專利名稱：一種惡臭假單胞菌制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種惡臭假單胞菌制劑及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
尼古丁(俗稱煙堿)是煙草生物堿中的主要成分，是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一，也是煙草工業(yè)生產(chǎn)廢水、廢物中的主要有害成分。煙堿進入人體后90％被肺部吸收，進入血液6秒鐘后即可到達大腦，嚴重影響人體的呼吸系統(tǒng)和交感神經(jīng)。在香煙生產(chǎn)過程中，煙堿的含量過高會增加煙氣的刺激性，影響卷煙吸味，安全性也差。如何把煙草的煙堿含量控制到人們所期望的范圍，是煙草科技工作者和環(huán)境保護者研究的熱點課題。降低煙草中的煙堿含量的方法通常利用農(nóng)業(yè)操作在煙草生長過程中控制煙堿的含量和利用物化手段在煙草加工過程中降低煙葉中的煙堿含量，但由于以上方法操作性不強、效果不明顯，國內(nèi)外的研究正趨向于利用微生物降解煙堿。
微生物特別是細菌廣泛存在于各種生態(tài)條件下，特定的環(huán)境孕育了特殊的微生物類群。早在20世紀三、四十年代就有關(guān)于從土壤中分離可代謝尼古丁微生物的報道。1947年Enders等就發(fā)現(xiàn)酵母菌可以降解煙堿，隨后研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了許多可以降解煙堿的微生物如球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformils)、煙草節(jié)桿菌(A.nicotianae)、噬煙堿節(jié)桿菌(A.nicotinovorans)、氧化節(jié)桿菌(A.oxydans)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、棒桿菌菌(Corynebacterium sp.)、煙草微球菌(Micrococcus nicotianae)等。這些微生物多數(shù)是通過富集培養(yǎng)，然后以尼古丁為唯一碳氮源分離而得。
雖然目前微生物降解尼古丁的機理還不是十分明確，但國內(nèi)外仍然有許多應(yīng)用微生物活體降解煙堿的報道。煙草加工過程中產(chǎn)生的許多固態(tài)或液態(tài)廢物主要含有大量的尼古丁等生物堿類有毒物質(zhì)，平均含量達18000mg/kg干重。這些廢物如不及時處理會給人們的生存和生活帶來極大的危害。1997年Civilini等報道了采用P.putida和A.oxidans pAO1處理尼古丁廢棄物的滲洗液，結(jié)果表明P.putida的處理效果最好。Brown&Williamson煙草公司利用纖維單胞菌來降低煙草中的煙堿和硝酸鹽含量。結(jié)果顯示，將經(jīng)過處理的白肋煙和其它煙葉混合，與未經(jīng)處理的白肋煙葉片相比，混合煙絲的硝酸鹽含量從1.63％降至1.04％，煙堿從1.79％降至1.32％。將這些經(jīng)過處理的混合煙絲制成卷煙后，煙氣分析表明，硝酸鹽、氰化氫和煙堿各降低了38.8％、19.7％和15.3％。由此可見，通過微生物手段降低尼古丁含量和消除污染在生產(chǎn)中具有很高的實際應(yīng)用價值，其意義不但可以提高煙葉資源的利用率，取得豐厚的經(jīng)濟效益，而且還可以改善生態(tài)環(huán)境，獲得顯著的社會效益，利用微生物降解煙堿前景廣闊。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種煙堿降解率高，并能夠提高煙草品質(zhì)的惡臭假單胞菌制劑及其應(yīng)。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的1、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)J5的獲得選自煙草葉片，煙葉樣品研磨，稀釋涂布平板，在M9+煙堿培養(yǎng)基Na2HPO412.8g、KH2PO43.0g、NaCl 0.5g、NH4Cl 0.5g、瓊脂粉17g、煙堿10g、10.0g維生素B1 1μg/ml、pH自然，于28℃溫度下培養(yǎng)2d，挑取能夠在平板上健康生長的細菌菌落，其中有一菌落表現(xiàn)較好，定名為J5菌株。
對J5菌株進行生物學(xué)和生化試驗，該菌營養(yǎng)瓊脂平板需氧培養(yǎng)24h，細菌生長旺盛，菌落光滑，濕潤，半透明淡黃色菌落，產(chǎn)生強烈的氣味。革蘭染色為陰性桿菌，極生多鞭毛，多數(shù)菌株鞭毛在三根以上。該菌專性好氧，呼吸型代謝，分解葡萄糖和木糖，利用枸櫞酸酶，苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)均為陰性。利用肌醇、氧化酶和細胞色素氧化酶陽性，精氨酸雙水解酶陽性，不產(chǎn)生果聚糖，不水解明膠，不水解淀粉，水解七葉靈，蛋黃反應(yīng)陰性，聚-β-羥基丁酸鹽陰性，還原硝酸鹽，羙紅試驗陰性，乙酰甲基甲醇試驗陰性，吲哚試驗陰性；4℃可生長，41℃不生長；適宜pH為7-8.5，pH在6以下不生長。
對該菌進行16SrDNA序列測定，GenBank注冊號DQ659138。通過序列比對和生化特性將J5鑒定為惡臭假單胞菌。
本發(fā)明所述的惡臭假單胞菌(J5)已于2006年10月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC NO.1828，分類命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。
2、制備惡臭假單胞菌制劑a.發(fā)酵種子培養(yǎng)將惡臭假單胞菌J5菌體接種到配方為牛肉膏3％、蛋白胨0.5％、氯化鈉0.5％、瓊脂1.5％、其余為蒸餾水、pH7.0-7.2的培養(yǎng)液中，在28-30℃溫度下培養(yǎng)48h，獲得試管種；b.發(fā)酵工藝將發(fā)酵種子接種到裝有液體培養(yǎng)基配方牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化鈉3％、K2HPO41％、pH7-7.5、消泡劑0.1％，其余為水的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度29-30℃、發(fā)酵罐攪拌速度120-150rpm、通氣量5-10％、發(fā)酵時間45-48h的條件下得到惡臭假單胞菌制劑，放入容器中避光保存，1星期內(nèi)使用完畢。
本發(fā)明的惡臭假單胞菌制劑作為降解煙草或煙草廢棄物中的煙堿的應(yīng)用。
附圖為J5在含有煙堿的液體中的生長和煙堿降解效果圖(實施1)。
本發(fā)明的惡臭假單胞菌制劑具有煙堿降解率高，并能夠提高煙草品質(zhì)等優(yōu)點。
具體實施例方式本發(fā)明實施例中培養(yǎng)基配方的比例均為重量百分比。
實施例1(用于含煙堿液體)制備惡臭假單胞菌制劑a.發(fā)酵菌種培養(yǎng)將惡臭假單胞菌J5菌絲體接種到配方為牛肉膏3％、蛋白胨0.5％、氯化鈉0.5％、瓊脂1.5％、其余為蒸餾水、pH7.0的培養(yǎng)基上，在28℃溫度下培養(yǎng)48h，獲得發(fā)酵菌種；c.發(fā)酵工藝將試管種接種到裝有液體培養(yǎng)基配方牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化鈉3％、K2HPO41％、pH7、消泡劑0.1％，其余為水的三角瓶發(fā)酵中，在發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速120rpm、通氣量10％、發(fā)酵時間45h的條件下得到惡臭假單胞菌制劑，放入容器中避光保存，1星期內(nèi)使用完畢。
本發(fā)明的煙堿降解制劑的應(yīng)用將降煙堿降解制劑接種(接種量1％)到含有0.1％煙堿的M9液體中，30℃ 150rpm藥瓶培養(yǎng)，每隔2小時取樣檢測溶液的煙堿含量，和代表菌體數(shù)量的溶液OD600值。應(yīng)用結(jié)果見附圖，降解12h時煙堿含量為0，即應(yīng)用制劑完全將溶液中的煙堿降解。
實施例2(用于含煙堿液體)基本同實施例1。不同之處為試管種培養(yǎng)中pH為7.2、溫度30℃；發(fā)酵工藝中pH為7.5、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速150rpm、通氣量5％、發(fā)酵時間48h。
實施例3(用于烤煙煙葉處理)惡臭假單胞菌制劑的制備基本同實施例1。不同之處為試管種培養(yǎng)中pH為7.1、溫度29.℃；發(fā)酵工藝中pH為7.3、發(fā)酵溫度29.5℃、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速130rpm、通氣量8％、發(fā)酵時間46h。
本發(fā)明的煙堿降解制劑的應(yīng)用將本發(fā)明的制劑用水稀釋10倍，放入長×寬×高為1.5m×0.5m×1m的水泥池中。將成熟好的煙葉采收后編桿。編桿后的煙葉放入含有菌劑的池中浸泡均勻，取出，自然流失掉多余的溶液，然后裝入烤房中，按常規(guī)的烘烤方法進行烘烤。烘烤后的煙葉進行煙堿的檢測，結(jié)果表明，本發(fā)明的煙堿降解制劑可以降低28％的烤煙煙堿。
使用本發(fā)明制劑后的烤煙的煙葉感官質(zhì)量評吸結(jié)果表明煙葉的勁頭明顯降低，香氣質(zhì)和香氣量有不同程度改善；刺激性明顯減弱，雜氣明顯減輕。
權(quán)利要求
1.一種惡臭假單胞菌制劑，由生產(chǎn)菌株經(jīng)發(fā)酵種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐發(fā)酵后得到，其特征在于該制劑由下列步驟得到a.選用的生產(chǎn)菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)J5，CGMCCNO.1828；b.發(fā)酵種子培養(yǎng)將惡臭假單胞菌J5菌絲體接種到配方為牛肉膏3％、蛋白胨0.5％、氯化鈉0.5％、瓊脂1.5％、其余為蒸餾水、pH7.0-7.2的培養(yǎng)基上，在28-30℃溫度下培養(yǎng)48h，獲得發(fā)酵種子；c.發(fā)酵罐發(fā)酵工藝將試管種接種到裝有液體培養(yǎng)基配方牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化鈉3％、K2HPO41％、pH7-7.5、消泡劑0.1％，其余為水的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度29-30℃、發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速120-150rpm、通氣量5-10％、發(fā)酵時間45-48h的條件下得到惡臭假單胞菌制劑。
2.權(quán)利要求1所述惡臭假單胞菌制劑，其特征在于該制劑用于降解煙草或煙草廢棄物中的煙堿。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種惡臭假單胞菌制劑，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該制劑由下列步驟得到a.選用的生產(chǎn)菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)J5，CGMCC No.1828；b.種子培養(yǎng)將J5接種到液體NA培養(yǎng)基上，在28－30℃溫度下培養(yǎng)48h獲得發(fā)酵種子；c.發(fā)酵罐發(fā)酵將種子接種到裝有牛肉膏0.5％、蛋白胨3％、氯化鈉3％、K
文檔編號C12R1/40GK1970737SQ200610048868
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月4日
發(fā)明者夏振遠, 雷麗萍, 吳玉萍, 魏海雷, 劉碩 申請人:云南省煙草科學(xué)研究所