專利名稱：抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及抗人髓系分化標(biāo)志基因(hMYADM)的單克隆抗體的制備及應(yīng)用，是利用細(xì)胞工程、抗體工程技術(shù)，獲得分泌抗hMYADM的單克隆抗體的細(xì)胞系，通過同品系的小鼠誘導(dǎo)腹水，制備抗hMYADM的單克隆抗體；再通過蛋白質(zhì)純化、電泳、免疫等技術(shù)實現(xiàn)對該抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫分子參與包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖分化及功能調(diào)節(jié)。一種重要免疫新分子的發(fā)現(xiàn)，往往對揭示免疫應(yīng)答、炎癥和造血細(xì)胞的分化發(fā)育等重大生命過程的本質(zhì)及其調(diào)節(jié)規(guī)律產(chǎn)生深遠影響，因此免疫新分子的發(fā)現(xiàn)和研究具有重要的理論探索意義和實用價值。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone MarrowStroma Cells，BMSC)是構(gòu)成骨髓造血微環(huán)境的一類非常重要的細(xì)胞群體，近年來發(fā)現(xiàn)造血微環(huán)境對調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增生和分化起著極其重要的作用，基質(zhì)細(xì)胞和造血主質(zhì)細(xì)胞相互依存，基質(zhì)細(xì)胞具有特殊的細(xì)胞表型，可產(chǎn)生和分泌眾多的細(xì)胞因子，并在膜表面表達許多細(xì)胞因子受體和其他的活性物質(zhì)，以及通過細(xì)胞與細(xì)胞間的直接接觸等作用，支持造血干細(xì)胞的定居、增殖、分化，調(diào)節(jié)其生長、自我更新、細(xì)胞間粘附及骨髓內(nèi)遷移過程。還有研究發(fā)現(xiàn)，BMSC對白血病細(xì)胞惡性克隆的選擇、增殖、分化、遷移、凋亡都有重要作用。而且，BSMC還是一種較理想的細(xì)胞和基因治療的靶細(xì)胞。研究BMSC來源的免疫新分子對深入闡明BMSC、造血細(xì)胞的分化發(fā)育、體內(nèi)遷移、生物學(xué)作用及其分子機理具有重大意義，可為認(rèn)識疾病(如白血病)發(fā)生發(fā)展的機制提供新的角度，也可能為疾病的防治提供新的思路和手段。
申請人建立了人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)cDNA基因文庫的大規(guī)模隨機測序體系，從得到的近萬條EST中克隆到了新的細(xì)胞分化抗原、免疫受體、Ig超家族成員、信號傳導(dǎo)分子等具有重要功能提示的免疫新分子。通過研究申請人發(fā)現(xiàn)了一個很有意義的來源于BMSC的免疫新分子，已得到其全長cDNA，為2080bp，包含169bp 5’非編碼區(qū)，969bp編碼區(qū)，編碼322個氨基酸，以及942bp 3’非編碼區(qū)。其氨基酸序列與小鼠的一個髓系細(xì)胞分化標(biāo)志基因(MYADM)有86％的同源性，我們將其命名為人髓系分化標(biāo)志基因hMYADM(human Myeloid-associated Differentiation Marker gene)，并已在GenBank中登錄，登錄號為AY037147，并申請了發(fā)明專利(名稱“新型人髓系分化標(biāo)志基因，其編碼序列及其用途”，申請?zhí)?2136523.7)。
通過對該新分子的研究發(fā)現(xiàn)，該基因選擇性表達在外周血來源的髓系細(xì)胞以及髓系白血病細(xì)胞，在PMA誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞分化以及骨髓CD34+細(xì)胞向粒、單核細(xì)胞分化中，hMYADM的表達明顯上調(diào)。共聚焦顯微鏡證明hMYADM是一種跨膜蛋白，表達于細(xì)胞膜上。這些結(jié)果較充分地揭示該新基因是與髓系分化發(fā)育密切相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志，有可能在白血病的發(fā)病機制以及誘導(dǎo)分化中起著一定的重要作用。制備hMYADM的單克隆抗體，對進一步深入研究其功能具有重要意義，可應(yīng)用于不同細(xì)胞和組織中該新分子的檢測，有可能揭示該新分子在臨床疾病防治中的可能應(yīng)用前景，豐富造血細(xì)胞分化發(fā)育過程的基礎(chǔ)理論研究，并對疾病發(fā)病機理、診斷、預(yù)后及療效判定等方面的研究起到啟發(fā)作用。
本發(fā)明用到雜交瘤細(xì)胞技術(shù)。該技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合，以建立等分泌均質(zhì)抗體的雜交瘤細(xì)胞系，也稱為單克隆抗體技術(shù)。該技術(shù)涉及到動物免疫、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞克隆培養(yǎng)和免疫測定等一系列方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗人髓系分化標(biāo)志基因(hMYADM)的單克隆抗體，抗人髓系分化標(biāo)志基因(hMYADM)已在GenBank中登錄，登錄號為AY037147，抗人髓系分化標(biāo)志基因(hMYADM)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏；地址中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期2006年2月23日；分類命名及保藏編號分別為抗人髓系分化標(biāo)志基因(hMYADM)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞ZMA1，CCTCC NOC200615，抗人髓系分化標(biāo)志基因(hMYADM)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞ZMA6，CCTCC NOC200616，抗人髓系分化標(biāo)志基因(hMYADM)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞ZMB5，CCTCC NOC200617。
抗hMYADM的單克隆抗體通過以下步驟獲得(1)動物的免疫選擇適齡的小鼠，以抗原肽(hMYADM的第266-283位氨基酸，18肽KYGGQPRRSRDVSCSRSH，參見SEQ No 1)對小鼠進行免疫。18肽KYGGQPRRSRDVSCSRSH通過固相法合成，在美國ABI公司的多肽合成儀(431A)上進行，采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)方案，合成步驟按照ABI公司的多肽合成操作手冊進行。經(jīng)高效液相色譜純化，純度＞95％，序列鑒定通過質(zhì)譜分析。
(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0并使之保持良好的生長狀態(tài)用于細(xì)胞融合。
(3)細(xì)胞融合以BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，含20％FCS的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)一天。將(1)中備好的小鼠處死，獲取脾臟淋巴細(xì)胞。收集(2)中的小鼠骨髓瘤細(xì)胞。將上述兩種細(xì)胞混合離心，然后以聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，接種至培養(yǎng)板，適當(dāng)條件培養(yǎng)。
(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選將上述培養(yǎng)物在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細(xì)胞集落長到大小合適時，吸取培養(yǎng)液上清做抗體鑒定，篩選陽性克隆。
(5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化以有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞，將稀釋到一定密度的細(xì)胞接種至96孔板，使每孔只有一個細(xì)胞生長。形成細(xì)胞集落的孔取上清做酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，鑒定陽性克隆?？梢灾貜?fù)克隆若干次，直到雜交瘤細(xì)胞的陽性孔率達到100％。將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)做抗體鑒定。
(6)小鼠腹水的誘導(dǎo)在接種雜交瘤細(xì)胞前10天，給BALB/C小鼠腹腔注射液體石蠟每只0.5ml，然后每只接種1.0×106陽性雜交瘤細(xì)胞，10天后收集腹水后離心，測定抗體效價，并純化單克隆抗體。
(7)單克隆抗體的純化利用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水上清中的單克隆抗體。
(8)本發(fā)明得到三個生產(chǎn)抗hMYADM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，即ZMA1、ZMA6、ZMB5，ZMA1、ZMA6、ZMB5細(xì)胞株經(jīng)3次克隆化，持續(xù)培養(yǎng)六月余，分泌抗體穩(wěn)定。該細(xì)胞株經(jīng)液氮凍存，復(fù)蘇后生長良好，抗體分泌未見衰退。ELISA間接法測得ZMA1、ZMA6、ZMB5上清效價分別為1∶128、1∶4、1∶32，腹水效價分別為ZMA1116384、ZMB5116384。經(jīng)濃縮后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，免疫雙擴散試驗結(jié)果顯示三株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體類型均為IgG。ZMA1、ZMA6、ZMB5的CCTCC的保藏號分別是ZMA1 CCTCC-C200615ZMA6 CCTCC-C200616ZMB5 CCTCC-C200617本發(fā)明的另一個目的是提供抗hMYADM單克隆抗體在人髓系分化標(biāo)志基因鑒定中應(yīng)用，通過下述途徑實現(xiàn)
①用SDS-PAGE電泳，通過免疫印跡方法(Western Blot)方法，對細(xì)胞表達hMYADM分子的情況進行鑒定。
②用免疫熒光實驗來鑒定細(xì)胞表面hMYADM分子的表達。
本發(fā)明的又一個目的是提供抗hMYADM單克隆抗體在人髓系分化標(biāo)志基因定量中應(yīng)用，通過下述途徑實現(xiàn)利用抗hMYADM單克隆抗體結(jié)合細(xì)胞，再結(jié)合熒光二抗，通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面的hMYADM分子的表達進行定量。
本發(fā)明的優(yōu)點在于提供了一種抗新基因hMYADM的單克隆抗體，尚未見文獻報道。制備方法簡單易行，更為重要的是該方法制備的單克隆抗體可以有多種用途，如對細(xì)胞和組織中hMYADM分子表達情況的定性和定量等，可應(yīng)用于檢測該新基因在不同組織和細(xì)胞，以及在骨髓干細(xì)胞向髓系分化不同階段的表達特征，更方便地應(yīng)用于該新基因的生物學(xué)和免疫學(xué)功能研究。
說明書附1為THP-1細(xì)胞的hMYADM單克隆抗體(ZMB5)免疫熒光實驗結(jié)果。
圖2為流式細(xì)胞儀定量檢測白血病細(xì)胞HL-60表面hMYADM的表達。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1.抗hMYADM的單克隆抗體的制備方法(1)小鼠的免疫首次免疫，將交聯(lián)BSA的hMYADM的18肽以弗氏完全佐劑乳化，第2、3次以不完全佐劑乳化，每鼠0.2ml(含hMYADM肽100μg)，背部皮內(nèi)多點注射，每周一次。一個月后加強免疫一次，于3天后進行融合。
(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)把來自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代，在含5％CO2飽和濕度的37℃孵箱中培養(yǎng)。融合前一天傳代以保證融合時進入對數(shù)生長期。
(3)細(xì)胞融合以BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，含20％FCS的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，次日取脾臟，置200目不銹鋼篩網(wǎng)中，剔除脂肪和結(jié)締組織，撕開包膜，分離脾細(xì)胞，離心洗滌細(xì)胞1～2次后用培養(yǎng)液重懸。收集小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，離心，洗滌2次后用培養(yǎng)液重懸，作為待融合的SP2/0細(xì)胞。以1.0×108個脾細(xì)胞與1.0×107個小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0混合，在50％PEG作用下融合。細(xì)胞混合后洗滌一次，離心棄上清，懸開細(xì)胞(勿加液體)用37℃50％PEG(pH＞8.0)0.8ml于60～90秒內(nèi)逐滴加入細(xì)胞沉淀中，其間輕輕振搖離心管，但勿吹打，靜置1分鐘，然后按先慢后快的原則，于1分鐘內(nèi)加完1ml無血清RPMI1640，于5分鐘內(nèi)逐漸加入37℃預(yù)溫的無血清RPMI1640培養(yǎng)基30～40ml，37℃溫?zé)?，并用吸管輕吸上下攪動液體，低速離心5～10分鐘。然后加入20％FCS HAT培養(yǎng)基，分別接種到富有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)。
(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選每隔3天換1/2培養(yǎng)液(HAT)一次，12天后改用HT培養(yǎng)液。這種選擇性培養(yǎng)大約持續(xù)兩周。在細(xì)胞集落長到適當(dāng)大小時，吸取培養(yǎng)液上清，做ELISA，篩選陽性克隆。采用ELISA間接法篩選陽性雜交瘤。主要步驟①0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋hMYADM重組蛋白，1μg/ml，0.1ml/孔包板，4℃過夜；②0.01M pH7.4PBS-Tween 20洗板三次；③10％FCS 0.01M pH 7.2的PBS封閉30s；④同上洗板；⑤加入雜交瘤培養(yǎng)上清，0.1ml/孔，同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照，37℃×1hr；⑥洗板；⑦加羊抗小鼠IgG/HRP，0.1ml/孔，37℃×1hr；⑧洗板；⑨加入底物(TMB)37℃×30s；⑩2M H2SO4終止反應(yīng)；490nm測定其OD值，以P/N≥2.1為陽性。
(5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)按有限稀釋法進行，選擇抗體陽性的雜交瘤孔細(xì)胞作適當(dāng)增殖后，準(zhǔn)確計數(shù)細(xì)胞。用完全1640培養(yǎng)基稀釋成10個/ml的細(xì)胞懸液接種到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)液中，每孔0.1ml，7-10天后觀察細(xì)胞生長情況，并檢測上清液中抗體，選擇抗體滴度較高，呈單個克隆細(xì)胞生長的培養(yǎng)孔，作再次克隆化培養(yǎng)，直至單克隆孔抗體檢測陽性率為100％。
(6)誘生腹水在接種雜交瘤細(xì)胞前10天，給BALB/C小鼠腹腔注射液體石蠟每只0.5ml，然后每只接種1.0×106陽性雜交瘤細(xì)胞，10天后收集腹水測定抗體效價。
(7)單克隆抗體的純化腹水上清中加入1倍體積的10mM的醋酸緩沖液，攪拌中每毫升上清中加入10μl辛酸，混勻后靜置4℃冰箱過夜。高速低溫離心后棄沉淀。上清中加入逐滴加入飽和硫酸銨，硫酸銨飽和度達50％，離心(12000g，10分鐘)，將上清棄去，取沉淀物溶于少量生理鹽水中。將上述生理鹽水溶解液用33％飽和硫酸銨沉淀，離心(12000g，10分鐘)，收集沉淀，溶解于PH＝7.4的PBS。將提取物裝入透析袋，在生理鹽水中透析，除去硫酸銨。
(8)單克隆抗體的類別鑒定經(jīng)濃縮后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，免疫雙擴散試驗結(jié)果為ZMA1、ZMA6、ZMB5株分泌抗體均為IgG。
實施例2.用該單克隆抗體進行hMYADM分子的鑒定本發(fā)明制備的抗hMYADM單克隆抗體可以用來鑒定細(xì)胞表面表達的hMYADM分子(定性檢測)，鑒定方法可以通過下述兩種方法實現(xiàn)1.間接免疫熒光，主要步驟①細(xì)胞消化后以1640懸浮，100ul/孔于96孔板，37℃×4h；②0.01M PH7.2PBS洗板三次；③培養(yǎng)上清100ul/孔，37℃×1.5h，同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照；④同上洗板；⑤加入熒光抗體，37℃×1h；⑥洗板三次；⑦熒光鏡檢。也可采用間接免疫熒光試管法，主要步驟①培養(yǎng)的細(xì)胞消化后以生理鹽水懸浮后加入到eppendorf管中，②每管100μl，加單克隆抗體100μl(1∶100)室溫孵育2小時，4000rpm/min離心5min，棄上清，以0.01M pH7.2PBS 3％FCS洗三次，③100μl PBS懸浮，加入熒光標(biāo)記的二抗3μl，純小牛血清100μl，④室溫避光1小時，同上洗三次，400μl PBS懸浮，⑤熒光鏡檢。在熒光顯微鏡下可見到細(xì)胞表面的熒光，鑒定為hMYADM表達陽性的細(xì)胞，結(jié)果參見附
圖1，其中培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞與抗hMYADM單抗(ZMB5)室溫孵育2小時，洗滌后與FITC標(biāo)記的二抗室溫避光孵育小時，壓片熒光鏡檢，可見到細(xì)胞表面的熒光，為hMYADM表達陽性。
2.Western Blotting細(xì)胞的裂解物用該單抗進行Western Blotting檢測，在相應(yīng)位置呈現(xiàn)目的條帶，表明檢測到hMYADM分子的表達。具體步驟(1)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實驗指南》(科學(xué)出版社1998)。采用10％分離膠和5％濃縮膠，電泳條件為電壓100V，電泳完畢后進行考馬斯亮蘭染色。
(2)電轉(zhuǎn)移方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實驗指南》(科學(xué)出版社1998)。用電轉(zhuǎn)移方式將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。
(3)免疫印跡5％脫脂奶粉4℃封閉過夜后，用本發(fā)明制備的單抗作為一抗，室溫下孵育2小時或4℃反應(yīng)過夜，用TST(TBS加入0.5％tween)洗滌3次，每次10min，再用TBS洗滌3次，每次10min。以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫反應(yīng)2h，用上述方法洗滌后用ECL作用1min后，在暗室用X膠片顯影。
實施例3、用該單克隆抗體進行細(xì)胞表面hMYADM分子的定量用流式細(xì)胞儀(FACS)方法檢測細(xì)胞表面表達hMYADM分子的強度收集培養(yǎng)的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS(含2％FCS)洗滌3次(1000g/5min/4℃)，棄上清，細(xì)胞打勻后每管加入2-5×105個細(xì)胞，加入我們制備的單克隆抗體作為一抗，試管置冰上，暗處反應(yīng)30min，用PBS洗滌細(xì)胞3遍，離心棄上清，打勻后用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育30min，將細(xì)胞沉淀重懸于250μl的PBS中，在流式細(xì)胞儀上檢測，可得到細(xì)胞表面表達hMYADM分子的熒光強度和陽性細(xì)胞率，結(jié)果參見附圖2，A為陰性對照，B圖的熒光強度表示hMYADM的表達量。
應(yīng)理解，本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體通過的以下步驟獲得(1)小鼠免疫選擇適齡的小鼠，以抗原肽即人髓系分化標(biāo)志基因的第266-283位氨基酸，18肽KYGGQPRRSRDVSCSRSH對小鼠進行免疫；(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0并使之保持良好的生長狀態(tài)用于細(xì)胞融合；(3)細(xì)胞融合以BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，含20％ FCS的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，將步驟(1)中備好的小鼠處死，獲取脾臟淋巴細(xì)胞。收集步驟(2)中的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，將上述兩種細(xì)胞混合離心，然后以聚乙二醇介導(dǎo)細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，接種至培養(yǎng)板，適當(dāng)條件培養(yǎng)；(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選將上述培養(yǎng)物在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在細(xì)胞集落長到大小合適時，吸取培養(yǎng)液上清做抗體鑒定，篩選陽性克??；(5)雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)以有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞，將稀釋到一定密度的細(xì)胞接種至96孔板，使每孔只有一個細(xì)胞生長。形成細(xì)胞集落的孔取上清做酶聯(lián)免疫吸附實驗，鑒定陽性克隆?？梢灾貜?fù)克隆若干次，直到雜交瘤細(xì)胞的陽性孔率達到100％。將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)做抗體鑒定；(6)小鼠腹水的誘生在接種雜交瘤細(xì)胞前10天，給BALB/C小鼠腹腔注射液體石蠟每只0.5ml，然后每只接種1.0×106陽性雜交瘤細(xì)胞，10天后收集腹水后離心，測定抗體效價，并純化單克隆抗體；(7)單克隆抗體的純化利用辛酸—硫酸銨沉淀法純化腹水上清中的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體在人髓系分化標(biāo)志基因定性檢測中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體在人髓系分化標(biāo)志基因鑒定中應(yīng)用，其特征是通過免疫印跡方法或免疫熒光的方法鑒定人髓系分化標(biāo)志基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體在人髓系分化標(biāo)志基因定量中應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體在人髓系分化標(biāo)志基因定量中應(yīng)用，其特征是通過流式細(xì)胞儀方法對人髓系分化標(biāo)志基因表達的強度和陽性細(xì)胞率進行定量。
全文摘要
本發(fā)明提供抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體及其應(yīng)用。經(jīng)抗原肽免疫小鼠，收集致敏的小鼠B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法判定陽性克隆，建立分泌抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體的細(xì)胞系，把陽性的細(xì)胞擴增培養(yǎng)并注射至同品系的小鼠腹腔誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水，經(jīng)過收集與純化，獲得抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體。本發(fā)明提供抗人髓系分化標(biāo)志基因的單克隆抗體可用于人髓系分化標(biāo)志基因分子的鑒定以及人髓系分化標(biāo)志基因分子的定量。
文檔編號C12P21/08GK1880335SQ20061004966
公開日2006年12月20日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者王青青, 沈建根, 沈芬平, 李楠, 曹雪濤 申請人:浙江大學(xué)