專利名稱：發(fā)酵產(chǎn)品方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于從粒狀淀粉產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品的方法。使用酶的新組合促進(jìn)了高干燥固體糖化醪(high dry solid mash)的加工。
背景技術(shù)：
用于將粒狀淀粉轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)品，例如乙醇產(chǎn)品的方法，在WO03/066826、WO 04/080923和WO 04/081193中公開。為了使這種方法有利可圖，存在對(duì)于能夠加工高干燥固體糖化醪的新方法的需求。本發(fā)明的目的是提供這種改進(jìn)的方法，其用于將粒狀淀粉轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)品。
發(fā)明概述本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在粒狀淀粉的液化和糖化中，使用包含糖結(jié)合模塊(CBM)的酸性α-淀粉酶促進(jìn)高干燥固體糖化醪的加工。
本發(fā)明人還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在粒狀淀粉的液化和糖化中，使用包含糖結(jié)合模塊(CBM)的酸性α-淀粉酶與降粘酶(viscosity reducing enzyme)，例如木聚糖酶和β-葡聚糖酶的組合，促進(jìn)高干燥固體糖化醪的加工，即使當(dāng)粗磨谷粉(grit)包含具有高木聚糖和β-葡聚糖含量的干磨的(dry milled)大麥、黑麥或小麥和其他谷物類型時(shí)。通過包含CBM的酸性α-淀粉酶的優(yōu)良的原淀粉降解能力的效果和/或降粘酶的作用，加工較高干燥固體糖化醪，能夠獲得較高的乙醇收率以及由此獲得較高的生產(chǎn)力(productivity)和處理量(throughput)。
在本發(fā)明的方法中，應(yīng)用降粘酶例如β-葡聚糖酶和木聚糖酶降解葡聚糖和木聚糖，由此減少糖化醪的粘度。粘度減少導(dǎo)致液化糖化醪的流率(flow rate)增加，由此增加生產(chǎn)工廠的生產(chǎn)能力。此外，本發(fā)明提供簡(jiǎn)化的方法，其中能夠?qū)为?dú)的降粘步驟省略。
對(duì)先前水解非淀粉多糖如阿拉伯糖基木聚糖和β-葡聚糖的蒸餾加工的效果，是總體提高的生產(chǎn)能力，以及更好的熱傳遞和相轉(zhuǎn)移。
對(duì)先前水解非淀粉多糖以及更完全水解淀粉多糖的副產(chǎn)品如蒸餾器的干酒糟(distiller’s dry grain)的效果，是整體改進(jìn)的進(jìn)料轉(zhuǎn)化，以及更好的營養(yǎng)物消化吸收率(digestivity)，所述營養(yǎng)物如礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和殘余淀粉。
因此本發(fā)明提供用于從粒狀淀粉產(chǎn)生乙醇產(chǎn)品的方法，該方法沒有所述淀粉的預(yù)先糊化(prior gelatinization)。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含如下步驟的方法，a)提供包含水和粒狀淀粉的漿液，b)在下列物質(zhì)存在下保持所述漿液i)包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶，和ii)發(fā)酵生物，以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品和，c)任選地回收發(fā)酵產(chǎn)品。所述發(fā)酵生物優(yōu)選為酵母，并且所述發(fā)酵產(chǎn)品優(yōu)選乙醇。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供組合物，其包含i)包含CBM的酸性α-淀粉酶和，ii)木聚糖酶，和/或iii)β-葡聚糖酶，和/或iv)葡糖淀粉酶。
發(fā)明詳述通過本發(fā)明的方法，能夠?qū)⒘畹矸鬯獬甥溠刻?、葡萄糖或特制糖漿(specialty syrup)，其用于作為甜味劑或作為其它糖類例如果糖的前體。還可以將麥芽糖和/或葡萄糖發(fā)酵成乙醇產(chǎn)品或其它發(fā)酵產(chǎn)品，例如檸檬酸、谷氨酸單鈉(monosodium glutamate)、葡萄糖酸、葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鉀、葡糖酸-δ-內(nèi)酯或異抗壞血酸鈉(sodium erythorbate)、衣康酸(itaconicacid)、乳酸、葡萄糖酸；酮；氨基酸、谷氨酸(谷氨酸單鈉)、青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，例如核黃素(riboflavin)、B12、β-胡蘿卜素或激素。
術(shù)語“乙醇產(chǎn)品”的意思是包含乙醇的產(chǎn)品，例如燃料乙醇、飲用和工業(yè)乙醇。然而，所述乙醇產(chǎn)品還可以是啤酒，該啤酒可以是任何類型的啤酒。優(yōu)選的啤酒類型包含愛兒啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒(porter)、陳貯啤酒(lager)、苦味酒(bitter)、麥芽酒(malt liquor)、happoushu、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低熱量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。
術(shù)語“粒狀淀粉”的意思是未加工的生的淀粉，即以其天然形式存在于谷類(cereal)、塊莖或谷粒(grain)中的淀粉。淀粉在植物細(xì)胞中形成為不溶于水的微小顆粒。當(dāng)置于冷水中時(shí)，淀粉顆?？梢晕丈倭康囊后w并且膨脹。在高達(dá)50℃-75℃的溫度，所述膨脹可以是可逆的。然而，在更高的溫度開始不可逆的膨脹，其稱為糊化。
術(shù)語“起始糊化溫度(initial gelatinization temperature)”的意思是淀粉糊化開始的最低溫度。在水中加熱的淀粉在50℃和75℃之間開始糊化；糊化的精確溫度取決于具體的淀粉，并且能夠容易地由熟練技術(shù)人員測(cè)定。因此，所述起始糊化溫度可根據(jù)植物物種，根據(jù)植物物種的具體種類以及隨生長條件而變化。在本發(fā)明的上下文中，給定淀粉的起始糊化溫度是所述淀粉顆粒的雙折射(birefringence)失去5％的溫度，其使用由Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/Strke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)所述的方法。
多肽“同源性”的意思是兩種氨基酸序列之間的同一性程度。同源性可以由本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序合適地測(cè)定，例如，GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。使用下列用于多肽序列比較的設(shè)置GAP產(chǎn)生罰分(creation penalty)3.0和GAP延伸罰分0.1。
術(shù)語“酸性α-淀粉酶”的意思是以有效量加入的α-淀粉酶活性(E.C.3.2.1.1)，其在pH3.0-7.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選3.5-6.0，或更優(yōu)選4.0-5.0具有活性。
酶包含CBM的酸性α-淀粉酶包含CBM的酸性α-淀粉酶是在EC 3.2.1.1之內(nèi)的多肽，其具有酸性α-淀粉酶活性，并且包含糖結(jié)合模塊，優(yōu)選所述CBM是淀粉結(jié)合域(SBD)，并且優(yōu)選家族CBM20的CBM。用于本發(fā)明的包含CBM的酸性α-淀粉酶可以是雜合體酶(hydrid enzyme)，或所述多肽可以是野生型酶，其已經(jīng)包含具有α-淀粉酶活性的催化模塊和糖結(jié)合模塊。用于本發(fā)明的方法包含CBM的酸性α-淀粉酶還可以是這種野生型酶的變體?？梢酝ㄟ^融合編碼第一氨基酸序列的第一DNA序列和編碼第二氨基酸的第二DNA序列來產(chǎn)生所述雜合體，或可將所述雜合體作為基于合適的CBM、接頭和催化域的氨基酸序列的知識(shí)完全合成的基因產(chǎn)生。本文使用術(shù)語“雜合體酶”來表征多肽，所述多肽是包含CBM的酸性α-淀粉酶，該多肽包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，所述第一氨基酸序列包含具有α-淀粉酶活性的催化模塊，而所述第二氨基酸序列包含至少一個(gè)糖結(jié)合模塊，其中所述第一和第二源自不同的來源。將術(shù)語“來源”理解為，但不限于，例如親本多肽，例如酶，例如淀粉酶或葡糖淀粉酶，或具有其它催化活性、包含合適的催化模塊和/或合適的CBM和/或合適的接頭的酶。所述CBM的親本多肽和酸性α-淀粉酶活性可以源自相同的菌株，和/或源自相同菌種或其可以源自相同菌種的不同菌株或源自不同菌種的菌株。真菌的和細(xì)菌的親本多肽二者均為優(yōu)選的，以及真菌的和細(xì)菌的野生型和野生型的變體。
本發(fā)明優(yōu)選的是包含CBM的任何酸性α-淀粉酶，包括但不限于源自真菌的雜合體酶和野生型變體，其公開于PCT/US2004/020499[NZ10490]中和與本申請(qǐng)?jiān)谕蝗仗峤坏牡湆＠暾?qǐng)[NZ10729]中，以及源自細(xì)菌的雜合體、野生型或野生型變體，其公開于與本申請(qǐng)?jiān)谕蝗仗峤坏牡湆＠暾?qǐng)[NZ10753]中。更優(yōu)選的是具有酸性α-淀粉酶活性并且包含CBM的酶，該酶具有如SEQ ID NO1(JA001)公開的氨基酸序列，所述序列包含與黑曲霉酸性α-淀粉酶相同的催化域和與川地曲霉(A.kawachii)α-淀粉酶CBM相同的CBM，如SEQ ID NO2(JA126)公開的序列或如SEQ ID NO3(JA129)公開的序列或包含CBM的酸性α-淀粉酶，該酸性α-淀粉酶具有的氨基酸序列與任何前述氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或甚至至少95％同一性。
含有CBM的雜合體酶，以及其制備和純化的詳細(xì)描述，是本領(lǐng)域已知的[參見，例如WO 90/00609、WO 94/24158和WO 95/16782，以及Greenwoodet al.Biotechnology and Bioengineering 44(1994)pp.1295-1305]。
不包含CBM的α-淀粉酶在本發(fā)明的方法的過程中還可以存在不包含CBM的α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶，如源自黑曲霉(Aspergillus niger)的酸性真菌α-淀粉酶和/或如細(xì)菌α-淀粉酶，例如源自芽孢桿菌屬的菌種(Bacillussp.)的α-淀粉酶。
不包含CBM的α-淀粉酶可以作為來自DSM(Gist Brochades)的分枝菌酶(Mycolase)、BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMX和SANTMSUPER、SANTMEXTRA L(Novozymes A/S)和澄解酶(Clarase)L-40,000、DEX-LOTM、Spezyme FRED、SPEZYMETMAA和SPEZYMETMDELTA AA(Genencor Int.)。
β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)可以在有效量的合適的β-葡聚糖酶存在下進(jìn)行本發(fā)明的方法。所述β-葡聚糖酶可以是微生物來源的，例如可以源自細(xì)菌(例如芽孢桿菌屬)的菌株，或可以源自絲狀真菌(例如，曲霉屬、木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢屬(Fusarium))。優(yōu)選的是源自木霉屬的菌種的β-葡聚糖酶，例如具有SEQ ID NO8(WO200014206)中所示序列的β-葡聚糖酶，優(yōu)選T.reesei例如具有SEQ ID NO6中所示序列的β-葡聚糖酶，或綠色木霉(T.viride)例如具有SEQ ID NO7中所示序列的β-葡聚糖酶。
用于本發(fā)明的方法的β-葡聚糖酶可以是內(nèi)切葡聚糖酶，例如內(nèi)-1，4-β-葡聚糖酶。商業(yè)上可得到的可使用的β-葡聚糖酶制劑包括CELLUCLAST、CELLUZYME、CEREFLO和ULTRAFLO(可由Novozymes A/S獲得)、GC 880、LAMINEXTM和SPEZYMECP(可獲得自Genencor Int.)和ROHAMENT7069 W(可由Rhm，Germany獲得)。優(yōu)選的是CEREFLO。
可以將β-葡聚糖酶以0.01-5000BGU/kg干固體的量，優(yōu)選地以0.1-500BGU/kg干固體的量，并且最優(yōu)選1-50BGU/kg干固體的量加入，并且在液化步驟(下游糖化醪)以1.0-5000BGU/kg干固體的量，并且最優(yōu)選10-500BGU/kg干固體的量加入。
木聚糖酶(EC 3.2.1.8和其它)可以在有效量的合適的木聚糖酶存在下進(jìn)行本發(fā)明的方法，所述木聚糖酶可以源自多種生物體，其包括真菌的和細(xì)菌的生物體，例如曲霉屬、Disporotrichum屬、青霉屬(Penicilluum)、脈孢菌屬(Neurospora)、鐮孢屬和木霉屬。
合適的木聚糖酶的實(shí)例包括源自以下菌種的木聚糖酶H.insolens(WO92/17573)；塔賓曲霉(Aspergillus tubigensis)(WO 92/01793)；黑曲霉(Shei et al.，1985，Biotech.和Bioeng.Vol.XXVII，pp.533-538，和Foumier et al.，1985，Bio-tech.Bioeng.Vol.XXVII，pp.539-546；WO 91/19782和EP 463 706)；棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 94/21785)。
所述木聚糖酶還可以是1，3-β-D-木聚糖木聚糖水解酶(1，3-beta-D-xylanxylanohydrolase)(EC.3.2.1.32)。
優(yōu)選地，木聚糖酶是家族10木聚糖酶，并且更加優(yōu)選地所述木聚糖酶源自曲霉屬的菌種。在具體的實(shí)施方案中，所述木聚糖酶是棘孢曲霉的木聚糖酶II，其公開于WO 94/21785，并且示于SEQ ID NO4，或所述木聚糖酶是Trichoderma reesei的木聚糖酶，其具有SEQ ID NO5(SWISSPROT Q9P973)中所示的序列。
預(yù)期的商業(yè)上可得到的包含木聚糖酶的組合物包括SHEARZYME200L、SHEARZYME500L、BIOFEED WHEAT和PULPZYMETMHC(來自Novozymes)和GC 880、SPEZYMECP(來自Genencor Int)。
可以將木聚糖酶以1.0-1000FXU/kg干固體的量加入，優(yōu)選5-500FXU/kg干固體，優(yōu)選5-100FXU/kg干固體，并且最優(yōu)選10-100FXU/kg干固體。
葡糖淀粉酶可以將葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)用在所述方法中。優(yōu)選的是真菌來源的葡糖淀粉酶，例如曲霉屬葡糖淀粉酶，具體為黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel et al.(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)。同樣優(yōu)選的是其變體，例如WO92/00381和WO00/04136中公開的；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO84/02921)、米曲霉(A.oryzae)(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或它們的變體或片段。優(yōu)選的葡糖淀粉酶包括源自黑曲霉的葡糖淀粉酶，例如與WO00/04136和SEQ ID NO13中所列氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。同樣優(yōu)選的是源自米曲霉的葡糖淀粉酶，例如與WO00/04136 SEQ ID NO2所列氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。
其它葡糖淀粉酶包括踝節(jié)菌屬(Talaromyces)葡糖淀粉酶，具體地源自Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美國專利號(hào)Re.32,153)、Talaromyces duponti、嗜熱踝節(jié)菌(Talaromyces thermophilus)(美國專利號(hào)4,587,215)，梭菌屬(Clostridium)葡糖淀粉酶，具體為嗜熱解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum) (EP135，138)和熱硫化氫梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)。
商業(yè)上可得到的包含葡糖淀粉酶的組合物包括AMG 200L；AMG300 L；SANTMSUPER、SAN EXTRA L和AMGTME(來自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(來自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(來自DSM)；G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990 ZR(來自Genencor Int.)。
肌醇六磷酸酶可以用于本發(fā)明的方法中的額外的酶是肌醇六磷酸酶。所述肌醇六磷酸酶可以是能夠從植酸(肌醇六磷酸(myo-inositolhexakisphosphate))或從它的任何鹽(植酸鹽)實(shí)現(xiàn)無機(jī)磷酸鹽的釋放的任何酶。肌醇六磷酸酶能夠根據(jù)它們?cè)诔跏妓獠襟E中的特異性，即根據(jù)哪個(gè)磷酸酯基團(tuán)首先被水解來分類。用于本發(fā)明中的肌醇六磷酸酶可以具有任何特異性，例如，作為3-肌醇六磷酸酶(E.C.3.1.3.8)、6-肌醇六磷酸酶(E.C.3.1.3.26)或5-肌醇六磷酸酶(無E.C.編號(hào))。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的商業(yè)上可得到的肌醇六磷酸酶包括BIO-FEEDPHYTASETM、PHYTASE NOVOTMCT或L(NovozymesA/S)，或NATUPHOSTMNG 5000(DSM)。
另一種酶可以是脫支酶，例如異淀粉酶(E.C.3.2.1.68)或支鏈淀粉酶(E.C.3.2.1.41)。異淀粉酶水解β-極限糊精和支鏈淀粉中的α-1，6-D-糖苷分支鍵(alpha-1，6-D-glucosidic branch linkage)，并且能夠憑借異淀粉酶不能攻擊支鏈淀粉，和憑借對(duì)α-極限糊精的有限作用區(qū)別于支鏈淀粉酶?？梢詫⒚撝敢员绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的有效量加入。
在第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生乙醇的方法，包含下列步驟(a)提供包含水和粒狀淀粉的漿液，(b)在下列物質(zhì)存在下在30℃-35℃之間的溫度溫育所述漿液i)包含CBM的酸性α-淀粉酶和ii)發(fā)酵生物，例如酵母，以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品，和，(c)任選地回收所述發(fā)酵產(chǎn)品，例如乙醇。所述步驟(a)、(b)和(c)可以順序進(jìn)行；然而，所述方法可以包含未在本文描述中詳細(xì)說明的額外的步驟，其可以在步驟(a)、(b)和(c)的任一項(xiàng)之前、之間或之后進(jìn)行。優(yōu)選地步驟(b)的溫度是28℃-36℃之間，優(yōu)選29℃-35℃，更優(yōu)選30℃-34℃，例如大約32℃，并且將所述漿液保持與以下物質(zhì)接觸一段時(shí)間i)包含CBM的酸性α-淀粉酶和ii)發(fā)酵生物，例如酵母，所述時(shí)間足以在步驟(b)的過程中使淀粉水解和釋放的糖類發(fā)酵，優(yōu)選25至190小時(shí)的時(shí)間，優(yōu)選30-180小時(shí)，更優(yōu)選40-170小時(shí)，甚至更優(yōu)選50-160小時(shí)，還更優(yōu)選60-150小時(shí)，甚至還更優(yōu)選70-140小時(shí)，并且最優(yōu)選80-130小時(shí)，例如85-110小時(shí)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟b)的過程中還存在木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟b)之前將所述漿液在低于起始糊化溫度0-30℃的溫度，例如在低于起始糊化溫度0-20℃，優(yōu)選0-10，更優(yōu)選5-10℃的溫度溫育。優(yōu)選在步驟b)之前將所述漿液在低于起始糊化溫度0-30℃的溫度，例如在30℃-45℃、40℃-50℃，或45℃-55℃溫育。
將包含CBM的酸性α-淀粉酶以有效量加入，該有效量是對(duì)于想要達(dá)到的目的來說足夠的酸性α-淀粉酶(活性)的濃度，所述目的是將淀粉漿液中的粒狀淀粉轉(zhuǎn)化成糊精。優(yōu)選所述包含CBM的酸性α-淀粉酶以10-10000AFAU/kg的DS的量，以500-2500AFAU/kg的DS的量，或更優(yōu)選以100-1000AFAU/kg的DS的量，例如大約500AFAU/kg的DS的量存在。當(dāng)以AAU單位測(cè)量時(shí)，所述酸性α-淀粉酶活性優(yōu)選以5-500000AAU/kg的DS的量，以500-50000AAU/kg的DS的量，或更優(yōu)選以100-10000AAU/kg的DS，例如500-1000AAU/kg的DS的量存在。
將所述葡糖淀粉酶以有效量加入，該有效量是對(duì)于想要達(dá)到的目的來說足夠的葡糖淀粉酶的濃度，所述目的是降解由酸性α-淀粉酶處理淀粉漿液產(chǎn)生的糊精。優(yōu)選所述葡糖淀粉酶活性以20-200AGU/kg的DS的量，優(yōu)選100-1000AGU/kg的DS，或更優(yōu)選以200-400AGU/kg的DS，例如250AGU/kgDS的量存在。當(dāng)以AGI單位測(cè)量時(shí)，所述葡糖淀粉酶活性優(yōu)選以10-100000AGI/kg的DS，50-50000AGI/kg的DS，優(yōu)選100-10000AGI/kg的DS，或更優(yōu)選以200-5000AGI/kg的DS的量存在。
優(yōu)選將酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性以0.3-5.0AFAU/AGU的比例加入所述漿液中。更優(yōu)選酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間的比例是至少0.35、至少0.40、至少0.50、至少0.60、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.85或甚至至少1.9AFAU/AGU。然而，酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間的比例應(yīng)該優(yōu)選少于4.5、少于4.0、少于3.5、少于3.0、少于2.5或甚至少于2.25AFAU/AGU。以AUU/AGI表示的酸性α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的活性優(yōu)選以0.4-6.5AUU/AGI的比例存在。更優(yōu)選地，酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間的比例是至少0.45、至少0.50、至少0.60、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.1、至少2.2、至少2.3、至少2.4或甚至至少2.5AUU/AGI。然而，酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性之間的比例優(yōu)選少于6.0、少于5.5、少于4.5、少于4.0、少于3.5或甚至少于3.0AUU/AGI。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，木聚糖酶可優(yōu)選以1-50000FXU/kg DS，優(yōu)選5-5000FXU/kgDS，或更優(yōu)選10-500FXU/kg DS的量存在，并且所述β-葡聚糖酶可以0.01-500000EGU/kg DS，優(yōu)選0.1-10000EGU/kgDS，優(yōu)選1-5000EGU/kg DS，更優(yōu)選10-500EGU/kg DS，并最優(yōu)選100-250EGU/kgDS的量存在。
所述酶活性可優(yōu)選以本發(fā)明第二個(gè)方面所述的組合物的形式配制，并且優(yōu)選地該組合物包含的前文所述酶的濃度在濃度上(in strength)等于在所述漿液中濃度的10倍、100倍、1000倍或甚至10000倍。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述淀粉漿液包含水和5-60％DS(干固體)粒狀淀粉，優(yōu)選10-50％DS粒狀淀粉，更優(yōu)選15-40％DS，特別是大約20-25％DS粒狀淀粉。在本發(fā)明的方法中待加工的粒狀淀粉具體可以得自塊莖(tuber)、根、莖、玉米芯(cob)、豆類、谷類或整谷粒(whole grain)。更具體地，所述粒狀淀粉可以得自玉米、玉米芯、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱(milo)、西米(sago)、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、高粱(sorghum)、稻、豌豆(pea)、豆類(bean)、香蕉或馬鈴薯。優(yōu)選的是蠟質(zhì)或非蠟質(zhì)兩種類型的玉米和大麥。最優(yōu)選的是谷類，特別是小麥、大麥和/或黑麥。所述待加工的粒狀淀粉可優(yōu)選源自磨碎的整谷粒。優(yōu)選地將包含所述粒狀淀粉的原料磨碎以打開結(jié)構(gòu)并且用于進(jìn)一步的加工。所述粒狀淀粉優(yōu)選是干磨的谷粒，例如小麥、大麥和/或黑麥。因?yàn)樾←?、大麥?或黑麥包含非常大量的β-葡聚糖和木聚糖，包含這些谷粒種類的干磨谷物(dry milled grist)能夠在常規(guī)方法中導(dǎo)致高糖化醪粘度，所述常規(guī)方法包含未糊化的粒狀淀粉的液化和/或糖化。因此源自干磨小麥、大麥和/或黑麥的粒狀淀粉對(duì)于本發(fā)明的方法是特別優(yōu)選的。
在經(jīng)過本發(fā)明所述第一個(gè)方面的方法之后，將至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或優(yōu)選99％的所述粒狀淀粉的干固體轉(zhuǎn)化成乙醇。
所述發(fā)酵的漿液包含至少7％、至少8％、至少9％、至少10％例如至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％例如至少16％的乙醇。
在發(fā)酵之后可以將乙醇任選地回收。所述乙醇回收可以通過任何常規(guī)方式，比如蒸餾來進(jìn)行，并且可將其用作燃料乙醇和/或飲用乙醇和/或工業(yè)乙醇。
材料和方法酸性α-淀粉酶活性當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時(shí)，可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶單位)測(cè)量任何酸性α-淀粉酶活性?？商鎿Q地，可以以AAU(酸性α-淀粉酶單位)測(cè)量酸性α-淀粉酶的活性。
酸性α-淀粉酶單位(AAU)所述酸性α-淀粉酶活性能夠以AAU(酸性α-淀粉酶單位)測(cè)量，其是絕對(duì)方法。一個(gè)酸性淀粉酶單位(AAU)是每小時(shí)將1g淀粉(100％的干固體)在標(biāo)準(zhǔn)化條件下轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的酶量，所述產(chǎn)品在與已知濃度的碘溶液反應(yīng)之后在620nm具有的透射(transmission)等于顏色參比(color reference)之一。
標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物可溶淀粉。濃度約為20g DS/L.
緩沖液檸檬酸鹽，約0.13M，pH＝4.2碘溶液40.176g碘化鉀+0.088g碘/L城市水 15°-20°dH(德國硬度(German degree hardness))pH4.2溫育溫度30℃反應(yīng)時(shí)間11分鐘波長620nm酶濃度0.13-0.19AAU/mL酶工作范圍0.13-0.19AAU/mL所述淀粉應(yīng)該是Lintner淀粉，其是輕沸的(thin-boiling)淀粉，在實(shí)驗(yàn)室中用作比色指示劑。Lintner淀粉通過稀釋鹽酸處理的天然淀粉獲得，因而其深持了與碘變?yōu)樗{(lán)色的能力。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可見于EP0140410B2，通過引用將其公開包括在本文中。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶單位)測(cè)量酸性α-淀粉酶活性，其相對(duì)于酶標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。將1FAU定義為在下述標(biāo)準(zhǔn)條件下每小時(shí)降解5.260mg淀粉干固體的酶量。
酸性α-淀粉酶，內(nèi)-α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan-glucanohydrolase)，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子內(nèi)部區(qū)域的α-1，4-糖苷鍵以形成具有不同鏈長的低聚糖和糊精。與碘形成的顏色強(qiáng)度與淀粉濃度成正比例。使用反向比色法(reverse colorimetry)，測(cè)定在特定分析條件下淀粉濃度的降低作為淀粉酶活性。
λ＝590nm藍(lán)色/紫色 t＝23秒 脫色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物可溶淀粉，約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，約0.03M碘(I2)0.03g/LCaCl21.85mMpH2.50±0.05溫育溫度40℃反應(yīng)時(shí)間23秒波長590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL更詳細(xì)描述這種分析方法的文件夾EB-SM-0259.02/01可以根據(jù)向Novozymes A/S，Denmark要求而獲得，通過引用將該文件夾包括在本文中。
細(xì)菌α-淀粉酶活性(KNU)可以使用馬鈴薯淀粉作為底物測(cè)定細(xì)菌α-淀粉酶活性。這種方法基于通過酶分解改性的馬鈴薯淀粉，并將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合來跟蹤該反應(yīng)。最初，形成黑藍(lán)色(blackish blue)，但在分解淀粉的過程中藍(lán)色變?nèi)酰⑶抑饾u轉(zhuǎn)變成紅棕色(reddish brown)，其與有色玻璃標(biāo)準(zhǔn)(colored glassstandard)比較。
將一千Novo α-淀粉酶單位(KNU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH5.6)下將5260mg淀粉干物質(zhì)Merck Amylum solu-bile糊精化的酶量。
更詳細(xì)描述這種分析方法的文件夾EB-SM-0009.02/01可以根據(jù)向Novozymes A/S，Denmark要求而獲得，通過引用將該文件夾包括在本文中。
葡糖淀粉酶活性可以以AGI單位或以淀粉葡萄糖苷酶單位(AGU)測(cè)量葡糖淀粉酶活性。
葡糖淀粉酶活性(AGI)葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase))將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。此處通過用于活性測(cè)定的葡萄糖氧化酶方法測(cè)定葡萄糖的量。該方法在“Approved methods of the American Association of Cereal Chemists”.Vol.1-2AACC，from American Association of Cereal Chemists，(2000)；ISBN1-891127-12-8中的76-11節(jié)Starch-Glucoamylase Method with SubsequentMeasurement of Glucose with Glucose Oxidase中有所描述。
一個(gè)葡糖淀粉酶單位(AGI)是在所述方法的標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘將形成1微摩爾葡萄糖的酶量。
標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件底物可溶淀粉，濃度約16g干固體/L.
緩沖液醋酸鹽，約0.04M，pH＝4.3pH4.3溫育溫度60℃反應(yīng)時(shí)間15分鐘終止反應(yīng)NaOH達(dá)到約0.2g/L(pH～9)的濃度酶濃度0.15-0.55AAU/mL.
所述淀粉應(yīng)該是Lintner淀粉，其是輕沸的淀粉，在實(shí)驗(yàn)室中用作比色指示劑。Lintner淀粉通過稀釋鹽酸處理天然淀粉來獲得，因而其保持了與碘變?yōu)樗{(lán)色的能力。
葡糖淀粉酶活性(AGU)將Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量，所述標(biāo)準(zhǔn)條件是37℃，pH4.3，底物麥芽糖23.2mM，緩沖液醋酸鹽0.1M，反應(yīng)時(shí)間5分鐘。
可以使用自動(dòng)分析器系統(tǒng)。將變旋酶(mutarotase)加入到葡萄糖脫氫酶試劑中，從而將存在的任何α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)變成β-D-葡萄糖。在上述反應(yīng)中葡萄糖脫氫酶與β-D-葡萄糖特異地反應(yīng)，形成NADH作為原始葡萄糖濃度的量度，所述NADH是使用光度計(jì)在340nm測(cè)定的。
AMG溫育底物麥芽糖23.2mM緩沖液醋酸鹽0.1MpH4.30±0.05溫育溫度37℃±1反應(yīng)時(shí)間5分鐘酶工作范圍0.5-4.0AGU/mL
顯色反應(yīng)GlucDH430U/L變旋酶9U/LNAD0.21mM緩沖液磷酸鹽0.12M；0.15M NaClpH7.60±0.05溫育溫度37℃±1反應(yīng)時(shí)間5分鐘波長340nm更詳細(xì)描述這種分析方法的文件夾(EB-SM-0131.02/01)可以根據(jù)向Novozymes A/S，Denmark要求而獲得，通過引用將該文件夾包括在本文中。
木聚糖水解(Xylanolytic)活性木聚糖水解活性可以以FXU單位表示，用remazol-木聚糖(用RemazolBrilliant Blue R，F(xiàn)luka染色的4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖(4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan))作為底物在pH6.0測(cè)定。
將木聚糖酶樣品與remazol-木聚糖底物一起溫育。將未降解的染色的底物背景通過乙醇沉淀。上清液中殘余的藍(lán)顏色(如通過分光光度法在585nm測(cè)定)與木聚糖酶活性成比例，然后相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下的酶標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定木聚糖酶單位，所述標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件即在50.0℃，pH6.0，以及30分鐘反應(yīng)時(shí)間。
更詳細(xì)描述這種分析方法的文件夾EB-SM-352.02/01可以根據(jù)向Novozymes A/S，Denmark要求而獲得，通過引用將該文件夾包括在本文中。
纖維素水解(Cellulytic)活性可以以內(nèi)-葡聚糖酶單位(EGU)測(cè)量纖維素水解活性，其在pH6.0用羧甲基纖維素(CMC)作為底物測(cè)定。制備底物溶液，其在pH6.0的0.1M磷酸鹽緩沖液中含有34.0g/l CMC(Hercules 7 LFD)。將所述待分析的酶樣品溶于相同的緩沖液中。將5ml底物溶液和0.15ml酶溶液混合，并且轉(zhuǎn)移到振動(dòng)粘度計(jì)(vibration viscosimeter)(例如MIVI 3000，來自Sofraser，F(xiàn)rance)中，于40℃恒溫30分鐘。將一個(gè)EGU定義為在這些條件下將粘度減少至一半的酶量。應(yīng)調(diào)節(jié)酶樣品的量以在所述反應(yīng)混合物中提供0.01-0.02EGU/ml。將主要標(biāo)準(zhǔn)物(arch standard)定義為880EGU/g。
更詳細(xì)描述這種分析方法的文件夾EB-SM-0275.02/01可以根據(jù)向Novozymes A/S，Denmark要求而獲得，通過引用將該文件夾包括在本文中。
酶制劑使用下列酶制劑細(xì)菌α-淀粉酶；包含多肽的酶制劑，所述多肽具有源自嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶活性(E.C.3.2.1.1)，并且具有如WO99/19467中SEQ.NO4公開的氨基酸序列?；钚?20KNU/g(密度＝1.20-1.25g/mL)。
包含酸性真菌α-淀粉酶和一些葡糖淀粉酶的組合物，所述酸性真菌α-淀粉酶包含具有SEQ ID NO1中所示序列的CBM?；钚?29AFAU/g，31AGU/g(密度＝1.2g/mL)。
源自黑曲霉的葡糖淀粉酶組合物，其包含葡糖淀粉酶和一些酸性真菌α-淀粉酶?；钚?63AGU/g，86AFAU/g(密度＝1.2g/mL)。
源自遺傳修飾的黑曲霉微生物(Spirizyme Fuel)的葡糖淀粉酶組合物，其包含葡糖淀粉酶和一些酸性真菌α-淀粉酶?；钚?50AGU/g，30AFAU/g。
源自遺傳修飾的黑曲霉微生物(Spirizyme Plus)的葡糖淀粉酶組合物，其包含葡糖淀粉酶和一些酸性真菌α-淀粉酶?；钚?63AGU/g，86AFAU/g。
酶組合物(Novozym 50024)，其包含木聚糖酶和纖維素酶活性，所述活性分別源自Trichoderma reesei和棘孢曲霉?；钚?00FXU/g+350EGU/g(密度＝1.2g/mL)。
酵母來自De Danske Spritfabrikker A/S(Danish Distillers)的干的面包酵母(Dried baker’s yeast)。
實(shí)施例1本實(shí)施例說明了使用包含CBM的酸性α-淀粉酶的本發(fā)明的方法。在室溫的自來水中制備磨碎小麥的20％D.S.漿液。對(duì)每個(gè)處理，將2×250g漿液分配到500mL藍(lán)蓋瓶中。使用6N HCl將pH調(diào)節(jié)至4.5。根據(jù)表6配制酶活性，并且將所述瓶在55℃振蕩水浴中溫育一小時(shí)。將所述瓶冷卻至32℃并添加0.25g干的面包酵母。將所述瓶置于32℃水浴72小時(shí)。記錄重量損失數(shù)據(jù)。在50和72.5小時(shí)將所述瓶稱重，并且測(cè)量CO2重量損失用于監(jiān)測(cè)該發(fā)酵進(jìn)程。所用的CO2損失量和乙醇重量之間的關(guān)系是CO2損失(g)×1.045＝EtOH(g)。
*基于50和72小時(shí)的重量損失，CO2損失(g)×1.045＝EtOH(g)，**基于100小時(shí)的HPLC。
實(shí)施例2將使用被稱作不加壓蒸煮(non-pressure cooking)(NPC)的傳統(tǒng)預(yù)液化的常規(guī)乙醇方法與本發(fā)明的方法進(jìn)行比較。用于產(chǎn)生飲用乙醇的傳統(tǒng)不加壓批式(batch)蒸煮方法在題為“Use of Novozymes enzymes in alcohol production”的Novozymes公開No.2001-10782-01中有所描述。
在室溫(RT)自來水中制備磨碎大麥的20％D.S.漿液。使用HAAKEViscotester VT02型粘度計(jì)測(cè)量粘度。
常規(guī)乙醇方法的NPC預(yù)處理在6×1升的桶(tub)中伴隨攪拌進(jìn)行。添加細(xì)菌α-淀粉酶并且將所述桶置于65℃水浴。當(dāng)糖化醪中的溫度達(dá)到55℃時(shí)，增加加熱以將該糖化醪加熱至90℃歷經(jīng)60分鐘。隨后將溫度調(diào)節(jié)至32℃，并且將3×250g糖化醪分配到帶有氣塞(air lock)的500mL藍(lán)蓋瓶中。向所有瓶中添加0.25g干面包酵母(對(duì)應(yīng)于5百萬-1千萬活細(xì)胞/g糖化醪)。根據(jù)下列表格添加酶活性，并將每個(gè)瓶稱重。將所述瓶置于32℃振蕩水浴中。在72小時(shí)將所述瓶稱重，并且測(cè)量CO2重量損失用于監(jiān)測(cè)該發(fā)酵進(jìn)程。所用的CO2損失量和乙醇重量之間的關(guān)系是CO2損失(g)×1.045＝EtOH(g)。
對(duì)于本發(fā)明的方法，在室溫(RT)自來水中制備磨碎大麥的30％D.S.漿液。將每個(gè)裝有250g漿液的500mL藍(lán)蓋發(fā)酵瓶裝上氣塞。使用4.0摩爾H2SO4將pH調(diào)節(jié)至5.0，并且使用HAAKE Viscotester VT02型粘度計(jì)測(cè)量粘度。將木聚糖酶、纖維素酶、葡糖淀粉酶和包含CBM的酸性α-淀粉酶根據(jù)表2配制。然后將溫度調(diào)節(jié)至32℃，將所述瓶保持在磁力攪拌下，并且如上所述監(jiān)測(cè)使用0.25g干的面包酵母的發(fā)酵(對(duì)應(yīng)于在發(fā)酵開始時(shí)5百萬-1千萬活細(xì)胞/g糖化醪)。本發(fā)明的時(shí)間從接種開始計(jì)算。
實(shí)施例3本實(shí)施例說明了使用多種原料的本發(fā)明的方法。在室溫自來水中制備磨碎谷類的30％D.S.漿液。對(duì)于每個(gè)處理，將2×250g分配到500mL藍(lán)蓋瓶中。然后將溫度調(diào)節(jié)至32℃，并且如上所述進(jìn)行和監(jiān)測(cè)使用0.25g干的面包酵母的發(fā)酵(對(duì)應(yīng)于在發(fā)酵開始時(shí)5百萬-1千萬活細(xì)胞/g糖化醪)。時(shí)間從接種計(jì)算。
使用4.0摩爾H2SO4將pH調(diào)節(jié)至5.0，并使用HAAKE Viscotester VT02型粘度計(jì)測(cè)量粘度。將木聚糖酶、纖維素酶、葡糖淀粉酶和酸性α-淀粉酶根據(jù)表3配制。將所述瓶調(diào)節(jié)至32℃并且添加0.25g干的面包酵母。將所述瓶在32℃水浴中在磁力攪拌下保持91小時(shí)。
*基于91小時(shí)的重量損失，CO2損失(g)×1.045＝EtOH(g)。
序 列 表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>發(fā)酵產(chǎn)品方法<130>10752.204-WO<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>616<212>PRT<213>人工的<220>
<223>黑曲霉-CBM<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(616)<400>1Ala Glu Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe1 5 10 15Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asp Thr Gly Asp Gln20 25 30Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asn His Leu Asp Tyr35 40 45Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Thr Glu50 55 60Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His Gly Tyr Trp65 70 75 80Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr Ala Asp Asp85 90 95Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met Tyr Leu Met100 105 110Val Asp Val Val Pro Asn His Met Gly Tyr Ala Gly Asn Gly Asn Asp115 120 125Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser Tyr Phe His130 135 140Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met Val Gln Asp145 150 155 160Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu Asn Thr Thr165 170 175Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala Asp Leu Val180 185 190Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val Leu Glu Val195 200 205Glu Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Gln Glu Ala Ala Gly Val Tyr Cys210 215 220
Val Gly Glu Val Asp Asn Gly Asn Pro Ala Leu Asp Cys Pro Tyr Gln225 230 235 240Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp Gln Leu Leu245 250 255Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu Tyr Asn Met260 265 270Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu Leu Gly Asn275 280 285Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Ser Asp290 295 300Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu Ser Asp Gly305 310 315 320Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ser Gly Gly Lys325 330 335Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr Asp Thr Ser340 345 350Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile Arg Lys Leu355 360 365Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn Asp Ala Phe370 375 380Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Thr Ser Gly Ser385 390 395 400Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly Ser Ser Tyr405 410 415Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr Lys Leu Ile420 425 430Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser Gly Asp Ile435 440 445Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg Val Leu Leu Pro Ala Ser450 455 460Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg Thr Thr Thr465 470 475 480Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ser Thr Ser Lys Ala Thr Thr Ser Ser Ser485 490 495Ser Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr Ser Ser Ser Cys Thr Ala Thr Ser500 505 510Thr Thr Leu Pro Ile Thr Phe Glu Glu Leu Val Thr Thr Thr Tyr Gly515 520 525Glu Glu Val Tyr Leu Ser Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Glu Trp Asp530 535 540Thr Ser Asp Ala Val Lys Leu Ser Ala Asp Asp Tyr Thr Ser Ser Asn545 550 555 560Pro Glu Trp Ser Val Thr Val Ser Leu Pro Val Gly Thr Thr Phe Glu565 570 575Tyr Lys Phe Ile Lys Val Asp Glu Gly Gly Ser Val Thr Trp Glu Ser580 585 590Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Glu Cys Gly Asn Gly Ser Gly595 600 605Glu Thr Val Val Asp Thr Trp Arg610 615<210>2
<211>558<212>PRT<213>人工的<220>
<223>具有接頭和來自A.rolfsii的SBD的Rhizomucor pusillus淀粉酶<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(558)<400>2Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys Arg Ala Thr Ser Asp1 5 10 15Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr Asp Arg Phe Gly20 25 30Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu Ser Asn Tyr Cys35 40 45Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp Tyr Ile Ser Gly50 55 60Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro Lys Asn Ser Asp65 70 75 80Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr Gln Leu Asn Ser85 90 95Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile Gln Ala Ala His100 105 110Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala Asn His Ala Gly115 120 125Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asp Ala Ser Leu130 135 140Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Gln Thr Ser Ile Glu145 150 155 160Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp Thr Glu Asn Ser165 170 175Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly Trp Val Gly Asn180 185 190Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys His Ile Arg Lys195 200 205Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val Phe Ala Thr Gly210 215 220Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro Tyr Gln Lys Tyr225 230 235 240Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala Leu Asn Asp Val245 250 255Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser Glu Met Leu Gly260 265 270Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu Thr Thr Phe Val275 280 285Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln Ser Asp Lys Ala290 295 300Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly Glu Gly Ile Pro305 310 315 320Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly Gly Ala Asp Pro
325 330 335Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Ser Ser Asp340 345 350Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg Met Lys Ser Asn355 360 365Lys Ala ValTyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn Ala Tyr Ala Phe370375 380Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr Gly Ser Gly Ser385 390 395 400Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe Asp Ser Gly Ala405 410 415Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr Val Ser Ser Asp420 425 430Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Ile Phe Thr435 440 445Ser Ala Gly Ala Thr Ser Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Val Glu Val450 455 460Thr Phe Asp Val Tyr Ala Thr Thr Val Tyr Gly Gln Asn Ile Tyr Ile465 470 475 480Thr Gly Asp Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Thr Pro Ala Asn Gly Val485 490 495Ala Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ala Thr Ile Ala Leu500 505 510Pro Ala Asp Thr Thr Ile Gln Tyr Lys Tyr Val Asn Ile Asp Gly Ser515 520 525Thr Val Ile Trp Glu Asp Ala Ile Ser Asn Arg Glu Ile Thr Thr Pro530 535 540Ala Ser Gly Thr Tyr Thr Glu Lys Asp Thr Trp Asp Glu Ser545 550 555<210>3<211>574<212>PRT<213>人工的<220>
<223>Meripilus giganteus淀粉酶和A.rolfsii SBD的雜合體<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(574)<400>3Arg Pro Thr Val Phe Asp Ala Gly Ala Asp Ala His Ser Leu His Ala1 5 10 15Arg Ala Pro Ser Gly Ser Lys Asp Val Ile Ile Gln Met Phe Glu Trp20 25 30Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Glu Cys Thr Asn Phe Ile Gly Pro Ala35 40 45Gly Tyr Gly Phe Val Gln Val Ser Pro Pro Gln Glu Thr Ile Gln Gly50 55 60Ala Gln Trp Trp Thr Asp Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Thr Leu Thr Gly
65 70 75 80Lys Arg Gly Asp Arg Ser Gln Phe Ala Asn Met Ile Thr Thr Cys His85 90 95Ala Ala Gly Val Gly Val Ile Val Asp Thr Ile Trp Asn His Met Ala100 105 110Gly Val Asp Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Ser Ser Phe Thr His Tyr115 120 125Asn Tyr Pro Gly Ile Tyr Gln Asn Gln Asp Phe His His Cys Gly Leu130 135 140Glu Pro Gly Asp Asp Ile Val Asn Tyr Asp Asn Ala Val Glu Val Gln145 150 155 160Thr Cys Glu Leu Val Asn Leu Ala Asp Leu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr165 170 175Val Arg Gly Arg Leu Ala Gln Tyr Gly Asn Asp Leu Leu Ser Leu Gly180 185 190Ala Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Ser Lys His Ile Pro Val Gly Asp195 200 205Ile Ala Asn Ile Leu Ser Arg Leu Ser Arg Ser Val Tyr Ile Thr Gln210 215 220Glu Val Ile Phe Gly Ala Gly Glu Pro Ile Thr Pro Asn Gln Tyr Thr225 230 235 240Gly Asn Gly Asp Val Gln Glu Phe Arg Tyr Thr Ser Ala Leu Lys Asp245 250 255Ala Phe Leu Ser Ser Gly Ile Ser Asn Leu Gln Asp Phe Glu Asn Arg260 265 270Gly Trp Val Pro Gly Ser Gly Ala Asn Val Phe Val Val Asn His Asp275 280 285Thr Glu Arg Asn Gly Ala Ser Leu Asn Asn Asn Ser Pro Ser Asn Thr290 295 300Tyr Val Thr Ala Thr Ile Phe Ser Leu Ala His Pro Tyr Gly Thr Pro305 310 315 320Thr Ile Leu Ser Ser Tyr Asp Gly Phe Thr Asn Thr Asp Ala Gly Ala325 330 335Pro Asn Asn Asn Val Gly Thr Cys Ser Thr Ser Gly Gly Ala Asn Gly340 345 350Trp Leu Cys Gln His Arg Trp Thr Ala Ile Ala Gly Met Val Gly Phe355 360 365Arg Asn Asn Val Gly Ser Ala Ala Leu Asn Asn Trp Gln Ala Pro Gln370 375 380Ser Gln Gln Ile Ala Phe Gly Arg Gly Ala Leu Gly Phe Val Ala Ile385 390 395 400Asn Asn Ala Asp Ser Ala Trp Ser Thr Thr Phe Thr Thr Ser Leu Pro405 410 415Asp Gly Ser Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Lys Ala Ser Gly Ser Ser420 425 430Cys Thr Gly Ser Ser Phe Thr Val Ser Gly Gly Lys Leu Thr Ala Thr435 440 445Val Pro Ala Arg Ser Ala Ile Ala Val His Thr Gly Gln Lys Gly Ser450 455 460Gly Gly Gly Ala Thr Ser Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Val Glu Val465 470 475 480Thr Phe Asp Val Tyr Ala Thr Thr Val Tyr Gly Gln Asn Ile Tyr Ile485 490 495
Thr Gly Asp Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Thr Pro Ala Asn Gly Val500 505 510Ala Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ala Thr lle Ala Leu515 520 525Pro Ala Asp Thr Thr Ile Gln Tyr Lys Tyr Val Asn Ile Asp Gly Ser530 535 540Thr Val Ile Trp Glu Asp Ala Ile Ser Asn Arg Glu Ile Thr Thr Pro545 550 555 560Ala Ser Gly Thr Tyr Thr Glu Lys Asp Thr Trp Asp Glu Ser565 570<210>4<211>384<212>PRT<213>棘孢曲霉<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(384)<400>4Val Gly Leu Asp Gln Ala Ala Val Ala Lys Gly Leu Gln Tyr Phe Gly1 5 10 15Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp Ile Pro Tyr Val Thr Gln20 25 30Leu Asn Asn Thr Ala Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Gly Asn Ser Met35 40 45Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Gly Thr Phe Thr Phe Thr Lys50 55 60Gly Asp Val Ile Ala Asp Leu Ala Glu Gly Asn Gly Gln Tyr Leu Arg65 70 75 80Cys His Thr Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu Pro Ser Trp Val Thr Ser85 90 95Gly Thr Trp Thr Asn Ala Thr Leu Thr Ala Ala Leu Lys Asn His Ile100 105 110Thr Asn Val Val Ser His Tyr Lys Gly Lys Cys Leu His Trp Asp Val115 120 125Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr Tyr Arg Thr Asn Ile Phe130 135 140Tyr Thr Thr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Ala Ala Ala145 150 155 160Ala Ala Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu165 170 175Glu Tyr Gly Gly Ala Lys Ala Ala Ser Ala Arg Ala Ile Val Gln Leu180 185 190Val Lys Asn Ala Gly Ala Lys Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ala His195 200 205Phe Ser Val Gly Thr Val Pro Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Leu210 215 220Gln Ser Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Tyr Thr Glu Ala Asp225 230 235 240Val Arg Ile Leu Leu Pro Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ala Gln Gln Ser
245 250 255Ser Asp Phe Gln Ala Leu Val Gln Ser Cys Val Gln Thr Thr Gly Cys260 265 270Val Gly Phe Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro275 280 285Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Ala Ala Leu Pro Trp Asp Glu Asn Leu290 295 300Val Lys Lys Pro Ala Tyr Ash Gly Leu Leu Ala Gly Met Gly Val Thr305 310 315 320Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Lys Thr325 330 335Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ser Thr Gly Thr Thr Ala Ala His340 345 350Trp Gly Gln Cys Gly Gly Leu Asn Trp Ser Gly Pro Thr Ala Cys Ala355 360 365Thr Gly Tyr Thr Cys Thr Tyr Val Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu370 375 380<210>5<211>347<212>PRT<213>木聚糖酶Trichoderma reesei<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(347)<400>5Met Lys Ala Asn Val Ile Leu Cys Leu Leu Ala Pro Leu Val Ala Ala1 5 10 15Leu Pro Thr Glu Thr Ile His Leu Asp Pro Glu Leu Ala Ala Leu Arg20 25 30Ala Asn Leu Thr Glu Arg Thr Ala Asp Leu Trp Asp Arg Gln Ala Ser35 40 45Gln Ser Ile Asp Gln Leu Ile Lys Arg Lys Gly Lys Leu Tyr Phe Gly50 55 60Thr Ala Thr Asp Arg Gly Leu Leu Gln Arg Glu Lys Asn Ala Ala Ile65 70 75 80Ile Gln Ala Asp Leu Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp85 90 95Gln Ser Leu Glu Asn Asn Gln Gly Gln Leu Asn Trp Gly Asp Ala Asp100 105 110Tyr Leu Val Asn Phe Ala Gln Gln Asn Gly Lys Ser Ile Arg Gly His115 120 125Thr Leu Ile Trp His Ser Gln Leu Pro Ala Trp Val Asn Asn Ile Asn130 135 140Asn Ala Asp Thr Leu Arg Gln Val Ile Arg Thr His Val Ser Thr Val145 150 155 160Val Gly Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Asn Glu165 170 175Ile Phe Asn Glu Asp Gly Thr Leu Arg Ser Ser Val Phe Ser Arg Leu180 185 190
Leu Gly Glu Glu Phe Val Ser Ile Ala Phe Arg Ala Ala Arg Asp Ala195 200 205Asp Pro Ser Ala Arg Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Arg Ala210 215 220Asn Tyr Gly Lys Val Asn Gly Leu Lys Thr Tyr Val Ser Lys Trp Ile225 230 235 240Ser Gln Gly Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Ser His Leu Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ala Leu Gln Gln Leu Ala Thr260 265 270Val Pro Val Thr Glu Leu Ala Ile Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala275 280 285Pro Thr Thr Asp Tyr Thr Gln Val Val Gln Ala Cys Leu Ser Val Ser290 295 300Lys Cys Val Gly Ile Thr Val Trp Gly Ile Ser Asp Lys Asp Ser Trp305 310 315 320Arg Ala Ser Thr Asn Pro Leu Leu Phe Asp Ala Asn Phe Asn Pro Lys325 330 335Pro Ala Tyr Asn Ser Ile Val Gly Ile Leu Gln340 345<210>6<211>419<212>PRT<213>Beta-葡聚糖酶 木霉屬的菌種<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(419)<400>6Met Asn Lys Pro Met Ser Ser Leu Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Ala1 5 10 15Gly Gly Ser Ile Ala Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln20 25 30Gly Trp Ser Gly Pro Thr Ser Cys Val Ala Gly Ser Ala Cys Ser Thr35 40 45Leu Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Thr Met Ser50 55 60Thr Thr Thr Lys Pro Thr Ser Val Ser Ala Ser Thr Thr Arg Ala Ser65 70 75 80Ala Thr Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Leu Thr Arg Phe85 90 95Ala Gly Val Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly Cys Gly Thr Asp Gly100 105 110Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Asn Tyr Ala Gly115 120 125Thr Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Val Gly Gln Met Gln His Phe Val Asn130 135 140Asp Asp Lys Leu Thr Ile Phe Arg Leu Pro Val Gly Trp Gln Tyr Leu145 150 155 160Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Thr Leu Asp Ser Asn Asn Phe Gly Lys
165 170 175Tyr Asp Gln Leu Val Gln Ala Cys Leu Ser Leu Gly Val Tyr Cys Ile180 185 190Val Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln195 200 205Gly Gly Pro Thr Asn Asp Gln Phe Thr Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala210 215 220Gln Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Lys Val Trp Phe Gly Ile Met Asn Glu225 230 235 240Pro His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Thr Thr Val Gln Ala Val245 250 255Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln Phe Ile Ser Leu260 265 270Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile Ser Asp Gly Ser275 280 285Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Lys Asn Pro Asp Gly Ser Thr Pro Asn290 295 300Leu Ile Phe Asp Leu His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr305 310 315 320His Ala Asp Cys Val Thr Asn Asn Val Asn Asp Ala Phe Ser Pro Val325 330 335Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln Ala Ile Leu Thr Glu Thr340 345 350Gly Gly Gly Asn Thr Gln Ser Cys Ile Gln Tyr Leu Cys Gln Gln Phe355 360 365Gln Tyr Ile Asn Gln Asn Ser Asp Val Tyr Leu Gly Tyr Val Gly Trp370 375 380Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Ile Leu Thr Glu Thr Pro Thr385 390 395 400Gly Ser Gly Ser Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser Cys Ile405 410 415Ser Arg Lys<210>7<211>459<212>PRT<213>Beta-葡聚糖酶 綠色木霉(Trichoderma viride)<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(459)<400>7Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile1 5 10 15Ala Arg Leu Val Ala Ala Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val20 25 30His Pro Lys Leu Thr Thr Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val35 40 45Ala Gln Asp Thr Ser Val Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His50 55 60
Asp Ala Asn Tyr Asn Ser Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr65 70 75 80Leu Cys Pro Asp Glu Ala Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly85 90 95Val Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr100 105 110Met Asn Gln Tyr Met Pro Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser115 120 125Pro Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys130 135 140Leu Asn Gly Gln Glu Leu Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro145 150 155 160Cys Gly Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly165 170 175Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr180 185 190Cys Asp Ala Gln Cys Pro Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn195 200 205Thr Ser His Gln Gly Phe Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly210 215 220Asn Ser Arg Ala Asn Ala Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala225 230 235 240Cys Asp Ser Ala Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys245 250 255Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr260 265 270Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu275 280 285Val Gly Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser290 295 300Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala305 310 315 320Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val325 330 335Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu340 345 350Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser355 360 365Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile370 375 380Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro385 390 395 400Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr405 410 415Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly420 425 430Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys435 440 445Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu450 455<210>8
<21l>232<212>PRT<213>Beta-葡聚糖酶EG III木霉屬的菌種<220>
<221>mat_肽<222>(1)..(232)<400>8Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr20 25 30Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys35 40 45Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala His Ala Asp Trp Gln Trp50 55 60Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln Ile Ala65 70 75 80Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro Thr Thr85 90 95Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val Ala Tyr100 105 110Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser Gly Asp115 120 125Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly Pro Ile130 135 140Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp Thr Leu145 150 155 160Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val Ala Gln165 170 175Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe Asn Tyr180 185 190Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val Leu Ser195 200 205Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu Asn Val210 215 220Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn225 230
權(quán)利要求
1.包括下列步驟的方法(a)提供包含水和粒狀淀粉的漿液；(b)在下列物質(zhì)存在下保持所述漿液以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)品i)包含糖結(jié)合模塊的酸性α-淀粉酶，和和/或ii)發(fā)酵生物，和，(c)任選地回收所述發(fā)酵產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)酵生物是酵母。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法，其中步驟b進(jìn)一步包含iii)木聚糖酶，iv)β-葡聚糖酶的存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中步驟b進(jìn)一步包含葡糖淀粉酶的存在，其優(yōu)選來自曲霉屬的菌種，并且更優(yōu)選來自黑曲霉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中將所述漿液在步驟b)之前，在低于起始糊化溫度0-30℃的溫度，例如在35℃至45℃、40℃至50℃或45℃至55℃溫育。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)品是燃料乙醇、飲用乙醇和/或工業(yè)乙醇，例如燃料乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵漿液包含至少7％、至少8％、至少9％、至少10％例如至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％例如至少16％的乙醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中的溫度是28℃-36℃，例如29℃-35℃，例如30℃-34℃，例如大約32℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述包含CBM的酸性α-淀粉酶是多肽，所述多肽與下組中的任何氨基酸序列具有至少50％的同源性SEQID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中包含CBM的酸性α-淀粉酶是包含氨基酸序列的α-淀粉酶，所述氨基酸序列與選自下組的任何序列具有至少70％，優(yōu)選至少75％、80％、85％或至少90％，例如至少95％、至少97％、至少98％，或至少99％的同源性SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中所述木聚糖酶源自曲霉屬的菌種的菌株，優(yōu)選源自棘孢曲霉的菌株，并且更優(yōu)選所述木聚糖酶具有SEQ IDNO4中所示的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述β-葡聚糖酶源自木霉屬的菌種的菌株，優(yōu)選源自T.reesei的菌株。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述酸性α-淀粉酶活性以50-500 AFAU/kg的DS的量存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述葡糖淀粉酶活性以20-200AGU/kg的DS的量存在。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其中所述酸性α-淀粉酶活性和葡糖淀粉酶活性的比例是0.35-5.00 AFAU/AGU。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中所述淀粉漿液具有5-60％DS粒狀淀粉，優(yōu)選10-50％DS粒狀淀粉，更優(yōu)選20-40％DS，特別是大約30％，例如至少31％，例如至少32％，例如至少33％，例如至少34％，例如至少35％，或甚至例如至少36％DS粒狀淀粉。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中步驟b過程中的乙醇含量達(dá)到至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％至少16％，至少17％(w/w)。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)過程中的pH在3.0-7.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選3.5至6.0，或更優(yōu)選4.0至5.0，例如4.3至4.6。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其中所述粒狀淀粉得自塊莖、根、莖、果實(shí)、種子、谷類和/或整谷粒。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，其中所述粒狀淀粉得自谷類，優(yōu)選得自小麥、大麥和/或黑麥。
21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法，其中所述粒狀淀粉得自玉米。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，其中所述粒狀淀粉得自整谷粒的干磨。
23.組合物，其包含i)含有CBM的酸性α-淀粉酶和ii)葡糖淀粉酶和/或iii)β-葡聚糖酶，和/或iv)木聚糖酶。
24，根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述含有CBM的酸性α-淀粉酶是雜合體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從粒狀淀粉產(chǎn)生乙醇產(chǎn)品的方法。
文檔編號(hào)C12N9/28GK101087887SQ200580044266
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者斯文·佩德森, 漢斯·S·奧爾森 申請(qǐng)人:諾維信公司