專(zhuān)利名稱(chēng)：能催化吲哚生成靛藍(lán)的質(zhì)粒pET28a(+)－P450BM3－gdh0310、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工中基因工程菌生產(chǎn)靛藍(lán)的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種能催化吲哚生成靛藍(lán)，能共表達(dá)細(xì)胞色素P450 BM3單加氧酶和葡萄糖脫氫酶的質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
靛藍(lán)是一種藍(lán)色色素，是最早發(fā)現(xiàn)的天然染料之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到1998年為止，世界染料的年總產(chǎn)量為800,000噸，其中靛藍(lán)占80,000噸。染料靛藍(lán)最初是從植物中提取的，直至1883年它的化學(xué)結(jié)構(gòu)被闡明后，化學(xué)合成制備方法被廣泛采用，它以生產(chǎn)簡(jiǎn)便、原料充足、純度高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)迅速普及，很快取代了植物靛藍(lán)。但化學(xué)合成靛藍(lán)環(huán)境污染嚴(yán)重，并有潛在的致癌作用。隨著人們環(huán)境保護(hù)和勞動(dòng)保護(hù)意識(shí)的加強(qiáng)，采用生物技術(shù)方法合成靛藍(lán)逐漸引起了研究者的注意。生物轉(zhuǎn)化合成靛藍(lán)不僅簡(jiǎn)化工藝，可能降低成本，而且對(duì)消除潛在致癌物，防止環(huán)境污染，具有較多的優(yōu)越性。因此發(fā)展生物法合成靛藍(lán)是極具有前途的。
P450酶系是廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物等不同生物體內(nèi)的一類(lèi)代謝酶系，因其主要組成中的P450蛋白與CO結(jié)合后在450nm處有特征光吸收峰而得名。迄今為止的研究表明，它可以催化成千上萬(wàn)的化學(xué)反應(yīng)，參與的主要反應(yīng)有烷基的羥基化、烷基的環(huán)氧化，羥基的氧化，氨、氧、硫部位上的脫烷基化，氨部位上的羥基化和氧化，硫部位上的氧化，氧化性脫氨、脫氫和脫鹵素，氧化性的C-C鍵斷裂以及其它一些還原催化反應(yīng)。有專(zhuān)著甚至指出它可能是自然界中最具催化多樣性的生物催化劑，由于該酶系的性質(zhì)和功能以及在生命活動(dòng)過(guò)程中的作用，P450酶系受到了廣大研究者的高度重視，P450酶系作用的重要性已經(jīng)成為當(dāng)代生物學(xué)研究中一個(gè)值得注意的領(lǐng)域。國(guó)外的研究工作主要分布于對(duì)該酶系在生物機(jī)體中的作用以及利用該酶系的催化作用大規(guī)模生產(chǎn)手性藥物等方面，而在國(guó)內(nèi)，雖有大量關(guān)于該酶系的綜述性和研究性報(bào)導(dǎo)，但研究工作卻只局限在該酶系在生物機(jī)體中的作用，目前尚未見(jiàn)有用該酶系的催化作用制備手性藥物的報(bào)導(dǎo)，有學(xué)者指出，主要原因是國(guó)內(nèi)目前尚未能獲得適量的酶。
在P450酶系中，P450 BM3是從巨大芽孢桿菌(B.megaterium)中發(fā)現(xiàn)的具有脂肪酸羥基化活性的P450酶，在NADPH和O2存在下，它具有快速催化鏈長(zhǎng)大約為C12-C18的飽和脂肪酸的加單氧酶活性。在國(guó)外，德國(guó)斯圖加特大學(xué)技術(shù)生化研究所R.D.Schmid領(lǐng)導(dǎo)的科研小組于2000年利用定向進(jìn)化技術(shù)獲得具有三個(gè)突變位點(diǎn)的P450 BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)，他們發(fā)現(xiàn)這一突變酶竟能催化吲哚生成靛藍(lán)；詳見(jiàn)“Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into anindole-hydroxylating catalyst”《Chemistry-A European Journal》Li Q S，Schwaneberg U，F(xiàn)ischer P，Schmid R D.2000，61531-1536。
而后由浙江大學(xué)生物工程研究所梅樂(lè)和教授領(lǐng)導(dǎo)的科研小組在此基礎(chǔ)上，通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)進(jìn)一步定向進(jìn)化P450BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)變體基因，獲得一個(gè)高于P450BM3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)催化吲哚活性的P450 BM3突變酶P450 BM3(D168N，A225V，K440N)，提高了靛藍(lán)的產(chǎn)量。詳見(jiàn)“催化吲哚生成靛藍(lán)的細(xì)胞色素450BM-3定向進(jìn)化研究”《生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展》李紅梅、梅樂(lè)和、VladaUrlacher、Schmid RolfD.2005，32(7)1-6。
但是P450 BM3催化吲哚生成靛藍(lán)需要還原型輔酶NADPH的參與，這就限制了P450 BM3用于合成靛藍(lán)的實(shí)用性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能共表達(dá)P450 BM3和葡萄糖脫氫酶，并能催化吲哚合成靛藍(lán)的質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310。
本發(fā)明還提供了上述質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的制備方法。
本發(fā)明還提供了質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310用于催化吲哚合成靛藍(lán)的用途。
一種能催化吲哚生成靛藍(lán)的質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310，由P450 BM3基因和葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個(gè)表達(dá)載體pET28a(+)構(gòu)建。
制備帶有上述質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌的方法，包括以下步驟(1)以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到gdh0310基因片段；，將該基因片段連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310；(2)上述pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；(3)挑選克隆接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)擴(kuò)增質(zhì)粒；(4)提取擴(kuò)增后的質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI酶解，將所得酶切片段定向連接到經(jīng)EcoRI和XhoI酶解處理過(guò)的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310；(5)將重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，涂布到含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；(6)挑選克隆接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)以擴(kuò)增質(zhì)粒；(7)提取擴(kuò)增質(zhì)粒，用NcoI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310進(jìn)行雙酶切，通過(guò)電泳鑒定；(8)將電泳鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中，得到帶有質(zhì)粒(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)的重組菌E.coliBL21。
上述質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310用于催化吲哚生成靛藍(lán)。
其催化吲哚生成靛藍(lán)包括以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽(yáng)性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，加入適量葡萄糖，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)加入適量底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h；(3)將所得培養(yǎng)液離心10min，收獲細(xì)胞，并用水洗滌2-3次，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)。
催化吲哚生成靛藍(lán)還可采用以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽(yáng)性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)6-8h，裝液量為25-50ml/250ml搖瓶；(3)將所得發(fā)酵液離心10min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆茫?4)稱(chēng)取濕菌體，懸浮于Tris-HCl緩沖液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；(5)反應(yīng)結(jié)束后，將所得反應(yīng)液離心10min，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)。
本發(fā)明在突變酶P450 BM3(D168N，A225V，K440N)突變基因的基礎(chǔ)上，將該突變基因與葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個(gè)表達(dá)載體pET28a(+)上，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21，得到的菌株能同時(shí)表達(dá)細(xì)胞色素P450 BM3單加氧酶和葡萄糖脫氫酶，并能協(xié)同作用催化吲哚生成靛藍(lán)，在反應(yīng)體系中形成輔酶再生循環(huán)系統(tǒng)，從而大幅度提高靛藍(lán)的產(chǎn)量，使生物轉(zhuǎn)化合成靛藍(lán)更加實(shí)用化。與只能表達(dá)P450 BM3的菌株E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)相比較，其催化活性提高了22-27倍，為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)染料靛藍(lán)提供了廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到gdh0310基因片段，將所得gdh0310基因片段用電泳檢測(cè)并從瓊脂糖凝膠中切膠回收葡萄糖脫氫酶基因片斷，通過(guò)“A-T”連接方式連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310；將所得pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到終濃度為50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑選大約8個(gè)克隆接種到3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)以擴(kuò)增質(zhì)粒；用堿裂解法提取擴(kuò)增質(zhì)粒，并用EcoRI和XhoI在37℃酶解，將獲得的酶切片段定向連接到用同樣雙酶切處理過(guò)的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310。
將重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑選8個(gè)克隆接種到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)以擴(kuò)增質(zhì)粒；用堿裂解法提取擴(kuò)增質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE-3)中，即得到了帶質(zhì)粒pET28a(+)P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21。
由LB平板挑取帶質(zhì)粒pET28a(+)P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽(yáng)性克隆接種到添加卡那霉素至終濃度為30μg/ml的LB種子培養(yǎng)基中，180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；發(fā)酵培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度30μg/ml，加入葡萄糖至100-200mM，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG至終濃度0.5-1.0mM誘導(dǎo)，同時(shí)加入適量底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h，得到藍(lán)色細(xì)胞，用N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)。
或者由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽(yáng)性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)6-8h，裝液量為25-50ml/250ml搖瓶；將所得發(fā)酵液離心10min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆?；稱(chēng)取濕菌體，懸浮于Tris-HCl緩沖液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；反應(yīng)結(jié)束后，將所得反應(yīng)液離心10min，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)。
序列表序列信息(a)序列特征，此序列不包括pET28(+)，P450 BM3基因片斷上游通過(guò)NheI酶切位點(diǎn)連接到pET28a(+)上，下游與葡萄糖脫氫酶基因片斷通過(guò)EcoRI酶切位點(diǎn)連接，葡萄糖脫氫酶基因片斷下游通過(guò)XhoI酶切位點(diǎn)與pET28a(+)連接，此序列從P450 BM3基因的啟動(dòng)子開(kāi)始，到葡萄糖脫氫酶基因的終止子結(jié)束。
長(zhǎng)度3946個(gè)堿基類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(b)分子類(lèi)型cDNA(c)最初來(lái)源P450 BM3基因片斷和葡萄糖脫氫酶基因均來(lái)自于巨大芽孢桿菌(d)序列描述ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAATCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGGTCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTGGTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCAGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTAGATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAACGAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAG
GAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGAAACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTATGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGATCCAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAGCAAGCCTACAAGACAAGTGCTGGCAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCATTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCT
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AAGCGGGAAGAGGTTAATAA具體操作采用如下步驟進(jìn)行1.葡萄糖脫氫酶基因的獲得以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到gdh0310基因片段，設(shè)計(jì)相應(yīng)的上下游引物分別是5’-AAAAGAATTCATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAG-3’和5’-AAAAACTCGAGTTATTAACCTCTTCCCGCTT-3’。
為便于與pET28a(+)-P450 BM3聯(lián)接，上下游引物的5’端分別設(shè)計(jì)了EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為向500μl的eppendorf管中加入10nmol的dNTPs，各10pmol的上游引物和下游引物，約1ng質(zhì)粒pQE30-gdh0310作為模板DNA，1.25U Taq Platinum聚合酶，5μl的PCR緩沖液，然后用無(wú)菌的蒸餾水加至總體積50μl。PCR反應(yīng)參數(shù)是94℃變性8min后，94℃/30s，54℃/30s，72℃/1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。
將所得gdh0310基因片段用電泳檢測(cè)并從瓊脂糖凝膠中切膠回收葡萄糖脫氫酶基因片斷，通過(guò)“A-T”連接方式連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310，將所得pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到終濃度為50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑選大約8個(gè)克隆接種到3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)以擴(kuò)增質(zhì)粒，用堿裂解法提取擴(kuò)增質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI在37℃酶解后，用電泳檢測(cè)并從瓊脂糖凝膠中切膠回收葡萄糖脫氫酶基因片斷。
酶切過(guò)程中，質(zhì)粒pMD18-gdh0310以及限制性?xún)?nèi)切酶的用量為質(zhì)粒pMD18-gdh031010μlEcoRI1μlXhoI 1μl緩沖液(10×H)3μl無(wú)菌水 15μl總體積 30μl
2.表達(dá)載體pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的構(gòu)建對(duì)上述質(zhì)粒pMD18-gdh0310用EcoRI，XhoI雙酶切，獲得的酶切片段定向連接到用同樣雙酶切處理過(guò)的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310。
酶切過(guò)程中，質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3以及限制性?xún)?nèi)切酶的用量為質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM310μlEcoRI 1μlXhoI 1μl緩沖液(10×H) 3μl無(wú)菌水15μl總體積30μl連接過(guò)程中，連接酶、葡萄糖脫氫酶基因片斷與質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3的用量為葡萄糖脫氫酶基因片斷 4μl質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3 4μlT4 DNA連接酶 1μl緩沖液(10×) 1μl總體積 10μl3.連接效果的鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到到E.coli DH5α，涂布到含有30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑選約8個(gè)克隆接種到3ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)以擴(kuò)增質(zhì)粒，用堿裂解法提取擴(kuò)增質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE-3)中，即得到了帶質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21；用NcoI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，利用DNA電泳檢測(cè)葡萄糖脫氫酶基因片段是否已連接到pET28a(+)-P450 BM3上。
4.全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)靛藍(lán)a)由LB瓊脂平板挑取帶質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽(yáng)性克隆，接種到添加卡那霉素至終濃度為30μg/ml的LB(pH7.0-7.5)種子培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；LB發(fā)酵培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度30μg/ml，加入葡萄糖至100-200mM，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG至終濃度0.5-1.0mM誘導(dǎo)，同時(shí)加入適量終濃度為0.1-10mM的底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h。
將所得培養(yǎng)液以8000r/min離心10min，收獲細(xì)胞，所得細(xì)胞用水洗滌2-3次，加入適量的N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)，8000r/min離心保留上清液，測(cè)吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算靛藍(lán)含量，得到靛藍(lán)產(chǎn)量為49.98-915.3mg/L。
b)種子培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度為30μg/ml，由平板挑取帶質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21接入，150-180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；LB發(fā)酵培養(yǎng)基中添加卡那霉素至終濃度30μg/ml，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG至終濃度0.5mM誘導(dǎo)6-8h。裝液量為25-50ml/250ml搖瓶。
發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液于8000r/min離心10min，收集菌體，用0.9％生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆?；稱(chēng)取0.2-0.4g濕菌體，懸浮于20mlTris-HCl緩沖液中，加入100-200mM葡萄糖和一定量終濃度為0.1-10mM的吲哚，于100r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于8000r/min離心10min，加入適量的N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)，8000r/min離心保留上清液，測(cè)吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算靛藍(lán)含量，得到靛藍(lán)產(chǎn)量為13.1-659mg/L。
權(quán)利要求
1.一種能催化吲哚生成靛藍(lán)的質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310，由P450 BM3基因和葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個(gè)表達(dá)載體pET28a(+)上構(gòu)建，從P450 BM3基因的啟動(dòng)子開(kāi)始，到葡萄糖脫氫酶基因的終止子結(jié)束的基因序列為ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAATCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGGTCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTGGTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCAGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTAGATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAACGAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAGGAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGAAACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTATGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGATCCAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAGCAAGCCTACAAGACAAGTGCTGGCAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCATTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCTATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTGTCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGGAGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCAAGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCTGCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCGCGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAGTCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCTCATGAAGACTATCTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACGCTTCATACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAATGGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCTATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATGAAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCTGCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAAGAATTCGGATCCATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTAGTTGTAACAGGCGGATCAAAAGGATTGGGTCGCGCAATGGCCGTTCGTTTTGGTCAAGAGCAGTCAAAAGTGGTTGTAAACTACCGCAGCAATGAAGAAGAAGCGCTAGAAGTAAAAAAAGAAATTGAACAAGCTGGCGGCCAAGCAATTATTGTTCGAGGCGACGTAACAAAAGAGGAAGACGTTGTGAATCTTGTAGAGACAGCTGTTAAAGAGTTTGGCACATTAGACGTTATGATTAACAATGCTGGTGTTGAAAACCCGGTTCCTTCACATGAATTATCGTTAGAAAACTGGAATCAAGTAATCGATACAAACTTAACAGGCGCGTTTTTAGGAAGCCGCGAAGCGATTAAATATTTTGTTGAAAATGATATTAAAGGAAACGTTATTAACATGTCCAGCGTTCACGAGATGATTCCTTGGCCACTATTTGTTCACTATGCAGCAAGTAAAGGCGGTATGAAACTAATGACAGAAACATTGGCTCTTGAATATGCGCCAAAAGGTATCCGCGTAAATAACATTGGACCAGGCGCGATCGATACGCCAATCAACGCTGAAAAATTCGCAGATCCGGAACAGCGTGCAGACGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGCTACATCGGCAACCCGGAAGAAATTGCATCAGTTGCAGCATTCTTAGCATCGTCACAAGCAAGCTACGTAACAGGTATTACACTATTTGCTGATGGCGGTATGACAAAATATCCTTCTTTCCAAGCGGGAAGAGGTTAATAA。
2.一種制備帶有如權(quán)利要求1所述質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310的重組菌的方法，包括以下步驟(1)以pQE30-gdh0310為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到gdh0310基因片段；，將該基因片段連接到pMD18-T質(zhì)粒上，得到pMD18-gdh0310；(2)上述pMD18-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，并涂布到含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；(3)挑選克隆接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)擴(kuò)增質(zhì)粒；(4)提取擴(kuò)增后的質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI酶解，將所得酶切片段定向連接到經(jīng)EcoRI和XhoI酶解處理過(guò)的pET28a(+)-P450 BM3上，構(gòu)建得到pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310；(5)將重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，涂布到含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；(6)挑選所得克隆接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)以擴(kuò)增質(zhì)粒；(7)提取擴(kuò)增質(zhì)粒，用NcoI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒pET28a(+)-P450BM3-gdh0310進(jìn)行雙酶切，通過(guò)電泳鑒定；(8)將電泳鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，得到帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coli BL21。
3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310在催化吲哚生成靛藍(lán)中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于催化吲哚生成靛藍(lán)包括以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽(yáng)性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，并加入適量葡萄糖，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)加入適量底物吲哚，將溫度調(diào)為30℃繼續(xù)培養(yǎng)24h；(3)將所得培養(yǎng)液離心10min，收獲細(xì)胞，并用水洗滌2-3次，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于催化吲哚生成靛藍(lán)還可采用以下步驟(1)由LB瓊脂平板挑取帶有質(zhì)粒pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310的重組菌E.coliBL21陽(yáng)性克隆接種到添加一定量卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，150-180r/min，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)12h；(2)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量卡那霉素，將種子液按1-2％(v/v)的接種量接入，150-180r/min，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600約為0.8-1.2，加IPTG誘導(dǎo)6-8h，裝液量為25-50ml/250ml搖瓶；(3)將所得發(fā)酵液離心10min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌兩次，得到的菌體于4℃下保存?zhèn)溆茫?4)稱(chēng)取濕菌體，懸浮于Tris-HCl緩沖液中，加入葡萄糖和吲哚，于100-200r/min振蕩條件下30-35℃恒溫反應(yīng)8h；(5)反應(yīng)結(jié)束后，將所得反應(yīng)液離心10min，加入適量N，N-二甲基甲酰胺提取藍(lán)色物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能共表達(dá)P450BM3和葡萄糖脫氫酶，并能催化吲哚合成靛藍(lán)的質(zhì)粒pET28a(+)－P450BM3－gdh0310、制備方法及其用途。它是將P450BM3基因和葡萄糖脫氫酶基因共同連接在同一個(gè)表達(dá)載體pET28a(+)上，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21，得到的菌株能同時(shí)表達(dá)細(xì)胞色素P450BM3單加氧酶和葡萄糖脫氫酶，并能協(xié)同作用催化吲哚生成靛藍(lán)，與以往菌株相比，其催化活性提高了22－27倍，為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)染料靛藍(lán)提供了廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1880459SQ200610050388
公開(kāi)日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2006年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月18日
發(fā)明者梅樂(lè)和, 陸燕 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)