(shí)例包括，但不僅限于，PLD-1(SEQ IDNO80)、Vav PH、DH、CRD域(SEQ ID NO 81)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所使用的GTP酶結(jié)合肽可以包含這樣的域，所述域是針對活性形式的Rnd2小G蛋白或TC10小G蛋白的結(jié)合蛋白。這類肽的實(shí)例包括，但不僅限于，針對TC10的PIST(SEQ ID NO95)、針對Rnd2的Rapostlin(SEQ ID NO96)和針對Rnd2的Pragmin(SEQ IDNO97)。
在一些實(shí)施方案中，Rho GTP酶結(jié)合肽或效應(yīng)物被修飾，從而使全部或部分的內(nèi)部半胱氨酸殘基突變成非半胱氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，Rho GTP酶結(jié)合肽或效應(yīng)物被修飾，從而使其含有C末端半胱氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，Rho GTP酶結(jié)合肽包含不同效應(yīng)物或者能結(jié)合Rho GTP酶蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)之片段的組合。
本領(lǐng)域中理解，要將兩種肽或蛋白質(zhì)看作具有共同的或保守的肽域，或者將它們看作保守蛋白質(zhì)家族的成員，其中一種肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列并不需要與另一種肽或蛋白質(zhì)100％相同。例如，對于短肽域(即少于50個氨基酸)而言，已發(fā)現(xiàn)有數(shù)種蛋白質(zhì)具有稱作Cdc42/Rac相互作用性結(jié)合(CRIB)域的肽域。CRIB域是一種14-16個氨基酸的序列，具有8個保守殘基，先前已證明其參與信號分子與活化GTP結(jié)合形式的Rac和Cdc42的結(jié)合。共有CRIB域是I-S-X-P-X(4)-F-X-H-X(2)-H-V-G，其中括號內(nèi)的數(shù)字代表可變(X)氨基酸殘基的總數(shù)。
對于較大的肽域，例如具有50個或更多個氨基酸的肽，當(dāng)兩種或更多種蛋白質(zhì)、肽或域是同源的、高度保守的或緊密相關(guān)時，給定的一種蛋白質(zhì)、肽或域的氨基酸序列與另一種肽、蛋白質(zhì)或給定的蛋白質(zhì)內(nèi)的域的氨基酸序列可以具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
一般地，在長度大于50個殘基、差異小于50-60％的多個序列或子序列中，有多種算法重現(xiàn)其比對的主要特征。因此，長度大于50個氨基酸的緊密相關(guān)序列和蛋白質(zhì)同源物將共有至少40％的氨基酸同一性，并且在一些實(shí)施方案中將共有至少40％-50％的氨基酸同一性，在一些實(shí)施方案中將共有至少50％-60％的氨基酸同一性，在一些實(shí)施方案中將共有至少60％-70％的氨基酸同一性，在一些實(shí)施方案中將共有至少70％-80％的氨基酸同一性，在一些實(shí)施方案中將共有至少80％-90％的氨基酸同一性，在另外一些實(shí)施方案中將共有至少90％-100％的氨基酸同一性。同源性可以用各種公眾可得的軟件工具進(jìn)行計算，例如那些由NCBI(Bethesda，MD)開發(fā)的軟件工具，它們可通過互聯(lián)網(wǎng)(ftp“點(diǎn)”ncbi“點(diǎn)”nlm“點(diǎn)”nih“點(diǎn)”gov/pub/)獲得。工具的實(shí)例包括，但不僅限于，可通過互聯(lián)網(wǎng)的萬維網(wǎng)在“ncbi”點(diǎn)”nlm”點(diǎn)”nih”點(diǎn)”gov訪問的BLAST系統(tǒng)，和可通過互聯(lián)網(wǎng)的萬維網(wǎng)分別在“點(diǎn)”ebi“點(diǎn)”ac“點(diǎn)”uk/emboss/align/和ebi“點(diǎn)”ac“點(diǎn)”uk/clustalw/獲得EMBOSS成對比對算法(BLOSUM62矩陣設(shè)置)和ClustalW比對。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的方法，包括使固體支持物與含活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品相接觸。固體支持物與活化Rho GTP酶結(jié)合肽連接。樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合。檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。在檢測期間，活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)保持與固體支持物聯(lián)結(jié)。作為非限制性實(shí)例，固體支持物是微量滴定板的孔，所述孔與Rho GTP酶結(jié)合肽連接，使含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品與所述微量滴定板接觸。在本實(shí)例中，Rho GTP酶結(jié)合肽和活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)彼此直接或者間接地通過復(fù)合物相互作用，而樣品中其余的蛋白質(zhì)和其他化合物被洗去或除去，留下活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)和固體支持物用于檢測步驟。因此，在本實(shí)例中，認(rèn)為Rho GTP酶蛋白質(zhì)保持與固體支持物聯(lián)結(jié)。相對地，在使用珠子的標(biāo)準(zhǔn)沉降測定中，其中Rh o GTP酶結(jié)合肽與珠子連接并與含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸，在將活化蛋白質(zhì)加載到凝膠或其他類型的分離介質(zhì)(例如柱)上之前將活化蛋白質(zhì)從珠子上被洗脫下來并與珠子分離，或者在檢測之前將活化蛋白質(zhì)與固體支持物分離。然后對Rho GTP酶蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，但是它已經(jīng)與固體支持物(例如珠子)分離，因此在標(biāo)準(zhǔn)沉降測定中，活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)在檢測步驟期間與固體支持物不保持聯(lián)結(jié)。
如這里所使用的，當(dāng)稱兩個蛋白質(zhì)或組分“彼此結(jié)合”時，這可以表示它們直接彼此接觸或者彼此形成復(fù)合物但不直接接觸。
固體支持物可以是Rho GTP酶結(jié)合肽能夠結(jié)合的任何表面。實(shí)例包括，但不僅限于，微量滴定板、珠子、盤(discs)、微陣列、載玻片等。在一些實(shí)施方案中，固體支持物包括微量滴定板或微陣列，但不包括珠子或盤。在一些實(shí)施方案中，用試劑活化或包被固體支持物，其中所述試劑會將蛋白質(zhì)共價附接于固體支持物，例如通過例如形成二硫鍵。這種試劑的實(shí)例包括，但不僅限于，馬來酰亞胺(malemide)。也可通過這樣的方式包被或修飾固體支持物，使得蛋白質(zhì)可以通過非共價相互作用而與固體支持物結(jié)合或鍵合。例如，固體支持物可以包含谷胱甘肽，谷胱甘肽會與含有GST部分的蛋白質(zhì)結(jié)合，或者固體支持物可以包含陽離子，陽離子使得含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)與固體支持物結(jié)合。也可使用其他的修飾，包括但不僅限于，抗生物素蛋白-生物素、HA-血凝素等。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的Rho GTP酶結(jié)合肽共價附接于馬來酰亞胺活化的板。馬來酰亞胺活化的板可以商購，并且設(shè)計成通過可用的-SH部分固定生物分子，其中-SH部分通常來自半胱氨酸殘基。馬來酰亞胺活化板的實(shí)例包括，但不僅限于，聚苯乙烯微量培養(yǎng)板，例如Costar的巰基結(jié)合板和條(Corning，Inc.Corning，NY)，Reacti-BindTM馬來酰亞胺活化板(Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL)和馬來酰亞胺活化微孔板-巰基-TRAPTM(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)。
在一些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明方法所用的效應(yīng)物肽附接在帶有預(yù)活化的共價表面分子的固體支持物(例如微量滴定板或微陣列)上。這些板可以商購，表面對其偶聯(lián)配偶物(coupling partners)高度特異，因此用于以位點(diǎn)定向(site-directed)的方式固定生物分子。這些板的實(shí)例包括，但不僅限于，N-氧琥珀酰亞胺(DNA-BINDTM)活化板、酰肼(Carbo-BINDTM)活化板、Univer-BINDTM板(Corning，Inc.Corning NY)、Reacti-Bind中性抗生物素蛋白包被板、Reacti-Bind鏈霉親和素包被板、Reacti-Bind抗GFP包被板、Reacti-Bind抗GST包被板(Pierce Biotechnology，Rockland，IL)、Biotin-TrapTM、GST-TrapTM、Amine-TrapTM、Sugar-TrapTM、Streptavidin-TrapTM板(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)等。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的效應(yīng)物肽可以和固體支持物(例如微量滴定板)連接(例如附接)，該固體支持物含有中度到高度結(jié)合性表面(medium to high binding surface)，其通過疏水或離子相互作用而被動地吸收生物分子。這些板的實(shí)例包括，但不僅限于，由Corning公司(Corning NY)、Pierce生物技術(shù)公司(Rockland IL)等制造的一系列EIA/RIA板。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的效應(yīng)物肽可以連接于含有胺化或羧化表面的微量滴定板。通過這些表面使用雙功能交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)共價偶聯(lián)，所述雙功能交聯(lián)劑使表面上的胺基或羧基偶聯(lián)于肽上的官能團(tuán)例如胺基、巰醇基或羧基。這些微量培養(yǎng)板包括，但不僅限于，由Corning公司(CorningNY)制造的聚苯乙烯或聚丙烯板系列。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的效應(yīng)物肽可以是配置為容納給定反應(yīng)體積的板。實(shí)例包括，但不僅限于，96孔板、384孔板、1536孔板等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的效應(yīng)物肽可以以微陣列模式提供。
在一些實(shí)施方案中，對本發(fā)明方法所用的固定的效應(yīng)物肽加以配制，使其可以在孔內(nèi)或者在微陣列模式中凍干，而且維持其在再水化時結(jié)合活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的能力。
在一些實(shí)施方案中，被固定的肽是Rho GTP酶蛋白質(zhì)，其產(chǎn)生效應(yīng)物或效應(yīng)物-HRP偶聯(lián)物的靶標(biāo)。在此情況下，將所述模式設(shè)計為篩選抑制或提高這兩種蛋白質(zhì)之間相互作用的配體。在此模式下，該測定方法可用于發(fā)現(xiàn)在藥物發(fā)現(xiàn)中有用的配體。
在一些實(shí)施方案中，測定(方法)包括將活性Rho結(jié)合肽或其片段固定(連接)于微量滴定板的孔。在一些實(shí)施方案中，該方法包括凍干孔內(nèi)的結(jié)合蛋白質(zhì)從而產(chǎn)生高度穩(wěn)定和穩(wěn)健(robust)的蛋白質(zhì)基質(zhì)(matrix)；將固定的結(jié)合性蛋白與來自澄清或未澄清的細(xì)胞裂解物或組織樣品或重組來源的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)共溫育；和用Rho GTP酶特異抗體對結(jié)合活化RhoGTP酶蛋白質(zhì)的效應(yīng)物的量進(jìn)行定量。
本方法與先前用于確定Rho GTP酶蛋白質(zhì)和其它小G蛋白活化狀態(tài)的基于效應(yīng)物的方法相比具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，本測定方法可產(chǎn)生附接于微量滴定孔或微陣列上的活化Rho GTP酶結(jié)合肽的穩(wěn)定凍干制劑，從而整個活化測定可以在單孔模式下進(jìn)行，無需不斷地操作樣品，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健性大大提高的測定。其次，在一些實(shí)施方案中，本方法不需要對含有Rho GTP酶蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行預(yù)澄清，從而可以更加容易地處理多個樣品，最大程度地減少GAP活性所造成的Rho活化的低估。第三，本測定方法比現(xiàn)有測定方法更加靈敏，可以使用更少量的細(xì)胞裂解物或總蛋白，這在可用的原始材料極少和需要高通量測定的情況下可能是相當(dāng)重要的。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對樣品(例如生物(組織、血液等)或細(xì)胞培養(yǎng)物)進(jìn)行高通量篩選以定量其活化G蛋白狀態(tài)的方法。本發(fā)明還提供了抑制或增強(qiáng)或促進(jìn)小G蛋白與其效應(yīng)物蛋白之間的相互作用的化合物或生物分子的高通量篩選方法。所述方法的實(shí)例包括，但不僅限于，抑制或增強(qiáng)RhoA-Rho激酶相互作用、RhoA-Dia相互作用、RhoC-Rho激酶相互作用、Rac1-Pak相互作用、Cdc42-Pak相互作用的化合物。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及基于固體支持物(例如微量滴定板或微陣列)ELISA的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)檢測方法。該方法包括使對活性Rho GTP酶特異的結(jié)合肽附接于固體支持物(例如微量滴定板或微陣列基質(zhì)(matrix))的孔上，將該固定的活性Rho GTP酶結(jié)合肽與含有一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品(例如細(xì)胞裂解物)共溫育，及使用對特定Rho GTP酶蛋白質(zhì)的抗體(例如非特異或特異的)定量活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所使用的抗體是Rho GTP酶蛋白質(zhì)的單克隆、重組或多克隆抗體。這些抗體可以對一個家族成員或多個家族成員特異。這些抗體的實(shí)例包括，但不僅限于，小鼠單克隆抗RhoA抗體(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz CA)、小鼠單克隆抗泛-Rho(pan-Rho)抗體(BD Transduction Laborataries，San Diego CA)、雞多克隆抗RhoA抗體(Genway，Inc.San Diego CA)、小鼠單克隆抗Rho A，B，C抗體(CytoskeletonInc.)、小鼠抗RhoA抗體(Cytoskeleton Inc.)等。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所使用的抗體可以是與酶或可檢測生物分子偶聯(lián)的單克隆、重組或多克隆第一抗體。這些可檢測的偶聯(lián)抗體避免了使用第二抗體，從而提高了反應(yīng)的特異性。偶聯(lián)抗體的實(shí)例包括，但不僅限于，HRP偶聯(lián)的第一抗體、AP偶聯(lián)的第一抗體、預(yù)先與鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶聯(lián)物混合的生物素偶聯(lián)的第一抗體。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用的抗體可以是針對Rho GTP酶蛋白質(zhì)的特定效應(yīng)物的單克隆、重組或多克隆抗體。
“對特定Rho GTP酶蛋白質(zhì)特異的抗體”是指僅對一種Rho GTP酶蛋白質(zhì)具有特異性，而不會與另外的Rho GTP酶蛋白質(zhì)反應(yīng)或檢測另外的RhoGTP酶蛋白質(zhì)的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體可以是雙特異性的，從而它能夠結(jié)合或檢測兩種Rho不同的Rho GTP酶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，抗體識別一種或多種Rho GTP酶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，使用能夠檢測和結(jié)合超過兩種Rho GTP酶蛋白質(zhì)的非特異性抗體?？贵w可以對特定的Rho GTP酶蛋白質(zhì)具有特異性，但是在一些實(shí)施方案中，抗體也可以僅識別活化形式的Rho GTP酶蛋白質(zhì)，非活性形式的Rho GTP酶蛋白質(zhì)，或者在一些實(shí)施方案中，抗體能夠同時識別活性或非活性形式。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種基于固體支持物(例如微量滴定板或微陣列)ELISA的活化重組Rho GTP酶蛋白質(zhì)檢測方法。該方法可包括將Rho GTP酶特異性的結(jié)合肽(例如效應(yīng)物肽)連接到微量滴定板孔或微陣列基質(zhì)(matrix)的孔上；將固體的效應(yīng)物肽與一種或多種活化的重組RhoGTP酶蛋白質(zhì)共溫育；并使用對特定Rho GTP酶蛋白質(zhì)特異性的抗體對活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。
在一些實(shí)施方案中，Rho GTP酶蛋白質(zhì)是Rho GTP酶的重組突變體形式和/或組成型活性突變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以創(chuàng)造Rho GTP酶蛋白質(zhì)的組成型活性突變體。在一些實(shí)施方案中，可以將效應(yīng)物蛋白質(zhì)或肽和固定的Rho GTP酶蛋白質(zhì)共溫育，并使用效應(yīng)物特異性抗體對Rho GTP酶效應(yīng)物相互作用進(jìn)行定量。
在一些實(shí)施方案中，本方法包括對活性Rho GTP酶蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量。
如這里所使用的，“效應(yīng)物特異抗體”是指僅結(jié)合一種效應(yīng)物，而不能檢測或結(jié)合其它效應(yīng)物的抗體。
在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞裂解物或樣品配制成含有緩沖組分的溶液，其pH為5-10，大約7.5，或者大約6-大約8，大約6-大約9，大約7-大約8，或大約7的pH。在一些實(shí)施方案中，含有效應(yīng)物肽或Rho蛋白質(zhì)的樣品可以包含去垢劑組分。去垢劑組分可以是，例如，非離子去垢劑，例如但不僅限于，Triton X-100。去垢劑的最終濃度可以是例如大約0.1、大約0.2、大約0.3、大約0.4、大約0.5、大約0.6、大約0.7、大約0.8、大約0.9、大約1.0、大約1.5、大約1-大約2、大約1-大約3、大約0.5-大約1.5、大約.75-大約1.25、大約1-大約5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、1-2、1-3、0.5-1.5、0.75-1.25、或1-5％。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞裂解物或樣品含有氯化鎂。在一些實(shí)施方案中，氯化鎂的最終濃度可以是例如大約5-大約80、大約10-大約50、大約15-大約25、大約20、5-80、10-50、15-25或20mM。
樣品或裂解緩沖劑還可以包含鹽組分。鹽組分的實(shí)例包括，但不僅限于，氯化鈉、氯化鉀等。鹽組分的最終濃度可以是例如大約10-大約700、大約100-大約500、10-700或者100-500、100、200、300、400、500、大約100、大約200、大約300、大約400、大約500mM。
在一些實(shí)施方案中，樣品或細(xì)胞裂解物中總蛋白的量是大約1-大約300、大約20-大約50、大約1-大約200、大約1-大約100、大約1-大約75、大約1-大約50、大約1-大約25、大約1-大約10、大約20、大約50、小于100、小于75、小于50、小于25、小于10、小于300、或者小于200μg。
在一些實(shí)施方案中，樣品包含大約103-大約106、103-大約105、103-大約104、104-大約105、小于106、小于105、或者小于104個細(xì)胞，或者用此處所示相同數(shù)目的細(xì)胞制備而得的細(xì)胞裂解物。
檢測Rho GTP酶結(jié)合肽與Rho GTP酶蛋白質(zhì)(例如活化的或非活化的)之間的相互作用(例如結(jié)合)，可以使用任何可用于檢測該相互作用的方法或儀器來進(jìn)行。例如，該檢測可以利用熒光、發(fā)光、吸光度的差異及其組合等。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之前，添加抗原提呈緩沖劑(APB)(也稱作“抗原提呈增強(qiáng)劑”)?？乖岢示彌_劑包括一種或多種能夠降低固體支持物上活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的損失的化合物或處理。在一些實(shí)施方案中，抗原提呈緩沖劑包括熱變性；干燥變性；尿素處理；交聯(lián)劑如SMCC和戊二醛；乙醇或甲醇；或三氯乙酸；或其任意組合或亞組。在一些實(shí)施方案中，固體支持物上活化的Rho GTP酶蛋白質(zhì)的損失減少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。在一些實(shí)施方案中，三氯乙酸的最終濃度為大約0.5-大約15％v/v。在一些實(shí)施方案中，TCA的最終濃度為大約0.5％-大約10％，大約0.5％-大約7.5％，大約0.5％-大約5％，大約0.5％-大約4％，大約0.5％-大約3％，大約0.5％-大約2％，大約0.5％-大約1％，大約0.5％，或者大約1％，小于10％，小于5％，小于4％，小于3％，或者小于2％v/v。
在一些實(shí)施方案中，在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之前，添加結(jié)合緩沖劑(也稱作“蛋白蛋白相互作用增強(qiáng)劑”)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合緩沖劑使Rho GTP酶結(jié)合肽與Rho GTP酶蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力比沒有結(jié)合緩沖劑時提高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，提高到2倍，3倍，或者超過3倍。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合緩沖劑包括水溶性聚蔗糖、葡聚糖或聚乙二醇，或者其任意組合或亞組。在一些實(shí)施方案中，聚乙二醇是PEG 4000或PEG 8000，最終濃度為大約2％-大約40％v/v。在一些實(shí)施方案中，PEG的最終濃度為大約2％-大約40％，大約2％-大約30％，大約2％-大約25％，大約2％-大約20％，大約2％-大約10％，大約2％-大約5％，大約2％，大約10％，大約20％，大約30％，大約40％。
在一些實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步包括對樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量。對蛋白的量進(jìn)行定量的方式對于本方法而言并不特定，任何定量方法均可使用。合適的方法包括，但不僅限于，熒光、發(fā)光或吸光度的差異。
在一些實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步包括使樣品與測試劑接觸，并確定測試劑是否調(diào)節(jié)活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，測試劑將提高所述結(jié)合，在其他的實(shí)施方案中，測試劑將降低所述結(jié)合。測試劑可以是任何化合物或組合物，例如蛋白質(zhì)、肽、有機(jī)小分子、碳水化合物等。如果測試劑抑制結(jié)合，則認(rèn)為測試劑是抑制劑?？梢詫⒋嬖诤筒淮嬖跍y試劑時Rho GTP酶蛋白質(zhì)與Rho GTP酶結(jié)合肽的結(jié)合進(jìn)行比較，以確定測試劑是否調(diào)節(jié)該結(jié)合。可以使用任何方法對該結(jié)合加以檢測或定量，包括這里描述的那些方法。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的方法，包括使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸，其中經(jīng)過修飾的Rho GTP酶結(jié)合肽與固體支持物連接，并且其中經(jīng)過修飾的RhoGTP酶結(jié)合肽與活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的Kd低于(即結(jié)合親和力大于)未經(jīng)修飾的Rho GTP酶結(jié)合肽與Rho GTP酶蛋白質(zhì)的Kd；和檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的Rho GTP酶結(jié)合肽是寡聚化的Rho GTP酶結(jié)合肽或突變的Rho GTP酶結(jié)合肽。經(jīng)過修飾的肽可以是任何如本文所描述的、且為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肽，包括但不僅限于經(jīng)修飾的Rho靶蛋白、經(jīng)修飾的ROCK1、經(jīng)修飾的PAK1、經(jīng)修飾的POSH、或經(jīng)修飾的WASP。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的方法，包括使微量滴定板或微陣列與含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸，其中活化Rho GTP酶特異性的抗體與微量滴定板或微陣列連接；和檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定活化Rho GTP酶結(jié)合肽的方法，包括在可選地存在抗原提呈緩沖劑的條件下，使測試劑與活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)接觸；和檢測Rho GTP酶蛋白質(zhì)與測試劑的結(jié)合，其中檢測到結(jié)合表明測試劑是活化Rho GTP酶結(jié)合肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法進(jìn)一步包括使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸，其中固體支持物與測試劑連接；和檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定抗原提呈緩沖劑是否有利于檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽的結(jié)合的方法，包括使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸，其中Rho GTP酶結(jié)合肽連接于固體支持物；和以不同的時間間隔檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)，其中不同時間間隔的檢測結(jié)果降低表明抗原提呈緩沖劑是有利的。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定測試緩沖劑是否是抗原提呈緩沖劑的方法，包括使固體支持物與測試緩沖劑和活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)接觸，其中活化Rho GTP酶結(jié)合肽連接于固體支持物；和以不同時間間隔檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽的結(jié)合，其中如果存在測試緩沖劑時沒有觀察到檢測結(jié)果與不存在測試緩沖劑相比降低，則測試緩沖劑是有助于檢測活化Rho GTP酶結(jié)合肽與活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之結(jié)合的抗原提呈緩沖劑。如果不存在測試緩沖劑時，檢測結(jié)果降低，而測試緩沖劑的存在防止檢測結(jié)果的降低，則測試緩沖劑是APB。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包括固體支持物；抗原提呈緩沖劑；活化的Rho GTP酶蛋白質(zhì)；和活化Rho GTP酶結(jié)合肽或經(jīng)過修飾的Rho GTP酶結(jié)合肽。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，所述試劑盒包括固體支持物和活化Rho GTP酶結(jié)合肽，其中活化Rho GTP酶結(jié)合肽可選地連接于固體支持物；和可選的抗原提呈緩沖劑。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括共價連接于固體支持物的Rho GTP酶結(jié)合肽。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括陽性對照，其中陽性對照包括能夠結(jié)合Rho GTP酶結(jié)合肽的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括抗原提呈緩沖劑，其含有三氯乙酸(TCA)。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括結(jié)合緩沖劑，例如葡聚糖、水溶性聚蔗糖、PEG、或其組合。
在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括Rho GTP酶結(jié)合肽，其是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH或WASP。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒進(jìn)一步包括關(guān)于實(shí)施活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)檢測的指導(dǎo)。
在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括用于檢測Rho GTP酶結(jié)合肽與活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之間結(jié)合的因子(agent)，其中該因子為發(fā)光性、熒光性或放射性。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包括的固體支持物是微量滴定板、微陣列、或載玻片，其中固體支持物可選地用馬來酰亞胺活化或者以其它方式活化或者如本文所述地包被，以便于Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合固體支持物。
為了使這里公開的發(fā)明被更加有效地理解，下文提供了實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例只是出于舉例說明的目的，不可解釋為對本發(fā)明有任何方式的限制。在所有這些實(shí)施例中，除非特別說明，否則分子克隆反應(yīng)和其他的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)是根據(jù)下文描述的方法使用可商購的試劑進(jìn)行的Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor出版公司(1989)。
實(shí)施例 實(shí)施例1用于G-LISA測定的效應(yīng)物-GBD肽的制備 一些序列基序是Rho GTP酶效應(yīng)物的多個亞群之間共有的，例如，Cdc42/Rac相互作用性結(jié)合(CRIB)基序存在于許多，雖然不是所有的Rac和Cdc42結(jié)合性蛋白中(Burbelo et al.，1995，J.Biol.Chem.，27029071-29074)，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它對于效應(yīng)物結(jié)合而言是必要但非充分的(Rudolph et al.，1998，J.Biol.Chem.，27318067-18076)。另一種常見的Rho效應(yīng)物基序是在PRK1和PRK2中發(fā)現(xiàn)的Rho效應(yīng)物同源性(REM)以及在效應(yīng)物如rhophilin和Rho靶蛋白中發(fā)現(xiàn)的HR1重復(fù)基序(Flynn et al.，1998，J.Biol.Chem.，2732698-2705)。然而，有大量效應(yīng)物不含有任何目前已經(jīng)鑒定的GTP酶結(jié)合基序。這些包括POSH、PI3K和DAG效應(yīng)物(Bishop et al.，2000，Biochem.J.，348241-255)。這類蛋白質(zhì)純粹是基于其可區(qū)分結(jié)合GTP(活化)和GDP(非活化)形式的Rho GTP酶的功能上的能力才歸類為Rho效應(yīng)物的(Tapon，1998，EMBO J.，171395-1404；和Kobayashi et al.，1998，J.Biol.Chem.，273291-295)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)，目前Rho效應(yīng)物是通過其選擇性識別結(jié)合GTP(活化)形式的Rho GTP酶，而不識別非活化的GDP形式的GTP酶的功能上的能力來定義的(Vetter et al.，2001，Science，2941299-1304；Blumenstein et al.，2004，J.Biol.Chem.，27953419-53426；Martin et al.，1995，EMBO J.，141970-1978；Leung et al.，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.，1025685-5690；Bishop et al.，2000，Biochem.J.，348241-255；和Fujisawa etal.，1998，J.Biol.Chem.，27318943-18949)。
這里提供的實(shí)施例采用了6種被表征最多的Rho效應(yīng)物，或者更具體地說，Rho效應(yīng)物-GTP酶結(jié)合域(GBD)肽。表1詳細(xì)描述了效應(yīng)物以及效應(yīng)物對活化Rho家族蛋白的特異性。
表1活化Rho家族蛋白質(zhì)的效應(yīng)物識別 材料和方法 效應(yīng)物cDNA克隆 這里作為實(shí)例提供的所有效應(yīng)物蛋白質(zhì)和效應(yīng)物GTP酶結(jié)合域(GBD)，先前均已描述了全長哺乳動物cDNA(見表2)。使用表2所示的引物和cDNA來源，通過PCR克隆了效應(yīng)物-GBD肽。表2中的核苷酸編碼相應(yīng)于Genbank的提交編碼方案。GTP酶結(jié)合域(GBDs)是根據(jù)鑒定效應(yīng)物活化Rho結(jié)合域的已公開數(shù)據(jù)選擇的(見表1)。
表2效應(yīng)物克隆信息 *下劃線表示半胱氨酸密碼子 本文中表2以及任何其他地方提供的GenBank登錄號的序列均全部引用并入本文。
修飾效應(yīng)物-GBD DNA序列以便定向共價結(jié)合于馬來酰亞胺活化板 在效應(yīng)物-GBD肽共價連接于馬來酰亞胺活化板的場合(見本實(shí)施例下文及表3)，對效應(yīng)物-GBD肽DNA進(jìn)行修飾，使之在羧基末端含有單個半胱氨酸殘基。將半胱氨酸密碼子工程化到ROCK1、PAK1和WASP的引物設(shè)計中(見表2，3’引物中的半胱氨酸密碼子用下劃線表示)。在POSH的場合，利用了鄰近羧基末端的半胱氨酸密碼子(351位)。
Rho靶蛋白的效應(yīng)物-GBD含有3個內(nèi)部半胱氨酸殘基(表2和圖1)。為使Rho靶蛋白-GBD可以定向結(jié)合于馬來酰亞胺板，化學(xué)合成Rho靶蛋白-GBD(Entelechon GmbH，St.Veit-Weg 2，93051 Regensburg，Germany)，除去3個內(nèi)部半胱氨酸，并分別用谷氨酸(aa# 43)、亮氨酸(aa# 49)和絲氨酸(aa# 65)代替。將一個半胱氨酸密碼子置于修飾的Rho靶蛋白-GBD的羧基末端，緊鄰在終止密碼子的上游。合成Rho靶蛋白-GBD序列的設(shè)計用Leto 1.0基因優(yōu)化軟件執(zhí)行，該軟件是基于一種專有權(quán)所有的遺傳算法(Entelechon GmbH，St.Veit-Weg 2，93051 Regensburg，Germany)。序列設(shè)計可以使密碼子用法、同源GC含量、mRNA二級結(jié)構(gòu)、密碼子和基序重復(fù)以及限制性位點(diǎn)得到優(yōu)化。合成的Rho靶蛋白-GBD DNA由Entelechon GmbH在pUC18克隆載體中提供。根據(jù)制造商說明書(Promega Corp.，Madison，WI)用限制性酶BamH1和EcoR1切割該DNA，將含有修飾Rho靶蛋白-GBD的273 bp DNA片段直接克隆到表達(dá)載體pGEX-4T的BamH1和EcoR1位點(diǎn)中，形成在氨基末端與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽融合、且在羧基末端含有獨(dú)有的(unique)半胱氨酸殘基的Rho靶蛋白-GBD域。全部分子生物學(xué)操作均根據(jù)MolecularCloning，A Laboratory Manual，1998，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress.，Ed.Sambrook等中概述的一般原則進(jìn)行。
表達(dá)質(zhì)粒載體骨架和純化標(biāo)簽 這里描述的實(shí)施例采用表達(dá)載體pRSET-A(Invitrogen Corp.，GrandIsland，NY)，其含有一個N-末端組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，和pGEX-4T(GEHealthcare(Pharmacia Inc.)，Piscataway，NJ)，其含有一個N-末端GST-標(biāo)簽。位于帶GST-標(biāo)簽的構(gòu)建體與感興趣的效應(yīng)物-GBD肽之間的凝血酶蛋白酶位點(diǎn)允許通過凝血酶切割除去GST標(biāo)簽。表3記載了實(shí)施例中使用的各種效應(yīng)物-GBD的克隆所用的載體。表3還記載了用于效應(yīng)物-GBD肽純化的標(biāo)簽以及將肽連接于微量滴定板的方法。微量滴定板包被的細(xì)節(jié)在實(shí)施例2中提供。
表3效應(yīng)物純化標(biāo)簽和板結(jié)合標(biāo)簽 效應(yīng)物蛋白質(zhì)表達(dá) 在加有合適抗生素(典型的是50μg/ml的氨芐青霉素)的培養(yǎng)基(典型的是LB培養(yǎng)基)中培養(yǎng)含有表達(dá)構(gòu)建體(例如表2中描述的質(zhì)粒)的細(xì)菌培養(yǎng)物(例如BL21(DE3)或BL21)。培養(yǎng)物在37℃、200rpm震蕩條件下生長，直到OD600達(dá)到大約0.6。為了誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)生，添加IPTG至0.2mM，室溫下繼續(xù)震蕩(典型地12小時)。在誘導(dǎo)之前，收集少量細(xì)菌樣品(典型地1ml)并保存在-20℃。在誘導(dǎo)之后，收集少量所述細(xì)菌的樣品(典型地1ml)并保存在-20℃。通過以6,000g離心沉淀細(xì)菌收獲剩余的培養(yǎng)物。細(xì)菌沉淀可以保存在-20℃直至加以處理。使用上面提到的1ml細(xì)菌樣品通過比較誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的細(xì)菌沉淀中的重組蛋白質(zhì)的水平來確定重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)效率，典型地，該分析通過在SDS-PAGE系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白的考馬斯染色來實(shí)施。
效應(yīng)物蛋白質(zhì)純化 將細(xì)菌沉淀重懸在裂解緩沖劑(典型地每升培養(yǎng)物20ml)中。用于帶His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的裂解緩沖劑典型地為50mM Tris pH 7.5、50mM NaCl、0.5mM MgCl2和5mM咪唑。用于帶GST標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的裂解緩沖劑典型地為50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl和2mM EDTA。使重懸的細(xì)胞通過4層粗棉布除去細(xì)胞碎片，再通過高壓微射流設(shè)備(Model M-110L，Microfluidics)裂解細(xì)胞。裂解物通過60,000g離心步驟加以澄清。
帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白通過固定化金屬親和色譜(IMAC)(Bornhorst et al.，2000，Methods in Enzymology，326245-254)加以純化。簡而言之，將裂解物與金屬螯合的珠子(典型地是鎳或鈷珠子，每升細(xì)菌培養(yǎng)物1ml珠子)共溫育。將珠子/裂解物混合物在4℃溫育30-60分鐘。用含有10mM-30mM濃度的咪唑的清洗緩沖劑(50mM Tris pH 7.5，0.5mM NaCl)清洗珠子。在3-5珠子體積的洗脫緩沖劑(500mM咪唑，200mM NaCl，50mM Tris pH 7.5，1mM MgCl2)中洗脫重組效應(yīng)物蛋白質(zhì)，并保存在-70℃。
通過谷胱甘肽親和色譜純化帶GST標(biāo)簽的蛋白質(zhì)(Smith，2000，Methodsin Enzymology，326254-270)。簡而言之，將裂解物與谷胱甘肽珠子(典型地，每升細(xì)菌培養(yǎng)物1ml珠子)在4℃溫育1小時。然后用等體積的裂解緩沖劑清洗珠子3次，再用3-5珠子體積的洗脫緩沖劑(裂解緩沖劑加10mM還原谷胱甘肽)洗脫重組帶GST標(biāo)簽的效應(yīng)物蛋白質(zhì)，并保存在-70℃。
帶GST標(biāo)簽的效應(yīng)物-GBD肽的凝血酶切割 規(guī)程遵循Meth.Enz.1995，256178中概述的程序。簡而言之，將結(jié)合在谷胱甘肽珠子上的帶GST標(biāo)簽的蛋白在加有1％Triton X-100的PBS中清洗3次，在50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl和2.5mM CaCl2中清洗3次。最后將珠子重懸在等體積的鈣緩沖劑中。向珠子添加牛α凝血酶(Sigma)，每mg蛋白30個單位。在4℃回旋條件下進(jìn)行2-5小時的切割。通過離心除去珠子，保留經(jīng)過切割的蛋白質(zhì)，并保存在-70℃。
沉降測定 將經(jīng)修飾的GST Rho靶蛋白-GBD肽結(jié)合于谷胱甘肽珠子，將20μg結(jié)合于珠子的效應(yīng)物添加到500μl(250μg)澄清的負(fù)載GTPγS或GDP的(GTPγ S or GDP loaded)血小板提取物中(裂解物制備見實(shí)施例2)。將混合物在4℃回旋溫育1小時。然后將珠子在清洗緩沖劑(50mM Tris pH 7.5，100mMNaCl，和30mM MgCl2)中清洗2次，重懸在1珠子體積的SDS樣品緩沖劑(75mM Tris pH 6.8、2％SDS、10％甘油、5％β-巰基乙醇和2mg/ml溴酚藍(lán))中，并進(jìn)行SDS-PAGE(4-20％梯度)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(批號IPVH304F0，Millipore，Bedford，MA)，之后用0.25μg/ml抗RhoA(批號ARH01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，0.25μg/ml抗Rac1(批號ARC01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，1μg/ml抗Cdc42(批號ACD01，CytoskeletonInc.，Denver，CO)進(jìn)行Western印跡。用特異識別RhoA蛋白質(zhì)的第一抗體和山羊抗小鼠第二抗體(Jackson Labs.，批號115-035-068)檢測活化RhoA蛋白質(zhì)條帶。測定至少執(zhí)行8次。
結(jié)果 效應(yīng)物-GBD克隆 確證了表2所述的全部效應(yīng)物-GBD cDNA序列均與公開的Genbank序列匹配。此外，也確證了ROCK1、PAK1和WASP構(gòu)建體中工程化的羧基末端半胱氨酸密碼子的存在。
圖1B詳細(xì)描述了合成Rho靶蛋白-Cys-GBD域的序列。合成的與野生型Rho靶蛋白-RBD序列的比較證實(shí)，合成構(gòu)建體中全部3個內(nèi)部半胱氨酸殘基均被除去，并替代為谷氨酸(aa# 43)、亮氨酸(aa# 49)和絲氨酸(aa# 65)。序列分析也確證了為定向結(jié)合馬來酰亞胺板的目的而引入的羧基末端半胱氨酸的存在(圖1B)。利用表2中引物所記載的限制位點(diǎn)克隆cDNAs。野生型和修飾Rho靶蛋白-Cys-GBD的DNA和氨基酸序列。野生型和Cys突變體效應(yīng)物-GBD之間的氨基酸殘基改變用粗體和下劃線表示。
效應(yīng)物表達(dá)和純化 典型的效應(yīng)物-GBD肽純度為70-80％，這是通過對SDS-PAGE凝膠上依分子量分離并經(jīng)考馬斯染色的肽進(jìn)行密度掃描測定而確定的(圖1A)。簡而言之，將PAK1-GST(30μg)、ROCK1-His(10μg)、WASP-His(20μg)、POSH-His(20μg)、Rho靶蛋白-Cys-無標(biāo)簽(用凝血酶切去GST標(biāo)簽)(10μg)、Rho靶蛋白野生型GBD-GST(20μg)和Dia1-GST(15μg)的經(jīng)過純化的GBD域加載到SDS-PAGE上，用考馬斯藍(lán)對蛋白質(zhì)凝膠染色。
效應(yīng)物-GBD生物活性的確證 針對全部效應(yīng)物-GBD肽，通過GST沉降(Figure 1C顯示修飾Rho靶蛋白-Cys，數(shù)據(jù)未顯示)或G-LISA測定(數(shù)據(jù)未顯示，見實(shí)施例2)來確定效應(yīng)物-GBD肽的選擇性結(jié)合活化Rho蛋白質(zhì)的能力。簡而言之，將50μg純化的Rho靶蛋白-Cys GBD突變體珠子與500μg負(fù)載GDP或GTPγS的血小板提取物共溫育，對珠子沉淀的RhoA-GTP進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗RhoA抗體對其進(jìn)行Western印跡分析。
討論 目前Rho家族有21個成員，如Wennerberg et al，2005，J.Cell Sci.，118843-6和Schnelzer et al.，2000，Oncogene，193013-3020定義的。它們是RhoA，RhoB，RhoC，RhoD，Rnd3，Rnd1，Rnd2，Rif，RhoG，RhoH，Rac1，Rac1b，Rac2，Rac3，Cdc42，TC10，TCL，Wrch-1，Wrch-2，RhoBTB1和RhoBTB2。
本實(shí)施例使用的效應(yīng)物-GBD肽的組合能夠選擇性結(jié)合21個Rho家族成員當(dāng)中的13個，或者說全部Rho家族成員中62％的活化形式(見表1)。這包括表征最全面的Rho蛋白質(zhì)，即RhoA，Rac1和Cdc42，如PubMed引用數(shù)所表明的(1996-2006年P(guān)ubMed引用數(shù)RhoA(2467)，Rac1(1931)，Cdc42(2455)，RhoB(283)，RhoC(117)，RhoD(187)，Rnd3(23)，Rnd1(31)，Rnd2(15)，Rif(作為Rif小G蛋白檢索)(5)，RhoG(83)，RhoH(26)，Rac2(219)，Rac3(85)，TC10(70)，TCL(作為TCL小G蛋白檢索)(6)，Wrch-1(6)，Wrch-2(4)，RhoBTB1(4)，RhoBTB2(6)，Rac1b(22))。因?yàn)槿魏谓o定的效應(yīng)物通常都會結(jié)合超過一種Rho GTP酶，所以針對特定內(nèi)源Rho GTP酶的檢測和定量的測定特異性依賴于效應(yīng)物-GBD和Rho GTP酶特異性抗體的組合。使用效應(yīng)物和抗體組合獲得Rho GTP酶特異性，使本測定方法與其他僅利用效應(yīng)物“特異性”的活性Rho GTP酶檢測系統(tǒng)(Pertz et al.，2004，J.Cell Sci.，1171313-1318)相比具有優(yōu)勢。
在剩余的所有實(shí)施例中均將述及此處提出的效應(yīng)物，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，這里公開的方法、測定法等同樣適用于任何Rho效應(yīng)物-GBD。當(dāng)認(rèn)為Vetter et al.，2001，Science，2941299-1304，“Effectors for GTP-bindingproteins are operationally defined as molecules interacting more tightly with theGTP-bound than with the GDP-bound form”中限定的Rho效應(yīng)物的定義被本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)為Rho GTP酶效應(yīng)物的實(shí)際定義時尤其如此。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施方案完全依賴于Rho GTP酶效應(yīng)物的實(shí)際操作上的定義。
實(shí)施例2共價連接的效應(yīng)物-GBD板在G-LISA測定中的效用 本領(lǐng)域中描述了許多用于將特定肽連接于微量滴定板或微陣列的化學(xué)(Dent et al.，1998，Bioconjugation，Macmillan Reference Ltd，Chapter8505-556)。在最廣泛的意義上，連接可以分成共價和非共價模式。這兩種連接類型在這里均有展示(見非共價連接，實(shí)施例7)。這里描述的實(shí)施例詳細(xì)描述了通過馬來酰亞胺活化的板進(jìn)行共價連接的方法。
肽通過活化的表面基團(tuán)與微量滴定板的共價連接在原子共享電子而生成化學(xué)鍵時發(fā)生。雖然形成這些鍵的反應(yīng)在理論上總是可逆的，但是實(shí)際上發(fā)生逆反應(yīng)的概率很低，以致可以認(rèn)為產(chǎn)物是永久性的(Dent et al.，Bioconjugation，Macmillan Reference Ltd，1998，p.218-342)。肽連接的實(shí)質(zhì)上的不可逆性，具有形成非常穩(wěn)定的、不會發(fā)生生物分子的損失、置換或表面遷移的效應(yīng)物-GBD基質(zhì)(matrix)的潛在優(yōu)勢(Larsson et al.，1987，J.Immunol.Meth，98129135；Dent et al.，1998，BioconjugationProtein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences，Chapter 8，Other Categories of proteinCoupling，p.505-556)。出于這個原因，我們決定深入探討共價連接模式(但也參見實(shí)施例7的非共價連接)。
有多種類型共價連接板化學(xué)可以用來將肽與板連接，包括但不僅限于，共價偶聯(lián)伯胺基團(tuán)的N-琥珀酰亞胺酯(NOS)表面(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)和與脂肪族碳-氫鍵反應(yīng)的Univer-BINDTM板(Corning，Inc.，NY)。本實(shí)施例中描述的板化學(xué)是馬來酰亞胺板，它們可商購，并設(shè)計成通過可用的-SH部分(其通常來自偶聯(lián)肽內(nèi)的半胱氨酸殘基)來固定生物分子。馬來酰亞胺活化的微量培養(yǎng)板的實(shí)例包括，但不僅限于，聚苯乙烯微量培養(yǎng)板如Costar’s巰基結(jié)合板和條(Costar’s Sulfhyryl Binding Plates and Strips，Corning，Inc.Corning，NY)，Reacti-BindTM馬來酰亞胺活化板(PierceBiotechnology，Inc.Rockford，IL)，和馬來酰亞胺活化微孔板--巰基-TRAPTM(NoAb Biodiscoveries，Inc.Mississauga，Ontario，Canada)。通過半胱氨酸殘基的連接為工程化產(chǎn)生含有單個半胱氨酸從而可以在板上定向的肽提供了機(jī)會(見實(shí)施例1)。預(yù)計均一的效應(yīng)物定向可產(chǎn)生重復(fù)性更高、整體變異系數(shù)更低的板(Dent et al.，1998，BioconjugationProtein Coupling Techniques forthe Biomedical Sciences，Chapter 8，Other Categories of protein Coupling，p.505-556)。
材料和方法 效應(yīng)物GBD肽共價附接于馬來酰亞胺板 將效應(yīng)物-GBD肽(ROCK1，POSH或WASP，見表2)在包被緩沖劑(PBSpH 7.2加1mM EDTA)中稀釋到最終濃度為0.05mg/ml，并將5μg肽添加到馬來酰亞胺板(Corning Inc.，批號2510)的孔中。將板在21℃溫育2小時，在PBS pH 7.2中清洗2次。將板在室溫下用牛奶(典型地為0.1-5％，取決于效應(yīng)物-GBD)封閉1小時。用PBS(pH 7.2)清洗2次后，向每個孔添加凍干緩沖劑(5％蔗糖和1％葡聚糖)，將板凍干并干燥貯存在4℃。
組成型活性重組Rho蛋白質(zhì) Rho A第63位氨基酸或者Rac1和Cdc42第61位氨基酸由谷氨酰胺突變成亮氨酸，將產(chǎn)生不能水解GTP而成為組成型活性的肽(Xu et al.，1994，J.Biol.Chem.，26923569-23574；and Nobes et al.，1994，Curr.Op.Gen.Dev.，477-81)。所述突變體蛋白可作為帶組氨酸標(biāo)簽的肽商購(Cytoskeleton Inc.批號R6301(組成型活性的RhoA)、R6101(組成型活性的Rac1)和C6101(組成型活性的Cdc42)。典型地，將組成型活性蛋白質(zhì)在細(xì)胞裂解緩沖劑(50mMTris pH 7.5，300mM NaCl，2％IGEPAL，0.01％SDS，和10mM MgCl2)中稀釋到0.2ng/μl，一次G-LISA測定中使用1-5ng蛋白質(zhì)。
體外制備負(fù)載核苷酸的細(xì)胞裂解物 可以使細(xì)胞裂解物負(fù)載GTP、GTPγS或GDP，并廣泛用作標(biāo)準(zhǔn)沉降測定的對照(Knaus et al.，1992，J.Biol.Chem.，26723575-23582)。人工負(fù)載的裂解物也可為給定G-LISA測定的開發(fā)提供穩(wěn)健的底物。將細(xì)胞裂解緩沖劑(50mM Tris pH 7.5，300mM NaCl，2％IGEPAL，0.01％SDS，和10mM MgCl2)中4mg/ml的人血小板提取物通過4℃ 8,000g離心3分鐘進(jìn)行澄清。添加EDTA至終濃度15mM。向不同等份的澄清裂解物中添加GTPγS、GTP或GDP至終濃度1mM。將每種裂解物在室溫下溫育15分鐘，以容許向Rho蛋白質(zhì)交換(加載)核苷酸。添加60mM MgCl2終止加載反應(yīng)。將裂解物在細(xì)胞裂解緩沖劑中稀釋至0.5mg/ml，并用于G-LISA測定。典型地，每次G-LISA測定使用7-15μg負(fù)載的血小板細(xì)胞裂解物。在本實(shí)施例中，將負(fù)載有GTP的血小板稱作不穩(wěn)定(labile)GTP提取物。
G-LISA測定 將活性Rho蛋白質(zhì)(典型地，7-15μg總細(xì)胞裂解物或1-5ng組成型活性重組蛋白質(zhì))直接添加到結(jié)合有效應(yīng)物的G-LISA板(Rac1和Cdc42G-LISAs)，或者用等體積的結(jié)合緩沖劑(20％PEG 8000，Sigma，St.Louis，MO)稀釋后添加到結(jié)合有效應(yīng)物的板(RhoA G-LISA)。將反應(yīng)物于4℃在微量滴定板搖床上溫育30分鐘，之后用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％ Tween-20)清洗孔1次，并立即用200μl抗原提呈緩沖劑(1％三氯乙酸(TCA))室溫處理孔2-5分鐘。然后，將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再添加第一抗體，典型地為1μg/ml(RhoA特異)、0.25μg/ml(Rac1特異)、1μg/ml(Cdc42特異)，并在室溫溫育45分鐘(4℃溫育得到相似的結(jié)果)。將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再與合適的第二抗體在室溫下溫育45分鐘(4℃溫育得到相似的結(jié)果)。對于RhoA和Rac1反應(yīng)，使用2μg/ml山羊抗小鼠第二抗體，對于RhoA，B，C反應(yīng)，使用0.5μg/ml驢抗雞第二抗體，對于Cdc42反應(yīng)，使用0.5μg/ml山羊抗綿羊第二抗體。將孔用PBST每次200μl清洗3次后，利用吸光度或發(fā)光檢測法來檢測活化的Rho蛋白質(zhì)，如下文所述。
用吸光度或發(fā)光測定法測量G-LISA測定 添加50μl OPD底物(Sigma批號P9187)，在37℃保持15分鐘，隨后添加50μl終止緩沖劑(1M硫酸)，之后用分光光度計(SpectraMax 250，Molecular Devices)測量OD490的吸光度。添加50μl lumigen試劑(LumigenInc.，批號PSA-100)，典型地設(shè)置為100-150增益和10-100ms積分，用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)測量發(fā)光。
抗體 在本實(shí)施例中用于G-LISA測定的第一抗體和第二抗體，以及當(dāng)在其他實(shí)施例中被提及用于G-LISA測定時的第一抗體和第二抗體，是下列抗體抗-RhoA(批號BK124中的克隆384或Part#GL01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，抗-RhoA，B，C(批號BK120中的克隆419或Part#GL04)，抗-Rac1(批號BK122h中的Part# GL06，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，抗-Cdc42(批號ACD02，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)，山羊抗小鼠和驢抗綿羊抗體(批號115-035-068和313-005-045，Jackson ImmunoResearch labs.Inc.，West Grove，PA)。
結(jié)果 效應(yīng)物-GBD馬來酰亞胺板對于檢測特異性Rho GTP酶的效用 對于給定的Rho GTP酶的細(xì)胞水平，已公開的估計值典型地為每個細(xì)胞1 x 10-4ng的范圍(2003，J.Immunol.，1705652-5657；和Quinn et al.，1993，J.Biol.Chem.，26820983-20987)。而且，根據(jù)公開的數(shù)據(jù)可以假定，一種特定Rho GTP酶中典型地有大約2-10％會響應(yīng)于任何特定的刺激而活化(Ren etal.，1999，EMBO J.，18578-585；Bernard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；和Werner et al.，2002，J.Cell Biol.，158357-368)。進(jìn)一步，根據(jù)公開的數(shù)據(jù)，一個標(biāo)準(zhǔn)沉降測定典型地需要1 x 106-1 x 107個細(xì)胞或300-800μg總細(xì)胞蛋白(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272；和Werner et al.，2002，J.Cell Biol.，158357-368)，這個量的裂解物相當(dāng)于大約100-1000ng的特定Rho蛋白質(zhì)(活化和非活化構(gòu)象合起來)。因此，假定有2-10％的特定Rho GTP酶響應(yīng)于特定刺激而活化，則在標(biāo)準(zhǔn)沉降測定中關(guān)注相應(yīng)于2-100ng范圍的活化RhoGTP酶的信號。
考慮到上面的計算，使用5ng重組組成型活性Rho GTP酶進(jìn)行G-LISA初始試驗(yàn)。該蛋白量被認(rèn)為接近于沉降測定的較低檢測水平(lower levels ofdetection)，并且，由于希望最終使用的細(xì)胞裂解物遠(yuǎn)少于300-800μg，所以應(yīng)設(shè)計初始試驗(yàn)以獲得相當(dāng)嚴(yán)格的檢測水平。使用組成型活性形式的RhoGTP酶是初始試驗(yàn)的合理選擇，因?yàn)樗鼈兪敲鞔_且易于解釋的系統(tǒng)。
典型地，Rho效應(yīng)物與活化Rho蛋白質(zhì)的多于一種同型(isotype)結(jié)合(見實(shí)施例1，表1)。例如，ROCK1(和ROCK1-GBD)識別RhoA、RhoB和RhoC以及RhoE/Rnd3的活化形式(Fujisawa，1996，J.Biol.Chem.，27123022；和Riento et al.，2003，Mol.Cell.Biol.，234219)。因此，特定G-LISA測定的特異性取決于效應(yīng)物和抗體二者的選擇。所以，在一個ROCK1-GBD板的實(shí)例中(圖2A)，RhoA特異性是通過組合使用ROCK-GBD板與RhoA特異抗體(克隆384)來提供的。
參考圖2A，按照“材料和方法”中的詳述，對僅裂解緩沖劑(空白)，5ng RhoA(63L)、Cdc42(61L)或Rac1(61L)進(jìn)行RhoA G-LISA測定，并按照“材料和方法”中描述的發(fā)光測定法(luminometry)檢測RhoA信號。圖2A顯示，組合使用ROCK1-GBD馬來酰亞胺板(ROCK板)和RhoA特異抗體(克隆384)，以5ng組成型活性RhoA產(chǎn)生的信號是背景(僅緩沖劑)的6倍高。對于該板，組成型活性Cdc42和Rac1未產(chǎn)生高于背景的信號。因此可以得出結(jié)論，該ROCK1-GBD板能夠結(jié)合活性RhoA，且該RhoA抗體能夠特異地檢測到高于背景的該水平的蛋白質(zhì)。抗體384對RhoA特異，如圖7A所證實(shí)的。經(jīng)測試，Rho靶蛋白-Cys效應(yīng)物-GBD選擇性結(jié)合RhoA。這種經(jīng)修飾地效應(yīng)物-GBD對于組成型活性RhoA所產(chǎn)生信號是背景的6倍高(數(shù)據(jù)未顯示)。
參考圖2B，按照“材料和方法”中的詳述(實(shí)施例2)，對僅裂解緩沖劑(空白)，5ng Rac1(61L)或RhoA(63L)進(jìn)行Rac1G-LISA測定，并按照“材料和方法”中的描述，通過490nm吸光度來檢測Rac1信號(實(shí)施例2)。類似地，圖2B顯示，組合使用Rac1特異性抗體(GL06，批號BK122h)和結(jié)合POSH的馬來酰亞胺板(POSH板)，以5ng組成型活性Rac1給出的信號是背景的9倍高。正如預(yù)期的那樣，組成型活性RhoA給出的信號幾乎不高于背景。
參考圖2C，按照材料和方法中的詳述對僅裂解緩沖劑(空白)，5ngCdc42(61L)或Rac1(61L)進(jìn)行Cdc42G-LISA測定(實(shí)施例2)，并按照如材料和方法中的描述通過490nm吸光度來檢測Cdc42信號(實(shí)施例2)。圖2C顯示，與Cdc42特異抗體(批號ACD02，Cytoskeleon Inc.，Denver，CO)組合使用的WASP結(jié)合馬來酰亞胺板(POSH板)對5ng組成型活化Cdc42發(fā)出的信號是背景的5倍。正如預(yù)期，組成型活化Rac1給出的信號不高于背景。
總之，圖2中的數(shù)據(jù)證明，連接馬來酰亞胺的效應(yīng)物-GBD保持識別其靶標(biāo)活性Rho GTP酶的能力。而且，與合適的抗體組合后，能夠檢測低納克水平的特定活性Rho GTP酶。
效應(yīng)物-GBD馬來酰亞胺板對于區(qū)分活化和非活化Rho GTP酶的效用 G-LISA不但應(yīng)該檢測特定的活化Rho GTP酶，它們還必須能夠區(qū)分特定Rho蛋白質(zhì)的活化(GTP結(jié)合)和非活化(GDP結(jié)合)狀態(tài)。使用人工負(fù)載的血小板提取物，對效應(yīng)物-GBD馬來酰亞胺板進(jìn)行了測試(詳見“材料和方法”)。本實(shí)施例中的人工負(fù)載提取物的內(nèi)源GTP酶已經(jīng)在體外被加載了GTPγS(一種可緩慢水解的GTP類似物)或GDP。因?yàn)镚TPγS是基本上不可水解的，所以來自活化樣品的信號非常穩(wěn)定。這與正常的細(xì)胞裂解物相反，在正常細(xì)胞裂解物中，Rho GTP酶容易發(fā)生由GTP酶活化蛋白(GAP)增強(qiáng)的GTP水解并因此失活(Moon et al，2003，Trends Cell Biol.，1313-22)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)，在需要穩(wěn)健的Rho活化(典型地>10％活化)同時有限地涉及Rho水解的場合，含有人工負(fù)載的固定活化狀態(tài)的內(nèi)源Rho蛋白質(zhì)的裂解物是有用的(Liseti et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
參考圖3A，將僅裂解緩沖劑、25μl GDP或GTPγS標(biāo)記的血小板提取物(0.5mg/ml)(或15μg)與相同體積的結(jié)合緩沖劑混合，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RhoAG-LISA測定。按照“材料和方法”所述通過發(fā)光測定法檢測RhoA信號。使用ROCK-GBD馬來酰亞胺板。結(jié)果顯示，ROCK板的結(jié)合性質(zhì)使得清晰區(qū)分活性RhoA(GTPγS)和非活性(GDP)RhoA成為可能，在此測定中活性RhoA的信號是非活性RhoA的7倍高。
參考圖3B，按照“材料和方法”中的詳細(xì)敘述，對50μl的僅裂解緩沖劑，GDP或GTPγS標(biāo)記的血小板提取物(0.5mg/ml)(或15μg)進(jìn)行Rac1G-LISA測定。按照“材料和方法”所述通過490nm吸光度檢測Rac1信號。使用POSH-GBD馬來酰亞胺板。結(jié)果顯示，POSH板的結(jié)合性質(zhì)使得清晰地區(qū)分活性Rac1(GTPγS)和非活性(GDP)Rac1成為可能，在此測定中活性Rac1的信號是非活性Rac1的30倍高。
總之，圖3中的數(shù)據(jù)表明，馬來酰亞胺連接的效應(yīng)物-GBD保持了區(qū)分特定Rho GTP酶的活性形式與非活性形式的能力。而且，活性Rho GTP酶信號可以利用基于發(fā)光測定法(圖2A)或吸光度(圖2B)的方法加以檢測。
實(shí)施例3用于G-LISA的抗原提呈緩沖劑的開發(fā) 最初嘗試在RhoA:ROCK和Rac1:POSH G-LISA測定中檢測活性RhoGTP酶沒有成功，因?yàn)闊o法獲得在這兩種測試的任一種中顯著高于背景的信號(圖5A(未處理)和5B(無APB))。最初的一種策略是按照與原本的沉降測定法基本上類似的規(guī)程來開發(fā)基于ELISA的測定法，其中原本的沉降測定法是Benard等描述的用于Rac1:PAK沉降測定(1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)的沉降測定法，以及Ren等和Kranenburg等描述的用于RhoA:Rho靶蛋白沉降測定的沉降測定法(分別為1999，EMBO J.，18578；和1999，Mol.Biol.Cell，101851-1857)。相同的程序還被用于利用ROCK、Citron、Dia和WASP的沉降測定(Kimura et al.，2000，J.Biol.Chem.，27517233-17236，和Edlund et al.，2002，Mol.Biol.Cell，13902-914)。簡而言之，用效應(yīng)物包被馬來酰亞胺板，將溶于標(biāo)準(zhǔn)沉降裂解緩沖劑(對于RhoA測定是50mM Tris，pH 7.2，1％Triton X-100，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，500mM NaCl，10mM MgCl2；對于Rac1和Cdc42是50mM Tris，pH 7.5，10mMMgCl2，200mM NaCl，1％Nonidet P-40，5％甘油)中的活性Rho GTP酶導(dǎo)入孔內(nèi)，并在4℃震蕩(400rpm)溫育1小時，然后用標(biāo)準(zhǔn)沉降清洗緩沖劑(對于RhoA測定是50mM Tris，pH 7.2，1％Triton X-100，150mM NaCl，10mMMgCl2；對于Rac1是25mM Tris，pH 7.6，1mM DTT，30mM MgCl2，40mMNaCl，1％Nonidet P-40)清洗孔，分別用Rho GTP酶特異性第一抗體(對于RhoA是批號ARH01，Cytoskeleton Inc.，對于Rac1是批號ARC01，Cytoskeleton Inc.)和抗小鼠或抗兔第二抗體(Jackson Labs)對反應(yīng)物進(jìn)行顯色。在TBST中清洗3次后，利用吸光度或發(fā)光檢測對反應(yīng)物進(jìn)行顯色。添加50μl OPD底物(Sigma批號P9187)在37℃保持15分鐘，隨后添加50μl終止緩沖劑(1M硫酸)，再用分光光度計(SpectraMax 250，Molecular Devices)測量OD490吸光度。添加50μl lumigen試劑(Lumigen Inc.，批號PSA-100)后用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)測量發(fā)光，典型的設(shè)置是100-150增益和10-100ms積分。應(yīng)當(dāng)注意，使用了基于ELISA的抗體濃度優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)棋盤滴定(Crowther，2001，Meth.Mol.Biol.，14983-113)。此外，這些G-LISA測定中使用的抗體已被證明在沉降測定中工作非常良好(它們是CytoskeletonPull-Down Assay Kits，批號BK034(Cdc42)，BK035(Rac1)和BK036(RhoA)中的組分)。還對各種阻斷劑、反應(yīng)緩沖劑、溫育溫度和抗體稀釋緩沖劑進(jìn)行了廣泛的試驗(yàn)。G-LISA不能在已應(yīng)用于所有沉降測定的標(biāo)準(zhǔn)條件下工作，表明這兩種測定模式之間存在一種或多種根本性的差異。
不受限于任何特定的理論，G-LISA方法在標(biāo)準(zhǔn)沉降條件下失敗的一個可能的原因，可能是使用了極低濃度的與板結(jié)合的效應(yīng)物——這將在下一個實(shí)施例中(在G-LISA中使用結(jié)合緩沖劑)加以討論。還有可能是，在沉降測定的Western印跡分析中能夠識別信號的抗體在G-LISA模式中不能識別Rho GTP酶——這種可能性在實(shí)施例5中(用于G-LISA測定的優(yōu)化抗體的開發(fā))加以討論。還有一種可能，同時也是本實(shí)施例在這里討論的主題，是G-LISA效應(yīng)物GTP酶復(fù)合體在G-LISA測定的溫育過程中被損失。
沉降測定用結(jié)合了效應(yīng)物的珠子或盤來捕獲活性Rho GTP酶，經(jīng)過清洗步驟后，必須將活性Rho GTP酶從珠子上洗脫下來，以便通過Western印跡檢測加以分析(Benard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；Renet al.，1999，EMBO J.，18578；Kranenburg at al.，1999，Mol.Biol.Cell，101851-1857；和Sun et al.，2006，Microcirculation，13237-247)。Rho GTP酶沉降測定與G-LISA測定之間的一個主要差異是，G-LISA測定依賴于在整個測定中與結(jié)合效應(yīng)物的固體支持基質(zhì)(例如但不限于微量滴定板)聯(lián)結(jié)的Rho GTP酶。本文公開的實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)的一個目的是a)確定在整個G-LISA中是否有GTP酶從固體基質(zhì)的任何解離，和b)如果有需要，確定防止Rho GTP酶損失的方法，從而為Rho GTP酶活化獲取定量的結(jié)果。
材料和方法 G-LISARho GTP酶效應(yīng)物結(jié)合的Western分析 使用組成型活性RhoA GTP酶蛋白質(zhì)(R63)和能夠水解GTP的GTP負(fù)載血小板提取物來檢查效應(yīng)物GTP酶的隨時間的解離。G-LISA測定如下進(jìn)行將R63蛋白質(zhì)(每個測定10ng)或GTP負(fù)載血小板提取物(25μg)與結(jié)合于馬來酰亞胺板的ROCK-GBD效應(yīng)物共溫育，溫育在4℃、400rpm震蕩下進(jìn)行30分鐘。用200μl TBST清洗反應(yīng)物2次以除去未結(jié)合的Rho GTP酶。此時，用SDS緩沖劑(5％SDS，63mM Tris pH 6.8，5％巰基乙醇，10％甘油)從數(shù)個孔洗脫樣品，合并用于后面的western分析。將剩余的反應(yīng)物在第一抗RhoA抗體(克隆384)中室溫400rpm震蕩下溫育45分鐘。在TBST中清洗3次后，如上所述地用SDS緩沖劑洗脫數(shù)個孔內(nèi)的樣品并保存用于后面的分析。剩余的反應(yīng)物在第二抗雞抗體中室溫400rpm震蕩溫育45分鐘。在TBST中清洗3次后，如上所述地從數(shù)個孔將樣品洗脫在SDS緩沖劑中并保存用于后面的分析。使用抗RhoA的小鼠單克隆抗體進(jìn)行Western分析。
Rho抗原提呈緩沖劑試驗(yàn) 用等體積的結(jié)合緩沖劑(20％ PEG 8000，Sigma，St.Louis，MO)稀釋負(fù)載有GTPγS或GDP核苷酸的血小板細(xì)胞裂解物(每個測定10μg總細(xì)胞裂解物)，然后加到ROCK效應(yīng)物結(jié)合板中。將反應(yīng)物于4℃在微量滴定板搖床溫育30分鐘，之后用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％ Tween-20)清洗孔1次，并立即用如下的化學(xué)/物理處理之一進(jìn)行處理在200μl PBS存在下微波3分鐘；干燥微波3分鐘；在200μl 8M尿素存在下微波3分鐘；200μl甲醇2分鐘；200μl乙醇2分鐘；200μl 0.5％ SDS 2分鐘，室溫下200μl 10％三氯乙酸(TCA)2分鐘。然后將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再添加RhoA第一抗體(B384)至1μg/ml，室溫溫育45分鐘。將孔用PBST清洗3次，每次200μl，再與抗小鼠第二抗體(Jackson Labs)室溫溫育45分鐘。將孔每次用200μl PBST清洗3次后，用發(fā)光檢測法檢測活化Rho蛋白質(zhì)。發(fā)光是在添加50μl lumigen試劑(Lumigen Inc.，批號PSA-100)后，用SpectroFluor Plus(Techan Inc.)進(jìn)行測量的。
TCA在Rac1G-LISA中益處的測試 將溶于細(xì)胞裂解緩沖劑中的組成型活性重組Rac1(5ng)，或者僅細(xì)胞裂解緩沖劑，直接添加到POSH效應(yīng)物結(jié)合G-LISA板上。將反應(yīng)物于4℃在微量滴定板搖床上溫育30分鐘，之后用200μl PBST(PBS pH 7.2，0.05％Tween-20)清洗孔1次，并立即在室溫下用200μl抗原提呈緩沖劑(1％三氯乙酸(TCA))處理2-5分鐘。然后將孔用PBST清洗3次，每次200μl，并添加第一Rac1抗體至1μg/ml，在室溫下溫育45分鐘。將孔用PBST清洗3次，每次200μl，然后在室溫下與抗小鼠第二抗體溫育45分鐘。將孔用200μl PBST清洗3次后，用吸光度檢測法來檢測活化的Rho蛋白質(zhì)。吸光度的測量如下添加50μl OPD底物(Sigma批號P9187)，在37℃保持15分鐘，然后添加50μl終止緩沖劑(1M硫酸)，用分光光度計(SpectraMax 250，Molecular Devices)測量OD490。
結(jié)果 為了檢查在允許GTP水解的系統(tǒng)中GTP酶與效應(yīng)物的解離，在ROCK包被的馬來酰亞胺板中對25μl GTP標(biāo)記的血小板提取物(2mg/ml)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)RhoA G-LISA。在G-LISA測定的不同階段用SDS緩沖劑洗脫結(jié)合的活化RhoA。在G-LISA測定的不同階段(在ROCK板中溫育30分鐘后(泳道1)，第一抗體溫育45分鐘后(泳道2)，第二抗體溫育90分鐘后(泳道3))用SDS緩沖劑洗脫結(jié)合的RhoA。然后對洗脫的Rho進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗RhoA抗體進(jìn)行Western印跡。為了檢查在不允許GTP水解的系統(tǒng)中GTP酶與效應(yīng)物的解離，對10ng RhoA(63L)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RhoA G-LISA。在G-LISA測定的不同階段(在ROCK板中溫育30分鐘后(泳道4)，第一抗體溫育45分鐘后(泳道5)，第二抗體溫育90分鐘后(泳道6))用SDS緩沖劑洗脫結(jié)合的RhoA(63L)。然后對洗脫的Rho進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗RhoA抗體進(jìn)行Western印跡。上圖和下圖相同，只是顯影底片的曝光長度不同。較短的曝光允許更加定量地觀察63L信號，而較長的曝光更宜于觀察內(nèi)源RhoA樣品中的信號損失。由于63L上存在His標(biāo)簽，63L重組組成型活性RhoA蛋白質(zhì)比內(nèi)源RhoA上行更高。
圖4的結(jié)果顯示，來自水解缺陷突變體RhoA蛋白質(zhì)(L63)的活性RhoA信號在第一抗體溫育后減少10％(圖4，比較泳道4和5)，在第二抗體溫育結(jié)束時減少40％(圖4，比較泳道4和6)。負(fù)載GTP的RhoA樣品的信號在第一抗體溫育后降低60％(圖4，比較泳道1和2)，在第二抗體溫育后降低>90％(圖4，比較泳道1和3)。GTP樣品中信號損失的增強(qiáng)很可能是由于測定期間的GTP酶水解(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359)。在這點(diǎn)上，負(fù)載有GTP的血小板提取物的信號隨時間的損失也顯著高于負(fù)載有非可水解GTPgS的血小板樣品(數(shù)據(jù)未顯示)。綜合考慮，該數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持這一點(diǎn)，即該測定中的RhoA信號損失是簡單解離和由GTP水解所致的RhoA失活引起的解離二者所造成的。在這點(diǎn)上，嘗試了通過在4℃進(jìn)行抗體溫育和使所有緩沖劑保持在4℃來減慢解離，但未能改善測定的信噪比(數(shù)據(jù)未顯示)。
總之，需要開發(fā)防止或使反應(yīng)中GTP酶的損失最小化的測定條件。
我們對數(shù)種抗原復(fù)合物穩(wěn)定性物理(熱變性)和/或化學(xué)處理進(jìn)行了評估。在初始研究中，我們選擇了交聯(lián)劑如戊二醛，蛋白沉淀試劑如甲醇、乙醇和三氯乙酸(TCA)，離液劑如尿素，和變性劑如十二烷基磺酸鈉(SDS)。
參考圖5A，對僅裂解緩沖劑(未處理)、15μg GDP-或GTPγS-標(biāo)記血小板提取物進(jìn)行了RhoA G-LISA測定。在溫育提取物后，用MW+PBS，MW/干燥，MW/8M尿素，甲醇，乙醇，0.5％ SDS，10％TCA對板進(jìn)行處理或不處理，然后進(jìn)行抗體溫育和發(fā)光檢測。MW＝5分鐘微波處理。白色條形顯示GDP信號，灰色條形顯示GTPγS信號。參考圖5B，對僅裂解緩沖劑(空白)或5ng Rac1(61L)按照“材料和方法”中所述進(jìn)行Rac1 G-LISA測定，只是測定使用或者不使用抗原提呈緩沖劑處理(分別為“1％TCA”或“無APB”)，按照“材料和方法”中所述通過490nm吸光度檢測Rac1信號。
我們發(fā)現(xiàn)，數(shù)種化學(xué)和/或物理處理，例如在8M尿素存在下組合使用微波(熱變性)，顯著地改善了G-LISA測定中活性RhoA蛋白質(zhì)的檢測(MW+尿素8M，圖5A)。在PBS中微波產(chǎn)生的GTPγS結(jié)合信號大大增加。然而，高cv值是這種方法的一個問題(MW+PBS，圖5A)。無緩沖劑存在下微波，GTPγS和GDP樣品間的區(qū)分較差(MW+干燥，圖5A)。在所測試的其它處理方法中，戊二醛(數(shù)據(jù)未顯示)和乙醇對于活性RhoA給出高于背景的持續(xù)正信號(圖5A)。用甲醇或0.5％SDS處理對活性RhoA則沒有給出任何高于背景的顯著信號。用200μl 10％TCA在室溫下將板處理2分鐘，給出的GDPRhoA信號是GTPγS RhoA信號的大約8倍高(10％ TCA，圖5A)。
通過進(jìn)一步的研究，我們發(fā)現(xiàn)，在所測試的包括乙酸(數(shù)據(jù)未顯示)在內(nèi)的數(shù)種酸性條件中，用1％ TCA在室溫下將效應(yīng)物GTP酶復(fù)合物(清洗之后)處理2分鐘是用于RhoA:ROCK和Rac1:POSH G-LISA測定的抗原提呈緩沖劑處理的合適選擇。圖5B中顯示了抗原提呈緩沖劑在Rac1:POSH G-LISA中的益處。在抗原提呈緩沖劑中溫育2分鐘，產(chǎn)生7倍于背景的組成型活性Rac1(5ng)的信號。省略抗原提呈緩沖劑則導(dǎo)致測定法不能檢測到高于背景(僅細(xì)胞裂解緩沖劑)的活性Rac1。
討論 在測試的所有G-LISA模式中均發(fā)現(xiàn)在抗體溫育期間有信號損失發(fā)生，然而損失的程度隨被分析的效應(yīng)物GTP酶對而有所不同。例如，當(dāng)不存在TCA時，RhoA:ROCK，Rac1:POSH，Rac1:PAK1(圖9)損失>80％的信號，而Rho-Dia1僅損失大約50％，Cdc42:WASP的信號僅損失20％(數(shù)據(jù)未顯示)。Rho效應(yīng)物-GBD肽可顯著減慢Rho蛋白質(zhì)GTP水解的本征速率，但并不阻止該過程(Leonard et al.，1997，Biochem.，361173-1180；和Bernard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)。因此，GTP酶解離發(fā)生的程度取決于，除了其他因素之外，特定效應(yīng)物對其活性GTP酶靶標(biāo)的親和力，以及效應(yīng)物防止其GTP酶靶標(biāo)的GTP水解的能力。
預(yù)計可提高Rho GTP酶信號損失的另一個因素是GTP酶的高本征水解速率。在這點(diǎn)上，Ras GTP酶的GTP水解本征速率大大低于Rho GTP酶(Nealet al.，1989，J.Biol.Chem.，26110963；和Self et al.，1995，Meth.Enz.，25667-76)。因此，對于基于Ras的G-LISA測定而言，水解造成的信號損失問題可能不會這么大。例如，公開的Rac1:PAK和Ras:Raf1的親和力均大約為20nM。因此，可以預(yù)知，盡管效應(yīng)物親和力相似，Ras測定對于抗原提呈緩沖劑的依賴性，將大大低于明顯受益于該步驟的Rac1:PAK測定(圖9)。
我們測試了數(shù)種化學(xué)和物理處理降低Rho GTP酶損失的能力。盡管其中的許多處理，例如8M尿素結(jié)合熱處理，提供了更高的信號，但是發(fā)現(xiàn)，用1％(60mM)TCA在室溫下對復(fù)合物處理2分鐘，似乎是復(fù)合物穩(wěn)定化的合適方法。
我們用多種效應(yīng)物GTP酶組合，包括RhoA:Rho靶蛋白、RhoA:Dia1、RhoA:ROCK、Rac1:PAK和Rac1:POSH，對TCA處理進(jìn)行了測試。在測試的全部實(shí)例中，TCA處理均提高了信號。一些G-LISA，例如RhoA:ROCK和Rac1:POSH(圖5A和5B)，顯示對TCA抗原提呈緩沖劑有很大益處，而其他的G-LISA，例如RhoA:Dia1，在用TCA處理時則給出更高的RhoA信號(數(shù)據(jù)未顯示)。還發(fā)現(xiàn)抗原提呈緩沖劑對于采用PAK-GST和Rho靶蛋白-GST非共價板的G-LISA測定同樣具有益處(見圖9，和數(shù)據(jù)未顯示)。這表明，Rho GTP酶損失不大可能受到特定板化學(xué)的影響，因此可能是G-LISA測定模式的一個普遍特征。
這里的發(fā)現(xiàn)預(yù)示，通過抗原提呈緩沖劑或類似物處理降低Rho GTP酶從G-LISA固體支持物上的損失，在開發(fā)任何特定的Rho G-LISA測定的過程中均為一項重要參數(shù)。就該方面而言，解離具有時間依賴性，這一事實(shí)也可以在任何效應(yīng)物Rho G-LISA測定的通用開發(fā)方案中加以利用。例如，90分鐘溫育后的解離(對于組成型活化RhoA是40％，對于野生型RhoA是90％)顯著大于45分鐘溫育后的解離(分別為10％和60％)這一事實(shí)，可能提示人們采用這樣的方案利用偶聯(lián)HRP的第一抗體等來最大程度地縮短測定時間。采用這種方案，有可能減少或者不再需要抗原提呈緩沖劑的存在。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可有效地利用這里公開的信息設(shè)計任何Rho G-LISA測定。
實(shí)施例4在G-LISA中使用結(jié)合緩沖劑 正如在前面實(shí)施例中提到的，簡單地將沉降測定改造適用于ELISA型系統(tǒng)時，G-LISA測定不能工作。在此我們推斷，低水平的效應(yīng)物(<1μg)和蛋白裂解物(6-15μg總裂解物)可能低于效應(yīng)物GTP酶結(jié)合所需的臨界濃度。因此，引入能夠提高蛋白蛋白相互作用的化合物或試劑有可能將結(jié)合平衡推向有利于效應(yīng)物GTP酶復(fù)合物的形成。因此，測試了蛋白蛋白相互作用增強(qiáng)劑，例如聚乙二醇(polyethyethylene glycol)等，在G-LISA反應(yīng)中的作用(Kozer et al.，2004，J.Mol.Biol.，336763-740；和Ingham，1990，Meth.Enz.，182301-306)。
材料和方法 活化細(xì)胞裂解物的制備 在補(bǔ)充有10％胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)Swiss 3T3細(xì)胞直到50％匯合。然后對它們血清饑餓24小時，再根據(jù)實(shí)施例8中的詳細(xì)說明，用100μg/ml鈣蛋白酶抑制劑處理30分鐘以活化RhoA。根據(jù)實(shí)施例8中的詳細(xì)說明用EGF處理HeLa細(xì)胞2分鐘以活化Rac1。
結(jié)果 在本實(shí)施例中，評估了向RhoA和Rac1 G-LISA中添加漸增劑量的PEG8000的效果。在RhoA的情形，發(fā)現(xiàn)漸增劑量的PEG(最終濃度0-10％)可使獲自鈣蛋白酶抑制劑處理的Swiss 3T3細(xì)胞的活性RhoA信號提高超過一個數(shù)量級(圖6B，0％PEG比10％PEG)。
參考圖6A，將25μl血清饑餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理(RhoA活化)的Swiss 3T3細(xì)胞裂解物(0.5mg/ml)在存在(+)或不存在(-)結(jié)合緩沖劑(10％PEG 8000，最終濃度)的條件下在室溫水浴中溫育0，10或30分鐘。然后在ROCK馬來酰亞胺板中對樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RhoA G-LISA測定，通過讀取490nm的吸光度進(jìn)行定量。SS是血清饑餓樣品(白色條形)，鈣蛋白酶抑制劑標(biāo)記的RhoA誘導(dǎo)樣品(灰色條形)。參考圖6B，將25μl血清饑餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理(RhoA活化)的Swiss 3T3細(xì)胞裂解物(0.5mg/ml)用等體積的0％、5％、10％、15％或20％PEG 8000稀釋，并立即在ROCK馬來酰亞胺板中對樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RhoA G-LISA測定，樣品通過閱讀490nm的吸光度加以定量。SS是血清饑餓樣品(白色條形)，鈣蛋白酶抑制劑標(biāo)記的RhoA誘導(dǎo)樣品(灰色條形)。參考圖6C，將25μl血清饑餓的或EGF處理(Rac1活化)的Hela細(xì)胞裂解物(1mg/ml)用等體積的0％，5％，10％，15％或20％PEG8000稀釋，并立即在POSH馬來酰亞胺板中對樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Rac1G-LISA測定。樣品通過讀取490nm的吸光度加以定量。SS是血清饑餓樣品(白色條形)，EGF標(biāo)記的Rac1誘導(dǎo)樣品(灰色條形)。在所有情況下，AU＝吸光度單位，全部讀數(shù)均減去了僅緩沖劑的背景。
Rho蛋白質(zhì)在裂解物中非常不穩(wěn)定，這是因?yàn)榇嬖谟写罅靠焖偎釸ho蛋白質(zhì)的GTP酶活化蛋白(GAPs)(Moon et al.，2003，Trends Cell Biol.，1313-22)。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可能認(rèn)為，向含有活性Rho蛋白的裂解物中添加蛋白蛋白相互作用增強(qiáng)劑，更有可能會通過增強(qiáng)Rho:GAP相互作用而增強(qiáng)GTP的快速水解，而不是增強(qiáng)Rho效應(yīng)物相互作用(Ren et al.，1999，EMBO J.，18578)。令人吃驚的是，這里發(fā)現(xiàn)，添加PEG等在室溫下10分鐘后對RhoA信號的影響并不顯著(圖6A，+/-10分鐘)，室溫30分鐘后僅造成RhoA信號微小的損失(圖6A，+/-30分鐘)。圖6A中活化RhoA信號隨時間逐漸降低是由于GTP水解導(dǎo)致RhoA失活的結(jié)果(Benard et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204)。因此，在RhoA G-LISA中，引入PEG“結(jié)合緩沖劑”的步驟有利于產(chǎn)生高度穩(wěn)健的來自活化RhoA的信號。PEG結(jié)合緩沖劑對RhoA G-LISA測定(使用His-ROCK1板)的益處已經(jīng)在數(shù)種不同的細(xì)胞系中得到證實(shí)，例如3T3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞和MDCK細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。
在Rac1的情況下，發(fā)現(xiàn)G-LISA測定中逐漸增加的PEG量(最終濃度從0到10％)與活性Rac1信號的降低相關(guān)(圖6C)。因此，在該情況下，PEG似乎對G-LISA信號有負(fù)作用。有人假設(shè)這是由于Rac GAP蛋白濃度增加導(dǎo)致活性Rac1上GTP的水解增強(qiáng)造成的。在這點(diǎn)上，已有報道說Rac1的GTP水解本征速度和與GAPs的親和力均比RhoA高(Liget et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
討論 引入PEG結(jié)合緩沖劑或類似物對給定G-LISA測定的改善或抑制程度，可能取決于多個交雜的參數(shù)。這包括結(jié)合緩沖劑對特定Rho蛋白的GAP活化GTP水解的作用，特定效應(yīng)物-GBD對特定活性Rho蛋白的結(jié)合常數(shù)，和每個孔結(jié)合效應(yīng)物的量。
實(shí)施例5用于G-LISA測定的優(yōu)化抗體的開發(fā) 如前面的實(shí)施例中提到的，最初在G-LISA測定中實(shí)現(xiàn)活化與非活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之間的差異信號的嘗試沒有產(chǎn)生陽性結(jié)果。先前，通過對從G-LISA板的匯集孔洗脫出的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western印跡分析確定，效應(yīng)物-GBD板能夠捕獲組成型活性Rho GTP酶(見圖4)。這促進(jìn)了用于產(chǎn)生G-LISA優(yōu)化的單克隆抗體的篩選策略的提出。下面的實(shí)施例描述了一種RhoA特異性抗體(克隆384)和一種Rho A，B，C特異性抗體(克隆419)的開發(fā)。
材料和方法 RhoA和RhoA，B，C特異抗體的開發(fā)如下合成Rho肽(CDEHTRRELAKMKQEPVKPEEGRD；SEQ ID NO110)(Bachem Inc.，Kingof Prussia，PA)，并根據(jù)制造商的使用說明，利用Imject試劑盒(Pierce，Rockford，IL 61105；批號0077610)與KLH偶聯(lián)。根據(jù)制造商的使用說明，使用Ellman’s試劑測量游離半胱氨酸(Sigma，St.Louis，MO，批號D8130)，來確定KLH-肽偶聯(lián)的效率。用50μg KLH偶聯(lián)肽免疫6周齡小鼠(BALB/c)。隨后間隔約10-15天進(jìn)行注射。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定和Western印跡測定對血液進(jìn)行重組RhoA(批號RH01，Cytoskeleton Inc.，Denver，CO)測試之后，選擇候選小鼠，并靜脈內(nèi)給予鹽水溶液進(jìn)行最后的加強(qiáng)免疫。3天后處死小鼠。將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，通過ELISA測定抗RhoA和RhoC肽，Western印跡測定抗RhoA、RhoB、RhoC肽和血小板提取物，以及在G-LISA測定中選擇雜交瘤細(xì)胞。在G-LISA篩選中使用負(fù)載GDP或GTPγS的血小板裂解產(chǎn)物(實(shí)施例2中描述的方法)。負(fù)載GTPγS的Rho信號高于負(fù)載GDP的Rho表明抗體在G-LISA測定中可能有用。通過在下列文獻(xiàn)中概述的標(biāo)準(zhǔn)程序產(chǎn)生克隆和純化抗體Harlow and Lane，1988，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。
第二抗體，山羊抗小鼠，從Jackson Immunoresearch Labs.，West Grove，PA(批號115-035-068)獲得。
結(jié)果 在三種不同的測定中篩選雜交瘤標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定，標(biāo)準(zhǔn)Western印跡測定，和Rho G-LISA測定。結(jié)果如下文和圖7A和7B所示。參考圖7A，通過Western印跡對每種抗體(克隆248，362，384，419，465，505，591，603，621，660，733，942，957，977，979，1019，1157，1164，1281，和1324)的標(biāo)準(zhǔn)化稀釋物(1:500)進(jìn)行分析。使用重組Rho A、B和C樣品(每個50ng)和20μg血小板提取物作為樣品，分析抗體特異性和相對靈敏度(Western分級)。以1:10,000的稀釋度使用山羊抗小鼠第二抗體。用化學(xué)發(fā)光檢測(Pierce westDura)對印跡進(jìn)行顯影。將來自血小板提取物的最強(qiáng)信號評為等級#1，最低的評為等級10th，N＝在所用條件下沒有信號。用重組RhoA或RhoC包被標(biāo)準(zhǔn)吸光度ELISA板，并按照標(biāo)準(zhǔn)的基于吸光度的測定法針對兩種抗原測試上述抗體，如下列文獻(xiàn)中的描述AntibodiesA Laboratory Manual，Ed.Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Press，1988，第六章，174-194。將對RhoA具有最強(qiáng)ELISA信號的抗體評級為最高。對于G-LISA測定，在標(biāo)準(zhǔn)RhoA G-LISA測定中用抗體檢測來自ROCK馬來酰亞胺板上12.5μg負(fù)載GDP或GTPγS的血小板提取物的信號。所有抗體僅以1:500稀釋度進(jìn)行測試，抗小鼠第二抗體以1μg/ml的終濃度使用。將給出最高的GTPγS對GDP比值的抗體評級為最高。參考圖7B，顯示了按照圖7A的描述產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)。
克隆362和621給出了最強(qiáng)的ELISA信號，而克隆1157給出的最弱?？贵w特異性也可通過這種篩選加以確定，例如克隆362和621在RhoA和RhoC ELISA中均強(qiáng)烈反應(yīng)，而克隆384和465是RhoA特異的。
Western印跡篩選使用RhoA、RhoB和RhoC重組蛋白和血小板提取物作為抗體組(panel)的潛在靶標(biāo)。根據(jù)從血小板提取物產(chǎn)生的RhoA或RhoA，B，C信號，對圖7A中的克隆加以評級。例如，克隆979給出的信號最強(qiáng)(密度測定)，而克隆248，362，384，465，660，733，942，977，1019，1281和1324在血小板提取物中沒有給出可檢測到的信號。所有的克隆(除克隆1157外)在Western印跡分析中均與一種或多種重組Rho蛋白給出了信號，用該數(shù)據(jù)來確定Rho特異性(圖7A)。
G-LISA測定比較來自負(fù)載GDP(非活性Rho)樣品和負(fù)載GTPγS(活性Rho)樣品的Rho信號。根據(jù)GTPγS對GDP信號的比值對克隆進(jìn)行評級，認(rèn)為比值越高，抗體的希望越大，因此獲得的級別相應(yīng)較高。因此，如圖7A所詳示的，克隆384在G-LISA測定中評級為第一，其GTPγS與GDP比值為50，而克隆1164等級為第二十，比值為0.7。
討論 在本開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，在Western印跡或ELISA測定中的強(qiáng)反應(yīng)性，并不預(yù)示抗體將在G-LISA測定中良好地工作(圖7A和7B)。例如，在20個雜交瘤的G-LISA篩選中表現(xiàn)最好的兩種抗體(分別為克隆384和419)，在ELISA測定中僅在20個中排第6和第8。尤其值得注意的是，被預(yù)測在沉降測定中工作良好的抗體，也就是在western篩選中評級較高那些的抗體，在G-LISA測定中一般沒有良好工作。事實(shí)上，來自G-LISA篩選的表現(xiàn)最好的抗體(克隆384)，在使用血小板提取物的Western印跡篩選中沒有給出可檢測到的信號(圖7A)。類似地，在ELISA測定中評級最高的抗體(克隆362和621)在G-LISA測定中表現(xiàn)非常差，在20個中僅排第16和第18(圖7A)。
實(shí)施例6在G-LISA測定中使用未澄清的裂解物 為了使G-LISA測定在高通量應(yīng)用中更便于用戶使用，人們希望省去澄清步驟，因?yàn)檫@個步驟非常麻煩且不適于HTS模式。在沉降測定的場合，澄清步驟是必要的，因?yàn)樵谇逑床襟E中不能清除細(xì)胞碎片(珠子會和碎片一起離心沉淀)。同樣在沉降測定中，為了進(jìn)行SDS-PAGE而添加SDS凝膠上樣緩沖劑，會產(chǎn)生高度粘稠的樣品(由于DNA釋放)，使得樣品不易處理且western定量困難。基于微量滴定板的測定，例如G-LISA，將不會受到這些缺點(diǎn)的困擾，將能夠通過簡單的清洗步驟除去細(xì)胞碎片。
參考圖8，將25μl血清饑餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理(RhoA活化)的細(xì)胞裂解物(0.5mg/ml)直接使用(“未澄清樣品”)，或者4℃、8,000rpm離心澄清5分鐘(“澄清樣品”)。將裂解物立即在ROCK馬來酰亞胺板上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RhoA G-LISA測定。按照“材料和方法”中所述，通過讀取發(fā)光度對樣品進(jìn)行定量。ALU＝任意光單位。所有的讀數(shù)均減去了僅緩沖劑的背景。
結(jié)果 按照“材料和方法”(實(shí)施例8)中的概述制備了鈣蛋白酶抑制劑處理的和血清饑餓的Swiss 3T3細(xì)胞裂解物。取每種裂解物的一半進(jìn)行澄清，另一半保持未澄清。將全部4種樣品同時在一個RhoA G-LISA測定中進(jìn)行分析(按照實(shí)施例2中的概述)。圖8的結(jié)果清晰地顯示，未澄清裂解物產(chǎn)生的活化信號與澄清裂解物相似。
討論 澄清步驟的需要是沉降測定規(guī)程的一個不可或缺的部分(Ren.et al.，1999，EMBO J.，18578-585；Benard.et al.，1999，J.Biol.Chem.，27413198-13204；Leung et al.，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，10215207-15212；Kimura et al.，2000，J.Biol.Chem.，27517233-17236；Kranenburg et al.，1999，Mol.Biol.Cell，61851-1857；Vouret-Craviari et al.，2002，J.Cell Sci.，1152475-2484；和Subauste et al.，2000，J.Biol.Chem.，2759725-9733)。進(jìn)行無澄清的沉降測定的嘗試結(jié)果導(dǎo)致非特異性細(xì)胞碎片——例如細(xì)胞核和相關(guān)蛋白——的積累。由于在此測定中細(xì)胞碎片和/或相關(guān)蛋白不能與效應(yīng)物GTP酶復(fù)合物分離，樣品很可能混有非活性GTP酶。進(jìn)一步地，嘗試省略沉降測定中的澄清步驟將導(dǎo)致在SDS-PAGE和western測定之前添加SDS上樣緩沖劑時產(chǎn)生高度粘稠的物料。這種高粘度是細(xì)胞核裂解和核酸釋放所致。這導(dǎo)致SDS-PAGE上樣不均勻，結(jié)果使得western定量結(jié)果變異很大。通過例如DNA酶處理或剪切力可以降低黏度，但操作增加使測定更加復(fù)雜，并增加樣品間的變異性的可能。更進(jìn)一步地，在沉降測定中必須引入澄清步驟，導(dǎo)致在GTP酶對GTP水解高度敏感的時刻(也就是，在效應(yīng)物添加之前)增加了額外的處理步驟。具有高本征水解速度RhoGTP酶，例如Rac和Cdc42 GTP酶，都特別容易受這個潛在問題的影響(Ligeti et al.，2004，J.Biol.Chem.，2795055)。
因此，G-LISA測定能夠省去澄清步驟，相對于沉降測定而言是非同一般的重要改進(jìn)。它在GTP酶對由GTP水解導(dǎo)致的失活最敏感的時刻減少了樣品處理時間，從而提高了測定的可重復(fù)性。在此點(diǎn)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知沉降測定具有高cv值(我們的結(jié)果是40-60％，數(shù)據(jù)未顯示)。省去澄清還使樣品處理簡單，并且適于高通量測定，例如診斷和藥物發(fā)現(xiàn)中將使用的高通量測定。沉降測定不適合于這些應(yīng)用。
實(shí)施例7效應(yīng)物-GBDs與谷胱甘肽板的非共價附接 如所有這些實(shí)施例所公開的，將效應(yīng)物-GBD肽連接到板上的方法之一是通過共價附接(covalent attachment)。還研究了非共價附接的使用。這里的實(shí)施例描述了與谷胱甘肽板連接的帶谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽的效應(yīng)物-GBD肽的使用。
材料和方法 將效應(yīng)物-GBD非共價附接于板上 將PAK-GBD-GST肽在包被緩沖劑(PBS；140mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸鈉(二堿價)，1.76mM磷酸鉀(一堿價)pH 7.2)中稀釋到終濃度為0.02mg/ml，并將50μl(1.0μg)蛋白質(zhì)添加到GST-Trap谷胱甘肽包被板(NoAb Biodiscoveries，Ontario，Canada)的各個孔中。將板在室溫溫育1小時。將板在PBS中清洗2次，添加含0.1％BSA的PBS pH 7.2室溫封閉1小時。
參考圖9，按照上文的概述將PAK-GBD-GST肽包被到谷胱甘肽板(NoAb Biodiscoveries)上。使用上述(實(shí)施例2)的標(biāo)準(zhǔn)Rac1 G-LISA測定對GDP、GTPγS和組成型活性Rac1L61進(jìn)行測定。按照“材料和方法”所述(實(shí)施例2)通過490nm吸光度檢測Rac1信號。所有讀數(shù)均減去了僅緩沖劑的背景。
結(jié)果 使用PAK-GBD-GST連接板以G-LISA模式(如實(shí)施例2中詳述的)對負(fù)載了組成型活性Rac1、GTPγS-或GDP-1的血小板進(jìn)行了測定。圖11中的結(jié)果顯示，非共價G-LISA模式能夠鑒定高于背景的組成型活性Rac1(僅緩沖劑)。組成型活性Rac1信號是背景的8倍，與從共價結(jié)合POSH效應(yīng)物的馬來酰亞胺板的產(chǎn)生的信號(圖2B，實(shí)施例2)相似。非共價PAK-GST測定能夠區(qū)分負(fù)載活性與非活性Rac1蛋白質(zhì)(圖9，GTPγS(活性)和GDP非活性)的血小板提取物。盡管本測定相當(dāng)靈敏(8倍活化)，但是沒有POSH連接的馬來酰亞胺板G-LISA(30倍，圖3B，實(shí)施例2)那樣穩(wěn)健。非共價PAK-GST測定在不存在抗原提呈緩沖劑的條件下沒有給出高于背景的信號(圖9，GTPγS無抗原提呈緩沖劑)。
討論 本實(shí)施例證明了非共價板模式對于開發(fā)G-LISA測定的效用?？梢钥闯?，通過下面的G-LISA開發(fā)規(guī)程，利用連接于谷胱甘肽板的PAK-GST效應(yīng)物可獲得良好的信號(圖9)。有趣的是，對于該測定而言，使用抗原提呈緩沖劑(APB)有利于獲得活性Rac1信號(圖9，GTPγS+ABP與-APB比較)。
實(shí)施例描述了GST谷胱甘肽連接的使用，由PAK-GST谷胱甘肽板產(chǎn)生的GTPγS信號小于由POSH馬來酰亞胺板(圖3B)和PAK馬來酰亞胺板(數(shù)據(jù)未顯示)產(chǎn)生的GTPγS信號。由于這個原因，并且由于共價板結(jié)合蛋白質(zhì)通常更加穩(wěn)定，我們進(jìn)一步考察了共價馬來酰亞胺板模式。然而，本文已經(jīng)證明，GST谷胱甘肽板在G-LISA中可良好工作，預(yù)期也可以使用其他的非共價連接，例如聚組氨酸鎳、聚組氨酸鈷、生物素鏈霉抗生物素蛋白、生物素抗生物素蛋白等。每種板模式的優(yōu)化均可遵循在這些實(shí)施例中概述的方法。
實(shí)施例8G-LISA測定的檢測限和驗(yàn)證 目前，所有公開的對細(xì)胞或組織樣品中Rho GTP酶的活化(或失活)水平的估計值均使用由標(biāo)準(zhǔn)Rho GTP酶沉降測定產(chǎn)生的數(shù)據(jù)(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；和Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272)。由于該測定方法清楚明確，并且在本領(lǐng)域被公認(rèn)為定量的金標(biāo)準(zhǔn)，所以我們期望通過證明G-LISA產(chǎn)生的活化估計值與在沉降實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的估計值相當(dāng)來驗(yàn)證G-LISA。因此，我們希望證實(shí)，雖然G-LISA測定與Rho GTP酶沉降測定相比具有速度大大提高、重復(fù)性更好、樣品通量增加、樣品操作更簡單以及樣品量更小等優(yōu)勢，這兩種測定對活化Rho GTP酶的實(shí)際定量結(jié)果卻是相似的。
材料和方法 通過鈣蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生活化RhoA細(xì)胞裂解物 將HeLa細(xì)胞接種在含有10％FBS的DMEM(Gibco.批號10313-021)中。令細(xì)胞生長到50-70％匯合度，隨后使之血清饑餓24小時。然后用鈣蛋白酶抑制劑(100ng/μl)處理細(xì)胞30分鐘。將細(xì)胞收集在裂解緩沖劑中，用裂解緩沖劑使裂解物的蛋白質(zhì)濃度等量為4mg/ml。然后相應(yīng)地對裂解物進(jìn)行稀釋，并進(jìn)行RhoA GLISA測定。
通過EGF誘導(dǎo)產(chǎn)生Rac1和Cdc42細(xì)胞裂解物 將HeLa細(xì)胞接種在含有10％FBS的DMEM(Gibco.批號10313-021)中。令細(xì)胞生長到50-70％匯合度，隨后使之血清饑餓24小時。然后用10ng/ml表皮生長因子(EGF)(Sigma.批號E9644)處理細(xì)胞2分鐘，將細(xì)胞收集在裂解緩沖劑中。用裂解緩沖劑使來自血清饑餓板和EGF處理板的裂解物的濃度等量為1mg/ml。然后對裂解物進(jìn)行RAC1或Cdc42 G-LISA測定。
沉降測定 測定根據(jù)Ren等所述進(jìn)行。將修飾的GST Rho靶蛋白-GBD肽與谷胱甘肽珠子結(jié)合，將20μg結(jié)合于珠子的效應(yīng)物添加到500μl(250μg)澄清的負(fù)載GTPγS或負(fù)載GDP的血小板提取物中(裂解物制備見實(shí)施例2)。將混合物在4℃回旋溫育1小時。然后，將珠子在清洗緩沖劑(50mM Tris pH 7.5，100mM NaCl，30mM MgCl2)中清洗2次，并進(jìn)行SDS-PAGE(4-20％梯度)和Western印跡程序。用特異識別RhoA蛋白的第一抗體和山羊抗小鼠第二抗體(Jackson Labs.，批號115-035-068)檢測活化的RhoA蛋白質(zhì)條帶。測定最少執(zhí)行4次。
參考圖10，將25μl血清饑餓的或鈣蛋白酶抑制劑處理的(RhoA活化的)、濃度為4，2，1，0.5，0.25，0.12，0.06mg/ml的Hela細(xì)胞裂解物，與相同體積的結(jié)合緩沖劑混合，并進(jìn)行RhoA G-LISA測定，隨后進(jìn)行吸光度檢測。同時對500μg相同的裂解物進(jìn)行GST-Rho靶蛋白-RBD沉降測定，隨后用抗RhoA抗體進(jìn)行Western印跡。所有的讀數(shù)均減去了僅緩沖劑的背景。
參考圖11，將25μl的僅裂解緩沖劑(0)、0.01、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1、2ng RhoA(63L)與相同體積的結(jié)合緩沖劑混合，并進(jìn)行RhoA G-LISA測定，隨后進(jìn)行吸光度檢測。所有的讀數(shù)均減去了僅緩沖劑的背景。
參考圖12，根據(jù)“材料和方法”(實(shí)施例7)中的概述制備PAK包被的GST板。PAK包被的谷胱甘肽珠子來自Cytoskeleton公司(批號PAK02)。針對來自血清饑餓的3T3細(xì)胞(SS)或EGF處理的3T3細(xì)胞(用于活化Rac1)的不同量的總細(xì)胞裂解物(實(shí)際量標(biāo)識在柱狀圖和Western印跡下面)，如實(shí)施例2所述利用標(biāo)準(zhǔn)Rac1 G-LISA測定法進(jìn)行測定，或如Benard等(J.Biol.Chem.，1999，27413198-13204)所述利用標(biāo)準(zhǔn)PAK-GST珠子沉降測定法進(jìn)行測定。如前文所述通過490nm吸光度對G-LISA測定定量。Rac1沉降通過Western印跡化學(xué)發(fā)光信號的密度測定加以定量?；瘜W(xué)發(fā)光檢測試劑是Supersignal West Dura Extended Duration Substarte(Pierce)。用于沉降的抗Rac1抗體由Cytoskeleton公司在其Rac1沉降測定用商業(yè)試劑盒(BK035)中出售。附圖顯示，Rac1:PAK G-LISA的檢測限是Rac1:PAK沉降測定的大約18-30分之一低。
參考圖13A，對50μl僅裂解緩沖劑、血清饑餓的或EGF處理的Hela細(xì)胞裂解物(0.5mg/ml)進(jìn)行Rac1 G-LISA測定，隨后進(jìn)行吸光度檢測。參考圖13B，如前文所述地對50μl血清饑餓的或EGF處理的Hela細(xì)胞裂解物(0.5mg/ml)進(jìn)行Cdc42 G-LISA測定，并如前文所述地通過發(fā)光測定法進(jìn)行定量。平行地用500μg相同裂解物進(jìn)行Cdc42沉降測定。此測定中使用的抗體與G-LISA中使用的相同(批號ACD01，Cytoskeleton公司)。通過對化學(xué)發(fā)光顯影的底片的密度測定來定量活化倍數(shù)(fold activation)。參考圖13C，利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(lipofectamine)，用5μg載體、p115RhoGEF或p190RhoGAP轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染16小時后，在細(xì)胞裂解緩沖劑中裂解細(xì)胞。然后對25μl僅裂解緩沖劑、載體、p115RhoGEF、載體、p190RhoGAP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(1mg/ml)進(jìn)行RhoA G-LISA測定，并通過吸光度檢測加以定量。平行地用500μg相同的裂解物進(jìn)行Rho沉降測定，通過對化學(xué)發(fā)光顯影底片的密度測定來定量活化倍數(shù)(對p115RhoGEF)或抑制倍數(shù)(foldinhibition)(對p190GAP)。
結(jié)果 RhoA G-LISA的檢測限 在本實(shí)施例中用兩種方法來確定利用基于吸光度的測量法檢測活性RhoA的G-LISA的檢測限。首先，確定細(xì)胞裂解物中內(nèi)源活性(鈣蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)的)RhoA的檢測限。其次，確定純重組組成型活性RhoA的檢測限。
用鈣蛋白酶抑制劑處理30分鐘誘導(dǎo)血清饑餓HeLa細(xì)胞中的RhoA活化(Schoenwaelder et al.，1999，J.Biol.Chem.，27414359-14367)。用500μg的每種裂解物(1mg/ml裂解物濃度)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)沉降測定(圖10中的插圖)。Western印跡結(jié)果的密度測定定量顯示，RhoA(圖4插圖中的鈣蛋白酶抑制劑泳道)活化為血清饑餓裂解物(圖4插圖中的SS泳道)的大約2倍。正如預(yù)期的，這與公開的數(shù)據(jù)非常一致(Schoenwaelder et al.，2000，Current Biol.，101523-1526)。
在平行G-LISA測定中，將血清饑餓裂解物和鈣蛋白酶抑制劑裂解物連續(xù)稀釋到給定的蛋白質(zhì)濃度，分別為4、2、1、0.5、0.25和0.125mg/ml，取25μl裂解物在RhoA G-LISA中測試。與血清饑餓樣品相比，濃度為0.25mg/ml-2mg/ml的裂解物(總細(xì)胞裂解物分別為6.25μg和50μg)使鈣蛋白酶抑制劑處理樣品活化了大約2倍(圖10，活化倍數(shù)示于鈣蛋白酶抑制劑滴定曲線上方)。因此，對于低至0.25mg/ml或6.25μg總細(xì)胞裂解物的蛋白濃度，RhoA G-LISA結(jié)果與公開的數(shù)據(jù)以及本實(shí)施例顯示的沉降測定數(shù)據(jù)非常一致。
在0.5-2mg/ml的蛋白濃度(典型的細(xì)胞裂解物濃度)，cv為11-8％。甚至在低至6.25μg總細(xì)胞裂解物的蛋白量，16％的cv值也是可以接受的。在更低的蛋白濃度(0.125mg/ml或3.1μg總細(xì)胞裂解物)，cv值將變得過高而不能給出Rho測定中有意義的結(jié)果(>50％)，而在最高的蛋白濃度4mg/ml(100μg裂解物)，cv值為11％，然而活化水平則略微低于2倍(1.7倍)。4mg/ml時活化倍數(shù)降低最有可能是由于活性RhoA讀數(shù)正在接近吸光度測定的飽和點(diǎn)(2.5吸光度單位)。有趣的是，圖12顯示，Rac1:POSH測定可以從少達(dá)3μg的總細(xì)胞裂解物中的檢測到活化Rac1，cv值為12％。
為了確定對于重組組成型活性RhoA的G-LISA吸光度檢測的極限，向ROCK-GBD馬來酰亞胺板上的8個孔內(nèi)各自添加0.01、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0和4.0ng蛋白質(zhì)。在整個RhoA G-LISA測定過程中取樣，并以O(shè)D490讀數(shù)對蛋白質(zhì)濃度作圖。圖11的結(jié)果顯示，吸光度G-LISA的線性范圍是0.1ng(cv＝6％)到2ng(cv＝6％)。重組組成型活性RhoA的信號似乎在蛋白量超過4ng時開始飽和。
為了進(jìn)一步比較G-LISA測定與沉降測定，用相同的細(xì)胞裂解物平行地進(jìn)行兩種測定。按照“材料和方法”部分所述，用表皮生長因子(EGF)刺激HeLa細(xì)胞。已有充分證據(jù)顯示，EGF瞬時活化Rac1，且活化為未刺激細(xì)胞的2倍到5倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。兩種測定均使用PAK-GST效應(yīng)物，且兩種測定分別根據(jù)實(shí)施例2和3中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行。從圖12可以看出，從使用3μg-12.5μg總裂解物的G-LISA蛋白檢測到了大約2倍的活化，而沉降測定在100μg樣品中檢測到了信號，在50μg總細(xì)胞裂解物中則沒有(大約2.5倍活化)。因此說，沉降測定中的檢測極限似乎是G-LISA可得的極限的大約18-30倍高。另外值得注意的是，本申請的發(fā)明人的沉降測定技術(shù)非常熟練，并曾經(jīng)用這一技術(shù)開發(fā)過商業(yè)化產(chǎn)品。因此，沉降和G-LISA的一對一比較結(jié)果顯示，兩種測定可給出相似的Rho活化定量(大約2倍)，結(jié)果清楚地證明G-LISA是更好的測定方法。G-LISA的優(yōu)勢不僅限于靈敏度更高，盡管這是主要的優(yōu)勢，G-LISA還更加迅速(<3h，相比于>10h)，需要的樣品量少得多，且適合于HTS應(yīng)用。
活性Rho GTP酶的Rac1和Cdc42 G-LISA測定定量與沉降定量的比較 為了進(jìn)一步考察G-LISA對Rho GTP酶體內(nèi)活化的效用，我們以多有報道的Rac1和Cdc42活化為例，比較了沉降數(shù)據(jù)與G-LISA測定數(shù)據(jù)。
EGF已被證明在數(shù)種細(xì)胞系中使Rac1活化為血清饑餓水平的2-5倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。圖13A顯示了使用500μg細(xì)胞裂解物的沉降測定和使用25μg細(xì)胞裂解物的Rac1G-LISA的比較結(jié)果。沉降測定的Western印跡的密度測定定量結(jié)果顯示Rac1活化了4倍。平行進(jìn)行的Rac1G-LISA結(jié)果與該活化倍數(shù)一致，是血清饑餓的細(xì)胞裂解物的4倍(圖13A)。
文獻(xiàn)中已充分證明，EGF可以使Cdc42活化為血清饑餓Cdc42的水平的2-3倍(Kurokawa et al.，2004，Mol.Biol.Cell，15100)。圖13B顯示了使用500μg細(xì)胞裂解物的沉降測定和使用25μg細(xì)胞裂解物的Cdc42 G-LISA的比較結(jié)果。沉降測定的Western印跡的密度測定定量結(jié)果顯示Cdc42活化了2倍。平行進(jìn)行的Cdc42 G-LISA結(jié)果與該活化倍數(shù)一致，是血清饑餓細(xì)胞裂解物2.2倍高(圖13B)。
將外源DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞培養(yǎng)物中，隨后觀察蛋白表達(dá)對Rho GTP酶活化的影響，是細(xì)胞和分子生物學(xué)中的一種常用手段(Klooster et al.，2006，J.Cell Biol.，1172759-769；和Cheng et al.，2004，J.Biol.Chem.，27912786-12793)。因此，評估了G-LISA檢測下述對象的能力用Rho GTP交換因子p115RhoGEF轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞時，內(nèi)源Rho GTP酶的活化；或者用GTP酶活化蛋白p150RhoGAP轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞時，Rho的失活(Wells et al.，2001，J.Biol.Chem.，27628897-28905；和Arthur et al.，2001，Mol.Biol.Cell，122711-2720)。
圖13C中的結(jié)果證實(shí)，G-LISA能夠如實(shí)地檢測轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中Rho GTP酶活化的提高(p115RhoGEF)或降低(p150RhoGAP)。而且，活性Rho GTP酶相對于僅有載體的樣品的定量結(jié)果在沉降與G-LISA測定之間是一致的。討論 實(shí)施例3中公開的結(jié)果證實(shí)，從給定Rho GTP酶獲得的活化水平在沉降測定和G-LISA測定之間高度相似。在血清饑餓的HeLa細(xì)胞中，對這兩種測定法針對RhoA的鈣蛋白酶抑制劑活化(圖10)、Rac1的EGF活化(圖13A)和Cdc42的EGF活化(圖13B)的定量進(jìn)行了比較。在所有情況下，兩種測定方法間的Rho GTP酶活化都是相似的(典型地為2-4倍活化)，且與公開數(shù)據(jù)一致(Kazuo et al.，2004，Mol.Biol.Cell，151003-1010)。還比較了用p115RhoGEF(活化子)或p190RhoGAP(去活化子)(圖13C)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中Rho的活化與失活。結(jié)果再次顯示，就活化倍數(shù)測量結(jié)果而言，沉降測定和G-LISA測定是相似的。在這些測定中對數(shù)種不同的細(xì)胞系(例如Swiss 3T3，Jurkats，MDCK細(xì)胞)進(jìn)行了分析，在所有情況下，G-LISA定量結(jié)果均與公開的沉降測定估計結(jié)果一致(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖10-13的數(shù)據(jù)清楚地顯示，G-LISA測定的效用在于從少量樣品中對RhoA活化進(jìn)行定量。因此，這種測定方法的線性范圍大約為6.25-50μg細(xì)胞裂解物(圖10)。這相當(dāng)于0.04-1.7ng活性RhoA的估計值(理由可見實(shí)施例2，“結(jié)果”部分)。發(fā)現(xiàn)純重組組成型活性RhoA的線性范圍為0.1-2ng(圖11)，這支持了根據(jù)細(xì)胞裂解物樣品的估計值。還應(yīng)當(dāng)注意，本實(shí)施例中描述的測定方法是用于基于吸光度的G-LISA。對此，基于發(fā)光測定的G-LISA測定方法比基于吸光度的版本更加靈敏，將測定的靈敏度提高到低于0.04ng(數(shù)據(jù)未顯示)。
與G-LISA相反，人們一般認(rèn)為，在標(biāo)準(zhǔn)沉降測定中內(nèi)源活化Rho GTP酶的定量典型地需要1 x 106至1 x 107個細(xì)胞，或300-800μg總細(xì)胞蛋白質(zhì)(Benard et al.，2002，Meth.Enz.，345349-359；和Ren et al.，2000，Meth.Enz.，325265-272)。文獻(xiàn)中進(jìn)一步承認(rèn)，當(dāng)樣品有限時，這樣的裂解物量可能使實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行(Gottig et al.，2006，Eur.J.Immunol.，36180-189)。對此，直接比較了PAK-GST沉降測定和PAK-GST G-LISA測定(圖12)。結(jié)果顯示，G-LISA比沉降測定靈敏大約18-30倍。
需要使用少量裂解物的場合包括原代細(xì)胞系的分析。其它場合包括在小生長室(growth chamber)中，例如12孔板(典型地4 x 105個細(xì)胞)，24孔板(典型地2 x 105個細(xì)胞)或96孔板(典型地3 x 104個細(xì)胞)中培養(yǎng)的高通量樣品的處理。G-LISA能夠檢測來自少至6μg的總細(xì)胞裂解物，相當(dāng)于2x 104個細(xì)胞的活性RhoA信號，因而這種測定方法即使在只能獲得有限量樣品的場合下，例如原代細(xì)胞系、臨床樣品和高通量應(yīng)用，也適用于Rho GTP酶活化研究。
實(shí)施例9用凍干法穩(wěn)定效應(yīng)物-GBD板 效應(yīng)物-GBD肽的穩(wěn)定化產(chǎn)生可長期干燥保存在4℃的板，從而為本測定模式提供了一種優(yōu)勢。參考圖14，將凍干的ROCK-RBD包被的微量滴定板在4℃和>10％的濕度下保存標(biāo)示的時間。使用血清饑餓或鈣蛋白酶抑制劑處理的細(xì)胞裂解物，通過標(biāo)準(zhǔn)RhoA G-LISA測試該板的活性。特別地，如實(shí)施例2所述地用效應(yīng)物-GBD包被板。在封閉和清洗步驟之后，向每個孔添加50μl凍干緩沖劑(5％蔗糖，1％葡聚糖，于PBS pH 7.2中)。將板冷凍到-70℃，并用如下的程序凍干 穩(wěn)定冷凍干燥機(jī)架溫(shelf temperature)到-40℃，5分鐘； 開始抽真空到<100 mtorr； -26℃抽真空4小時； -10℃抽真空4小時； 0℃抽真空4小時；和 30℃抽真空4小時。
然后將板從冷凍干燥機(jī)移出并封裝在含有干燥劑包的容器內(nèi)。將板保存于4℃及濕度小于10％的條件。按圖14所示的時間間隔，用L63組成型活性RhoA(每孔5ng)在標(biāo)準(zhǔn)Rho:ROCK G-LISA中對板進(jìn)行分析。對每個板相對于0時間測定的板活性(100％活性)的％活性作圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些條件下，板在至少120天內(nèi)保持非常穩(wěn)定。讓其變潮濕的板在1-2小時后喪失活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
討論 配制穩(wěn)定的G-LISA板具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括容易保存和在HTS模式中容易操作。由于此測定還以試劑盒的形式提供，所以將板的內(nèi)含物凍干，就可以在沒有干冰等的情況下進(jìn)行運(yùn)輸。
實(shí)施例10G-LISA測定在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用 文獻(xiàn)中已充分證明，Rho家族蛋白及其效應(yīng)物蛋白參與了多種人類疾病，包括癌癥和腎病(Fiordalisi et al.，2006，Canc.Res.，663153-3161；Fritz etal.，2006，Curr.Cancer Drug Targ.，11-14；和Wakino et al.，2005，Drug NewaPerspect.，18639-643)。因此，建立能夠鑒定直接Rho GTP酶調(diào)節(jié)因子和直接調(diào)節(jié)Rho GTP酶與效應(yīng)物的相互作用的化合物的篩選方法是非常有價值的。因此，此處將G-LISA技術(shù)的應(yīng)用擴(kuò)展到包括這些篩選方法。
參考圖15，對僅裂解緩沖劑(空白)或5ng Rac1(61L)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Rac1:POSH G-LISA。PAK-GST包含在該測定的裂解物溫育階段的反應(yīng)中。PAK肽可能是POSH結(jié)合Rac1 GTP酶的競爭抑制劑，從而降低G-LISA信號。在一些反應(yīng)中，ROCK-GST包含在陰性對照“抑制劑”中。PAK-和ROCK-GST肽的摩爾值以μM給出。正如預(yù)期的那樣，PAK肽是Rac1:POSH反應(yīng)更高效的競爭物(IC50 0.1μM，相比于8μM)。
結(jié)果 圖15所示的實(shí)施例顯示了來自與POSH-GBD馬來酰亞胺板結(jié)合的5ng組成型活性Rac1(61L)的G-LISA數(shù)據(jù)。G-LISA如前所述進(jìn)行，只是在存在或者不存在可能充當(dāng)Rac1:POSH結(jié)合的競爭抑制物的PAK-GBD-GST的條件下進(jìn)行反應(yīng)，向反應(yīng)中添加0μM至10μM的PAK-GBD-GST。圖15顯示，PAK的IC50是大約0.1μM。該測定中也測試了RhoA效應(yīng)物ROCK-GBD。對這種肽的IC50大約是PAK的80倍(8μM)。這個實(shí)施例用于證明G-LISA測定在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。
討論 本實(shí)施例描述了G-LISA在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。該測定模式使用純化的組成型活性Rho GTP酶和純化的效應(yīng)物-GBD肽，因此，它是一種明確的、將產(chǎn)生具有直接、機(jī)械關(guān)聯(lián)性的結(jié)果的系統(tǒng)。應(yīng)當(dāng)注意，所述G-LISA測定還適合于鑒定調(diào)節(jié)內(nèi)源Rho GTP酶活性的化合物。該測定(或試劑盒)模式可如下實(shí)施在合適的適于HTS的容器如96孔板上培養(yǎng)細(xì)胞，用化合物庫處理細(xì)胞(任選在處理前對細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓)，將細(xì)胞裂解在25μl裂解緩沖劑中(此時可任選地進(jìn)行蛋白定量)并轉(zhuǎn)移到存在或不存在20％PEG 8000的G-LISA板中。將板在4℃溫育30分鐘，然后室溫清洗，用抗原提呈緩沖劑處理2-5分鐘。清洗板，并對孔中的Rho GTP酶進(jìn)行定量。定量可以使用Rho特異性抗體，或者通過其他方法。HTS方法學(xué)也可采用微量滴定板或微陣列常用的機(jī)器人系統(tǒng)。
除了本文所描述的以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前述的說明書可以顯見本發(fā)明的各種修改形式。這些修改形式也包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本申請引證本文引用每篇參考文獻(xiàn)(包括但不僅限于，雜志文獻(xiàn)、美國和非美國專利、專利申請公開、國際專利申請公開、gene bank登錄號等)的全部內(nèi)容。本文引證2005年7月5日提交的美國臨時專利申請系列No.60/695,844的全部內(nèi)容。
序列表
<110>西托斯科萊頓股份有限公司(CYTOSKELETON INC.)
Cheng，Li
Davis，Ashley
Middleton，Kim
<120>Rho蛋白質(zhì)檢測
<130>CSKL0005-500WO
<150>US 60/695,844
<151>2005-07-05
<160>110
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>193
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>196
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
<210>3
<211>193
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
<210>4
<211>210
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
<210>5
<211>244
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
<210>6
<211>232
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
<210>7
<211>227
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
<210>8
<211>211
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
<210>9
<211>191
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
<210>10
<211>191
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<213>人(Homo sapiens)
<400>10
<210>11
<211>192
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
<210>12
<211>192
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
<210>13
<211>192
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<213>人(Homo sapiens)
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<213>人(Homo sapiens)
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<211>24
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>110
權(quán)利要求
1.一種用于檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的方法，包括
使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸，其中該固體支持物與活化Rho GTP酶結(jié)合肽連接，并且其中樣品中的活化Rho GTP酶與活化Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合；和
檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)，其中在檢測期間活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)保持與固體支持物聯(lián)結(jié)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該樣品包括含有內(nèi)源活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該樣品含有少于50μg的總蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中該細(xì)胞裂解物是從少于105個細(xì)胞制備的。
5.權(quán)利要求2的方法，其中該細(xì)胞裂解物未被澄清。
6.權(quán)利要求1的方法，其中在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之前，添加抗原提呈緩沖劑，其中該抗原提呈緩沖劑包括一種或多種能夠減少活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)自固體支持物的損失的化合物或處理。
7.權(quán)利要求6的方法，其中該抗原提呈緩沖劑包括熱變性、尿素處理、戊二醛或乙醇，或其任意組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在檢測樣品中的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)之前添加結(jié)合緩沖劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中該結(jié)合緩沖劑包括水溶性聚蔗糖、葡聚糖或聚乙二醇，或其任意組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中聚乙二醇是PEG4000或PEG8000，其終濃度為大約2％到大約40％v/v。
11.權(quán)利要求1的方法，其中使用對一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)特異的抗體檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)是組成型活性突變體。
13.權(quán)利要求1的方法，其中該樣品包含外源GTP、GDP或GTPγS。
14.權(quán)利要求1的方法，其中該活化的Rho GTP酶蛋白質(zhì)是RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rnd1、Rnd2、Rnd3、Rif、RhoG、Rac1、Raclb、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、TCL、Wrch-1、Wrch-2、RhoBTB1或RhoBTB2。
15.權(quán)利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合一種或多種活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)，且其對活化形式的Rho GTP酶蛋白質(zhì)的親和力是對非活化形式的親和力的至少2倍。
16.權(quán)利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結(jié)合肽是Rho靶蛋白、ROCK1、PAK1、POSH、WASP或Dia1，或者它們的突變體或多聚體。
17.權(quán)利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結(jié)合肽與固體支持物共價或非共價連接。
18.權(quán)利要求17的方法，其中該共價連接是二硫鍵連接，且其中該非共價連接是GST連接。
19.權(quán)利要求1的方法，其中該活化Rho GTP酶結(jié)合肽是凍干的。
20.權(quán)利要求1的方法，其中該固體支持物是微量滴定板或微陣列。
21.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括對與活化Rho GTP酶結(jié)合肽結(jié)合的活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量。
22.權(quán)利要求21的方法，其中使用對一種或多種Rho GTP酶蛋白質(zhì)特異的抗體對活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的量進(jìn)行定量。
23.權(quán)利要求1的方法，其中活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的檢測是利用吸光度、發(fā)光或熒光來檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽的之間相互作用而進(jìn)行的。
24.權(quán)利要求1的方法，還包括使樣品與測試劑接觸，并確定測試劑是否調(diào)節(jié)活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)與活化Rho GTP酶結(jié)合肽之間的相互作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過使固體支持物與含有活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的樣品接觸來檢測活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)的方法。該固體支持物與活化Rho GTP酶結(jié)合肽連接。在檢測期間，活化Rho GTP酶蛋白質(zhì)保持與固體支持物聯(lián)結(jié)。
文檔編號C12N9/12GK101501495SQ200680032416
公開日2009年8月5日 申請日期2006年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者利 程, 阿什利·戴維斯, 金·米德爾頓 申請人:西托斯科萊頓股份有限公司