三分三莨菪堿6β-羥化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：三分三莨菪堿6β-羥化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及在三分三中表達的莨菪堿6P-羥化酶 基因、蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
莨菪烷生物堿主要是從茄科植物如莨菪及三分三T AA /SOCf〃SacuteA gu/us^等植物中提取到的，在醫(yī)用方面是作用于副交感神經(jīng)系統(tǒng)的抗膽堿藥，具有麻醉、解痙、止痛的功能。此外,還具有改善微循環(huán)的作用，臨床 上可用于治療微循環(huán)障礙性疾病。由于我國學(xué)者的努力，莨菪烷生物堿的臨床應(yīng)用遍及內(nèi)科、外科、婦產(chǎn)科、神經(jīng)科、皮膚科、耳鼻喉科等，能治療100 多種疾病，市場需求十分巨大。莨菪堿(外消旋體阿托品)和東莨菪堿是結(jié)構(gòu)相 關(guān)的兩類莨菪烷生物堿，由于兩者對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有不同的作用，目前在國內(nèi) 外市場上東莨菪堿的需求量是莨菪堿的10倍，而東莨菪堿在資源植物中的含 量比莨菪堿低得多，如莨菪中的東莨菪堿的含量只有萬分之幾。因此，東茛菪堿的價格也遠遠高于莨菪堿(約為10倍)，致使其在臨床上的應(yīng)用受到r極大的限制。近年來基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，為利用現(xiàn)代生物技 術(shù)提高東莨菪堿含量開辟了一條嶄新的途徑。利用現(xiàn)代生物技術(shù)將東莨菪堿 生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)胭Y源植物中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并進行大 規(guī)模的培養(yǎng)，是實現(xiàn)從根本上提高東莨菪堿含量的最佳途徑之一。由于莨菪堿6(3-羥化酶(Hyoscyamine鄰-Hydroxylase, H6H)是整個東莨 菪堿生物合成途徑中最后一步的催化酶,也是最為關(guān)鍵的一個酶，它通過兩步連續(xù)反應(yīng)催化莨菪堿轉(zhuǎn)變成更有價值的東莨菪堿。因此，克隆莨菪堿6p-羥化酶的編碼基因并利用基因工程技術(shù)來提高藥用植物如三分三等中莨菪堿6(3-羥化酶的活性或含量，從而提高轉(zhuǎn)基因植物如三分三中東莨菪堿的含量，這 有著十分重要的醫(yī)學(xué)價值。在對現(xiàn)有文獻的分析中，The Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué) 雜志)，1991， 266(7): 46484653報道了從莨菪中克隆了莨菪堿6j3-羥化酶基 因，但至今尚未有任何從我國云南特有的藥物植物三分三中分離克隆出莨菪 堿6p-羥化酶基因的文獻報道。由于這個基因編碼的酶催化東莨菪堿合成的最 后一步并對東莨菪堿的合成效率具有決定性影響，因此，這一步是利用基因 工程技術(shù)來調(diào)控東莨菪堿生物合成的重要切入點。發(fā)明內(nèi)容所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種三分三莨菪堿6(3-羥化酶基因及 編碼的蛋白與用途，以填補尚未有任何從我國云南特有的藥物植物三分二中 分離克隆出莨菪堿6p-羥化酶基因的空白，克服三分三中東茛菪堿有效成分較 低的缺陷。發(fā)明提供三分三莨菪堿6(3-羥化酶的核苷酸序列、包含所說基因的 融合基因構(gòu)建體、攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達載體、所說的表達載體轉(zhuǎn)化 的植物細胞、以及由轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的所說基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代(包括 植物種子及植物組織)，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物將具有顯著提高的東莨菪堿含技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種莨菪堿6(3-羥化酶基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的 同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種三分三莨菪堿6p-羥化酶蛋白質(zhì)，由i: 述的基因序列所編碼。其優(yōu)選方案為，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種含有上述技術(shù)方案之一的三分三良菪 堿6p-羥化酶基因全序列或部分片段的質(zhì)粒。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種含有上述技術(shù)方案之一的三分三茛菪 堿6p-羥化酶基因全序列或部分片段的植物表達載體。本發(fā)明的技術(shù)方案之五是提供一種宿主細胞，該細胞含有上述技術(shù)方案 之一或之三或之四中任一項所述的基因序列。優(yōu)選所說的細胞為大腸桿菌細 胞，或者優(yōu)選為農(nóng)桿菌細胞，或者優(yōu)選為三分三發(fā)根細胞。本發(fā)明的技術(shù)方案之六是提供一種三分三莨菪堿6p-羥化酶基因的應(yīng)用， 包括用技術(shù)方案之四所述的植物表達載體轉(zhuǎn)化三分三細胞、或者用上述的農(nóng) 桿菌與三分三細胞共培養(yǎng)、或者用上述的含有所述基因序列的三分三發(fā)根細 胞培育雄性不育植株。或者，技術(shù)方案之六也可以是提供一種轉(zhuǎn)基因三分三， 該三分三含有所述的莨菪堿6(3-羥化酶基因序列。具體而言，本發(fā)明的技術(shù)方案中涉及的概念的定義如下在本發(fā)明所說的三分三茛菪堿6(3-羥化酶基因的DNA分子包括編碼具 有三分三茛菪堿6(3-羥化酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列 與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第125-1159位的核苷酸序列有至少70%的同源 性；或者所述的核苷酸序列能在40—55"C條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 1屮 從核苷酸第125-1159位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的三分三莨菪堿6(3-羥化酶多肽包括具有SEQ ID NO. 2 氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。 較佳地，該多肽是具有SEQIDNO. 2序列的多肽。本發(fā)明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀 態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)，.伴 隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語"三分三莨菪堿6P-羥化酶(或多肽)基因"指編碼 具有三分三莨菪堿6p-羥化酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1屮 第125-1159位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的編碼框第125-1159位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨 基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1中第125-1159位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編 碼出SEQ ID NO. 2所述的序列。還包括能在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1 中從核苷酸第125-1159位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第125-1159位的核苷酸序列的同源性至少70。/。，較佳 地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編 碼具有與天然的三分三莨菪堿6p-羥化酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若千個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、 插入和/或取代，以及在5，和/或3'端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為 30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"三分三莨菪堿6p-羥化酶蛋白或多肽"指具有二分 三莨菪堿6(3-羥化酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與 天然三分三莨菪堿6P-羥化酶相同功能的SEQ ID N0.2序列的變異形式。這 些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更 佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端 和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳 地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行 取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加^ 個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括三分三莨菪堿 6(3-羥化酶的活性片段和活性衍生物，還包括能夠可操作地連于信號肽、啟動 子或者核糖體結(jié)合位點序列所組成的衍生物。本發(fā)明的三分三莨菪堿6p-羥化酶多肽的變異形式包括同源序列、保守 性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴謹條件F 能與三分三莨菪堿6p-羥化酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用三 分三莨菪堿6p-羥化酶多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中三分三莨菪堿6p-羥化酶保守性變異多肽指與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基 酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。表1.保守性變異多肽中的取代殘基最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala (A)Val; Leu; lieValArg (R)匕ys; Gin; AsnLysAsn (N)Gin; His; Lys; ArgGinAsp (D)GluGluCys (C)SerSerGin (Q)AsnAsnGlu (E)AspAspGly (G)Pro; AlaAlaHis (H)Asn; Gin; Lys; ArgArgHe (I)Leu; Val; Met; Ala; Phel_euLeu (L)lie; Val; Met; Ala; PhelieLys (K)Arg; Gin; AsnArgMet闊Leu; Phe; lieLeuPhe (F)Leu; Val; lie; Ala; TyrLeuPro (P)AlaAlaSer (S)ThrThrThr (T)SerSerTrp (W)Tyr; PheTyrTyr (Y)Trp; Phe; Thr; SerPheVal (V)lie; Leu; Met; Phe; AlaLeu發(fā)明還包括三分三莨菪堿6(3-羥化酶或多肽的類似物。這些類似物與天然莨菪堿6P-羥化酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序 列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變 異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn) 生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還 包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天 然存在的或合成的氨基酸(如(3、 y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽 并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進 一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴 露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式 還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序 列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域己知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的三分三莨菪堿6P-羥化酶多肽時，可以將三分三良菪 堿6p-羥化酶基因的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成三分三 莨菪堿6(3-羥化酶表達載體。如本發(fā)明所用的"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某 些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA 作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操 作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編 碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地 連于編碼序列。 一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意 味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中宿主細胞為原核細胞或者真核細胞。常用的原核宿主細胞包 括大腸桿菌；常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析三分三莨菪堿6|3-羥化酶基因產(chǎn)物的表 達，即分析三分三莨菪堿6(3-羥化酶的RNA轉(zhuǎn)錄物在細胞中的存在和數(shù)量。此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子通常具有三分三莨菪堿6p-羥化酶 核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼三分三莨菪堿6P-羥化酶的核酸分子' 本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在三分三莨菪堿6p-羥化酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合，較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于三分三莨菪堿6p-羥化酶核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的三分三莨菪堿6P-羥化酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選三分三莨菪堿6p-羥化酶源基因或同源蛋白。為了得到與三分三莨菪堿6p-羥化酶基因相關(guān)的三分三cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選三分三cDNA文庫，這些探針是在低嚴謹條件下，用32P 對三分三莨菪堿6(3-羥化酶基因的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合 于篩選的cDNA文庫是來自三分三的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細胞或者組織 的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA 文庫也可以購買到，例如購自Clontech， Stratagene, Palo Alto, Cal.。這種篩 選方法可以識別與三分三茛菪堿6(3-羥化酶的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的三分三莨菪堿6p-羥化酶核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂?PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本 發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市 售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模 板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增， 然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969) Solid-Phase P印tide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield丄(1963)丄Am Chem. Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City, CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化 學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。 利用本發(fā)明的三分三莨菪堿6p-羥化酶，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與 三分三莨菪堿6(3-羥化酶發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。有益效果本發(fā)明提供的莨菪堿6p-羥化酶基因是首次從三分三中克隆制備的，可以 通過基因工程技術(shù)用來提高三分三等植物中東莨菪堿的含量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn) 基因組織中東莨菪堿的提高效果顯著。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授 的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形 式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如
Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1
三分三莨菪堿6p-羥化酶基因的克隆
1. 組織分離(isolation)
三分三植株來源于云南麗江，采取幼嫩根后立即置于液氮中冷凍保存。
2. RNA的分離(RNA isolation)
取部分組織用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管，充分振蕩后， 再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents, G舊CO BRL, USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在 分光光度計上測定RNA含量。
3. 基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA) 根據(jù)莨菪及其它茄科植物的H6H氨基酸保守序列,設(shè)計簡并引物,利用同
源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech試劑盒)進行cDNA全 長克隆，分三個階段進行 (1)3'-RACE
PCR (UPM+F2)得到AaH6HF2'(876bp)，回收,連接到T-Easy載體上， 用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye， Perkin-曰mer, USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer, USA)上進行測序。測序結(jié)果 用GCG軟件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有200610118927.0
的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL),知其核酸序列及編碼蛋白與已知莨菪堿6|3-羥 化酶基因(如莨菪莨菪堿6p-羥化酶等)的同源性很高，故初步認為它是一個良 菪堿6(3-羥化酶基因。 (2) 5'-RACE
根據(jù)3'RACE結(jié)果，設(shè)計反向特異引物R2，經(jīng)PCR (UPM+R2)得到 AaH6HR2' (647bp)(過程同(1))?；厥?，連接到T-Easy載體上，用SP6或 T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye， Perkin-Elmer, USA)的方法， 在ABI 377測序儀(Perkin-曰mer, USA)上進行測序。將測序結(jié)果與3'RACE 結(jié)果比序并進行拼接，得到全長片段序列。
(3)將5'RACE測序結(jié)果與3'RACE測序結(jié)果比序并進行拼接，得到全 長片段序列信息，并設(shè)計一對特異引物進行PCR擴增AaH6H編碼區(qū) (AaH6HKF1+AaH6HKR1)得到AaH6H編碼區(qū)(1032bp)(過程同步驟(1))。
BLAST的結(jié)果證明從三分三中新得到的基因確為一個莨菪堿鄰-羥化酶 基因。由于已知的同源的來源于莨菪的莨菪堿鄰-羥化酶基因具有提高東茛菪 堿的功能(Hashimoto等，1994; Sato等，2001)，故推測此基因具有相同 的功能。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的三分三AaH6H蛋白的全長編 碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計引 物AaH6HF1:5'國ACAGAAAATTAGAGCAGTGTTCTC-3'(SEQ ID N0.3)為正 向引物，寡核苷酸AaH6HR1:5'-AACACAAAGAAACAATAAGACATA-3'(SEQ IDN0.4)為反向引物，以總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，F(xiàn)1/R2的PCR 條件為94°C 5分鐘，隨之以94°C 1分鐘、60°C 1分鐘和72°C 2分鐘進行35個循環(huán)，最后以72。C延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增 片段長度為1364bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進行克隆、測序，獲得 SEQ ID NO. 1所示的序列。
實施例2
三分三莨菪堿6p-羥化酶基因的序列信息與同源性分析 本發(fā)明新的三分三莨菪堿6p-羥化酶全長cDNA的長度為1364 bp,詳細 序列見SEQ ID NO. 1 ，其中開放讀框位于125-1159位核苷酸。根據(jù)全長cDNA 推導(dǎo)出三分三莨菪堿6p-羥化酶的氨基酸序列，共344個氨基酸殘基，分子量 38.769KD, pl為5.09。詳細序列見SEQ ID NO. 2。
將三分三莨菪堿6p-羥化酶的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST 程序在Non-redundant GenBank +EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+ SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進 行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與莨菪H6H基因(GenBank Accession No.M62719)具有92%的同源性(見表2);在氨基酸水平上，它與 莨菪H6H(GenBank Accession No.ABG89397)的第1-344位氨基酸殘基有 890/。的相同性和95%的相似性(見表3)。由上可見，三分三莨菪堿6|3-羥化酶 基因與莨菪莨菪堿6p-羥化酶基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的 同源性，故可以認為三分三莨菪堿6(3-羥化酶在提高資源植物中東莨菪堿的含 量上也具有相似的作用。
表2.本發(fā)明的三分三AaH6H與莨菪(Hyoscyamus niger) Hn H6H
的核苷酸序列的同源比較(GAP)表
Query 125ATGGCTACTCTTGTCTCAAATTGGTCTACTAACMTGTTTCTGAMGCTTTAAAGCACCA 184Sbjct 45
104
Query 185 TTAGAGAAMGGGCAGAAAAGGACGTTCCTTTAGGAMTGATGTCCCTATCATTGATCT(: 244 Sbjct 105TTACAGAAAAGAGCAGAAAAAGATGTTCCCGTAGGAMTGATGTCCCTATTATTGATCTC 164
Query 245CAACMGATCACCATCTTGTTGTTCMCAAATCACCAMGCTTGTCAAGATTTTGGTCT(: 3(M
lim HI1 HHMU i'卜，i;i丄i !'
Sbjct 165CAACMCATCATCATCTTCTTGTTCAACAMTCACCAAAGCTTGTCAAGATTTTGGTCT(: 224
Query 305 TTTCAGGTGATCMCCATGGATTTCCAGAAAAGCTAATGGCAGAGACAATGAAAGTGTGC 364 Sbjct 225TTTCAGGTGATCAATCATGGATTTCCAGAAGAACTAATGTTAGAGACAATGGAAGTGTG(: 284
Query 365 MAGAGTTTTTTGCACTGCCTGCTGAGGAGAMGAAMGCTTCAGCCAMAGGAAAGCCA 424 Sbjct 285AAAGAGTTCTTTGCACTGCCAGCTGAGGAAAAGGAAAAGTTTMGCCAMAGGAGAGGCA 344
Query 425 GCTMATTTGMCTTCCTCTCGAGCAGAAAGCAAAGCTATATATTGAAGGAGAACAACTC 484 Sbjct 345GCTAAATTTGAACTTCCTCTTGAGCAGAAAGCAAAGCTATATGTTGAAGGAGAACAACTC 404
Query 485 TCTAACGGGGAGCTCTTT，CTGGAAAGACACTTTGGCTCATGGTTGTCATCCTCTGGAT 54.4 Sbjct 405 TCTAACGAGGAGTTCTTATACTGGMAGACACTTTGGCTCATGGTTGTCATCCTCTTGAT
Query 545 GAAGAGTTAGTCAACTCCTGGCCTGAAAAACCAGCAACATATAGAGAGGTGGTGTCTAAA 6()4 Sbjct 465CAAGACTTAGTCAATTCCTGGCCTGAAAAACCAGCAAMTATAGAGAGGTGGTTGCTAAA 524
Query 605 TATTCAGTGGAAGTGAGGMGTTGACCATGAGGATGCTCGACTATATCTGTGMGGACTT 6M Sbjct 525TATTCAGTAGMGTGAGGMGTTGACCATGAGGATGCTGGACTACATCTGTGAAGGACTT 584
Query 665GGGCTTAMTTGGGTTACTTTGATMTGAGCTTAGCCAMTTCAGATGATGCTGGCTMC 724
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Sbjct 585GGGCTTAMTTGGGCTACTTTGATAATGAACTTAGCCAAATTCAGATGATGCTGACTAAC 64.4
Query 725 TATTACCCACCATGTCCAGACCCAAGTTCMCATTGGGTTCAGGAGCACACTATGATGGT 784 Sbjct 645TATTACCCACCATGCCCAGACCCAAGTTCMCATTGGGATCAGGAGGACACTATGATGGT 7(M
Query 785MCGT|ATMCTTTGCT，MCAAGACTTGCCTGGTTTG(^ACAACTTATTGTTAAGGAT 844
15Sbjct 705AACCTTATMCTTTGCTTCAACAAGACTTGCCTGGTTTGCAACMCTCATTGTTAAGGAT 764
Query 845GACMCTGGATTGCTGTTGMCCTATCCCTACTGCTTTTGTGGTCMTTTGGGATTGACT 904
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Query 905TTAAAGGTTATTACCAATGMMGTTTGAAGGTTCTATCCATAGGGTGGTGACMATCCA 964
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Sbjct 825CTAAAGGTTATTACCAATGAAAAGTTTGAAGGTTCTATCCATAGGGTAGTGACAGATCCA 884
Query 965ACAAGAGACAGGGTTTCMTTGCCACTTTGATTGGTCCTGATTATTCTTGTACCATTGM 1024
MMiiimmm!mm mm;:iU;Mmmi; mhim h
Sbjct 885ACAAGAGACAGGGTTTCAATTGCTACTTTGATTGGTCCTGATTATTCATGTACCATTGM 944
Query 1025 CCTGCTAAAGAACTACTCAGCCMGACAACCCCCCACTCTACAAACCTTATCCATATGCT 1084
Sbjct 945
Query 1085 GAGTTTGCTGAGATTTACCTAAGTGACAAATCAGGCTATGATGCTGGTGTTMGCCATAT 1144
iii!mmi !im mum m!:!!: ;mm mm:MhH:H
Sbjct 1005 GAGTTTGCTGACATTTATCTAAGTGATAAATCAGACTATGATTCTGGTGTTAAGCCATAT 1064 Query 1145 AAAATCAATGCCTMGCAAATMGTTAATATATT 1178 Sbjct 1065 AAAATCAATGTCTAAGCAAATMCTTAATATATT 1098
其中，Query表示三分三AaH6H的核酸序列；Sbjct表示莨菪HnH6H的核酸序列 (GenBankAccession No.M62719)。
結(jié)果在1054個核苷酸的比對中兩者有92%的相似性。
表3.本發(fā)明的三分三的莨菪堿6(3-羥化酶與莨菪的莨菪堿6p-羥化酶
氨基酸序列的同源比較(FASTA)表
Query 1 MATLVSNWSTNNVSESFKAPLEKRAEKDVPLGNDVPIIDLQQDHHLVVQQITKACQDF(;L 60
MAT VSNWST +VSESF APL+KRAEKDVP+GNDVPIIDLQQ HHL+VQQITKACQDFGL Sbjct 1 MATFVS麗STKSVSESFIAPLQKRAEKDVPIGNDVPI:IDLQQHHHLLVQQITKACQDF(;L 60
Query 61FQVINHGFPEKLMAETMKVCKEFFALPAEEKEKLQPKGKPAKFELPLEQKAKLYIEGEQL 120
FQV麗GFPE+LM ETM+VCKEFFALPAEEKEK +PKG+ AKFELPLEQ認LY+EGEQL Sbjct 61FQVINHGFPEELMLETMEVCKEFFALPAEEKEKFKPKGEAAKFELPLEQKAKLYVEGEQL 120
16Query121SNGELFYWKDTLAHGCHPLDEELVNSWPEKPATYREVVSKYSVEV亂TMRMLDYICEGL180
SN E YWKDTLAHGCHPLD++LVNSWPEKPA YREVV+KYSVEVRKLTMRMLDYICEGL
Sbjct121SNEEFLYWKDTLAHGCHPLDQDLVNSWPEKPAKYREVVAKYSVEVRKLTMRMLDYICEGL180
Query181GLKLGYFDNELSQIQMMLANYYPPCPDPSSTLGSGAHYDGNVITLLQQDLPGLQQLIVK1)240
GLKLGYFDNELSQ顯L NYYPPCPDPSSTLGSG HYDGN+ITLLQQDLPGLQQLIVKD
Sbjct181GLKLGYFDNELSQIQMMLTNYYPPCPDPSSTLGSGGHYDGNLITLLQQDLPGLQQLIVKD240
Query241DNWIAVEPIPTAFVVNLGLTLKVITNEKFEGSIHRVVTNPTRDRVSIATLIGPDYSCTIE300
WIAV+PIPTAFVVNLGLTLKVITNEKFEGSI冊VVT+PTRDRVSIATLIGPDYSCTIE
Sbjct241ATWIAVQPIPTAFVVNLGLTLKVITNEKFEGSI冊VVTDPTRDRVSIATLIGPDYSCTIE300
Query301PAKELLSQDNPPLYKPYPYAEFAEIYLSDKSGYDAGVKPYKIN 343
PAKELL+QDNPPLYKPY Y+EFA+IYLSDKS YD+GVKPYKIN
Sbjct301PAKELLNQDNPPLYKPYSYSEFADIYLSDKSDYDSGVKPYKIN 343
其中，Query表示三分三AaH6H的核酸序列；Sbjct表示莨菪HnH6H的核酸序列 (GenBankAccession No. ABG89397);相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
結(jié)果在343個氨基酸的比對中，兩者分別有89%的相同性和95。/。的相似性。
實施例3
三分三莨菪堿6p-羥化酶或多肽在大腸桿菌中進行原核表達及提純 在該實施例中，將全長的三分三AaH6H編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的 蛋白質(zhì)融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。 原核表達載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌
根據(jù)三分三AaH6H的核苷酸序列，設(shè)計擴增出蛋白編碼區(qū)的引物，并在 正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這根據(jù)選用的pET32a(+)載體而定)， 以便構(gòu)建表達載體'。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后， 將三分三AaH6H基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pET32a(+)載體
17(Novagen)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 ，篩選鑒 定得到含有pET32a(+)-AaH6H表達載體的工程菌BL21-pET32a(+)-AaH6H。 表達Trx-AaH6H重組蛋白的工程菌的分離鑒定
挑取單菌落的BL21- pET32a(+)-AaH6H工程菌于3mL含100 ng/mL氨
芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1: 100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的 LB培養(yǎng)基(含100 ^g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至006()()達0.5后， 加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37 i:分別培養(yǎng)0， 1， 2， 3小時。取培 養(yǎng)時間不同的1mL菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2xSDS上樣緩沖 液50pL，蒸餾水45pL， 二巰基乙醇5(iL)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分 鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12。/。SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀 察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達 Trx-AaH6H融合蛋白的工程菌。
Trx-AaH6H融合蛋白的提取純化
按上述方法誘導(dǎo)表達Trx-AaH6H融合表達蛋白的工程菌 BL21-pET32a(+)-AaH6H，經(jīng)離心沉淀收集菌體，并根據(jù)廠家(Novagen) 的說明書以BugBuster試劑和Benzonase核酸酶來純化包涵體。包涵體可 用溶解緩沖液(50mM CAPS， pH 110,0.3% N-lauroylsarcosine)來溶解，再用 透析緩沖液(200mMTris-HCI,pH8.5沐透析。然后用組氨酸結(jié)合(His'Bind) 樹脂進行親和層析，并經(jīng)洗脫緩沖液(1M imidazole, 500mM NaCI， 20mM Tris-HCI pH 7.9 )洗脫來收集Trx-AaH6H融合蛋白。融合蛋白經(jīng)腸激酶2CTC 酶切16小時后即可分離獲的AaH6H的表達蛋白。200610118927.0
實施例4
三分三莨菪堿6p-羥化酶或多肽在三分三中進行真核細胞表達及轉(zhuǎn)基因
發(fā)根中東莨菪堿含量測定
含目的基因(三分三莨菪堿6(3-羥化酶基因)的表達載體的構(gòu)建,根據(jù)三分 三莨菪堿6p-羥化酶的全長序列(SEQ ID NO. 1)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框 的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載 體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR 擴增后，將三分三莨菪堿6p-羥化酶基因cDNA克隆至中間載體(如 pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的 pCAMBIA1304)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，遺傳轉(zhuǎn)化資源植物三分三。利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的三 分三的遺傳轉(zhuǎn)化
1) .發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1。使用前自冰箱取出,傳代2次，傳代用固體培養(yǎng)基 為YEB培養(yǎng)基。菌種在使用前接種于YEB液體培養(yǎng)基中,28t:培養(yǎng)過夜。
2) .經(jīng)種子萌發(fā)生長8周左右的三分三的無菌嫩葉片。
3) .經(jīng)過夜培養(yǎng)的菌液,用轉(zhuǎn)化液稀釋為100個細菌/mL。取無菌三分三葉 片，用無菌的解剖刀劃以"+"字形傷口，放入上述轉(zhuǎn)化中，60rpm/min振蕩培養(yǎng)8h 取出，用無菌水沖洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同濃度 6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培養(yǎng)基中，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中1次,待長 出毛狀根后分離毛狀根,轉(zhuǎn)移至含250-500mg/L卡那霉素?zé)o激素的B5培養(yǎng)基 中培養(yǎng),轉(zhuǎn)移4-5次直至無細菌為止，然后再轉(zhuǎn)移至不含卡那霉素的無激素B5 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4) .把在固體培養(yǎng)基中的毛狀根的繼代培養(yǎng)物，接種于裝有IOOmL無激素 B5，培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,培養(yǎng)溫度、光照、轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件與愈傷組 織液體懸浮培養(yǎng)條件相同,培養(yǎng)20天，將毛狀根從培養(yǎng)基上取出放入冷凍千燥 機中進行干燥，然后稱重,貯存于-7(TC備用。
5) 含三分三莨菪堿6p-羥化酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根的東莨菪堿含量測定 我們進一步對表達三分三莨菪堿6p-羥化酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根進行東莨
菪堿含量測定。按Zhang等(PNAS，2004)的方法對表達三分三莨菪堿6(3-羥化酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根進行東莨菪堿含量測定。結(jié)果表明，在表達三分三 莨菪堿6(3-羥化酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根中東茛菪堿含量同非轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈系南?比顯著提高(P<0.05)。因此轉(zhuǎn)基因結(jié)果證明，三分三莨菪堿6p-羥化酶基因 對促進東莨菪堿含量的提高有明顯作用，三分三莨菪堿6p-羥化酶基因可用于 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高東莨菪堿含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中。核苷酸序列表 SEQUENCE LISTING
〈110>上海師范大學(xué)
〈120〉三分三莨菪堿6 e -羥化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用
<160〉 4
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 1380
<212> ■
〈213〉 三分三(Anisodus acutangulus) 〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (125).. (1159)
<223〉
〈400> 1
acag犯aatt卿gcagtgttctccctcttcaactctcgcttctaaattt60
atccacaacgtaacttctttcttatttaagacttttgttccctgaaaa￡igcagsa犯atc120
acaaatggctactcttgtctcaaattggtcgtttctgaaetgctttaaagc180
accattagagaa犯ggscgttcctttaggaaatgatgtccctatcattga240
tctccaacaagatcaccatcttgttgttcaaaagcttgtcaagattttgg300
tctctttcaggtgatcaaccatggatttccatggcag卿caatgaaagt360
gtgcaa卿gttttttgeaetgcctgctgaaagcttcagccaaaagg已a^420
gccagctaaatttgaacttcctctcgagcagaaagcaaagctatatattg犯ggsgaaca480
actctctaacggggagctcttttactggaaagacactttggctcatggttgtcatcctct540
ggatgs卿gttagtcsactcctggcctgaacatEitagag鄉(xiāng)tggtgtc600
taaatatteaggaagttgaccatgaggatgctcgactatatctgtg犯gg660
acttgggcttaaattgggttactttgataatgagcttagctgatgctggc720ccaccatgtccagacccaagttcaac3ttgggttcaggagcacactatga780
tggt咖gttataactttgccttgcctggtttattgttaa840
ggatgacaactggattgctgttgaacctatccctactgcttttgtggtcaatttgggatt■
gttattaccaatgaaaagtttg卿gttctatccatagggtggtgacaaa96()
tccaacaagagacagggtttcaattgccactttgattggtcctgattattcttgtaccat1020
tgaacctgcta犯g^ctactcagccaagacaacccccc3cttatccata1080
tgctgagtttgctgagatttacctaagtgacaaatcaggct8tgatgctggtgttaagcc1140
atataas^tcaatgcctaagatgctaaagt1200
acaaaaatatg3ttgtttgtgaattatggcacgttgaattactgtxtatt1260
aagcctcaagtaatatgtatgaggcttccgtgtggtat.tatctggtctacttgtatttgt1320
aaccttt.ttgtatgtcttattgtttctttgaaaaaaaaaaL380
〈210〉 2
〈211〉 344
〈212〉 PRT
<213> 三分三(Anisodus
acutangulus)
〈400〉 2 Met Ala Thr 1
Phe Lys Ala
Asn Asp Val 35
Gin Gin lie 50
Asn His Gly 65
Lys Glu Phe
Leu Val Ser Asn Trp Ser Thr Asn Asn Val Ser Glu Ser
Pro
20
Pro
5
Leu lie
Thr Lys
Phe Pro
Phe
Ala 85
Glu Lys Arg
lie Asp Leu 40
Ala Cys Gin 55
Glu Lys Leu 70
Leu Pro Ala
Ala
25
Gin
10 Glu
Lys Asp Vai
Gin Asp His
Asp Phe (;ly
Met Ala
Glu
Glu 90
Glu
75
Lys
Leu
60
Thr
His
45
Phe
Pro
30
Leu
15 Leu
Met Lys Val
Gly
Val Val
Gin Val lie
Glu Lys Leu
Cys 80 Gin Pro 95
22Lys Gly Lys Pro Ala Lys Phe Glu Leu Pro Leu Glu Gin Lys Ala Lys
100 105 110
Leu Tyr lie Glu Gly Glu Gin Leu Ser Asn Gly G丄u Leu Phe Tyr Trp
115 120 125
Lys Asp Thr Leu Ala His Gly Cys His Pro Leu Asp G]u Glu Leu Val
130 135 140
Asn Ser Trp Pro Glu Lys Pro Ala Thr Tyr Arg Glu Val Val Ser Lys 145 150 155 160
Tyr Ser Val Glu Val Arg Lys Leu Thr Met Arg Met Leu Asp Tyr lie
165 170 175
Cys Glu Gly Leu Gly Leu Lys Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Gin lie Gin Met Met Leu Ala Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Asp Pro
195 200 205
Ser Ser Thr L,eu Gly Ser Gly Ala His Tyr Asp G]y Asn Va丄lie Thr
210 215 220
Leu Leu Gin Gin Asp Leu Pro Gly Leu Gin Gin Leu lie Val Lys Asp 225 230 235 240
Asp Asn Trp lie Ala Val Glu Pro lie Pro Thr Ala Phe Val Va] Asn
245 250 255
Leu Gly Leu Thr Leu Lys Val lie Thr Asn Glu Lys Phe Glu Gly Ser
260 265 270
l丄e His Arg Val Val Thr Asn Pro Thr Arg Asp Arg Val Ser lie A丄a
275 280 285
Thr Leu lie Gly Pro Asp Tyr Ser Cys Thr lie Glu Pro Ala Lys G〗u
290 295 300
Leu Leu Ser Gin Asp Asn Pro Pro Leu Tyr Lys Pro Tyr Pro Tyr Ala 305 310 315 320
Glu Phe Ala Glu lie Tyr Leu Ser Asp Lys Ser Gly Tyr Asp Ala GJy .325 330 335Val Lys Pro Tyr Lys lie Asn Ala 340
〈210〉 3 <211〉 24 〈212〉 廳
<213〉三分三(Anisodus acutangulus) 〈400> 3
acagaaaatt agagcagtgt tctc 24
〈210〉 4 <211> 24 〈212〉 畫
〈213> 三分三(Anisodus acutangulus) <400> 4
aac3c3朋ga aacaataaga cats 2權(quán)利要求
1.一種三分三莨菪堿6β-羥化酶基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列，或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2. —種三分三莨菪堿6e-羥化酶蛋白，由權(quán)利要求1所述的基因序列所編碼。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的莨菪堿6P-羥化酶蛋白質(zhì)，其特征在于，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨 基酸的同源序列。
4. 一種含有權(quán)利要求1所述的三分三莨菪堿6 P -羥化酶基因全序列或部分片 段的質(zhì)粒。
5. —種含有權(quán)利要求1所述的三分三莨菪堿6 P -羥化酶基因全序列或部分片 段的植物表達載體。
6. —種宿主細胞，該細胞含有權(quán)利要求1或4或5中任一項所述的基因序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所說的細胞為大腸桿菌細胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所說的細胞為農(nóng)桿菌細胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其特征在于，所說的細胞為三分三發(fā)根 細胞。
10. —種三分三莨菪堿6P-羥化酶基因的應(yīng)用，包括用權(quán)利要求5所述的表達 載體轉(zhuǎn)化三分三細胞、或者用權(quán)利要求8所述的農(nóng)桿菌與三分三細胞共培 養(yǎng)、或者用權(quán)利要求9所述的三分三發(fā)根細胞培育三分三植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三分三莨菪堿6β-羥化酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以及由SEQ ID NO.1所編碼或者有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的莨菪堿6β-羥化酶蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了上述的莨菪堿6β-羥化酶基因在三分三中進行真核細胞表達及在轉(zhuǎn)基因發(fā)根中提高東莨菪堿含量的應(yīng)用，顯著地提高了資源植物中的有效成分含量，可用于中藥材三分三等的品質(zhì)改良。
文檔編號C12N15/52GK101538575SQ20061011892
公開日2009年9月23日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者偉 周, 周根余, 開國銀, 禮 李, 陳軍峰 申請人:上海師范大學(xué)