專利名稱：一種快速篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的篩選，具體的說是一種快速篩選降解有 機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)應(yīng)用的農(nóng)藥是防治病害、蟲害、草害的有效的植物保護(hù)方法之一。農(nóng)藥以不同的 劑型經(jīng)過稀釋，以拌種、噴霧或撒施等方式降落在作物上及士壤里。然而，在目前的技術(shù) 水平條件下，農(nóng)藥的利用率僅為20%，而80%或更多的農(nóng)藥在施用后進(jìn)入環(huán)境中，進(jìn)入環(huán) 境的農(nóng)藥很容易隨雨水形成的地表徑流而進(jìn)入河流或近岸海域，形成對水環(huán)境的污染。現(xiàn) 有技術(shù)中，針對有機(jī)磷污染物，人們不斷在在自然界中尋找能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物 和其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，但絕大多數(shù)微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥效率低、微生物的作用極其緩慢， 目前，降解有機(jī)磷微生物產(chǎn)品往往集中于陸地土壤微生物，而降解有機(jī)磷的海洋微生物產(chǎn) 品還是空白。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、結(jié)果可靠、效率高的 快速篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
(1) 樣品采集
用無菌取樣瓶采集沿?；蚪夂２稉茲O場的水樣或泥樣，放入20-4(TC的恒溫箱中恒溫
0.5-1.5小時恒溫箱中待用；
(2) 分離篩選
水樣中加入不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥，搖勻，靜置30min后在營養(yǎng)瓊脂平板上涂布，20-40 'C培養(yǎng)48-72h，從有菌落生長的有機(jī)磷農(nóng)藥濃度最高的平板上挑選不同形態(tài)的菌落接種到 營養(yǎng)瓊脂斜面上。
(3) 降解菌的富集培養(yǎng)
將所挑選的耐藥菌分別接種到濃度為300,600,800和1,000 [X 10、V/V)]的含有有機(jī)磷 農(nóng)藥的選擇性培養(yǎng)液中，28'C培養(yǎng)3d，而后在平板上劃線。從有菌落生長的最高藥物濃度 的平板上挑耐藥菌接種到斜面上，28t:培養(yǎng)24h，再以此菌株為試驗(yàn)菌株，反復(fù)重復(fù)上述試 驗(yàn)。選取目前生產(chǎn)中常用的有機(jī)磷農(nóng)藥樂果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷作為目標(biāo)農(nóng)藥。
(4) 降解菌的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定-
降解菌的鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《Bergey'smanual of determinative bacteriology》(ninthedition)進(jìn)行。
(5) 對分離篩選的菌種進(jìn)行性能檢測
a. 菌株對有機(jī)磷耐受能力的測定
分別制各甲胺磷含量為400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800 mg/L PSB液體培養(yǎng)基， 接種培養(yǎng)5-7d，觀察記錄其生長情況。
b. 菌株對有機(jī)磷的降解率的測定
以目標(biāo)農(nóng)藥有機(jī)磷作為唯一的碳源，配制含有目標(biāo)農(nóng)藥的500mg/L和1 000mg/LPSB 培養(yǎng)液，接種菌液l mL于125mL的培養(yǎng)液中，同時設(shè)有不接種菌的兩種濃度的空白對照 和只接種菌而小加農(nóng)藥的對照，以消除水解和光解等因素引起目標(biāo)農(nóng)藥減少的影響，在與 前述條件相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7d取樣用氣相色譜測定細(xì)菌對目標(biāo)農(nóng)藥的降解率。
c. 菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥降解譜的測定.-
為探討菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解譜，選取目前生產(chǎn)中常用的有機(jī)磷農(nóng)藥樂果、毒死 啤、三唑磷、辛硫磷作為目標(biāo)農(nóng)藥，按照b.的方法進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)7d取樣用氣相色譜測定 細(xì)菌對目標(biāo)農(nóng)藥的降解率。
具體實(shí)施例方式
為了進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，如下提供了制備本發(fā)明的組合物的實(shí)施例，然而應(yīng)當(dāng)理解， 本發(fā)明的范圍不因這些實(shí)施例而受到限制。 實(shí)施例1
1. 樣品采集
用無菌取樣瓶采集沿海或近外海捕撈漁場的水樣或泥樣，放入20-4(TC的恒溫箱中 恒溫0.5-1.5小時恒溫箱中待用；
2. 分離篩選
水樣中加入不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥，搖勻，靜置30min后在營養(yǎng)瓊脂平板上涂布， 25-3(TC培養(yǎng)48-72h，從有菌落生長的有機(jī)磷農(nóng)藥濃度最高的平板上挑選不同形態(tài)的菌 落接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上。選取目前生產(chǎn)中常用的有機(jī)磷農(nóng)藥樂果、毒死啤、三唑磷、 辛硫磷作為目標(biāo)農(nóng)藥。
3. 降解菌的富集培養(yǎng)
將所挑選的耐藥菌分別接種到濃度為300、 600、 800和1,000 [X10—、V/V)]的有機(jī) 磷農(nóng)藥(樂果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷)選擇性培養(yǎng)液中，28。C培養(yǎng)3d，而后在平 板上劃線。從有菌落生長的最高藥物濃度的平板上挑耐藥菌接種到斜面上，28'C培養(yǎng) 24h，再以此菌株為試驗(yàn)菌株，反復(fù)重復(fù)上述試驗(yàn)。
4. 降解菌的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定
降解菌的鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《Bergey'smanual of determinative bacteriology》(第九版)進(jìn)行。
5. 對分離篩選的菌種進(jìn)行性能檢測
5.1菌株對有機(jī)磷耐受能力的測定 分別制各甲胺磷含量為400、 800、 1,600、 3，200、 6,400、 12,800 mg/L PSB液體培養(yǎng)基， 接種培養(yǎng)5-7d，觀察記錄其生長情況。 5.2菌株對有機(jī)磷的降解率的測定
以目標(biāo)農(nóng)藥有機(jī)磷作為唯一的碳源，配制含有目標(biāo)農(nóng)藥的500mg/L和1 000mg/LPSB 培養(yǎng)液，接種菌液lml于125ml的培養(yǎng)液中，同時設(shè)有不接種菌的兩種濃度的空白對照和 只接種菌而小加農(nóng)藥的對照，以消除水解和光解等因素引起目標(biāo)農(nóng)藥減少的影響，在與前 述條件相同的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7d取樣用氣相色譜測定細(xì)菌對目標(biāo)農(nóng)藥的降解率。
5.3菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥降解譜的測定 為探討該菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解譜，選取目前生產(chǎn)中常用的有機(jī)磷農(nóng)藥樂果、毒死啤、
三唑磷、辛硫磷作為目標(biāo)農(nóng)藥，按照5.2的方法進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)7d取樣用氣相色譜測定細(xì)
菌對目標(biāo)農(nóng)藥的降解率。
權(quán)利要求
1.一種快速篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法，包括以下步驟(1)樣品采集用無菌取樣瓶采集沿?；蚪夂２稉茲O場的水樣或泥樣，放入恒溫箱中待用；(2)分離篩選水樣中加入不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥，搖勻，靜置在營養(yǎng)瓊脂平板上涂布、培養(yǎng)，從有菌落生長的有機(jī)磷農(nóng)藥濃度最高的平板上挑選不同形態(tài)的菌落接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上；(3)降解菌的富集培養(yǎng)將所挑選的耐藥菌接種到含有有機(jī)磷農(nóng)藥的選擇性培養(yǎng)液中，培養(yǎng)，而后在平板上劃線。從有菌落生長的最高藥物濃度的平板上挑耐藥菌接種到斜面上，培養(yǎng)，再以此菌株為試驗(yàn)菌株，反復(fù)重復(fù)上述試驗(yàn)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法，其特征在于，其中步驟(1)所述的恒溫條件為20-40。C的恒溫箱中恒溫0.5-1.5小時。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法，其特征在于，其 中步驟(2)所述的有機(jī)磷農(nóng)藥可以為樂果、毒死啤、三唑磷、辛硫磷。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法，其特征在于，其中性能檢測是進(jìn)行下面各項(xiàng)指標(biāo)的檢測菌株對有機(jī)磷耐受能力的測定、菌株對有機(jī)磷的降解率的測定和菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥降解譜的測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥海洋微生物的方法，包括(1)樣品采集；(2)分離篩選；(3)降解菌的富集培養(yǎng)；(4)降解菌的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定；(5)對分離篩選的菌種進(jìn)行性能檢測。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)效率高，操作簡單，結(jié)果可靠，促進(jìn)了從海洋微生物中篩選降解有機(jī)磷農(nóng)藥的工作效率。
文檔編號C12N1/00GK101104843SQ20061010129
公開日2008年1月16日 申請日期2006年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日
發(fā)明者金彬明 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院