生物分子固定化基片、生物芯片及生物傳感器的制作方法

專利名稱：生物分子固定化基片、生物芯片及生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子固定化基片、生物芯片以及生物傳感器。更具體地，本發(fā)明涉及采用親水單分子膜和脂雙層將生物分子固定于基片。
背景技術(shù)：
(關(guān)于生物傳感)對于將生物分子二維排列在芯片基片上的生物芯片、量子芯片，目前正在探索其在醫(yī)療-環(huán)境領(lǐng)域、電子領(lǐng)域及其它領(lǐng)域的應(yīng)用。特別是在治療-診斷領(lǐng)域以及生物體機理的研究中，芯片基片上二維排列著為數(shù)眾多的蛋白質(zhì)分子(protein)的蛋白質(zhì)芯片對于疾病診斷、健康診斷、個體鑒定、生物體系統(tǒng)解析等用途是非常必要的。
例如，為了了解生物體系統(tǒng)，必須要明確了解細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)分子間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及此網(wǎng)絡(luò)隨時間的變動情況。為此，能夠高通量解析表達蛋白質(zhì)的相互作用的蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)建就顯得尤其必要。
在蛋白質(zhì)芯片中，將各種各樣的探針(蛋白質(zhì))二維地排列固定在芯片基片上。若將樣品與蛋白質(zhì)芯片相接觸，則樣品中只有特異性的靶物質(zhì)(蛋白質(zhì))與探針相結(jié)合，這是由于探針的特性所決定的。因此，若能檢測出由于探針與靶的結(jié)合所致的探針的特性變化，將其轉(zhuǎn)換為光、電等信號，以此讀出特性變化的有無、靶物質(zhì)的量等，則可對作為靶物質(zhì)的蛋白質(zhì)的種類進行鑒定、對蛋白質(zhì)的表達或相互作用進行解析。
例如，若采用將某種抗體二維固定在芯片基片上的蛋白質(zhì)芯片，使血液等樣品與此蛋白質(zhì)芯片相接觸，則只有特定的抗原(例如，炭疽菌、天花病毒等特定的病毒抗原)與該抗體反應(yīng)，被吸附于蛋白質(zhì)芯片上，由此可通過蛋白質(zhì)芯片檢出是否存在特定抗原?；蛘撸部梢杂嫓y出被蛋白質(zhì)芯片上的抗體所吸附的抗原量或者樣品中抗原的減少量。因此，通過這樣的方法，可以診斷出特定細菌感染的有無或疾病的程度等。
而且，蛋白質(zhì)芯片也有望在疑難疾病的特效藥物的開發(fā)、沒有副作用的醫(yī)療藥品的開發(fā)、預(yù)防醫(yī)藥的實現(xiàn)等方面發(fā)揮作用。
另外，作為如上所述的用于生物傳感技術(shù)中的蛋白質(zhì)芯片，有下述幾種(1)將抗體、疑似抗體、適體、噬菌體展示文庫固定于基片的蛋白質(zhì)芯片；(2)將由cDNA表達的蛋白質(zhì)固定于基片的蛋白質(zhì)芯片；(3)將從細胞或組織中精制的蛋白質(zhì)固定于基片的蛋白質(zhì)芯片等。
(關(guān)于脂雙層)在這種生物芯片(蛋白質(zhì)芯片)中，為了將抗體固定在芯片基片上，需要首先在芯片基片的表面形成脂雙層，然后再在其上固定抗體等蛋白質(zhì)。脂雙層是生物膜的基本構(gòu)造，通過在脂雙層上嵌入或結(jié)合蛋白質(zhì)，可得到生物膜的基本骨架。因此，若在芯片基片上形成人工的脂雙層，將蛋白質(zhì)固定在脂雙層的表面，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)嵌入脂雙層中，則蛋白質(zhì)就能夠表達本來的生理機能。因此，現(xiàn)有技術(shù)中已提出多種在芯片基片表面形成人工脂雙層的方法。
特開平6-90736號公報(專利文獻1)中公開了一種生物傳感器，其中，將記錄電極配置在芯片基片(Teflonblock)內(nèi)，在該電極上以存在大量水層的方式形成脂雙層，再在其上形成參照電極。脂雙層通過含親水性間隔(spacer)分子的架橋系留分子而附著于記錄電極上。
這里作為架橋系留分子，使用與末端具有巰基或硫醚殘基的聚氧化烯鏈鍵合的磷脂酰乙醇胺?；蛘?，采用PE-NH-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-SH(n為約7～約24，PE-NH為磷脂酰乙醇胺的殘基)。架橋系留分子末端的巰基或硫醚殘基附著于記錄電極的表面，架橋系留分子與脂雙層通過共價鍵結(jié)合。
特開平9-236571號公報(專利文獻2)所公開的生物傳感器中，在表面形成有Au膜的芯片基片上隔著間隔分子形成脂雙層，在脂雙層中嵌入受體。
在這里，作為間隔分子，使用含有肽的分子(具體來說，該分子含有1分子的乙醇胺、4～20個由C2-C10-α-氨基酸形成的螺旋結(jié)構(gòu)或折疊片結(jié)構(gòu)的寡肽、以及反應(yīng)性基團，該反應(yīng)性基團參與間隔分子與芯片基片的化學(xué)或物理化學(xué)結(jié)合)。在該間隔分子中，乙醇胺與脂雙層的磷酸基通過共價鍵(酯鍵)結(jié)合。
但是，在專利文獻1、專利文獻2所記載的生物傳感器中，脂雙層和架橋系留分子或間隔分子(含有肽的分子)通過共價鍵強烈地結(jié)合，因而脂雙層和芯片基片通過架橋系留分子或間隔分子直接進行固定，脂雙層的固定化沒有柔性。因此，在這些生物傳感器中，脂雙層有可能失活，而且，脂雙層的壽命也很短。
另外，生物分子在流動的介質(zhì)中具有活動性，與之相反，若使用架橋系留分子或者間隔分子，則脂雙層以及與之相結(jié)合的生物分子的流動性均消失了，因而生物分子原本的功能和活動受到限制，有可能不能觀察到生物分子原本的功能和活動。另外，芯片基片通常采用Au膜因而價格高昂，并且希望芯片基片能重復(fù)使用，但是，若采用架橋系留分子或間隔分子，則脂雙層以很強的結(jié)合力結(jié)合于芯片基片，因而難以重復(fù)使用芯片基片。
另外，專利文獻2所記載的生物傳感器中，磷脂的親水性部位與乙醇胺分子結(jié)合，然后將4～20個α-氨基酸鍵合在乙醇胺的N原子上，形成間隔分子和磷脂的單分子膜。然后，利用間隔分子的HS部位將含有間隔分子的二磷脂?；衔锕潭ㄓ谛酒?，在其中添加脂質(zhì)體(liposome)溶液，使脂膜間互相融合，從而在芯片基片上形成脂雙層。
可是，這種脂雙層形成方法中，不論是形成間隔分子和磷脂的單分子膜的工序，還是形成脂雙層的工序，都是非常耗時的程序，效率低下。
在特開平10-510277號公報(專利文獻3)中公開了一種生物傳感器，在該生物傳感器中，在芯片基片上，通過具有親水性羥基的肽分子形成脂雙層，肽分子的羥基和脂雙層通過氫鍵結(jié)合，這里，肽用R-A-B-C-D-E-OH表示。A為選自由Ala、Gly和Leu組成的組中的氨基酸的殘基，B為選自由Ala、Ser、Gly-Gly和Ser-Ser組成的組中的氨基酸殘基或二肽殘基，C為選自由Ala、Ala-Ala、Leu-Leu、Ala-Ala-Ala、Arg-Gly-Asp和Leu-Leu-Leu組成的組中的氨基酸或二肽或三肽的殘基，D為選自由Ala和Ser組成的組中的氨基酸的殘基，E為選自由Ala、Leu和Pro-Lys組成的組中的氨基酸或二肽基，R為H、HS-烷基-CO、HS-烷基-CO-NH-烷基’-CO-、Trt-S-烷基-CO-、Trt-S-烷基-CO-NH-烷基’-CO-或者1，2-二硫環(huán)戊烷-3-(CH2)4-CO-(其中，若A、B、C、D和E中至少之一不是Ala，則R可以為H；各烷基與烷基’之間沒有關(guān)系，分別是碳原子數(shù)為1～11的亞烷基，Trt為三苯甲基)及它們的鹽。
專利文獻3所記載的生物傳感器中，脂雙層和肽分子通過氫鍵結(jié)合，這樣，脂雙層通過肽分子以比較弱的結(jié)合力被系留在芯片基片上，因而能夠防止固定于脂雙層上的生物分子的失活，同時能夠?qū)⒛さ鞍踪|(zhì)固定在脂雙層上。另外，在該生物傳感器中，作為使芯片基片與脂雙層相結(jié)合的手段，采用了具有導(dǎo)電性的肽，可通過肽分子傳導(dǎo)電信號，因而可通過生物傳感器的電氣變化檢測出生物分子的變化等。
可是，在這種生物傳感器中，鑒于肽分子構(gòu)造上的原因，肽分子不能在芯片基片上達到高密度，因而難以將脂雙層緊密地系留在芯片基片上，容易產(chǎn)生脂雙層的剝落。而且，由于肽穩(wěn)定性低且很柔軟，因而通過肽系留的脂雙層容易隨時間產(chǎn)生變化。
進一步，在采用肽分子的生物傳感器中，控制肽分子的膜厚恒定是很困難的，也很難自由設(shè)定脂雙層與在芯片基片上形成的電極的距離，這樣，通過光學(xué)傳感方法，特別是通過SPR(表面等離子共振，surfaceplasmon resonance)測定脂雙層上固定的生物分子時，測定精度也不穩(wěn)定。而且，肽分子很難保持均一膜厚，在通過SPR對生物分子進行測定時，噪音增加且測定精度降低。
另外，在專利文獻3所記載的生物傳感器中，首先合成肽分子(R-A-B-C-D-E-OH)，使其R基與電極結(jié)合，形成肽分子單分子膜，然后，含有磷脂(該磷脂具有磷脂酰膽堿或磷脂酸-NH2基)的脂質(zhì)體(liposome)與肽分子融合，將脂雙層固定于電極?？墒?，這種脂雙層的形成方法中，不論是形成肽分子單分子膜的工序，還是形成脂雙層的工程，均屬于非常耗時的程序，效率低下。
專利文獻1特開平6-90736號公報(第3213341號專利)
專利文獻2特開平9-236571號公報專利文獻3特開平10-510277號公報發(fā)明內(nèi)容針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供新的生物分子固定化基片或生物芯片等，所述生物分子固定化基片或生物芯片中，采用親水性單分子膜和脂雙層將生物分子固定于芯片基片上。
本發(fā)明的生物分子固定化基片是在基片上系留脂雙層的生物分子固定化基片，其中，所述生物分子固定化基片具有單分子膜和脂雙層，所述單分子膜是將以X-(CH2)n-OH(X為巰基)表示的分子排列在基片上的單分子膜；所述脂雙層通過氫鍵與所述單分子膜連接，據(jù)此使該脂雙層系留在所述基片上。
在本發(fā)明的生物分子固定化基片中，脂雙層與單分子膜通過氫鍵以比較弱的力結(jié)合，柔性地系留于基片上，因而脂雙層不易失活，壽命也較長；而且，由于脂雙層柔性地系留于基片上，因而脂雙層或與其結(jié)合的生物分子的流動性不易受到阻礙，可以在保持生物分子原本的功能或活動性的情況下對其進行觀察。
而且，在本發(fā)明的生物分子固定化基片中，作為單分子膜使用X-(CH2)n-OH，因而可以使單分子膜的膜厚保持均一，其膜厚可以控制在單位的水平。進一步，在其上形成的脂雙層的膜厚也是均一的，因而可以很容易地將生物識別分子和受體在脂雙層上排列整齊和進行定向，從而使受體的結(jié)合部位朝向上方。而且，利用該脂雙層能夠防止非特異性的檢體被生物識別分子和受體吸附，提高檢體的測定精度和可信性。
進一步，在專利文獻3的生物芯片中，難以使肽分子的分子密度高于1mol(摩爾)/nm2，但在本發(fā)明的生物分子固定化基片中，單分子膜的分子密度可以大于或等于1mol/nm2，因此，根據(jù)本發(fā)明的生物分子固定化基片，可以增大單分子膜的分子密度、可以增強脂雙層與基片的連接強度，因而可以使脂雙層穩(wěn)定，并可減小脂雙層隨時間變化。
而且，本發(fā)明的生物分子固定化基片中，可以利用例如表面活性劑來解離單分子膜和脂雙層間的氫鍵，因而在使用后可以剝離脂雙層，形成新的脂雙層，據(jù)此可將生物分子固定化基片再生，從而使生物分子固定化基片的再利用成為可能。
本發(fā)明的生物芯片具有單分子膜、脂雙層、生物識別分子、以及受體，所述單分子膜是將以X-(CH2)n-OH(X為巰基)表示的分子排列在基片上的單分子膜；所述脂雙層通過氫鍵與所述單分子膜連接，據(jù)此使該脂雙層系留在所述基片上；所述生物識別分子固定于所述脂雙層；所述受體固定于所述生物識別分子并與特定的蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合。例如，生物識別分子含有結(jié)合于脂雙層的生物素以及與該生物素相結(jié)合的抗生物素蛋白，受體為生物素化的抗體。
本發(fā)明的生物傳感器具備本發(fā)明的生物芯片并具有測定裝置，所述測定裝置用于檢出是否存在作為檢測對象的檢體、檢體的量、或者結(jié)合特異性等反應(yīng)狀態(tài)。更具體地，其是一種利用表面等離子共振的生物傳感器。具體來說，其優(yōu)選為下述生物傳感器在基片表面形成的Au薄膜(金屬層)的膜厚或者Au粒子的直徑為40nm～50nm，單分子膜的膜厚為小于等于1nm，脂雙層的膜厚為5nm～10nm，用于表面等離子共振的光的波長為可見光。
本發(fā)明的生物芯片和生物傳感器具有本發(fā)明的生物分子固定化基片同樣的作用效果。進一步，在本發(fā)明的生物芯片和生物傳感器中，由于單分子膜、脂雙層的膜厚均一，因而可使受體與金屬層的距離均一，在通過表面等離子共振等對檢體進行測定時，可以減少噪音、提高測定精度。
本發(fā)明的生物分子固定化基片的制備方法是用于制備在基片上系留脂雙層的生物分子固定化基片的方法，即具有在基片上形成單分子膜的工序和將脂雙層系留在所述基片上的工序，所述在基片上形成單分子膜的工序中，將以X-(CH2)n-OH(X為巰基)表示的分子利用其自體組織化排列在基片上，從而在基片上形成單分子膜；所述將脂雙層系留在所述基片上的工序中，將脂質(zhì)利用其自體組織化進行排列，以此形成脂雙層，該脂雙層通過氫鍵與所述單分子膜連接，據(jù)此使該脂雙層系留在所述基片上。
用于本發(fā)明的生物分子固定化基片的單分子膜和脂雙層均具有自體組織化的功能，因此，在制作生物分子固定化基片時，只要利用其自體組織化的功能得到單分子膜和脂雙層，就會很容易地制備出生物分子固定化基片。
另外，本發(fā)明的上述說明的構(gòu)成要素可以盡其可能地任意組合。


圖1為概略表示本發(fā)明的生物芯片的構(gòu)成的圖。
圖2為表示單分子膜中所包含的亞甲基鏈的數(shù)目與單分子膜的膜厚的關(guān)系的圖。
圖3(a)-圖3(f)說明在芯片基片表面上形成單分子膜的工序。
圖4為示意性表示磷脂囊球的圖。
圖5(a)～圖5(d)說明制備磷脂囊球的工序。
圖6(a)和圖6(b)說明將磷脂囊球附著于芯片基片上制備脂雙層的工序。
圖7為表示本發(fā)明的生物傳感器的構(gòu)造的概略圖。
圖8表示隨著改變?nèi)肷涔獾娜肷浣?，反射率所發(fā)生的變化，該變化通過生物傳感器測定。
圖9表示模擬中所用的模型。
圖10為用表1的值表示反射率變化的圖。
圖11為用表2的值表示反射率變化的圖。
圖12為用表3的值表示反射率變化的圖。
附圖標(biāo)記說明11生物芯片12生物分子固定化基片13生物傳感器21芯片基片22金屬層23單分子膜24脂雙層
25磷脂25a親水性部分25b疏水性部分27生物識別分子28受體29生物素30抗生物素蛋白31檢體32生物素部位51棱鏡52發(fā)光裝置53受光裝置具體實施方式
以下，根據(jù)附圖詳細說明本發(fā)明的實施例。
實施例1圖1為示意表示本發(fā)明的生物芯片11(即固定了受體的生物分子固定化基片12)的構(gòu)成的圖。在生物分子固定化基片12中，如以下的詳細描述，其通過親水性的單分子膜23將脂雙層24系留在表面形成有金屬層22的芯片基片21上。另外，生物芯片11在生物分子固定化基片12的脂雙層24的上面固定生物識別分子27，受體28固定在生物識別分子27上。
芯片基片21是由玻璃、石英等具有透光性的材料形成的薄板。芯片基片21的上面固定有多個金屬微粒，形成金屬層22。
形成金屬層22的金屬微粒是直徑為數(shù)10nm(特別是40～50nm)的Au、Ag等的納米水平的無機金屬微粒，幾乎無凝集，以互相分離的狀態(tài)固定。金屬微粒的配置不需要有規(guī)則，隨機分散即可。金屬微粒之間的間隔(相鄰的微粒表面之間的最小距離)優(yōu)選為金屬微粒直徑的2倍～4倍。例如，如果金屬微粒的密度約為每1平方微米370個微粒，則換算為被覆率約為0.17。
在金屬層22的上面，分子通過自體組織化進行排列，形成親水性單分子膜23，在其上系留脂雙層24。該單分子膜23是以X-(CH2)n-OH(X為巰基)表示的分子(間隔分子)通過自體組織化進行排列而形成的膜。各分子的巰基X固定于金屬層22(或者芯片基片21)。這種構(gòu)成親水性單分子膜23的分子可以表示為硫代烷醇基HS(CH2)nOH。單分子膜23的膜厚優(yōu)選小于等于1nm，越薄越好。
對于脂雙層24，其中兩親性的磷脂25通過疏水性部分25b朝向內(nèi)側(cè)相互對向而排列成2層。脂雙層24與單分子膜23通過氫鍵進行連接，從而系留在芯片基片21的表面。但是，脂雙層24并不直接與單分子膜23通過氫鍵結(jié)合，而是借助于脂雙層24與單分子膜23之間的媒介26的水分子而互相結(jié)合。即，單分子膜23通過將巰基X附著于金屬層22而固定于芯片基片21，單分子膜23的羥基-OH與水分子以氫鍵結(jié)合，并且水分子與脂雙層24的親水性部分(磷脂25的親水性部分25a)以氫鍵結(jié)合，其結(jié)果就是，脂雙層24通過單分子膜23系留于芯片基片21。脂雙層24的膜厚度優(yōu)選為5～10nm，優(yōu)選膜厚度薄。
這樣，由于脂雙層24與單分子膜23通過氫鍵以比較弱的力結(jié)合，因而脂雙層24柔性地系留在芯片基片21上，所以，在此生物芯片11中，脂雙層24不易失活，脂雙層24的壽命也增長。而且，由于脂雙層24柔性地系留在芯片基片21上，因而脂雙層以及與其結(jié)合的生物分子的流動性不易受到阻礙，可以在維持生物分子原本的功能或活動性的情況下對其進行觀察。
上述單分子膜23的分子密度優(yōu)選為每1平方納米1摩爾(lmolecules/nm2)或更高。在論文“表面固定化的人工亮氨酸拉鏈蛋白的pH依賴性行為(pH-Dependent Behavior of Surface-immobilized ArtificialLeucine Zipper Protains)(Molly M.Stevens等，Langmuir 2004，20，7747-7752 American Chemical Society)的第7749頁中，記載了將肽以708ng/cm2的密度固定在Au膜上，將此值換算為摩爾密度為0.5mol/nm2。這被認為是在Au膜上形成的肽的摩爾密度的最大值。然而，根據(jù)論文“硫代鏈烷醇自體組織化膜”(Deboirs L.H.& Nuzzo，R.G.(1992)Annu.Rev.Phys.Chem.43437)，作為硫代鏈烷醇中的一種的HS-(CH2)11-OH(Mw＝204.37)的密度為157ng/cm2，換算為摩爾密度為4.8mol/nm2。
因此，如果采用親水性的單分子膜23，則可使分子以高于專利文獻3中的肽分子密度的高密度進行排列，特別是可以以每1平方納米1摩爾(1mol/nm2)或更高的密度進行排列。這樣，根據(jù)本發(fā)明的生物芯片11，可以使單分子膜23的分子密度增大，通過增大單分子膜23的分子密度，可以增強脂雙層24與金屬層22的結(jié)合強度，因而可使脂雙層24穩(wěn)定，并且使脂雙層24的隨時間的變化也減小?；蛘哒f，通過調(diào)整單分子層23的分子密度，使得調(diào)整脂雙層24的結(jié)合強度成為可能。
另外，在論文“肽衍生的自我裝配單層結(jié)構(gòu)N-硬脂酰L-半胱氨酸甲基酯在金上的吸附”(Peptide-derived Self-assembled MonolayersAdsorption of N-Stearoyl L-Cysteine Methyl Ester on Gold)(Susan L.Dawson和David A.TirrellJournal of Molecular Recognition，Vol.，10，18-25(1997))中，報告了肽分子在Au膜上的肽層積膜中的無序性(disorder)。因此，專利文獻3中記載的肽分子的單分子膜中，很難將肽分子的膜厚控制為恒定值。
與此相對，在本發(fā)明單分子膜23中，可以使膜厚保持均一，并且可將膜厚控制在單位的水平。附圖2為從論文“有機硫醇從溶液向金的自發(fā)性裝配所形成的單層膜”(Formation of Monolayer Films by theSpontaneous Assembly of Organic Thiols from Solution onto Gold)(Collin D.Bain等，J.Am.Chem.Soc.1989，111，321-335)轉(zhuǎn)載的一個表，該表顯示了將HS(CH2)nOH3化學(xué)吸附在Au薄膜上時的單分子膜的膜厚的試驗值，其中采用橢圓偏振儀進行計測。在附圖2中，橫軸表示單分子膜中的亞甲基鏈的數(shù)目n，縱軸表示單分子膜的膜厚。從圖2可以獲知，亞甲基鏈的數(shù)目n與單分子膜的膜厚之間在級別上被認為是呈線性變化的。因此，根據(jù)本發(fā)明的生物芯片11，通過控制構(gòu)成單分子膜23的X-(CH2)n-OH中的亞甲基鏈的數(shù)目n，可以得到具有均一膜厚的單分子膜23，同時可以對單分子膜23的膜厚進行自由地調(diào)節(jié)。
脂雙層24上固定的生物識別分子27含有生物素29和抗生物素蛋白30。生物素29固定于脂雙層，抗生物素蛋白30與生物素29相結(jié)合。或者，若使用的脂雙層含有生物素化的磷脂，則抗生物素蛋白可直接固定于脂雙層。
受體28選擇與特定的檢體31(蛋白質(zhì))特異性結(jié)合的抗體，該受體被生物素化。此受體28的生物素部位32與生物識別分子27的抗生物素蛋白30相結(jié)合，受體28據(jù)此固定于生物識別分子27。
根據(jù)本發(fā)明的生物芯片11，如上述，由于可使單分子膜23的膜厚保持均一，因而在其上形成的脂雙層24的膜厚也是均一的。由此很容易將脂雙層上的生物識別分子27和受體28排列整齊和進行定向，可以使受體28的結(jié)合部位朝向上方。其結(jié)果就是，可以防止非特異性的檢體被生物識別分子27、受體28吸附，從而提高生物芯片11的測定精度和可信性。
接下來，根據(jù)附圖3～6說明上述生物芯片11的制備方法。首先，如圖3(a)所示，在100％乙醇溶液41中加入硫代烷醇42(HS(CH2)11OH)，如圖3(b)那樣將硫代烷醇42溶解于乙醇溶液41。
接下來，如圖3(c)所示，將單面覆有金屬層22(膜厚為40～50nm的Au薄膜)的芯片基片21置于上述乙醇溶液41中浸漬1小時。一旦將芯片基片21浸漬到乙醇溶液41中，如圖3(d)所示，溶解于乙醇溶液41中的硫代烷醇42就會在金屬層22的表面進行自體組織化并析出。然后，如圖3(e)所示，在金屬層22的上面形成含有硫代烷醇42的單分子膜23。
然后，將芯片基片21從乙醇溶液41中取出，進行清洗，然后進行干燥，如圖3(f)示，在芯片基片21上得到目的單分子膜23。這樣得到的單分子膜23中，各硫代烷醇42的巰基固定于金屬層22上，已知各硫代烷醇42以數(shù)十度傾斜的狀態(tài)互相平行排列。
接下來制備磷脂囊球43。所謂囊球(vesicle)，是指磷脂的疏水性部分互相會合，親水性部分與水溶液層接觸形成雙層，其雙層呈如圖4所示的閉合球狀。
制備囊球43時，如圖5所示，在燒瓶等中裝入磷脂25。作為磷脂，例如采用純度高的1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)。將此磷脂25在干燥的Ar氣體氛圍氣中進行干燥，然后進一步進行2小時的真空干燥。這樣，如圖5(b)所示，磷脂25被干燥，然后加入水使磷脂25混懸，如圖5(c)所示，進行超聲波處理使磷脂25得到充分?jǐn)嚢璩蔀榫|(zhì)。接下來，如圖5(d)所示，超速離心取上清液，將上清液保存于4℃。此上清液包含直徑為數(shù)10nm或以下的磷脂25的囊球43。
接下來，如圖6(a)所示，將包含囊球43的懸濁液滴加在表面形成有單分子膜23的芯片基片21的規(guī)定區(qū)域，或者將芯片基片21浸漬在包含囊球43的懸濁液中。這樣，囊球43在單分子膜23的上面破裂散開，連鎖發(fā)生所破裂的脂雙層24間的融合，并自體組織化，如圖6(b)所示，在芯片基片21的單分子膜23的上面形成脂雙層24。另外，在圖6(a)、圖6(b)中，芯片基片21上由光致抗蝕劑形成隔壁44。其用于固定各種不同受體、實現(xiàn)各種不同受體的陣列化。
若如上制備生物分子固定化基片12，則由于單分子膜23和脂雙層24均通過自體組織化在芯片基片21上很容易地形成，因而可以容易地制備得到生物芯片11。
接下來，根據(jù)圖7說明采用本實施例的生物芯片11的生物傳感器13，其可以利用表面等離子共振通過光學(xué)理論檢測出是否存在作為檢測對象的檢體31、檢體的量、或者結(jié)合特異性等反應(yīng)狀態(tài)。
該生物傳感器13含有上述生物芯片11和測定裝置。測定裝置由直角三角形的棱鏡51、發(fā)光裝置52和受光裝置53組成。棱鏡51與生物芯片11的芯片基片21的下面緊密接合。發(fā)光裝置52發(fā)射可見光區(qū)(例如波長為635nm)的激光束，其位于棱鏡51的斜下方，與一個棱鏡斜面對向配置。受光裝置53位于棱鏡51的斜下方，與另一個棱鏡斜面對向配置，將其配置為可以接收下述光，所述光由發(fā)光裝置52發(fā)出，透過棱鏡51和芯片基片21、并經(jīng)金屬層22反射。而且，發(fā)光裝置52和受光裝置53由于棱鏡的旋轉(zhuǎn)而可以移動，通過移動發(fā)光裝置52可以變化調(diào)節(jié)對生物芯片11的光入射角度。
對生物芯片11進行設(shè)置，使得受體28與分析樣品液的流路直接接觸。因此，若在此分析樣品液中包含有與受體28特異性結(jié)合的檢體31，則該檢體31與固定于生物芯片11上的受體28特異性地結(jié)合，從而固定于生物芯片11的表面。檢體31一旦被固定于受體28，金屬層22附近的折光率就會隨著所固定的檢體31的量而發(fā)生變化。
該生物傳感器13可以利用表面等離子共振檢測出是否存在檢體31、與受體28結(jié)合的檢體31的量、或者結(jié)合特異性等反應(yīng)狀態(tài)。也即，從發(fā)光裝置52發(fā)射激發(fā)光，該激發(fā)光以在芯片基片21和金屬層22的界面的入射角大于在該界面中全反射的臨界角的角度進行發(fā)射。透過棱鏡51和基片21的激發(fā)光在金屬層22和芯片基片21的界面全反射。此時在金屬層22的上面產(chǎn)生瞬逝光(evanescent light)，瞬逝光的電場透過金屬層22、受體28，沿著金屬層22的上面擴展。
由于瞬逝光不向金屬層22的上方射出，而只局限于金屬層22上面的極狹小的區(qū)域，所以，瞬逝光與結(jié)合于受體28的檢體31相互作用，而不與未固定于受體28的檢體31相互作用。
因此，受光裝置53接收的反射光會隨著固定于受體28上的檢體31的量或密度等而變化。由此可通過分析受光裝置53接收的光的反射率來測定固定于受體28的特異性的檢體的量、密度等。
例如，移動發(fā)光裝置52使得射向生物芯片11的光的入射角變化，同時由受光裝置53測定反射光的強度，測定入射角和反射率的變化，則觀察到如圖8所示的曲線。然后，由這個共鳴角(反射率最小時的入射角)以及共鳴角中的反射率的值等可以得到有關(guān)檢體31的信息。
在這種生物傳感器13中，如前述，由于生物芯片11的單分子膜23和脂雙層24的膜厚可以保持均一，因而受體28和金屬層22間的距離也可以達到均一，當(dāng)通過表面等離子共振檢測檢體時，可以使噪音變小、測定精度提高。而且，由于可將單分子膜23的膜厚控制在單位水平，因而可以調(diào)整單分子膜的膜厚(特別是使單分子膜的厚度變薄)，以使受體、檢體位于生物傳感器13的檢測靈敏度高的位置，從而可以制備出S/N比良好的生物傳感器13。
因此，采用這樣的生物傳感器可以用于例如調(diào)查血液中是否存在病原體、以及醫(yī)療或健康診斷等用途。而且，可以對食品中所包含的蛋白質(zhì)的種類等進行檢測，也可用于食品檢測和環(huán)境監(jiān)測等用途。進一步，可以通過核對個人特異性的檢體，而用于安全保衛(wèi)或個人識別的用途。
而且，對于這種生物芯片11，可以通過表面活性劑將其單分子膜23和脂雙層24之間的結(jié)合解離。作為表面活性劑，例如可以采用SDS十二烷基硫酸鈉H3C-(CH2)10-CH2OSO3-Na+，將使用后的生物芯片11浸漬于SDS溶液中，就可以將單分子膜23與脂雙層24解離。由此，可以很容易地將脂雙層24從使用后的生物芯片11上剝離掉，通過重新在單分子膜23上形成新的脂雙層24可以使生物芯片11再生，從而使生物芯片11的再利用成為可能。
最后，對本發(fā)明的生物傳感器性能的模擬結(jié)果進行說明。模擬中使用的模型如圖9所示。芯片基片21用折射率為1.52的透明的基片制作。金屬層22用膜厚為50nm的Au層制備。單分子膜23的折射率為1.5，膜厚為2nm。脂雙層24的折射率為1.49，膜厚為5nm。而且，生物識別分子27的折射率為1.57，膜厚為10nm。另外，包含檢體的樣品溶液的折射率為1.33。
以這樣的模型為基礎(chǔ)，使單分子膜23的膜厚在2nm和0.1nm之間變化，研究共鳴角和反射率的變化。另外，使脂雙層24的膜厚在10nm和5nm之間變化，研究共鳴角和反射率的變化。還使金屬層22的膜厚在80nm和30nm之間變化，研究共鳴角和反射率的變化。但是，入射光的波長為635nm，入射光的入射角在20°至90°之間變化。
下述表1求出了單分子膜23的膜厚變化為2nm、1nm、0.1nm時共鳴角和反射率的變化結(jié)果。圖10為用表1的值表示反射率變化的圖。由表1和圖10的結(jié)果可以獲悉，隨著單分子膜23的膜厚逐漸變薄，共鳴角和反射率也逐漸變小，特別是反射率相對于單分子膜23的膜厚呈線性變化。因為反射率變小，測定精度提高，所以優(yōu)選將單分子膜23的膜厚變薄。
表1

下述表2求出了將脂雙層24的膜厚變化為10nm、8nm、5nm時共鳴角和反射率的變化結(jié)果。圖11為用表2的值表示反射率變化的圖。由表2和圖11的結(jié)果可以獲悉，隨著脂雙層24的膜厚逐漸變薄，共鳴角和反射率也逐漸變小，特別是反射率相對于脂雙層24的膜厚呈線性變化。因為反射率變小，測定精度提高，所以優(yōu)選將脂雙層24的膜厚變薄。
表2

下述表3求出了將金屬層22的膜厚變化為80nm、55nm、50nm、45nm、40nm、30nm時共鳴角和反射率的變化的結(jié)果。圖12為用表3的值表示反射率變化的圖。由表3和圖12的結(jié)果可以獲悉，隨著金屬層22的膜厚逐漸變薄，共鳴角也逐漸變小。而與此相對，如圖12所示，反射率在金屬層22的膜厚為80nm和30nm之間顯示出最小值。由此可知，金屬層22的膜厚存在一最適值(在該模擬中約為45nm)，金屬層22的膜厚優(yōu)選在這個最適值附近。
表3

權(quán)利要求
1.一種生物分子固定化基片，其是將脂雙層系留在基片上的生物分子固定化基片，其中，所述基片包含單分子膜，其是將以X-(CH2)n-OH表示的分子排列在基片上的單分子膜，上式中的X為巰基；和脂雙層，該脂雙層通過氫鍵與所述單分子膜連接，據(jù)此系留在所述基片上。
2.如權(quán)利要求1所述的生物分子固定化基片，其特征在于，所述單分子膜的分子密度是大于或等于1mol/nm2。
3.如權(quán)利要求1所述的生物分子固定化基片，其特征在于，所述基片具有含Au或Ag等無機材料的薄膜。
4.如權(quán)利要求1所述的生物分子固定化基片，其特征在于，所述單分子膜和脂雙層之間的氫鍵能夠解離。
5.一種生物芯片，其包含單分子膜，其是將以X-(CH2)n-OH表示的分子排列在基片上的單分子膜，上式中的X為巰基；脂雙層，該脂雙層通過氫鍵與所述單分子膜連接，據(jù)此系留在所述基片上；生物識別分子，其固定于所述脂雙層；和受體，其固定于所述生物識別分子并與特定的蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合。
6.如權(quán)利要求5所述的生物芯片，其特征在于，所述生物識別分子含有生物素和抗生物素蛋白，所述生物素與脂雙層相結(jié)合，所述抗生物素蛋白與該生物素相結(jié)合；所述受體是生物素化的抗體。
7.一種生物傳感器，其具備權(quán)利要求5所述的生物芯片和測定裝置，所述測定裝置用于檢出是否存在作為檢測對象的檢體、檢體的量、或者結(jié)合特異性等反應(yīng)狀態(tài)。
8.如權(quán)利要求7所述的生物傳感器，其特征在于，所述測定裝置為采用表面等離子共振的裝置。
9.如權(quán)利要求7所述的生物傳感器，其特征在于，在所述基片的表面形成Au薄膜，所述Au薄膜的膜厚或者Au粒子的直徑為40nm～50nm；所述單分子膜的膜厚小于或等于1nm；所述脂雙層的厚度為5nm～10nm；用于表面等離子共振的光的波長為可見光。
10.一種生物分子固定化基片的制作方法，其是用于制備在基片上系留脂雙層的生物分子固定化基片的方法，所述方法包括在基片上形成單分子膜的工序，在該工序中，將以X-(CH2)n-OH表示的分子利用其自體組織化排列在基片上，從而在基片上形成單分子膜，上式中的X為巰基；和將脂雙層系留在所述基片上的工序，在該工序中，將脂質(zhì)利用其自體組織化進行排列，以此形成脂雙層，該脂雙層通過氫鍵與所述單分子膜連接，據(jù)此使該脂雙層系留在所述基片上。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的生物分子固定化基片或生物芯片，該基片或芯片中，采用親水性單分子膜和脂雙層將生物分子固定于芯片基片上。在本發(fā)明的生物芯片中，在透明的芯片基片(21)上形成含有Au微粒的金屬層(22)。在該金屬層(22)上面，利用自體組織化形成含有X－(CH
文檔編號C12Q1/00GK1892219SQ20061009421
公開日2007年1月10日 申請日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日
發(fā)明者松下智彥, 西川武男, 山下英之, 池田正哲, 青山茂, 和沢鐵一, 瀨崎浩史 申請人:歐姆龍株式會社, 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)