專利名稱：一種建立小麥品種的ssr指紋代碼的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種建立小麥品種的SSR指紋代碼的方法。
背景技術(shù)：
SSR為簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats)的縮寫，是一類以2-6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，處于染色體的非編碼區(qū)。SSR廣泛分布于真核生物基因組中，小麥品種間同一位點的SSR重復(fù)次數(shù)的差異，造成品種間等位位點的差異。利用由SSR位點兩翼的非重復(fù)核苷酸序列設(shè)計的引物，對小麥DNA進行PCR擴增，在特定條件下可擴增出相應(yīng)位點的DNA片段，經(jīng)過電泳分離和硝酸銀染色，DNA帶紋顯現(xiàn)于凝膠上。凝膠上所顯現(xiàn)的DNA核苷酸序列長度多態(tài)性片段即為SSR標(biāo)記。本發(fā)明所使用的SSR引物均為德國慕尼黑技術(shù)大學(xué)植物栽培育種研究室Marion S.Roder博士等設(shè)計，發(fā)表在Genome的1998年149期2007-2023頁。鑒于SSR標(biāo)記方法具有經(jīng)濟、快捷、分辨率高的優(yōu)點，目前被認為是建立小麥DNA指紋的最佳分析方法。小麥的SSR指紋是由某些SSR位點所產(chǎn)生的帶型而形成的。目前記錄帶型的方法是，在凝膠某區(qū)段用1表示有SSR帶紋，用0表示沒有SSR帶紋。但是小麥的SSR帶型具有“帶型種類多，每種帶型的帶紋數(shù)目多，帶紋分布不均勻”的特點，用1和0記錄每條帶紋就非常困難。
小麥的每個SSR等位位點的帶型是由2～5條帶組成，用1和0記錄帶型時，只記錄每組帶的最上面一條，以下的帶作為影子帶對待。圖1表示14個小麥品種的WMS334位點(SSR位點，參見Marion S.Roder等，1998年Genome的149期2007-2023頁)的SSR帶型。如圖1所示，品種1的帶型包括4條帶。因為每兩條帶為一個等位位點的帶型，所以只記錄每兩條帶上面的一條。4條帶中上面兩條來自一個位點，從而上面的一條記作1，下面的一條視為影子帶而記作0。第3、4條帶是另一位點的帶型，第3條帶而記作1，第4條視為影子帶記作0。如果由下至上記錄帶紋的有無，還需要知道其他小麥品種WMS334帶型在這4條帶的上下有多少帶，才能為這個帶型標(biāo)出正確的代碼。本發(fā)明的發(fā)明人使用300個小麥品種進行試驗，在位點WMS334處共擴增出18種帶型。在同一塊膠上將具有不同帶型的樣品一起電泳，多態(tài)區(qū)中由下至上共有16組帶，所以18種帶型的代碼均為16位數(shù)。圖1僅列出14個品種中的12種帶型，其中，品種1(農(nóng)林10號)缺少第1、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16組帶，其WMS334的帶型代碼應(yīng)記為0000101000000000。品種2(豫麥18)缺少第1、2、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16組帶，其代碼應(yīng)記為0010100000000000。品種3(復(fù)壯30)缺少第1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16組帶，應(yīng)記為0010000000000100。依次品種4、5、7和8、9、10(京花1號、澤優(yōu)1號、豐抗8號、淮麥19、中優(yōu)16、Chenny)應(yīng)記為0010000000000010、0010000000000001、0001000010000000、0001000001000000和0001000000100000。品種11和12、13、14(揚00-126、揚麥13、揚麥9號、興農(nóng)2號)分別記為0000101000000000、0000100100000000和0000100001000000。品種6為一雜交種，需要根據(jù)父母本的帶型標(biāo)注，此處暫不詳述。由此可見，建立某位點帶型代碼，必須收集到帶紋長度連續(xù)排列的一套帶型，否則將無法確定每個帶型代碼的數(shù)字位數(shù)。
一個位點的帶型多，有利于展現(xiàn)品種間的多樣性，但是卻提高了記錄帶型的難度。首先是難以準(zhǔn)確標(biāo)注帶紋，如圖1所示，第14個品種(興農(nóng)2號)的帶型發(fā)生了傾斜，該帶型第一組帶與相鄰的品種13(揚麥9號)的帶型相同，可以認為他們的遷移率相同。但處于175-200bp的第二組帶與第9、10個品種(中優(yōu)16、Chenny)的兩種帶型的第二組帶遷移率相近，與哪組帶相同決定這一個品種指紋的正確與否。如果品種14與品種9、10處于相鄰泳道，并不難判斷，若是相隔十條泳道以上就很難作判斷。配制聚丙烯酰胺凝膠和電泳過程中的很多因素都會造成帶紋的傾斜，此時需要人為進行矯正，但是一塊凝膠可以同時電泳五、六十個PCR樣品，在五、六十條泳道之間矯正帶紋，很容易造成錯誤判斷，必須對照帶型標(biāo)準(zhǔn)反復(fù)核對校正，才可為每個樣品的帶型確定代碼。一塊凝膠除對照樣品以外，還可同時電泳約40個待測樣品，判讀40個待測樣品的帶型需要2～3個小時，而且代碼的數(shù)字多，記錄時也容易產(chǎn)生筆誤。
用1和0標(biāo)記帶型所得到的帶型代碼，隨著新帶型的增加還有可能需要增加代碼的數(shù)字位數(shù)。如果WMS334位點新帶型的第二組帶紋比品種5(澤優(yōu)1號)的第二組帶高一條帶，其代碼應(yīng)為00100000000000001，共17位數(shù)。因為其他帶型沒有此帶，他們的代碼的最后還需加一個0。由于帶型代碼的變更，由帶型代碼組成的指紋代碼也必須隨之而變。
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的發(fā)明人為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題而提出并完成本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供一種建立小麥品種的SSR指紋代碼的新方法。
本發(fā)明的再一目的為提供上述方法在鑒定小麥品種中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的為提供上述方法在小麥分類中的應(yīng)用。
本發(fā)明的方法基于發(fā)現(xiàn)一種簡單快速記錄SSR帶型的方法，從而簡化了SSR指紋代碼，進一步確?？焖贉?zhǔn)確地建立小麥品種的SSR指紋代碼。
小麥的很多SSR位點具有10個左右的等位位點，可產(chǎn)生10種左右的帶型，如上所述，用1和0為每組帶紋賦值，難以為每個品種確立準(zhǔn)確無誤的指紋。因此，本發(fā)明提出了按小麥SSR帶型賦值的新方法，即為每種帶型賦予不同的編號以示區(qū)別。
具體地，一種建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，包括以下步驟(1)分別使用小麥的各個SSR核心引物，對所有的現(xiàn)有小麥品種的DNA進行PCR擴增，分別獲得各現(xiàn)有小麥品種的對應(yīng)于每個SSR位點的各個等位位點的帶型，其中，每個核心引物對應(yīng)于小麥染色體上的一個SSR位點；(2)對于使用每一SSR核心引物獲得的現(xiàn)有小麥品種的各SSR等位位點的帶型進行分類，相同帶型被分為同一類，在具有相同等位位點帶型的品種中選擇推廣廣泛的品種作為代表品種，為每種代表品種的帶型編號；(3)以代表品種作為對照，使用相同的SSR核心引物，在相同的試驗條件下對代表品種與待測品種的DNA進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物在同一張凝膠上進行電泳，從而獲得兩者的帶型；(4)對比步驟(3)中所獲得的待測品種與代表品種的帶型，依據(jù)代表品種的已知帶型為待測品種的帶型編號；(5)按照與步驟(3)中所使用的SSR核心引物對應(yīng)的SSR位點在小麥染色體上的固定順序，匯聚待測品種的各個帶型編號，從而形成所述待測品種的SSR指紋代碼。
根據(jù)本發(fā)明的方法進一步包括依據(jù)各個帶型中的帶紋分布，確定各個帶型編號所對應(yīng)的以數(shù)個0或1表示的帶型代碼的步驟。
根據(jù)本發(fā)明，用150對已公開的小麥SSR引物對300個小麥品種進行SSR分析，從中選出40對帶紋清晰、帶型簡明的引物作為小麥SSR指紋分析的常用引物。在常用引物中進一步篩選出16對多態(tài)性信息指數(shù)高的作為核心引物。16對核心引物為WMS294(2AL)、WMS339(2A)、WMS614(2AS)、WMS120(2BL)、WMS261(2DS)、WMS155(3AL)、WMS131(3BL)、WMS161(3DS)、WMS160(4AL)、WMS186(5AL)、WMS304(5AS)、WMS272(5DL)、WMS334(6AS)、WMS617(6AL)、WMS350(7AS/7DS)、WMS44(7DM)。16對引物的序列見表1。
表1 核心引物名稱和序列
WMS44 P15’GTTGAGCTTTTCAGTTCGGC 3’，P25’ACTGGCATCCACTGAGCTG 3’；WMS120P15’GATCCACCTTCCTCTCTCTC 3’，P25’GATTATACTGGTGCCGAAAC 3’；WMS131P15’AATCCCCACCGATTCTTCTC 3’，P25’AGTTCGTGGGTCTCTGATGG 3’；WMS155P15’AATCATTGGAAATCCATATGCC 3’，P25’CCAACCGTGCTATTAGTCATTC 3’；WMS160P15’TTCAATTCAGTCTTGGCTTGG 3’，P25’CTGCAGGAAAAAAAGTACACCC 3’；WMS161P15’GATCGAGTGATGGCAGATGG 3’，P25’TGTGAATTACTTGGACGTGG 3’；WMS186P15’GCAGAGCCTGGTTCAAAAAG 3’，P25’CGCCTCTAGCGAGAGCTATG5’3’；WMS261P15’CTCCCTGTACGCCTAAGGC 3’，P25’CTCGCGCTACTAGCCATTG 3’；WMS272P15’TGCTCTTTGGCGAATATATGG 3，’P25’GTTCAAAACAAATTAAAAGGCCC 3’；WMS294P15’GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG 3’，P25’GCAGAGTGATCAATGCCAGA 3’；WMS304P15’AGGAAACAGAAATATCGCGG 3’，P25’AGGACTGTGGGGAATGAATG 3’；WMS334P15’AATTTCAAAAAGGAGAGAGA 3’，P25’AACATGTGTTTTTAGCTATC 3’；WMS339P15’AATTTTCTTCCTCACTTATT 3’，P25’AAACGAACAACCACTCAATC 3’；WMS350P15’ACCTCATCCACATGTTCTACG 3’，P25’GCATGGATAGGACGCCC 3’；WMS614 5’GATCACATGCATGCGTCATG 3’5’TTTTACCGTTCCGGCCTT 3’WMS617P15’GATCTTGGCGCTGAGAGAGA 3’，P25’CTCCGATGGATTACTCGCAC 3’。
在本發(fā)明中，分別使用上述各SSR核心引物，對300個小麥品種的DNA進行PCR擴增。所用的各品種的名稱、親本、育種單位名稱均刊登于農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心印發(fā)的2003-2005年度國家冬小麥品種試驗匯總和《全國農(nóng)作物審定品種目錄》。本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員，可以根據(jù)試驗的需要、和本領(lǐng)域的公知常識確定選用的小麥品種數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明的方法，當(dāng)比較對照品種和待測品種時，所使用的核心引物的數(shù)目可以根據(jù)兩者的遺傳背景的遠近而決定，被比較的品種的親緣關(guān)系越近，鑒定時所使用的核心引物的數(shù)目就應(yīng)相應(yīng)地增加。具體地，當(dāng)比較對照品種和待測品種時，可以先用10對SSR對待測品種進行分析，獲得品種的指紋代碼，如果這個指紋代碼與其他品種相同，則再做6對引物。通過核心引物的分析可以區(qū)別絕大多數(shù)品種，但如果對照品種和待測品種具有相同親本，育種的選擇目標(biāo)又相同，品種間的表型無明顯差異，16個位點也都相同，此時應(yīng)繼續(xù)增加引物數(shù)量，直到40對常用引物都用過，仍檢測不到品種間的差異，就可否定品種間的特異性。如果需要進行聚類分析，則可將每個帶型編號轉(zhuǎn)換成以1和0表示的帶型代碼，按軟件要求輸入計算機進行聚類分析。
根據(jù)本發(fā)明，簡化了記錄小麥SSR帶型的方法，減少了這一環(huán)節(jié)的記錄誤差和工作時間，并將小麥的SSR指紋代碼由一個距陣縮小為一組數(shù)據(jù)，使之更加易于轉(zhuǎn)換成條形碼。而且本發(fā)明可以有效地應(yīng)用于小麥新品種的鑒定、品種真?zhèn)舞b別和品種分類。
圖1為14個品種WMS334位點的帶型電泳圖，其中，MDNA標(biāo)準(zhǔn)，1～1414個品種的編號，每兩條泳道為同一品種的帶型。
圖2為WMS334的17種帶型電泳圖，其中06～6217種WMS334帶型的編號，每兩條泳道為同一種帶型。
圖3為待測品種的WMS334帶型與對照的WMS334帶型比對電泳圖，其中，第1、10、20、22、24、26、28、39、41泳道為帶型06、20、25、29、30、31、34、35、36的對照樣品，其余泳道為待測品種。
圖4為WMS44位點各種帶型的電泳圖。
具體實施例方式
本發(fā)明中所涉及的小麥品種均刊登于農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心印發(fā)的2003-2005年度國家冬小麥品種試驗匯總和《全國農(nóng)作物審定品種目錄》。
實施例1 為小麥的WMS334位點的各種SSR帶型編號位點WMS334在300個品種中產(chǎn)生18種帶型，其中16種由兩組帶紋構(gòu)成(見圖2，圖2中只列出17種帶型，)。按照第一組帶紋遷移率，對所得的帶型進行分類，把第一組帶紋的遷移率相同的帶型分在一組，從而，所得的18種帶型被分為6組。目前第一組中只有一種帶型，編號為06。因為06的兩組帶之間相隔6條帶，據(jù)此估計與06的第一組帶相同而比第二組帶低的帶型應(yīng)該有5種，所以目前第一組中唯一的帶型編號為06。第二組帶型目前已有6種，他們的第一組帶的遷移率相同，按第二組帶遷移率的大小順序排列6種帶型，形成階梯狀，但因有些帶型尚未收集到，編號時必須預(yù)先留出預(yù)計帶型的編號，所以第二組的6種帶型分別編號為20、25、28、29、30、31。第3組已收集到4種帶型，因考慮到他們與帶型31之間可能會有兩種帶型，而從34開始編號，分別為34、35、36、37，第4組已收集到5種帶型，分別編號42、43、44、45、46。第5、6組分別只收集到1種帶型，他們只有一組帶紋，分別編號為52、62。由此每種帶型便具有了屬于自己的編號。因為考慮到隨著檢測的品種不斷增加，還會發(fā)現(xiàn)的新帶型，為此沒有連續(xù)編號。當(dāng)其他品種的WMS334處的SSR分析產(chǎn)生的帶型與某帶型標(biāo)準(zhǔn)相同時，為該品種賦予相應(yīng)的帶型編號。若產(chǎn)生出新的帶型將插入相似的帶型之間，不需因增加了新的帶型而為所有帶型重新編號。小麥SSR引物最多可產(chǎn)生20多種帶型，為此帶型編號只需兩位數(shù)。
這樣，在確定待測品種某SSR位點的帶型時，由于對照品種的帶型編號已提前被確定，從而，將待測品種的SSR樣品與產(chǎn)生的相似帶型的樣品在同一塊膠上電泳，進行比對，便可確定待測品種的帶型編號。如圖3所示，第1、10、20、22、24、26、28、39、41泳道為帶型06、20、25、29、30、31、34、35、36的對照樣品，其余泳道為待測品種。這樣判讀一塊凝膠的帶型，只要10～30分鐘?？梢姲磶陀涗泿途幪柋扔?和0記錄帶型代碼，更加快捷并避免了錯判，另外由于帶型編號僅兩位數(shù)，不容易產(chǎn)生記錄筆誤。兩種記錄方法相比，為帶型賦予兩位數(shù)的編號，給人的感覺更直觀、更簡單。表2中列出了5個小麥品種的8種帶型的編號，兩品種之間SSR位點的異同在表中一目了然。
表2 5個小麥品種的8個位點的SSR帶型編號
盡管以1和0的記錄方法有缺陷，但可以客觀地記錄雙位點和三位點的遺傳信息，進行品種聚類分析和計算遺傳相似系數(shù)的軟件讀入的信息必須是1和0組成的指紋代碼，所以在為每種帶型編號的同時還須建立相應(yīng)的帶型代碼，表3為WMS334各帶型的編號和代碼。每種帶型具備了編號和代碼，在人工記錄電泳結(jié)果時，使用帶型編號可以快速記錄每個樣品的帶型，當(dāng)進行聚類分析和計算遺傳相似系數(shù)時，通過計算機輕而易舉地將每個帶型編號轉(zhuǎn)換成帶型代碼，輸入軟件進行計算。每種帶型既有根據(jù)帶型特征賦予的編號，又有表示帶紋位置的代碼，一個編號對應(yīng)一個代碼，可以根據(jù)需要相互轉(zhuǎn)換。編號為人工操作提供了方便，代碼主要用于軟件分析。
表3 WMS334各帶型的編號和代碼
一個小麥品種的DNA經(jīng)過對不同SSR位點的分析，將獲得一系列帶型編號，按照固定的位點順序，串聯(lián)各帶型編號，形成一組數(shù)據(jù)，成為該品種的指紋代碼。將指紋代碼轉(zhuǎn)換成條形碼，便形成了該品種的指紋。表4中5個品種的指紋代碼是按表1中位點排列順序，集合各帶型編號而形成的。
表4 5品種的指紋代碼
實施例2 鑒定小麥品種隆安麥4號是否具有新穎性小麥品種濟麥20為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的新品種，于2003年通過山東省審定、2004年通過國家審定，但是2005年安徽省濉溪縣農(nóng)科所申請安徽省審定的小麥品種隆安麥4號與濟麥20的表型極為相似。根據(jù)本發(fā)明的方法，通過比較隆安麥4號和濟麥20的SSR指紋代碼，認為隆安麥4號與濟麥20的遺傳背景極為相似，否定了隆安麥4號的新穎性。具體步驟如下(1)篩選小麥SSR引物用150對小麥SSR引物對(均為德國慕尼黑技術(shù)大學(xué)植物栽培育種研究室Marion S.Roder博士等設(shè)計，發(fā)表在Genome的1998年149期2007-2023頁)與300個小麥品種(各品種名稱、親本、育種單位名稱均刊登于農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心印發(fā)的2003-2005年度國家冬小麥品種試驗匯總和《全國農(nóng)作物審定品種目錄》)進行SSR分析，從中選出40對帶紋清晰、帶型簡明的引物作為小麥SSR指紋分析的常用引物。在常用引物中進一步篩選出15對多態(tài)性信息指數(shù)高的作為核心引物。用這15對引物可以為我國的絕大多數(shù)小麥品種分別建立各自的指紋代碼，有效地區(qū)分品種間的特異性。15對核心引物為WMS294、WMS339、WMS120、WMS261、WMS155、WMS131、WMS161、WMS160、WMS186、WMS304、WMS272、WMS334、WMS617、WMS350、WMS44。各引物的序列見表1。
(2)建立小麥SSR位點各等位變異的帶型圖譜匯集每對引物產(chǎn)生的各種帶型，有規(guī)律地進行排列，形成每個SSR位點各等位變異的帶型圖譜。見圖2和圖4。
(3)確定每種帶型的代表品種，為每種帶型編號從具有相同帶型的品種中選知名度較高、純度高的品種作為該帶型的代表品種。每種帶型的編號方法參見實施例1中WMS334的例子。
(4)為待測品種的帶型編號以代表品種的SSR樣品為對照，與待測品種的樣品在同一張凝膠上電泳，將待測品種的SSR帶型與對照比對，為待測品種的帶型賦予編號。
(5)待測品種指紋代碼的形成按固定的位點順序匯聚待測品種的各個帶型編號，形成該品種的指紋代碼。
(6)比較兩品種在以往的工作中，用這15對核心引物進行品種間特異性鑒定，很容易在品種間檢測到兩個位點以上的差異。但是用15對核心引物對隆安麥4號與濟麥20進行SSR分析后，只檢測到在一個位點上一個堿基的差異。如此微弱的差異無法證明隆安麥4號與濟麥20不同，為此增加檢測位點到40個，又檢測到另一個位點一個堿基的差別。證明兩品種的遺傳差異微弱，指紋代碼很相似，可以否認隆安麥4號的新穎性。
實施例3 鑒定冀曲麥12號的新穎性是否具有新穎性按照實例2的方法檢測冀曲麥12號與邯鄲農(nóng)科院培育的國家審定品種邯5316，否定了冀曲麥12號的新穎性。
實施例4 鑒定小麥品種洛川9510與洛川9538之間是否存在特異性按照實例2的方法，對洛川9510與洛川9538進行了特異性檢測，認為洛川9510與洛川9538之間不存在特異性。
序列表[1].txtApplication Project-------------------<110>Applicant北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心<120>Title一種建立小麥品種的SSR指紋代碼的方法Sequence--------<400>PreSequenceStringgttgagcttt tcagttcggc 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName1SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringactggcatcc actgagctg 19<212>TypeDNA<211>Length19SequenceName2SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgatccacctt cctctctctc 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName3SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgattatactg gtgccgaaac 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName4SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaatccccacc gattcttct c 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName5SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringagttcgtggg tctctgatgg 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName6SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaatcattgga aatccatatg cc 22<212>TypeDNA<211>Length22SequenceName7SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringccaaccgtgc tattagtcat tc 22<212>TypeDNA<211>Length22SequenceName8
序列表[1].txtSequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringttcaattcag tcttggcttg g 21<212>TypeDNA<211>Length21SequenceName9SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringctgcaggaaa aaaagtacac cc 22<212>TypeDNA<211>Length22SequenceName10SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgatcgagtga tggcagatgg 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName11SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringtgtgaattac ttggacgtgg 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName12SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgcagagcctg gttcaaaaag 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName13SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringcgcctctagc gagagctatg 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName14SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringctccctgtac gcctaaggc 19<212>TypeDNA<211>Length19SequenceName15SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringctcgcgctac tagccattg 19<212>TypeDNA<211>Length19SequenceName16SequenceDescriptionprimerSequence
序列表[1].txt--------<400>PreSequenceStringtgctctttgg cgaatatatg g 21<212>TypeDNA<211>Length21SequenceName17SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgttcaaaaca aattaaaagg ccc 23<212>TypeDNA<211>Length23SequenceName18SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringggattggagt taagagagaa ccg 23<212>TypeDNA<211>Length23SequenceName19SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgcagagtgat caatgccaga 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName20SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaggaaacaga aatatcgcgg 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName21SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaggactgtgg ggaatgaatg 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName22SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaatttcaaaa aggagagaga 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName23SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaacatgtgtt tttagctatc 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName24SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaattttcttc ctcacttatt 20
序列表[1].txt<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName25SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringaaacgaacaa ccactcaatc 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName26SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringacctcatcca catgttctac g 21<212>TypeDNA<211>Length21SequenceName27SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgcatggatag gacgccc17<212>TypeDNA<211>Length17SequenceName28SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgatcacatgc atgcgtcatg 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName29SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringttttaccgtt ccggcctt 18<212>TypeDNA<211>Length18SequenceName30SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringgatcttggcg ctgagagaga 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName31SequenceDescriptionprimerSequence--------<400>PreSequenceStringctccgatgga ttactcgcac 20<212>TypeDNA<211>Length20SequenceName32SequenceDescriptionprimer
權(quán)利要求
1.一種建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)分別使用小麥的各個SSR核心引物，對所有的現(xiàn)有小麥品種的DNA進行PCR擴增，分別獲得各現(xiàn)有小麥品種的對應(yīng)于每個SSR位點的各個等位位點的帶型，其中，每個核心引物對應(yīng)于小麥染色體上的一個SSR位點；(2)對于使用每一SSR核心引物獲得的現(xiàn)有小麥品種的各SSR等位位點的帶型進行分類，相同帶型被分為同一類，在具有相同等位位點帶型的品種中選擇推廣廣泛的品種作為代表品種，為每種代表品種的帶型編號；(3)以代表品種作為對照，使用相同的SSR核心引物，在相同的試驗條件下對代表品種與待測品種的DNA進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物在同一張凝膠上進行電泳，從而獲得兩者的帶型；(4)對比步驟(3)中所獲得的待測品種與代表品種的帶型，依據(jù)代表品種的已知帶型為待測品種的帶型編號；(5)按照與步驟(3)中所使用的SSR核心引物對應(yīng)的SSR位點在小麥染色體上的固定順序，匯聚待測品種的各個帶型編號，從而形成所述待測品種的SSR指紋代碼。
2.如權(quán)利要求1所述的建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，其特征在于，所述SSR核心引物的名稱及其核苷酸序列如下WMS44 P15’GTTGAGCTTTTCAGTTCGGC 3’，P25’ACTGGCATCCACTGAGCTG 3’；WMS120P15’GATCCACCTTCCTCTCTCTC 3’，P25’GATTATACTGGTGCCGAAAC 3’；WMS131P15’AATCCCCACCGATTCTTCTC 3’，P25’AGTTCGTGGGTCTCTGATGG 3’；WMS155P15’AATCATTGGAAATCCATATGCC 3’，P25’CCAACCGTGCTATTAGTCATTC 3’；WMS160P15’TTCAATTCAGTCTTGGCTTGG 3’，P25’CTGCAGGAAAAAAAGTACACCC 3’；WMS161P15’GATCGAGTGATGGCAGATGG 3’，P25’TGTGAATTACTTGGACGTGG 3’；WMS186P15’GCAGAGCCTGGTTCAAAAAG 3’，P25’CGCCTCTAGCGAGAGCTATG5’3’；WMS261P15’CTCCCTGTACGCCTAAGGC 3’，P25’CTCGCGCTACTAGCCATTG 3’；WMS272P15’TGCTCTTTGGCGAATATATGG 3，’P25’GTTCAAAACAAATTAAAAGGCCC 3’；WMS294P15’GGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG 3’，P25’GCAGAGTGATCAATGCCAGA 3’；WMS304P15’AGGAAACAGAAATATCGCGG 3’，P25’AGGACTGTGGGGAATGAATG 3’；WMS334P15’AATTTCAAAAAGGAGAGAGA 3’，P25’AACATGTGTTTTTAGCTATC 3’；WMS339P15’AATTTTCTTCCTCACTTATT 3’，P25’AAACGAACAACCACTCAATC 3’；WMS350P15’ACCTCATCCACATGTTCTACG 3’，P25’GCATGGATAGGACGCCC 3’；WMS614 5’GATCACATGCATGCGTCATG 3’5’TTTTACCGTTCCGGCCTT 3’WMS617P15’GATCTTGGCGCTGAGAGAGA 3’，P25’CTCCGATGGATTACTCGCAC 3’。
3.如權(quán)利要求1所述的建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，其特征在于，在步驟(3)中，使用4～16對SSR核心引物分別進行PCR擴增。
4.如權(quán)利要求1所述的建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，其特征在于，在步驟(3)中，使用8～12對SSR核心引物分別進行PCR擴增。
5.如權(quán)利要求1所述的建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，其特征在于，在步驟(3)中，使用10對SSR核心引物分別進行PCR擴增。
6.如權(quán)利要求1所述的建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，其特征在于，在步驟(3)中，使用15對SSR核心引物分別進行PCR擴增。
7.如權(quán)利要求1所述的建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，其特征在于，該方法還包括依據(jù)各個帶型中的帶紋分布，確定各個帶型編號所對應(yīng)的以數(shù)個0或1表示的帶型代碼的步驟。
8.如權(quán)利要求1所述的方法在鑒定小麥品種中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1所述的方法在小麥品種分類中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種建立小麥品種SSR指紋代碼的方法，包括以下步驟(1)使用小麥的各個SSR核心引物對現(xiàn)有小麥品種的DNA進行PCR擴增，獲得每個SSR位點的各個等位位點的帶型；(2)為每種帶型編號；(3)確定各個帶型編號所對應(yīng)的帶型代碼；(4)使用相同的SSR核心引物，在相同的試驗條件下對代表品種與待測品種進行PCR擴增；(5)對比步驟(4)中所獲得的帶型；(6)匯聚待測品種的各個帶型編號，從而形成所述待測品種的SSR指紋代碼。本發(fā)明的方法簡化了記錄小麥SSR帶型的方法，減少了這一環(huán)節(jié)的記錄誤差和工作時間。而且本發(fā)明可以有效地應(yīng)用于小麥新品種的鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK101041852SQ20061006568
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月21日
發(fā)明者王立新, 趙昌平, 李宏博, 張風(fēng)廷, 葛玲玲, 常利芳 申請人:北京雜交小麥工程技術(shù)研究中心