用芽孢桿菌屬細(xì)菌防治植物病害的方法和防治劑的制作方法

專利名稱：用芽孢桿菌屬細(xì)菌防治植物病害的方法和防治劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌性、真菌性或病毒性植物病害的防治方法及其防治劑或材料。
背景技術(shù)：
在蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物的農(nóng)業(yè)栽培中，種傳、上傳或氣傳或水傳植物病害的發(fā)展通常涉及高質(zhì)量作物的生產(chǎn)、穩(wěn)定的產(chǎn)量和獲利等諸多方面。尤其是當(dāng)面對易于發(fā)生植物病害的異常氣象條件時，商業(yè)化農(nóng)場將會受到毀滅性影響。
認(rèn)為這類可傳播病害的致病因子的主要病原體是絲狀真菌、細(xì)菌和病毒。為了實現(xiàn)正常栽培，防治所述病原體所致植物病害，這是必不可少的。
為了使農(nóng)產(chǎn)品有效抵御病害，化學(xué)技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，例如殺蟲劑(例如殺真菌劑、殺細(xì)菌劑或抗病毒藥)的應(yīng)用。近年來，合成有機(jī)殺蟲劑因其效果而廣泛使用，所述殺蟲劑已有效防治植物病害，導(dǎo)致顯著改善了農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)。然而，病害防治極大地依賴于殺蟲劑的使用，這對全球環(huán)境、社會和農(nóng)業(yè)不利，例如土壤中的殘留殺蟲劑、食品中的殘留殺蟲劑以及病原微生物抗藥性的增加。而且，殺蟲劑的過量使用對農(nóng)民的安全是個問題。
這些問題業(yè)已受到世界范圍的極大關(guān)注，作為回應(yīng)，正在嘗試各種各樣的措施。例如，蒙特利爾條約(Montreal Protocol)在2005年禁止使用土壤熏蒸劑，即甲基溴，除非在迫切需要時使用，因為它是導(dǎo)致臭氧層損耗的原因。
作為過度依賴殺蟲劑的一個替代方案，在世界范圍內(nèi)強烈需要建立與天然生態(tài)系統(tǒng)和諧的病蟲害綜合治理系統(tǒng)(IPM)。
利用細(xì)菌等微生物的能力來防治植物病害的方法，即涉及使用微生物殺蟲劑的病害防治方法，預(yù)期可作為解決以上難題的有效方法。
有關(guān)本申請的發(fā)明，例如以下現(xiàn)有技術(shù)文件記錄是可用的。美國專利第5,344,647號；美國專利第5,061,495號；日本公開特許公報第8-175919號；日本公開特許公報第2003-277210號；日本公開特許公報第2002-145712號；日本公開特許公報第9-124427號；日本公開特許公報第11-302120號；美國專利第5,935,571號；日本公開特許公報第7-267811號；Phae，C.G.，Shoda，M，Kita，N.，Nakano，M.和Ushiyama，K.，Ann.Phytopath.Soc.Japan，58，329-339，1992；MasaoYamada，Biseibutsu nouyaku-kankyou hozenkata nougyou wo mezasite(Microbial pesticides -in pursuit of environmental conservativeagriculture)，Zenkoku nouson kyouiku kyoukai，第328頁，2000；和Shunichi Iwata等(編著)，Shokubutsu boueki kouza-byougai-hen(Plantprotection course-disease volume，Japan Plant Protection Association，第281頁，1983。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于生物防治由植物病原細(xì)菌、真菌或病毒所致的植物病害的防治劑或材料，涉及使用所述防治劑或材料以防治植物病害的方法，還涉及其中所使用的細(xì)菌。
本發(fā)明包括以下發(fā)明。
(1)一種植物病害的防治劑或材料，所述防治劑或材料包含能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖的芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌。
(2)(1)的防治劑或材料，其中能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖的芽孢桿菌屬細(xì)菌是DAIJU-SIID2550菌株或其突變體。
DAIJU-SIID2550菌株于2003年11月20日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本茨城縣筑波市東1丁1番1中央第6，郵編305-8566)(International Patent OrganismDepositary of the National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566，Japan)，保藏號FERM BP-10114(由FERMP-19591菌株轉(zhuǎn)變而來，該菌株已于2003年11月20日進(jìn)行了國內(nèi)保藏)。該保藏物由本發(fā)明的發(fā)明人Daiju Yuki(3-10-5，SakaeNuza，Saitama，352-0014，Japan)于2003年11月20日進(jìn)行保藏，并于申請日期之前即2005年2月7日轉(zhuǎn)給本申請的申請人Itsuki Co.，Ltd.(3-12-5，Saiwai-cho，Asaka，Saitama，351-0015，Japan)。
(3)(1)或(2)的防治劑或材料，其中所述植物病原細(xì)菌是土壤桿菌屬(Agrobacterium)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短小桿菌屬(Curtobacteium)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)或黃單胞菌屬(Xanthomonas)細(xì)菌，并且所述植物病害是由它們引起的。
(4)(1)或(2)的防治劑或材料，其中所述植物病原性真菌是氣傳真菌或土傳真菌，并且所述植物病害是由它們引起的。
(5)(1)或(2)的防治劑或材料，其中所述植物病原性病毒是煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、辣椒輕型斑駁病毒(Pepper mildmottle virus，PMMoV)、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)、甜瓜枯斑病毒(Melon necrotic spot virus，MNSV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)或Kyuri綠斑駁花葉病毒(Kyuri green mottle mosaic virus，KGMMV)，并且所述植物病害是由它們引起的。
(6)一種防治植物病害的方法，所述方法包括將(1)-(5)的任一項的防治劑或材料施用于植物病原細(xì)菌、真菌或病毒的宿主植物。
(7)(6)的方法，其中所述植物屬于十字花科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、百合科(Liliaceae)、豆科(Legummosae)、菊科(Asteraceae)、藜科(Chenopodiaceae)、禾本科(Gramineae)、薔薇科(Rosaceae)、石竹科(Caryophvllaceae)、報春花科(Primulaceae)、蕓香科(Rutaceae)、葡萄科(Vitaceae)、獼猴桃科(Actinidiaceae)、柿樹科(Ebenaceae)、傘形科(Umbelliferae)、旋花科(Convolvulaceac)或天南星科(Araceae)。
(8)(6)或(7)的方法，其中所述防治劑或材料通過至少一個選自以下的處理施用于植物用所述細(xì)菌給植物種子包衣，將植物種子浸泡在含有所述細(xì)菌的懸液中，將所述細(xì)菌灌溉到植物栽培用土壤中，將所述細(xì)菌摻入到植物栽培用土壤中，將所述細(xì)菌噴灑在植物莖葉上，以及使所述細(xì)菌接觸植物損害。
(9)一種新的芽孢桿菌屬菌株，即DAIJU-SIID2550(保藏號FERM BP-10114)。
根據(jù)本發(fā)明，可以對植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖所致植物病害進(jìn)行生物防治。
本說明書包括日本專利申請第2004-55059號和第2004-216083號的說明書和/或附圖所公開的部分或全部內(nèi)容.所述文獻(xiàn)是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。
附圖簡述

圖1顯示BAL菌對野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris)增殖的抑制效果。
圖2顯示在人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的小白菜種子萌發(fā)時，野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的發(fā)病狀況。
圖3顯示在人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子附近野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的發(fā)病狀況，這些種子已經(jīng)用含BAL菌的防治劑處理過。
圖4顯示實施例8的實驗開始后9天的樣品外觀。
圖5顯示實施例8的實驗開始后9天的樣品外觀。
圖6顯示實施例9的實驗開始后26天的樣品外觀。
圖7A顯示殺細(xì)菌劑和殺蟲劑對BAL菌增殖的影響。
圖7B顯示殺細(xì)菌劑和殺蟲劑對BAL菌增殖的影響(續(xù)圖7A)。
圖8顯示通過BAL菌抑制潰瘍病菌增殖的效果。
圖9顯示通過BAL菌抑制萎蔫病菌增殖的效果。
圖10顯示通過BAL菌抑制軟腐病菌增殖的效果。
圖11顯示實施例14的實驗開始后1天的樣品外觀。
圖12A顯示實施例15的水稻秧苗猝倒病實驗開始后16天的樣品外觀。
圖12B顯示實施例15的水稻細(xì)菌粒腐病實驗開始后16天的樣品外觀。
圖13顯示實施例16的實驗開始后24小時的樣品外觀。括號中的放大倍數(shù)表明在萌發(fā)試驗時的最終稀釋因子。
圖14顯示實施例17的實驗開始后24小時的樣品外觀。
圖15顯示實施例19中BAL菌培養(yǎng)液對灰霉病的效果。
圖16顯示實施例20的實驗開始后20天的樣品外觀。
圖17顯示實施例21中BAL菌培養(yǎng)液對黑斑病的效果。
圖18顯示實施例22中BAL菌培養(yǎng)液對白銹病的效果。
圖19顯示實施例23的實驗開始后18天的樣品外觀。
圖20顯示實施例24的實驗開始后11天的樣品外觀。
圖21顯示實施例25中BAL菌培養(yǎng)液對TMV的效果。
圖22顯示實施例26中BAL菌培養(yǎng)液對甜瓜枯斑病的效果。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案本發(fā)明涉及防治植物病害的方法，所述方法包括將能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖的芽孢桿菌屬細(xì)菌施用于作為植物病原細(xì)菌、真菌或病毒宿主的植物。
本發(fā)明也涉及植物病害的防治劑或材料，所述防治劑或材料包含能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒的感染或增殖的芽孢桿菌屬細(xì)菌。
此外，本發(fā)明涉及能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖的芽孢桿菌屬細(xì)菌在制備用于細(xì)菌、真菌或病毒所致植物病害的防治劑或材料中的用途。
本發(fā)明提供用于生物防治植物病原細(xì)菌、真菌或病毒所致植物病害的方法及其防治劑和防治材料。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)出用芽孢桿菌屬細(xì)菌防治植物病害的若干方法(參見以上“背景技術(shù)”部分所述文件)；然而，這些方法與本發(fā)明所公開的發(fā)明都不相同。
本發(fā)明所防治的細(xì)菌性植物病害是任何由細(xì)菌病原體所致的植物病害。其實例包括由以下屬的細(xì)菌所致的植物病害土壤桿菌屬、棍狀桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、羅爾斯通氏菌屬、棒桿菌屬、短小桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、黃單胞菌屬、根瘤桿菌屬(Rhizobacter)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)。本發(fā)明的防治劑或材料對以下屬的細(xì)菌所致植物病害特別有用土壤桿菌屬、棍狀桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、羅爾斯通氏菌屬、棒桿菌屬、短小桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬或黃單胞菌屬。具體實例包括但不限于由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(在本說明書中稱為黑腐病細(xì)菌)感染十字花科植物所致黑腐病，由發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染甜瓜所致發(fā)根病，由根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染胡蘿卜所致根癌病，由唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)感染洋蔥所致鱗腐病(scale rot)，由密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)感染番茄所致細(xì)菌潰瘍病，由棒桿菌(Corynebacterium sp.)感染辣椒和甜椒所致細(xì)菌潰瘍病，由棒桿菌(Corynebacterium sp.)感染番茄所致細(xì)菌葉癭病，由萎蔫短小桿菌(Curtobacterium flaccumfaciens)感染洋蔥所致細(xì)菌潰瘍病，由胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwinia carotovora subsp.carotovora)感染蕓苔(Brassica campestris)、Brassica campestris L.var.amplexicaulis Tanaka et Ono、菜苔(Brassica campestris L.var.chinensis(L.)Ito)、蕪菁、花椰菜、甘藍(lán)、黃瓜、蘿卜、小白菜、洋蔥、辣椒、甜椒、番茄、茄子、韭(Allium tuberosum)、胡蘿卜、蒜(Allium sativum)、大蔥(Allium fistulosum)、大白菜(Chinese cabbage)、青花椰菜、甜瓜或萵苣所致軟腐病(例如細(xì)菌軟腐病和粘性軟腐病(slimy soft rot))，由菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)感染草莓所致細(xì)菌莖腐病，由菊歐文氏菌感染南瓜所致細(xì)菌腐爛病，由菊歐文氏菌感染茄子所致細(xì)菌莖腐病，由菊歐文氏菌感染大蔥所致細(xì)菌軟腐病，由大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)感染洋蔥所致細(xì)菌莖腐爛病(軟腐病)，由歐文氏菌(Erwinia sp.)感染蒜所致腐爛病，由菊苣假單胞菌(Pseudomonascichorii)感染秋葵所致細(xì)菌葉枯病，由菊苣假單胞菌感染茄子所致壞死性葉斑病(necrotic leaf spot)，由菊苣假單胞菌感染蒜所致腐爛病，由菊苣假單胞菌感染甜瓜和萵苣所致細(xì)菌腐爛病，由皺紋假單胞菌(Pseudomonas corrugata)感染番茄和茄子所致髓壞死病，由熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)感染番茄所致髓壞死病，由邊緣假單胞菌(Pseudomonas marginalis)感染大白菜(Brassica campestris var.pekinensis)所致細(xì)菌芽腐病，由邊緣假單胞菌邊緣致病變種(Pseudomonas marginalis pv.marginalis)感染草莓所致芽枯病，由邊緣假單胞菌邊緣致病變種感染甘藍(lán)、茼蒿(Chrysanthemum coronarium)、洋蔥、大蔥、大白菜、青花椰菜和萵苣所致細(xì)菌腐爛病(例如軟腐病和頭腐病(head rot))，由邊緣假單胞菌邊緣致病變種感染黃瓜所致邊緣枯萎病(marginal blight)，由邊緣假單胞菌邊緣致病變種感染蘿卜所致黑環(huán)病，由邊緣假單胞菌邊緣致病變種感染番茄所致細(xì)菌腐爛病，由邊緣假單胞菌邊緣致病變種感染蒜所致腐爛病，由假單胞菌(Pseudomonas sp.)感染草莓所致褐腐病，由假單胞菌(Pseudomonas sp.)感染番茄所致番茄黑斑病，由假單胞菌(Pseudomonas sp.)感染茄子所致細(xì)菌斑點病，由假單胞菌(Pseudomonas sp.)感染韭所致細(xì)菌基部鱗莖腐爛病(basal bulb rot)，由丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)感染洋蔥和大蔥所致細(xì)菌斑點病(細(xì)菌葉斑病)，由丁香假單胞菌黃瓜致病變種(Pseudomonas syingae pv.lachrymans)感染南瓜、黃瓜、苦瓜(Momordica charantia)和甜瓜所致細(xì)菌斑點病(例如角斑病和細(xì)菌斑點病)，由丁香假單胞菌斑生致病變種(Pseudomonas syringae pv.maculicola)感染油菜、Brassica campestris L.var.amplexicaulis Tanakaet Ono、菜苔、蕪菁、芥菜(Brassica juncea).Brassica juncea var.integlifolia、花椰菜、甘藍(lán)、Brassica rapa var.laciniifolia、蘿卜和大白菜所致細(xì)菌黑斑病(例如細(xì)菌葉斑病和細(xì)菌黑斑病)，由丁香假單胞菌菠菜致病變種(Pseudomonas syringae pv.spinaciae)感染菠菜所致細(xì)菌斑點病(細(xì)菌葉斑病)，由丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringae pv.tomato)感染番茄所致細(xì)菌葉斑病，由綠黃假單胞菌(Pseudomonas viridiflava)感染秋葵所致細(xì)菌葉枯病，由綠黃假單胞菌感染甘藍(lán)所致細(xì)菌腐爛病(軟腐病)，由綠黃假單胞菌感染黃瓜所致邊緣枯萎病，由綠黃假單胞菌感染番茄所致細(xì)菌黑斑病，由綠黃假單胞菌感染大白菜(Brassica campestris var.pekinesis)所致細(xì)菌芽腐病，由綠黃假單胞菌感染大白菜(Chinese cabbage)所致細(xì)菌褐條病，由綠黃假單胞菌感染萵苣所致細(xì)菌腐爛病，由茄羅爾斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)感染草莓、蕪菁、南瓜、黃瓜、茼蒿、蘿卜、辣椒、甜椒、番茄、茄子和苦瓜所致細(xì)菌萎蔫病，由胡蘿卜根瘤桿菌(Rhizobacter dauci)感染胡蘿卜所致細(xì)菌癭瘤病，由野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)感染草莓所致細(xì)菌角斑病，由野油菜黃單胞菌感染茼蒿所致黑腐病，由野油菜黃單胞菌感染青花椰菜所致黑腐病，由Xanthomonas campestris pv.allii感染大蔥所致細(xì)菌葉枯病，由野油菜黃單胞菌胡蘿卜致病變種(Xanthomonas campestris pv.carotae)感染胡蘿卜所致細(xì)菌斑點病(細(xì)菌性疫病)，由野油菜黃單胞菌黃瓜致病變種(Xanthomonas campestris pv.cucurbitae)感染南瓜、黃瓜和甜瓜所致壞死性葉斑病(例如細(xì)菌斑點病、細(xì)菌褐斑病和細(xì)菌葉斑病)，由野油菜黃單胞菌蘿卜致病變種(Xanthomonas campestris pv.raphani)感染蕪菁、甘藍(lán)、蘿卜、小白菜和大白菜(Chinese cabbage)所致細(xì)菌斑點病，由野油菜黃單胞菌辣椒致病變種(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)感染辣椒、甜椒和番茄所致細(xì)菌斑點病，由野油菜黃單胞菌葡萄蔓致病變種(Xanthomonas campestris pv.vitians)感染萵苣所致細(xì)菌斑點病，由草莓黃單胞菌(Xanthomonas fragariae)感染草莓所致細(xì)菌角斑病，由丁香假單胞菌水稻致病變種(Pseudomonas syringae pv.oryzae)感染水稻所致暈疫病，由燕麥?zhǔn)乘峋帑溩儊?Acidovoraxavenae subsp.avenae)感染水稻所致細(xì)菌褐條病，由菊歐文氏菌玉米致病變種(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)感染水稻所致細(xì)菌根腐病，由水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas orvzae pv.oryzae)感染水稻所致細(xì)菌葉枯病，由菠蘿歐文氏菌(Erwinia ananas)感染水稻所致細(xì)菌內(nèi)稃褐變病(palea browning)，由植物伯克霍爾德氏菌(Burkholderia plantarii)感染水稻所致細(xì)菌苗枯病，由莢殼伯克霍爾德氏菌(Burkholderia glumae)感染水稻所致細(xì)菌粒腐病，由褐鞘假單胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)感染水稻所致鞘褐腐病，由丁香假單胞菌日本致病變種(Pseudomonas syringae pv.japonica)感染小麥所致細(xì)菌黑節(jié)病，由茄羅爾斯通氏菌感染馬鈴薯所致細(xì)菌性萎蔫病，由菊歐文氏菌菊致病變種(Erwinia chrysanthemi pv.chrysanthemi)感染馬鈴薯所致細(xì)菌性莖腐病，由胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑腐亞種(Erwiniacarotovora subsp.Atroseptica)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種和菊歐文氏菌感染馬鈴薯所致黑腳病，由胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種感染馬鈴薯所致細(xì)菌性軟腐病，由棍狀桿菌(Clavibacter sp.)感染馬鈴薯所致粘腐病(slimy rot)，由密執(zhí)安棍狀桿菌壞腐亞種(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)感染馬鈴薯所致環(huán)腐病，由野油菜黃單胞菌大豆致病變種(Xanthomonas campestris pv.glycines)感染大豆所致細(xì)菌斑疹病，由丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.glycinea)感染大豆所致細(xì)菌斑點病(細(xì)菌性斑枯病)，由燕麥?zhǔn)乘峋帑溩兎N感染玉米所致細(xì)菌褐條病，由須芒草伯克霍爾德氏菌(Burkholderia andropogonis)感染玉米所致細(xì)菌條斑病，以及由菊歐文氏菌玉米致病變種(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)和邊緣假單胞菌感染玉米所致細(xì)菌莖腐病。
已知由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種所致的黑腐病是一種影響十字花科植物生產(chǎn)的毀滅性病害。作為一種危險的病害，黑腐病的防治在包括已經(jīng)發(fā)生過黑腐病的國家和尚未發(fā)生過黑腐病的國家以及日本在內(nèi)的全世界受到極大關(guān)注。迄今為止，實際上還沒有批準(zhǔn)能抵抗黑腐病的植物品種，也沒有開發(fā)出有效殺蟲劑。根據(jù)本發(fā)明，可以有效防治例如以下十字花科植物的黑腐病甘藍(lán)、大白菜、蘿卜、青花椰菜、花椰菜、蕪菁、小白菜、Brassica chinensis komatsuna、菜苔、歐洲油菜(Brassica napus)、Shirakukina、Brassica campestris L.var.amplexicaulis Tanaka et Ono、油菜、報子甘藍(lán)(Brussels sprouts)、球莖甘藍(lán)(kohlrabi)、芥藍(lán)(Chinese kale)、Brassica chinensis var.rosularis、芥菜(Brassica juncea)、油菜和羽衣甘藍(lán)(cabbage var.acephala)。
水稻的細(xì)菌粒腐病和水稻的細(xì)菌苗枯病是來自稻殼的種傳病害，在濕地水稻栽培中必須防治它們，它們是重要的水稻細(xì)菌性病害，種子的消毒尤其必不可少。為此，化學(xué)防治技術(shù)目前通常投入實際使用。然而，用殺蟲劑對稻殼進(jìn)行消毒，涉及處理殘留殺蟲劑等的問題?！癕omigenki”(Nissan Chemical Industries，Ltd.)是唯一市售的用于消毒水稻種子的生物殺蟲劑。根據(jù)本發(fā)明，可以有效防治濕地水稻種傳細(xì)菌性病害。
本發(fā)明可防治的真菌病害可以是任何由真菌病原體所致的植物病害。其實例包括氣傳真菌病害和土傳真菌病害。在本發(fā)明中，氣傳真菌病害包括水傳病害。氣傳真菌的實例包括但不限于白粉菌(白粉菌屬(Erysiphe)、單絲殼屬(Sphaerotheca)和內(nèi)絲白粉菌屬(Leveillula))、葡萄孢屬(Botrytis)、Fulvia fulva，棒孢屬(Corynespora)、白銹屬(Albugo)、霜霉(假霜霉屬(Pseudoperonospora)、霜霉屬(Peronospora)、單軸霉屬(Plasmopara)和盤梗霉屬(Bremia))、瘟病真菌(Pyricularia grisea)、宮部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)，尾孢屬(Cercospora)以及相關(guān)屬(尾孢屬、小尾孢屬(Cercosporella)、假尾孢屬(Pseudocercospora)、Paracercospora和菌絨孢屬(Mycovellosiella)，炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthrasis)(刺盤孢屬(Colletotrichum)和小叢殼屬(Glomerella))，銹病真菌(柄銹菌屬(Puccinia))，黑斑病真菌(鏈格孢屬(Alternaria))和鏈格孢屬。土傳真菌的實例包括但不限于根腫病真菌(蕓苔根腫菌(Plasmodiophorabrassicae))、疫霉屬(Phytophthora)、鐮孢屬(Fusarium)、輪枝孢屬(Verticillium)、腐霉屬(Pythium)和絲核菌屬(Rhizoctonia)。
氣傳真菌病害具體實例包括但不限于由白粉菌感染番茄、茄子、蘿卜、甘藍(lán)、蕪菁、芥菜、大白菜、Brassica chinensis komatsuna、胡蘿卜、黃瓜、草莓、辣椒、甜瓜、西瓜、南瓜和菊花所致白粉?。挥苫移咸焰?Botrytis cinerea)感染葫蘆科、茄科、萵苣、豆類和草莓所致灰霉??；由山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)感染黃瓜所致棒孢菌葉斑??；由大孢白銹(Albugo macrospora)感染多種十字花科蔬菜(例如大白菜、花椰菜、蕪菁、蘿卜和Brassica chinensis komatsuna)所致白銹?。挥伤垢腥竞J、十字花科蔬菜、大蔥、洋蔥、辣根、茼蒿、鴨兒芹(Cryptotaenia japonica)、菠菜和萵苣所致霜霉病；由瘟病真菌感染水稻所致稻瘟?。挥擅何奂傥叉?Pseudocercospora fuligena)感染番茄所致番茄葉霉病(尾孢葉霉病)；由Paracercospora egenula感染茄子所致茄褐斑病(葉斑病)；由辣椒尾孢(Cercospora capsici)感染甜椒和辣椒所致植物斑點病(蛙眼葉斑病)；由瓜類尾孢(Cercosporaciirullina)感染黃瓜、甜瓜、西瓜和絲瓜所致植物斑點病(葉斑病)；由蕓苔小尾孢(Cercosporella brassicae)感染大白菜和蕪菁所致大白菜和蕪菁上的白斑；由灰毛茄菌絨孢(Mycovellosiella nattrassii)感染茄子所致茄葉霉??；由炭疽芽孢桿菌感染大白菜、蕪菁、蘿卜、Brassicachinensis komatsuna、甜菜(Beta vulgaris)、小白菜、蕓苔、矮菜豆、辣椒、甜椒、葫蘆、嫩莢菜豆、大蔥、洋蔥、韭、菠菜和草莓所致炭疽病；由銹病真菌感染大蔥、洋蔥、薤(Allium bakeri)、蒜和韭所致銹??；由銹病真菌感染菊花所致菊花銹病；由黑斑病真菌感染十字花科蔬菜和胡蘿卜所致黑斑病(例如鏈格孢葉斑病和鏈格孢黑腐病)；由蕓苔生鏈格孢(Alternaria brassicicola)感染甘藍(lán)所致鏈格孢菌黑斑病(sooty spot)；由胡蘿卜鏈格孢(Alternaria dauci)感染胡蘿卜所致葉枯??；由番茄鏈格孢(Alternaria solani)感染馬鈴薯所致早疫病；由番茄鏈格孢感染番茄所致番茄早疫??；由匍萄孢屬真菌感染洋蔥和韭所致葉枯??；和由蔥腐葡萄孢(Botrytis allii)感染洋蔥所致灰霉頸腐病。氣傳真菌病害，例如白銹病、黑斑病、炭疽病和霜霉病，已知對十字花科葉菜類和根菜類的生產(chǎn)具有毀滅性影響，這類嚴(yán)重病害的防治一直受到包括已經(jīng)發(fā)生過這類病害的國家和尚未發(fā)生過這類病害的國家以及日本在內(nèi)的全世界的極大關(guān)注。迄今為止，實際上尚沒有批準(zhǔn)能抵抗白銹病、黑斑病、炭疽病和霜霉病的植物品種。有一些具有足夠防治效果的殺蟲劑(例如甲霜靈可濕性粉劑、異菌脲可濕性粉劑、TPN可濕性粉劑和甲基托布津可濕性粉劑)。因為這些殺蟲劑直接施用于人類消費的葉菜類和根菜類，所以其安全使用標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格，并且使用這些殺蟲劑在病害防治期間可能會產(chǎn)生不利影響。本發(fā)明能夠?qū)缫韵轮参锏倪@類病害進(jìn)行生物防治蕪菁、小白菜、Brassica chinensis komatsuna、菜苔、蘿卜、芥藍(lán)、Brassica chinensisvar.rosularis、花椰菜、青花椰菜、大白菜、甘藍(lán)、蕓苔和芥菜(參見實施例21和22)。
土傳真菌病害的具體實例包括但不限于由蕓苔根腫菌感染十字花科作物所致根腫?。灰呙咕T導(dǎo)的病害，例如由水稻、蘋果、百合、草莓、柑橘、梨、甜椒、辣椒、南瓜、芋、馬鈴薯、番茄、茄子、黃瓜、西瓜、甜瓜、葫蘆、大蔥、香石竹(Dianthus caryophyllus)、柑橘和菠菜感染所致枯萎病，由番茄和黃瓜感染所致灰疫病，由茄子、番茄、西瓜和柑橘感染所致褐腐病，由草莓感染所致根腐病，由水稻、大麥、小麥、燕麥、玉米和剪股穎感染所致黃矮病，由玫瑰感染所致莖腐病，由水稻、大豆和茄子感染所致棉疫病(cottonblight)，由柑橘感染所致根腐病，由洋蔥、大蔥、四季蔥(Alliumfistulosum caespitosum)、薤、蒜、韭和野蔥(Allium grayi)感染所致白疫病(whife blight)，由赤豆(Phaseolus angularis)和大豆感染所致莖枯病，由茄子感染所致苗葉枯病，以及由番茄和茄子感染所致根腐??；腐霉菌誘導(dǎo)的病害，例如由矮菜豆、南瓜和黃瓜感染所致棉疫病(cottony blight)，由水稻、茄子、番茄、菠菜、南瓜、黃瓜、矮菜豆、豌豆、秋葵和甜瓜感染所致秧苗猝倒病，由胡蘿卜感染所致梗腐病(cavity spot)，由剪股穎感染所致腐霉疫病，由大豆、黃瓜、甜瓜和菠菜感染所致猝倒病，由小麥、大麥、燕麥、黑麥、黑麥草和羊茅感染所致褐色雪腐病，由草莓、黃瓜、芋和番茄感染所致根腐病，由甘薯感染所致白腐病，以及由水稻感染所致苗腐?。唤z核菌菌誘導(dǎo)的病害，例如由水稻感染所致紅頸腐病(red crown rot)，由水稻、大麥、粟(Setaria italica)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)和粟感染所致鞘枯病，由大豆、赤豆、矮菜豆、豌豆、馬鈴薯、鴨茅、早熟禾、羊茅、黑麥草、剪股穎和高粱感染所致葉腐病，由草莓感染所致芽枯病，由蠶豆和香石竹感染所致莖腐病，由水稻、番茄、茄子、甜椒、辣椒、黃瓜、甜瓜、甜瓜(Cucumis melo)、葫蘆(Lagenaria siceraria)、甘藍(lán)、花椰菜、青花椰菜、Brassica chinensis komatsuna、洋蔥、大蔥、秋葵和仙客來感染所致秧苗猝倒病，由菠菜、大麥、小麥和甘藍(lán)感染所致苗枯病，由萵苣感染所致根萎病(foot blight)，由馬鈴薯和牛蒡感染所致黑痣病，由蘿卜和胡蘿卜感染所致根腐病，由大白菜(Brassica campestris var.pekinensis)感染所致底腐病，由胡蘿卜感染所致柴根腐病，以及由菊花感染所致猝倒病；輪枝孢誘導(dǎo)的病害，例如由草莓、食用土當(dāng)歸(Aralia cordata)和大豆感染所致萎蔫病，由茄子、辣椒(甜椒)、番茄、秋葵、黃瓜、蜂斗菜(Petasites japonica)、甜瓜、菊花和玫瑰感染所致輪枝孢萎蔫病，由甘藍(lán)和萵苣感染所致輪枝孢萎蔫病，由蘿卜感染所致輪枝孢菌黑斑病，以及由大白菜感染所致黃疸(icterus)；以及鐮孢誘導(dǎo)的病害，例如由茄子感染所致鐮孢萎蔫病，由黃瓜、葫蘆、絲瓜、甜瓜和西瓜感染所致鐮孢萎蔫病，由甘薯感染所致莖腐病，由甘藍(lán)、草莓、蘿卜、蕪菁、Brassica chinensiskomatsuna和食用土當(dāng)歸感染所致黃萎病，由萵苣和矮菜豆感染所致根腐病，由薤、洋蔥、蒜、韭、芋和胡蘿卜感染所致莖腐病，由鴨兒芹感染所致苗枯病，由牛蒡、大蔥、番茄、菠菜、香石竹、仙客來和赤豆感染所致萎蔫病，由蘆筍和香石竹感染所致猝倒病，由蓮感染所致細(xì)菌性腐爛病，由甜瓜和薯蕷感染所致褐腐病，由番茄和大蔥感染所致鐮孢冠根腐病，由水稻感染所致苗腐病，和由小麥感染所致粉色雪腐病。由例如鐮孢屬、輪枝孢屬或疫霉屬真菌所致的土傳真菌病害難以控制，而且這些病害對蔬菜栽培具有毀滅性影響。為了處理所述病害，已經(jīng)進(jìn)行了培育抗性品種、用化學(xué)殺蟲劑消毒土壤、對病害進(jìn)行預(yù)測和其它工作。例如，已經(jīng)進(jìn)行了茄科(例如番茄、茄子、甜椒和青椒)和葫蘆科(例如黃瓜、西瓜和甜瓜)抗性品種或砧木的栽培，用化學(xué)殺蟲劑(例如氯化苦、棉隆和甲基溴)消毒土壤或檢驗土壤病原體，以便防治病害。十字花科蔬菜(例如蕪菁、小白菜、Brassica chinensis komatsuna、大白菜、甘藍(lán)或蘿卜)的收獲周期比茄科或葫蘆科蔬菜要短。因此，每年的連續(xù)種植頻率非常高。例如，Brassica chinensis komatsuna、小白菜或蕪菁的連續(xù)種植次數(shù)為每年5-6次。因此，土傳病害所致的損害是毀滅性的。在每個種植季節(jié)采用本發(fā)明的防治劑或材料，能夠預(yù)防土壤中難以防治的病原體的增殖或傳播并減少病害的發(fā)展(參見實施例23和24)。
本發(fā)明所防治的病毒性植物病害可以是任何由病毒性病原體所致的植物病害。其實例包括但不限于以下病毒所致的植物病害煙草花葉病毒(TMV)、辣椒輕型斑駁病毒(PMMoV)、番茄花葉病毒(ToMV)、甜瓜枯斑病毒(MNSV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)或Kyuri綠斑駁花葉病毒(KGMMV)。
病毒性植物病害的具體實例包括但不限于由TMV所致的煙草花葉病，由PMMoV、ToMV或TMV所致甜椒花葉病，由MNSV所致甜瓜枯斑病，由CGMMV所致黃瓜綠斑駁花葉病，由CGMMV所致的甜瓜綠斑駁花葉病和由KGMMV所致kyuri綠斑駁花葉病毒病。
TMV、KGMMV、CGMMV和MNSV所致的病毒性病害表現(xiàn)出比其它病毒所致病害更強效的接觸感染性、汁液傳播性、種子傳播性和土壤傳播性。因此，這類重要病毒性病害的防治已經(jīng)受到全世界的極大關(guān)注，一直在培育對這類病害具有抗性的植物品種或砧木，而且所述栽培產(chǎn)物已經(jīng)投入實際應(yīng)用中。在某些情況下，市場或消費者的需求超過了栽培能力，有效抗性品種或砧木可能不會使用。因此，化學(xué)防治技術(shù)特別用于預(yù)防汁液傳播、種子傳播和土壤傳播。例如，已經(jīng)采用Lentemin水溶性粉劑預(yù)防汁液傳播，用磷酸三鈉預(yù)防種子傳播和汁液傳播，或者用甲基溴預(yù)防土壤傳播(參見Iwata等，同上)。因為這些防治技術(shù)是通過化學(xué)處理來進(jìn)行的，所以濫用會導(dǎo)致令人不滿意的結(jié)果，作物受損害或人類受害。此外，甲基溴(甲基溴熏蒸劑)在日本已經(jīng)廣泛使用，以防治病毒性病害的土壤傳播。根據(jù)蒙特利爾條約在2005年禁止使用該熏蒸劑，因為它與臭氧層損耗有關(guān)。目前，正在廣泛搜尋它的替代品。根據(jù)本發(fā)明，可以用生物方法有效防治種傳病毒性病害和土傳病毒性病害(參見實施例25和26)。
可用于本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌并無具體限制，只要它們能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒的感染或增殖。其實例包括解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。特別優(yōu)選DAIJU-SIID2550(保藏號FERM BP-10114)，該菌株保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心。該菌株經(jīng)推測與解淀粉芽孢桿菌有親緣關(guān)系，因此在下文中縮寫為“BAL菌”。優(yōu)選含有BAL菌的植物病害防治劑或材料，因為它能夠穩(wěn)定地定植于植物或土壤中，有效維持植物病害防治活性，并且即使所述防治劑或材料暴露給介于40℃-100℃的高溫時也能保持病害防治活性。在本發(fā)明中，可以使用經(jīng)誘變產(chǎn)生的BAL菌突變體?？梢杂萌魏魏线m誘變劑進(jìn)行誘變。本文所用的術(shù)語“誘變劑”應(yīng)按其通常含義來理解。例如，誘變劑不僅包括具有誘變作用的藥物，而且包括產(chǎn)生誘變效果的處理，例如UV的應(yīng)用。合適誘變劑的實例包括核苷酸堿基類似物，例如甲磺酸乙酯、UV的應(yīng)用、N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍和溴尿嘧啶以及吖啶類。也可使用任何其它有效誘變劑。
上述BAL菌可以按照例如以下方式來分離。對食用蘑菇培養(yǎng)殘余物進(jìn)行蒸汽滅菌(80℃，30分鐘)，殘余物加入生理鹽水進(jìn)行稀釋，重量比例為1∶9(殘余物∶生理鹽水)，用振幅10cm的往復(fù)振蕩器振搖稀釋物達(dá)15分鐘。然后，所得產(chǎn)物于500rpm低速離心5分鐘，得到上清液?；蛘撸卯a(chǎn)物用Toyo Roshi No.2進(jìn)行過濾，得到濾液。隨后，上清液或濾液用含有0.05％瓊脂的蒸餾水進(jìn)行系列稀釋(″Saikingaku jisshu teian(Proposa1 regarding bacteriological laboratorytraining)，″the Alumni Association of the Institute of Infeectious Disease(編著))。制備1×101-8倍稀釋液來進(jìn)行系列稀釋，將各100μl稀釋液加入到9cm培養(yǎng)皿中的YPA培養(yǎng)基(一種含有蛋白胨、酵母和鹽的培養(yǎng)基；參見″Shokubutsu byougensei biseibutsu kenkyu-hou(Study ofplant pathogenic microorganisms)，idenshi sousa wo fukumu kiso to ouyo(Basics and applications including genetic engineering)，″SatoshiWakimoto(編著))中，在25℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48-72小時，然后分別對生長的細(xì)菌取樣。取樣的細(xì)菌再在YPA斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。為了證實該細(xì)菌未污染無關(guān)細(xì)菌，對傳代培養(yǎng)的細(xì)菌再進(jìn)行系列稀釋，以獲得單菌落。從由此分離的純的細(xì)菌單菌落中，通過在YPA平板上拮抗培養(yǎng)各單菌落細(xì)菌和蕪菁黃病毒(turnip yellows viruse)(羽扇豆尖鐮孢(Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans)，一種用于證實針對野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的抗微生物活性的簡單標(biāo)記)，并根據(jù)所形成的抑制帶的強度，選擇具有最強抑制作用的細(xì)菌。
由此選擇的細(xì)菌具有如下特性革蘭氏染色陽性；內(nèi)生孢子有；形態(tài)桿狀；G+C(DNA)含量(mol％)43.5-44.9(該值比枯草芽孢桿菌高，枯草芽孢桿菌為42-43)；最適生長溫度25℃-30℃；生物安全水平1(它不會引起人類疾病，也不會引起植物或動物的嚴(yán)重病害)。
使用長度約1600bp的16S rDNA核苷酸序列(16S rRNA基因)(參見以下細(xì)節(jié))推測該細(xì)菌的分類群。結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的細(xì)菌是芽孢桿菌屬的新菌株。該目的細(xì)菌于2003年11月20日作為DAIJU-SIID2550菌株保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(保藏號FERM BP-10114)。
可通過往復(fù)振蕩培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)或用培養(yǎng)槽培養(yǎng)等液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)等常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)可用于本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌。可用于本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)基并無具體限制，只要能讓細(xì)菌有效達(dá)到對數(shù)生長期即可。采用優(yōu)選培養(yǎng)基，在25℃-30℃，在48-96小時內(nèi)可達(dá)到最大收率。采用更優(yōu)選培養(yǎng)基，在25℃，在48小時內(nèi)可達(dá)到最大收率?？梢允褂冒韵鲁煞值暮铣苫蛱烊慌囵B(yǎng)基例如作為碳源，葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、紅糖塊、麥麩或米糠等糖類；作為氮源，銨鹽(例如硫酸銨、氯化銨或硝酸銨)和硝酸鹽等無機(jī)氮源，或有機(jī)氮源，例如酵母提取物、玉米浸膏、肉浸膏、小麥胚芽、聚胨、蔗渣、啤酒糟、大豆粉、米糠或魚粉；作為無機(jī)鹽，含磷、鉀、錳、鎂或鐵的鹽，例如磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳或硫酸亞鐵。當(dāng)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)時，可按需要加入消泡劑等添加劑。因為芽孢桿菌屬細(xì)菌是需氧菌，所以優(yōu)選在需氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)，例如通氣攪拌培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)。優(yōu)選在10℃-50℃、更優(yōu)選在15℃-40℃，優(yōu)選pH水平在5-9、更優(yōu)選在6-8進(jìn)行培養(yǎng)。如實施例5所述，優(yōu)選使用含有豆腐渣、麥麩和米糠的混合培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能滿足上述要求。因為這些物質(zhì)是工業(yè)廢棄物的形式，從有效利用工業(yè)廢棄物的觀點來看，優(yōu)選使用含有豆腐渣、麥麩和米糠的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的植物病害防治技術(shù)，可以使用含有芽孢桿菌屬細(xì)菌的上述培養(yǎng)液，而無需進(jìn)行任何處理。為了提高病害防治效果，可以對培養(yǎng)液進(jìn)行膜分離、離心、過濾分離或其它技術(shù)，以獲得具有更高濃度的溶液，可優(yōu)選使用所得的濃縮物。
在本發(fā)明中，可以使用含有芽孢桿菌屬細(xì)菌的上述培養(yǎng)液的脫水產(chǎn)物。而且，可以將含有芽孢桿菌屬細(xì)菌的上述培養(yǎng)液離心，將所得上清液脫水，再使用其產(chǎn)品。此外，含有芽孢桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)液離心得到的沉淀細(xì)菌可以用水洗滌并脫水，可以使用其脫水產(chǎn)物(脫水產(chǎn)物中通常約50％-100％(重量)為細(xì)菌)。讓含芽孢桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)液吸附到多孔吸附材料(例如粉狀活性炭、硅藻土或滑石粉)上，將吸附材料脫水，也可使用所得產(chǎn)物(其中通常包含1×108-109cfu/g細(xì)菌)。在各種情況下，可以通過凍干或減壓干燥等常規(guī)技術(shù)進(jìn)行脫水。脫水產(chǎn)物還可在脫水之后通過球磨等方法磨碎。以下介紹用BAL菌制備脫水產(chǎn)物的方法的具體實例。向裝有100ml AG培養(yǎng)基(1％葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、1％聚胨(NihonPharmaceutical Co.，Ltd.)、0.1％KH2PO4(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和0.05％MgSO4·7H2O(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，pH7.00，高壓滅菌15分鐘)的300ml三角燒瓶中，加入一鉑環(huán)量的BAL菌斜面培養(yǎng)物，在25℃振蕩培養(yǎng)24小時(120rpm)。隨后，將所得培養(yǎng)物(100μl)加入到100ml AG培養(yǎng)基中，在需氧條件下，在25℃培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)液離心，使培養(yǎng)物沉淀與培養(yǎng)物上清液分離，回收上清液，沉淀物用水洗滌，得到細(xì)菌?；蛘撸渭釉撆囵B(yǎng)物，讓其吸附到多孔吸附材料上，以得到細(xì)菌，所述吸附材料例如粉狀活性炭(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、硅藻土(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)或滑石粉(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，這些材料填充在直徑1.8cm、長10-15cm的玻璃管或透明塑料管中。由此得到的培養(yǎng)上清液、經(jīng)洗滌的細(xì)菌或被吸附的細(xì)菌都通過凍干或減壓干燥而脫水，再用球磨磨碎。因此可得到含芽孢桿菌屬細(xì)菌的脫水產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，芽孢桿菌屬細(xì)菌可以培養(yǎng)液、濃縮物或脫水產(chǎn)物的形式單獨使用。芽孢桿菌屬細(xì)菌可任選與其它任意組分混合在一起，從而以類似于通常的微生物制劑形式(例如粉劑、可濕性粉劑、乳劑、溶液劑、可流動劑(flowable agent)或涂擦劑)制備。擬與芽孢桿菌屬細(xì)菌混合的其它任意組分的實例包括固體賦形劑和輔助劑。固體賦形劑的實例包括例如以下有機(jī)物的粉末皂土、硅藻土、滑石粉化合物、珍珠巖、蛭石、羧甲基纖維素鈉(CMC)、啤酒糟、蔗渣、豆腐渣、麥麩、殼多糖、米糠和小麥面粉。輔助劑的實例包括固定劑和增稠劑，例如明膠、阿拉伯膠、糖類和吉蘭糖膠。啤酒糟、蔗渣、豆腐渣、麥麩和米糠都是工業(yè)廢棄物形式，因此，從有效利用工業(yè)廢棄物的觀點來看，優(yōu)選在本發(fā)明中使用它們。以下詳細(xì)介紹包含含芽孢桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)液以及豆腐渣等工業(yè)廢棄物的本發(fā)明的防治劑或材料的實例。向裝有100ml AG培養(yǎng)基(1％葡萄糖(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)、1％聚胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、0.1％KH2PO4(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和0.05％MgSO4·7H2O(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，pH 7.00，高壓滅菌15分鐘)的300ml三角燒瓶中，加入一鉑環(huán)量的BAL菌斜面培養(yǎng)物，在25℃往復(fù)振蕩培養(yǎng)(120rpm)后，再將BAL菌濃度調(diào)整到1×107cfu/ml。分別將1,300g豆腐渣、600g麥麩和100g米糠混合在一起(在下文，該混合物稱為“基本生長培養(yǎng)基”)。將上述培養(yǎng)液(1ml)加入到100ml基本生長培養(yǎng)基中，在暗處靜置培養(yǎng)72-120小時，每天充分?jǐn)嚢枰淮?。靜置培養(yǎng)后，將培養(yǎng)產(chǎn)物脫水，得到本發(fā)明的防治劑或材料。由此獲得的防治劑或材料中BAL菌的含量約為4×109- 10cfu/g。
如上所述，從食用蘑菇培養(yǎng)殘余物中分離出BAL菌。因此，含有BAL菌的食用蘑菇培養(yǎng)殘余物也可用作本發(fā)明的防治劑或材料。食用蘑菇培養(yǎng)殘余物可按需要脫水并磨碎。當(dāng)食用蘑菇培養(yǎng)殘余物或其脫水產(chǎn)物中所述細(xì)菌濃度低時，可按需要向其中加入BAL菌培養(yǎng)液、濃縮物或脫水產(chǎn)物。在這種情況下，優(yōu)選加入所述物質(zhì)，使得殘余物中的最終BAL菌濃度為1×109-10cfu/ml以上。
在工業(yè)廢棄物中繁殖的BAL菌也可用作本發(fā)明的防治劑或材料。這類防治劑或材料的實例包括在以下物質(zhì)中繁殖的BAL菌麥麩、稻草、麥秸、玉米秸或用過的菇床(蘑菇培養(yǎng)殘余物，例如食用蘑菇培養(yǎng)殘余物)。從有效利用工業(yè)廢棄物的觀點來看，優(yōu)選本發(fā)明的這一實施方案。在由此獲得的防治劑或材料中BAL菌濃度通常為1×107-8cfu/g，盡管該濃度因所摻入的材料不同而異。在可用的工業(yè)廢棄物中的CN比率，在稻草中為70％，在麥秸中為70％-90％，而在玉米秸中為80％-90％。
以下介紹本發(fā)明的上述實施方案的具體實例。將等量的麥麩、麥秸(切成5-10cm)和水混合并攪拌，加入米糠(氮含量1.7％-2.0％)，每100kg混合物中米糠含量為5-10kg，優(yōu)選5-6kg。按照與制作堆肥相同的方式，在室內(nèi)堆放該混合物(因為室內(nèi)不下雨)。發(fā)酵產(chǎn)熱6-7天后，將培養(yǎng)在AG培養(yǎng)基上的500ml BAL菌液(通常含1×107-109cfu/ml細(xì)菌)均勻分散并攪拌溶液，接著進(jìn)一步沉淀。以后，每4-6天、優(yōu)選每4或5天，翻動5-6次。一旦發(fā)酵完成，將發(fā)酵產(chǎn)物脫水，得到含BAL菌的防治材料。制成的防治材料按照所摻入的材料不同而呈現(xiàn)出不同的肥料組分和分析特征值。一般而言，pH為7.0-7.5，水分含量為35％-40％，N含量為2.5％-3.0％，P2O含量為3.5％-4.0％，K2O含量為2.0％-2.5％，CaO含量為1.0％，MgO含量為1.0％-1.5％，有機(jī)物含量為50％-60％，C/N比為07-1.3。當(dāng)使用本發(fā)明的防治材料時，也可以同時使用簡單的曬太陽的方法。(使用太陽能時，地表覆蓋透明地膜，從而在白天將地面下15cm處的內(nèi)部溫度調(diào)節(jié)至30℃-40℃，地表溫度調(diào)節(jié)至35℃-40℃，在土壤水含量70％-80％的情況下處理7-10天。)本發(fā)明的防治材料對于抑制土傳細(xì)菌、真菌或病毒對宿主侵襲或感染來說特別有效。因為本發(fā)明的防治材料可有效防治土壤中的土傳病毒(參見實施例25)，所以它是甲基溴土壤熏蒸劑的特別有用的替代品。
根據(jù)不同情況，例如擬防治的植物病害類型、植物病害的發(fā)展情況，擬處理的植物品種或芽孢桿菌屬細(xì)菌的形式，適當(dāng)選擇將芽孢桿菌屬細(xì)菌施用于植物的方法。例如，可通過例如以下的不同技術(shù)來施用地上施用、戶內(nèi)施用、摻入土壤中、灌溉土壤或表面處理(例如拌種或種子包衣)。因此，本發(fā)明的防治劑或材料可用于防治種子傳播、土壤傳播或者空氣或水傳播(通過風(fēng)力或水來感染)。(防治細(xì)菌植物病害的技術(shù)通?？纱致苑譃檫@3類)。更具體地講，優(yōu)選通過至少一種選自以下的技術(shù)來施用用不同形式的芽孢桿菌屬細(xì)菌給植物種子包衣，用所述細(xì)菌灌溉植物栽培用土壤，將其摻入到植物栽培用土壤中，將其施用于植物莖葉，以及使其與植物損害部分接觸?？赏ㄟ^例如以下方式，用芽孢桿菌屬細(xì)菌給植物種子包衣用芽孢桿菌屬菌于含有成膜劑(例如吉蘭糖膠、瓊脂或羧甲基纖維素鈉)的溶液中的懸浮液來包被植物種子，然后脫水。或者，將植物種子浸泡在類似懸液中，然后脫水。
當(dāng)將芽孢桿菌屬細(xì)菌施用于植物時，可以按需要進(jìn)一步混入其它常規(guī)活性成分，例如殺蟲劑、殺線蟲利、殺螨劑、除草劑、殺真菌劑、殺菌細(xì)劑、抗病毒藥、肥料或土壤結(jié)構(gòu)改良劑(例如泥炭)。這些物質(zhì)也可交替使用或同時使用，而無需混合。在大多數(shù)情況下，如實施例所述，用于本發(fā)明的芽孢桿菌屬細(xì)菌的活性不受同時使用的其它活性成分的干擾。
在本發(fā)明中，根據(jù)不同情況，例如擬防治的植物病害類型、植物病害的發(fā)展情況，擬處理的植物品種或芽孢桿菌屬細(xì)菌的形式，適當(dāng)選擇將芽孢桿菌屬細(xì)菌施用于植物的用量。當(dāng)含BAL菌的溶液施用于例如感染黑腐病的植物的地上部分時，防治劑中的活BAL菌濃度通常約為1×107-10cfu/ml，優(yōu)選約1×108-9cfu/ml。所述防治劑的用量優(yōu)選為100-250l/10a。當(dāng)將含BAL菌的脫水粉劑摻入到污染了野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的土壤中時，脫水粉劑中活BAL菌濃度通常為1×108-10cfu/g，優(yōu)選1×109cfu/g。脫水粉劑的用量優(yōu)選為500-2000kg/10a，更優(yōu)選500-1000kg/10a。按照以上用量，將含BAL菌的防治劑或材料施用于污染了野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的土壤，并通過充分?jǐn)嚢瓒鴵饺氲酵寥乐?。然后，不處理該土壤，讓其在土壤水含量約30％-40％、在土壤溫度20℃-30℃條件下放置5-7天，同時小心注意保持土壤水分以免干燥。如果實施所述處理，則即使十字花科植物種子播種在這樣的受污染土壤中，該植物也不會受到黑腐病的感染。
參考實施例DAIJU-SIID2550的分類群的檢驗將DAIJU-SIID2550株加入到CM3瓊脂(Oxoid，UK)中，在30℃培養(yǎng)2天。然后，該菌株用作DNA提取用試驗菌株。通過PrepMan方法(Applied Biosystems，U.S.A.)提取基因組DNA。提取的基因組DNA用作模板，通過PCR擴(kuò)增16S核糖體RNA基因(16S rDNA)總核苷酸序列的1500-1600bp區(qū)。然后，對擴(kuò)增的16S rDNA進(jìn)行測序，得到試驗菌株的16S rDNA核苷酸序列。純化PCR產(chǎn)物，使用MicroSeqFull 16S rDNA細(xì)菌測序試劑盒(Applied Biosystems，U.S.A.)對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行循環(huán)測序。使用GeneAmp PCR系統(tǒng)9600熱循環(huán)器(Applied Biosystems，U.S.A.)，使用ABI PRISM 3100 DNA測序儀(Applied Biosystems，U.S.A.)，使用AutoAssembler 2.1(AppliedBiosystems，U.S.A.)裝配所得核苷酸序列片段。按照Applied Biosystems，P/N4308132Rev.A的方案，進(jìn)行從基因組DNA提取到循環(huán)測序的基本操作。
所得16S rDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)用于進(jìn)行同源性搜索，確定表現(xiàn)出高度同源性的前10株。此外，通過neighbor-joining方法，用所確定的前10株和試驗株16S rDNA來構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并檢查相關(guān)菌種和試驗株的分類群。用MicroSeq Mirobial IdentificationSystem Software V.1.4.1進(jìn)行同源性搜索并構(gòu)建系統(tǒng)樹。在同源性搜索中，使用數(shù)據(jù)庫MicroSeq Bacterial Full Gene Library v.0001(AppliedBiosystems，U.S.A.)。
當(dāng)通過MicroSeq Bacterial Full Gene Library，在同源性搜索中沒有發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出100％同源性的菌株時，用DNA核苷酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank/DDBJ/EMBL進(jìn)行了BLAST同源性搜索。
通過MicroSeq Bacterial Full Gene Library分析的結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌枯草亞種(B.subtilis subsp.subtilis)和摩加夫芽孢桿菌(B.mojavensis)之間的差異分別是0.45％、0.65％和0.71％。沒有發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出完全同一性的細(xì)菌菌株。按照分子系統(tǒng)樹，發(fā)現(xiàn)目的菌株的16S rDNA與解淀粉芽孢桿菌成簇(cluster)并且與其相關(guān)。用GenBank/DDBJ/EMBL進(jìn)行BLAST同源性搜索的結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)試驗株表現(xiàn)出與芽孢桿菌Bch(Bacillus sp.Bch)(AF411118)菌株的最高同源性為99.7％，盡管沒有發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出完全同一性的菌株。
因此，發(fā)現(xiàn)DAIJU-SIID2550(保藏號FERM BP-10114)菌株是芽孢桿菌屬的新菌株。
下文介紹了有關(guān)用BAL菌進(jìn)行植物病害防治的實施例。
實施例1BAL菌最大生長時間的測定將作為DAIJU-SIID2550株保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(保藏號FERM BP-10114)的解淀粉芽孢桿菌相關(guān)菌種(在下文稱為“BAL菌”)(一鉑環(huán)量)懸浮于9ml無菌水中，將100μl所得懸液加入到裝有100ml AG培養(yǎng)基(1％葡萄糖(Wako PureChemical Industries，Ltd.)、1％聚胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、0.1％KH2PO4(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和0.05％MgSO4·7H2O(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，pH7.00，高壓滅菌15分鐘)的300ml三角燒瓶或含有2％蔗糖的100ml馬鈴薯浸汁液體培養(yǎng)基中。(馬鈴薯浸汁制備如下將200g馬鈴著切成約1cm3，加入約1升蒸餾水并用小火將其煮沸30-40分鐘，再通過雙層紗布過濾而成。將2％蔗糖加入到濾液中，加入蒸餾水直至體積達(dá)到1升。所得產(chǎn)物稱為“PS培養(yǎng)基”，放在1號加熱室中。)用振幅10cm的往復(fù)振蕩器于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)144小時。培養(yǎng)開始后0小時、24小時、48小時、72小時和144小時，取出1ml培養(yǎng)液作為樣品。將樣品培養(yǎng)液加入到9ml無菌水中，將混合物充分混合，制備10倍稀釋液。然后，連續(xù)取出1ml樣品液并加入到9ml無菌水中。重復(fù)進(jìn)行該步驟，制備107-8倍稀釋液(10倍系列稀釋)。將100μl的各稀釋液加入在YPA平板(包含蛋白胨、酵母和鹽)的9cm培養(yǎng)皿中，用Conradi涂棒均勻涂布，在25℃培養(yǎng)72小時，然后測定所形成的菌落數(shù)。由此得到每一時間點的BAL菌數(shù)(相對值)(表1)。最大生長時間為開始后的48小時或72小時。這表明，當(dāng)在BAL菌和野油菜黃單胞菌野油菜致病變種存在下進(jìn)行培養(yǎng)時，培養(yǎng)開始后48-72小時可達(dá)到最大防治效果。
表1

*細(xì)胞計數(shù)以各時間點的相對值來表示，在培養(yǎng)開始時細(xì)胞計數(shù)確定為1(cfu/ml)。
實施例2BAL菌對野油菜黃單胞菌野油菜致病變種增殖的抑制作用從YPA斜面培養(yǎng)基上刮取一環(huán)量的BAL菌，接種到裝有100mlAG培養(yǎng)基的300ml三角燒瓶中。所得產(chǎn)物用振幅10cm的往復(fù)振蕩器，于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)48小時。將野油菜黃單胞菌野油菜致病變種懸液(100μl)加入到該培養(yǎng)液中，再在相同條件下振蕩培養(yǎng)48小時。本文所用的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種懸液制備如下刮取一環(huán)量的培養(yǎng)在含有2％蔗糖的馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基(下文簡稱為“PSA”)斜面培養(yǎng)基上的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種，將其懸浮于9ml無菌水中。作為對比實驗(對照組)，將100μl野油菜黃單胞菌野油菜致病變種懸液加入到100ml未加入BAL菌的AG培養(yǎng)基中，在25℃同樣振蕩培養(yǎng)48小時。各培養(yǎng)液通過系列稀釋技術(shù)(參見實施例1)稀釋，將100μl各稀釋液(100,000倍、1,000,000倍和10,000,000倍稀釋液)加入到Y(jié)PA平板(直徑9cm)中，在25℃培養(yǎng)72小時，然后測定所產(chǎn)生的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種菌落數(shù)。圖1顯示培養(yǎng)開始后72小時的菌落外觀(左圖1,000,000倍稀釋度；右圖10,000,000倍稀釋度)。在圖1中，上面部分表示野油菜黃單胞菌野油菜致病變種單獨的培養(yǎng)產(chǎn)物，而下面部分表示野油菜黃單胞菌野油菜致病變種與BAL菌一起的培養(yǎng)產(chǎn)物。表2顯示野油菜黃單胞菌野油菜致病變種菌落數(shù)測定結(jié)果。當(dāng)野油菜黃單胞菌野油菜致病變種與BAL菌一起于25℃振蕩培養(yǎng)48小時時，野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的增殖被完全抑制。
表2野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的菌落數(shù)

實施例3人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子的制備用紗布包裹小白菜種子(34g，品種Fuyushoumi)，在500mlChemicron G(中性次氯酸鈣；有效氯70％)的150倍稀釋液中浸泡10分鐘，以便消毒種子。種子消毒后，在流水下沖洗1小時，然后除去水分，在35℃脫水過夜。另外，將野油菜黃單胞菌野油菜致病變種在5個PSA平板上提前培養(yǎng)3天，刮取所有生長菌并懸浮于100ml蒸餾水中，制備1×1012cfu/ml野油菜黃單胞菌野油菜致病變種菌液。將消毒過的種子(17g)在野油菜黃單胞菌野油菜致病變種溶液中浸泡20分鐘，然后在35℃脫水過夜，制備人工污染的種子。檢查其感染程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每粒感染種子上的感染菌數(shù)為105-6cfu，且預(yù)處理種子感染百分率為100％。將這些感染的種子播種到消毒土壤中時，經(jīng)常觀察子葉上的病害(圖2)。在圖2中，左圖顯示出施用對照種子的結(jié)果(對比實驗)，而右圖顯示出用野油菜黃單胞菌野油菜致病變種人工污染的種子的結(jié)果。
實施例4用BAL菌包被人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子的效果按照以下方法，處理人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子。將先前培養(yǎng)在2個YPA平板上的BAL菌懸浮于1)50ml 0.5％吉蘭糖膠(Scott Laboratories，Inc.)水溶液中或2)50ml 1.5％瓊脂(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)水溶液中，所得溶液用磁力攪拌器攪拌至BAL菌均勻懸浮。將300mg得自實施例3的人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子浸泡在該50ml懸液中，讓其靜置過夜，從中取出后風(fēng)干。作為對比實驗(對照組)，將人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子同樣浸泡到不含BAL菌的50ml 0.5％吉蘭糖膠水溶液或50ml 1.5％瓊脂的水溶液中后風(fēng)干。將風(fēng)干的種子放在YPA平板上，在25℃培養(yǎng)72小時，觀察種子附近是否有野油菜黃單胞菌野油菜致病變種生長。根據(jù)觀察結(jié)果，通過以下公式，求出各組的損害。
損害＝允許野油菜黃單胞菌野油菜致病變種在種子附近生長的種子數(shù)量/所加入的種子總數(shù)根據(jù)所計算的損害，通過以下公式，求出防治效價。
防治效價＝100-(處理組的損害/對照組的損害)×100結(jié)果見表3。當(dāng)人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子用BAL菌包衣時，附著于種子的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的增殖被抑制。這表明BAL菌可使感染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子消毒。
表3

實施例5用豆腐渣培養(yǎng)基培養(yǎng)BAL菌向在105℃滅菌了20分鐘的100ml豆腐渣中，混入1ml1×107cfu/ml BAL菌培養(yǎng)液，在25℃避光培養(yǎng)48小時，得到BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物。將所得的500mg BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物懸浮于9ml無菌水中，使用Conradi涂棒，將按照實施例1的同樣方法進(jìn)行10倍系列稀釋所得的100μl各稀釋液分別均勻加入到9cm培養(yǎng)皿中的YPA平板，然后測定BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末中的BAL菌數(shù)。分離出一部分BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末，在100℃脫水過夜，測定水分含量。BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末中的BAL菌數(shù)為4.3×109cfu/g，水分含量為87.6％。
該實驗結(jié)果證實，BAL菌能夠用工業(yè)廢棄物即豆腐渣作為培養(yǎng)基來增殖。在該實施例中所得到的BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末的干熱脫水產(chǎn)物具有適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度和水分含量。因此，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物可用作制備含BAL菌的本發(fā)明防治試劑或材料的原料。
實施例6用BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末包被人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子的效果將得自實施例5的BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末(水分含量87％)在35℃脫水過夜，用球磨磨碎，得到BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末。將BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末(各500mg)加入到1)50ml 0.5％羧甲基纖維素鈉(在下文簡稱為CMC，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的水溶液中或2)50ml 0.5％吉蘭糖膠水溶液中，然后將所得混合物用磁力攪拌器攪拌10分鐘。用紗布包裹人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子(300mg)，在各溶液中浸泡10分鐘，讓BAL菌牢固吸附在種子表面，在35℃脫水過夜。由此制備用BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末包衣的種子。作為對比實驗(對照組)，將人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子在沒有加入BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末的0.5％CMC水溶液或0.5％吉蘭糖膠水溶液中浸泡，然后脫水。
3)將BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末(2mg)與200mg人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子和16μl 0.5％CMC水溶液混合(拌種)。
將處理過的種子(各20粒種子)加入到NSCAA培養(yǎng)基(Randhawa，P. S.和Schaad，N.W.，1984，Phytopathology 74268-272)中，在25℃培養(yǎng)72小時。觀察野油菜黃單胞菌野油菜致病變種在種子附近是否生長。對于以上實驗1)和2)，培養(yǎng)后的樣品外觀見圖3。在圖3中，左上部分代表CMC水溶液處理的一組(對照組1)，右上部分代表用含BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末的CMC水溶液處理的一組(處理組1)，左下部分代表用吉蘭糖膠水溶液處理的一組(對照組2)，右下部分代表用含BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末的吉蘭糖膠水溶液處理的一組(處理組2)。
檢查允許野油菜黃單胞菌野油菜致病變種在種子附近生長的種子數(shù)量，計算出“損害”，求出“防治效價”。“損害”和“防治效價”如實施例4的定義。
結(jié)果見表4。在1)-3)的所有實驗中，都證實野油菜黃單胞菌野油菜致病變種受到防制。具體地講，人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種并用BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末包衣的種子能夠抑制附著在種子上的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種增殖。作為包衣輔料，發(fā)現(xiàn)CMC比吉蘭糖膠更合適。這表明，人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種并用BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末和CMC水溶液的混合物包衣的種子，能夠抑制種子受到野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的感染。
表4

實施例7(1)食用蘑菇培養(yǎng)殘余物的制備按照以下方法，制備食用蘑菇培養(yǎng)殘余物。
在栽培食用蘑菇前1個月，準(zhǔn)備切斷的新鮮稻草。新鮮稻草中補充大豆餅和米糠，使C/N比為約70％，堆放成合適寬度和高度的草垛。每5天噴水，并翻動4次，直到它們分解并制成堆肥。
在培養(yǎng)室中，將由此獲得的堆肥切成15-18cm厚度，用作菇床。當(dāng)菇床溫度降至24℃時，向其中加入菌種(雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)即“白蘑菇”)，在溫度為16℃、濕度為96％、二氧化碳為3,000ppm的條件下栽培食用蘑菇。接種后1周，一旦菌絲體從菇床表面延伸出來，則將整個菇床用大豆粉覆蓋，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌。兩周后，每平方米的菇床上放入88kg黑泥炭蘚。接種后60天收獲食用蘑菇，將用過的菇床在80℃消毒30分鐘。由此得到食用蘑菇培養(yǎng)殘余物。(Agaricus brown mushroom可用作菌種，在接種后適當(dāng)時間(例如60-90天)后，收獲蘑菇。)(2)在污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的土壤中抑制野油菜黃單胞菌野油菜致病變種增殖的試驗將野油菜黃單胞菌野油菜致病變種加入到消毒土壤中，制備污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的土壤(1×1012cfu/ml野油菜黃單胞菌野油菜致病變種)。讓污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的土壤在25℃靜置1天，相對于1升污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的土壤中摻入50g食用蘑菇培養(yǎng)殘余物(即2,000kg殘余物/10a土壤)，讓所得混合物在25℃靜置5天，檢查土壤中野油菜黃單胞菌野油菜致病變種細(xì)菌數(shù)。作為對比實驗(對照組)，用野油菜黃單胞菌野油菜致病變種污染土壤，同樣對沒有加入食用蘑菇培養(yǎng)殘余物的土壤中野油菜黃單胞菌野油菜致病變種細(xì)菌數(shù)進(jìn)行檢查。
按照以下方法，測定土壤中野油菜黃單胞菌野油菜致病變種細(xì)菌數(shù)。也就是說，將20g土壤通過300目篩網(wǎng)，將篩過的土壤加入到80ml生理鹽水(0.85％NaCl)中，得到懸液，用振幅為10cm的往復(fù)振蕩器，于120rpm將懸液振搖30分鐘，再以500rpm離心5分鐘。離心所得上清液用含有0.05％瓊脂的蒸餾水進(jìn)行10倍系列稀釋，將500μl稀釋液滴加到NSCAA培養(yǎng)基(Randhawa，P.S.和Schaad，N.W.，1984，Phytopathology 74268-272)中，用Conradi涂棒均勻涂布在其上，在25℃培養(yǎng)，檢查顯示出野油菜黃單胞菌野油菜致病變種特有外觀的菌落數(shù)，確定野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的細(xì)菌計數(shù)。
每克干土壤中野油菜黃單胞菌野油菜致病變種細(xì)菌計數(shù)當(dāng)加入食用蘑菇培養(yǎng)殘余物時為1.09×107cfu(處理組)，當(dāng)未加入食用蘑菇培養(yǎng)殘余物時為7.06×107cfu(對照組)。
按照以下公式，求出防治效價為84.6％。結(jié)果概述于表5。
防治效價＝100-(處理組的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種細(xì)菌計數(shù))/(對照組的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種細(xì)菌計數(shù))×100試驗結(jié)果表明，將食用蘑菇培養(yǎng)殘余物加入到土壤中，可明顯抑制野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的增殖。
表5

實施例8人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種并浸泡在BAL菌培養(yǎng)液中的種子的效果以及將食用蘑菇培養(yǎng)殘余物摻入到土壤中對黑腐病發(fā)病的抑制效果將BAL菌加入到AG培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7天，制備BAL菌培養(yǎng)液，其菌濃度為1×106cfu/ml。用紗布包裹人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子(200mg)，在培養(yǎng)液中浸泡給定時間。浸泡10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘。浸泡后，從種子上去除水分，將種子鋪開，然后在35℃脫水過夜。為了進(jìn)行比較，將人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子浸泡在未加入BAL菌的AG培養(yǎng)基中達(dá)同樣時間，然后脫水。
將按照上述方法處理過的種子加入到土壤中，土壤用蒸汽土壤消毒器(SB-150，Marubun Seisakusyo Co.Ltd.，)在100℃消毒30分鐘(在下文稱為“消毒土壤”)，再在消毒土壤中摻入2,000kg/10a食用蘑菇培養(yǎng)殘余物，制備混合土壤(參見實施例7(1))(在下文稱為“含有食用蘑菇培養(yǎng)殘余物的土壤”)。將土壤(各150ml)加入到可密封容器中，加入20粒如上處理的人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子，接著在25℃處理。
作為對照組，向消毒土壤中加入人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子，準(zhǔn)備試驗組。
施用后9天的樣品外觀見圖4和圖5。在圖4中，上面部分代表“在含BAL菌的AG培養(yǎng)基中浸泡和額外包含食用蘑菇培養(yǎng)殘余物的土壤”條件下的栽培結(jié)果，而下面部分代表“在含BAL菌的AG培養(yǎng)基中浸泡和消毒土壤”(浸泡持續(xù)時間從左開始為10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘)條件下的栽培結(jié)果。在圖5中，最左邊部分代表“在不含BAL菌的AG培養(yǎng)基中浸泡和消毒土壤”條件下的栽培結(jié)果，中間部分代表“在含BAL菌的AG培養(yǎng)基中浸包和消毒土壤”條件下的栽培結(jié)果，而最右邊代表“在含BAL菌的AG培養(yǎng)基中浸泡和額外包含食用蘑菇培養(yǎng)殘余物的土壤”條件下的栽培結(jié)果(浸泡持續(xù)時間在所有實驗中都為60分鐘)。
研究了在施用BAL菌后9天出現(xiàn)在子葉上的黑腐病的病害癥狀。根據(jù)以下6個病害狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。
0無癥狀1損害面積占子葉的一半以下2損害面積占一片子葉3損害面積占1.5片子葉4損害面積占2片子葉5枯萎根據(jù)研究結(jié)果，按照以下公式求出發(fā)病率。
發(fā)病率＝(1n1+2n2+3n3+4n4+5n5)/(5×所研究的植物總數(shù))在公式中，n1、n2、n3、n4和n5各自獨立代表按照標(biāo)準(zhǔn)1、2、3、4和5分類的單個植物的數(shù)量。
根據(jù)所測定的發(fā)病率，按照以下公式求出防治效價防治效價＝100-處理組發(fā)病率/對照組發(fā)病率×100以上各組的防治效價見表6。如表6所示，將人工污染野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的種子浸泡在BAL菌培養(yǎng)液中，抑制了黑腐病的發(fā)展。發(fā)現(xiàn)當(dāng)在BAL菌培養(yǎng)液中浸泡時間延長時，該抑制效果更高。對于使用其中摻入食用蘑菇培養(yǎng)殘余物的土壤的試驗組來說，在BAL菌培養(yǎng)液中浸泡時間較短(例如10分鐘)的試驗組，與種子在含BAL菌的AG培養(yǎng)基中浸泡60分鐘并加入到消毒土壤中的試驗組相比，產(chǎn)生的防治效價基本上相同。
表6

*具有負(fù)防治效價的試驗組表現(xiàn)出比對照組更高的發(fā)病率實施例9地上施用BAL菌培養(yǎng)液對黑腐病的防治在4葉期，用噴霧器將已在AG培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)的BAL菌培養(yǎng)液(300ml，細(xì)菌濃度3×108cfu/ml)噴霧到9株小白菜(品種Fuyushoumi)葉面上。讓小白菜植株過約1小時后，用噴霧器將300ml野油菜黃單胞菌野油菜致病變種溶液噴霧到這些植株上。該野油菜黃單胞菌野油菜致病變種溶液制備如下先將野油菜黃單胞菌野油菜致病變種在5個PSA平板上培養(yǎng)，從平板上刮取所有野油菜黃單胞菌野油菜致病變種，懸浮于150ml蒸餾水中，制備108cfu/ml野油菜黃單胞菌野油菜致病變種溶液待用。將已施用BAL菌的植物移入保濕室(濕度80％)中，保持在20℃。為了進(jìn)行比較，準(zhǔn)備了兩組噴灑BAL菌培養(yǎng)液、但沒有施用野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的試驗組，以及未噴灑BAL菌培養(yǎng)液、但施用了同樣濃度的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種溶液的試驗組(即9株小白菜)(對照組)。圖6顯示實驗開始后26天的地上部分。在圖6中，左邊一欄顯示在“加入BAL菌、但未加入野油菜黃單胞菌野油菜致病變種”的土壤中的栽培結(jié)果，中間一欄顯示在“加入BAL菌和野油菜黃單胞菌野油菜致病變種”的土壤中的栽培結(jié)果(處理組)，而右邊一欄顯示在“未加入BAL菌、但加入野油菜黃單胞菌野油菜致病變種”的土壤中的栽培結(jié)果(對照組)。評價實驗開始后33天葉片上出現(xiàn)的黑腐病癥狀，檢查病害發(fā)展。首先測定葉片上的發(fā)病率(病葉占所檢查葉片的百分率)。然后再通過以下公式測定防治效價。
防治效價＝100-(處理組的葉片發(fā)病率/對照組的葉片發(fā)病率)×100結(jié)果見表7。在加入野油菜黃單胞菌野油菜致病變種之前噴灑BAL菌，導(dǎo)致抑制了黑腐病的發(fā)展。這表明，將BAL菌培養(yǎng)液預(yù)防性施用于野油菜黃單胞菌野油菜致病變種宿主的地上部分，可抑制黑腐病的發(fā)展和傳播。
表7

實施例10常規(guī)殺真菌劑或殺蟲劑對BAL菌的影響常規(guī)殺真菌劑和殺蟲劑，即Amistar 20 Flowable(Syngenta，腈嘧菌酯可濕性粉劑)、Jimandaisen可濕性粉劑(DSS Hishishou，代森錳鋅可濕性粉劑)、Rovral可濕性粉劑(Yashima Kagaku，異菌脲可濕性粉劑)、Rizolex可濕性粉劑(Sumitomo Chemical Co.，Ltd.，甲基立枯磷可濕性粉劑)、Sthana可濕性粉劑(Sumitomo Chemical Co.，Ltd.，喹菌酮可濕性粉劑)、Daconil 1000 Flowable(SDS，TPN可濕性粉劑)、Z-Bordeaux(Nihon Nohyaku Co，Ltd.，銅可濕性粉劑)、Benlate可濕性粉劑(Sumitomo Chemical Co.，Ltd.，苯菌靈可濕性粉劑)、Ridomyl MZ可濕性粉劑(Syngenta，代森錳鋅/甲霜靈可濕性粉劑)、Bestguard水溶性粉劑(Sumika Takeda，硝胺烯啶水溶性粉劑)、DDVP乳劑(NihonNohyaku Co，Ltd.，DDVP乳劑)、Affirm乳劑(Syngenta，苯甲酸emamectin乳劑)、Admire可濕性粉劑(Bayer CropScience，吡蟲啉可濕性粉劑)、Lannate 45可濕性粉劑(Sankyo Agro Co.，Ltd.，滅多威可濕性粉劑)、Pandan SG水溶性粉劑(Sumika Takeda，殺螟丹水溶性粉劑)、Mospilan水溶性粉劑(Nippon Soda Co.，Ltd.，吡蟲清水溶性粉劑)、Elsan乳劑(Nissan Chemical Co.Ltd.，PAP乳劑)、Actara顆粒水溶性粉劑(Syngenta，Thiamethoxam水溶性粉劑)、Kotetsu flowable(Nihon Nohyaku Co，Ltd.，chlorphenapyr可濕性粉劑)和Torebon乳劑(Mitsui Chemicals，Inc.，醚菊酯乳劑)，將其稀釋至給定濃度，制備化學(xué)物，將濾紙(Toyo Roshi No.2)浸泡在這些化學(xué)物中，然后干燥。再將BAL菌在蒸餾水中的懸浮液(2×108cfu/ml)以44μl/cm2的用量噴灑到這些濾紙上，再將濾紙干燥，將其放在25℃避光過夜。將濾紙切割成5-10mm2的小片，在YPA平板上、在25℃進(jìn)行避光培養(yǎng)。
培養(yǎng)后，對放入YPA平板內(nèi)的10mm2濾紙片附近生長的BAL菌觀察3-4天。
結(jié)果見表8。另外，培養(yǎng)4天后的平板見圖7。BAL菌的生長不受殺真菌劑或殺蟲劑的影響，只受某些化學(xué)品的影響。然而，在Jimandaisen可濕性粉劑和Ridomyl MZ可濕性粉劑存在下，BAL菌的生長非常緩慢，培養(yǎng)3天后，基本上沒有觀察到菌落。也就是說，沒有觀察到BAL菌的生長，但是培養(yǎng)4天后逐漸觀察到生長。在Sthana可濕性粉劑和Daconil 1000可流動劑存在下，完全沒有觀察到BAL菌的生長。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明的含BAL菌的植物病害防治劑或材料可以與許多常規(guī)殺真菌劑或殺蟲劑聯(lián)合使用，或者可以交替使用或同時使用而不混合。
表8常規(guī)殺真菌劑或殺蟲劑對BAL菌的影響

*+培養(yǎng)后3天觀察到菌落；±因生長緩慢，培養(yǎng)后4天才觀察到菌落；-沒有觀察到菌落。
實施例11BAL菌對潰瘍病真菌(密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種)增殖的抑制從YPA斜面培養(yǎng)基上刮取一鉑環(huán)量BAL菌，加入到裝有100mlAG培養(yǎng)基的300ml三角燒瓶中，用振幅為10cm的往復(fù)振蕩器于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)48小時。向該培養(yǎng)液中加入100μl密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種懸液，再在同樣條件下振蕩培養(yǎng)48小時。本文所用的密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種懸液制備如下刮取一鉑環(huán)量培養(yǎng)在PSA斜面培養(yǎng)基上的密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞和，然后將其懸浮在9ml無菌水中。作為對比實驗(對照組)，將100μl密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種懸液加入到其中未加入BAL菌的100ml AG培養(yǎng)基內(nèi)，然后同樣在25℃振蕩培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)液用系列稀釋技術(shù)進(jìn)行稀釋(參見實施例1)，將100μl各稀釋液(100,000倍、1,000,000倍和10,000,000倍稀釋液)加入到9cm YPA平板中，在25℃培養(yǎng)72小時，測定生長的密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種的菌落計數(shù)。菌落計數(shù)測定結(jié)果見表9。菌落外觀見圖8。當(dāng)密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種細(xì)胞與BAL菌一起在25℃振蕩培養(yǎng)48小時時，密執(zhí)安棍狀桿菌密執(zhí)安亞種的增殖因此被完全抑制。
表9

實施例12BAL菌對萎蔫病細(xì)菌(茄羅爾斯通氏菌)增殖的抑制從YPA斜面培養(yǎng)基上刮取一鉑環(huán)量BAL菌，加入到裝有100mlAG培養(yǎng)基的300ml三角燒瓶中，用振幅為10cm的往復(fù)振蕩器于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)48小時。向該培養(yǎng)液中加入100μl茄羅爾斯通氏菌懸液，再在同樣條件下振蕩培養(yǎng)120小時。本文所用的茄羅爾斯通氏菌懸液制備如下刮取一鉑環(huán)量培養(yǎng)在PSA斜面培養(yǎng)基上的茄羅爾斯通氏菌，然后將其懸浮在9ml無菌水中。作為對比實驗(對照組)，將100μl茄羅爾斯通氏菌懸液加入到其中未加入BAL菌的100ml AG培養(yǎng)基內(nèi)，然后同樣在25℃振蕩培養(yǎng)120小時。培養(yǎng)液用系列稀釋技術(shù)進(jìn)行稀釋(參見實施例1)，將100μl各稀釋液(1,000,000倍和10,000,000倍稀釋液)加入到9cm YPA平板中，在25℃培養(yǎng)72小時，測定生長的茄羅爾斯通氏菌的菌落計數(shù)。菌落計數(shù)測定結(jié)果見表10。菌落外觀見圖9。當(dāng)茄羅爾斯通氏菌細(xì)胞與BAL菌一起在25℃振蕩培養(yǎng)120小時時，茄羅爾斯通氏菌的增殖由此被抑制。
表10

實施例13BAL菌對軟腐病細(xì)菌(胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種)增殖的抑制從YPA斜面培養(yǎng)基上刮取一鉑環(huán)量BAL菌，加入到裝有100mlAG培養(yǎng)基的300ml三角燒瓶中，用振幅為10cm的往復(fù)振蕩器于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)48小時。向該培養(yǎng)液中加入100μl胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種懸液，再在同樣條件下振蕩培養(yǎng)96小時。本文所用的胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種懸液制備如下刮取一鉑環(huán)量培養(yǎng)在含2％蔗糖的馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基(在下文簡稱為“PSA”)斜面培養(yǎng)基上的胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種，然后將其懸浮在9ml無菌水中。作為對比實驗(對照組)，將100μl胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種懸液加入到其中未加入BAL菌的100mlAG培養(yǎng)基內(nèi)，然后同樣在25℃振蕩培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)液用系列稀釋技術(shù)進(jìn)行稀釋(參見實施例1)，將100μl各稀釋液(1,000,000倍和10,000,000倍稀釋液)加入到9cm YPA平板中，在25℃培養(yǎng)72小時，測定生長的胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種的菌落計數(shù)。菌落計數(shù)測定結(jié)果見表11。菌落外觀見圖10。當(dāng)胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種細(xì)胞與BAL菌一起在25℃振蕩培養(yǎng)96小時時，胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種的增殖由此被完全抑制。
表11

實施例14對大白菜軟腐病的抑制將大白菜的葉柄依次用自來水、蒸餾水和70％乙醇洗滌，用Kimwipes擦去水分，將葉柄放入大的玻璃培養(yǎng)皿中。軟腐病細(xì)菌即胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種在YPA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，然后懸浮于9ml蒸餾水中，制備1×107cfu/ml菌液。向1ml該菌液中加入1ml BAL菌培養(yǎng)液，將所得混合物充分?jǐn)嚢?，?根棉針(cotton needle)浸泡在其中，用針刮擦大白菜葉柄。由此引入BAL菌。隨后，將玻璃培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)っ芊?，以防?xì)菌干燥，將培養(yǎng)皿在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。作為對比實驗(對照組)，同樣用針引入含有1ml菌液和1ml蒸餾水的混合液。通過測定沒有軟腐病的葉柄(記為“-”)和染有軟腐病的葉柄(記為“+”)，進(jìn)行損害評價。通過以下公式測定防治效價。
防治效價＝100-(處理組發(fā)病率/對照組發(fā)病率)×100結(jié)果見表12。實驗開始后1天的菌落外觀見圖11。
表12

實施例15對種子傳播植物伯克霍爾德氏菌和莢殼伯克霍爾德氏菌的抑制用于制備人工污染水稻種子的培養(yǎng)液制備如下將植物伯克霍爾德氏菌(日本植物保護(hù)協(xié)會(Japan Plant Protection Association)的原種)在PPG培養(yǎng)基(200g馬鈴薯、3g十水磷酸氫二鈉(Wako)、0.5g磷酸氫二鉀(Wako)、5g蛋白胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、3g氯化鈉(Wako)、5g葡萄糖(Wako)和1升蒸餾水)中、在25℃振蕩培養(yǎng)3天。將擬污染的水稻種子先在250倍Chemicron G(Nippon Soda Co.，Ltd.)溶液中浸泡30分鐘進(jìn)行消毒，再用流水沖洗45分鐘后，干燥。將含有15g種子和上述細(xì)菌的培養(yǎng)液(30ml)加入到100ml燒杯中，用真空泵(Yamato MINIVAC PS-22)在減壓條件下感染種子。
將污染的種子(3g)和30ml用豆腐渣提取物(50g豆腐渣懸浮于100ml蒸餾水中，紗布過濾，高壓滅菌121℃達(dá)20分鐘)振蕩培養(yǎng)5天的含BAL菌培養(yǎng)液(在下文稱為“BAL菌培養(yǎng)液”)加入到50mlFalcon管中進(jìn)行浸泡。將在室溫下浸泡48小時的種子(1.5g)加入到含有100ml Kumiai-Ryujyou-Baido D(Kureha Chemical Industry Co.，Ltd.)的冰淇淋杯(由聚乙烯制成，直徑10cm，高5.5cm)中。作為對照，同樣也加入未浸泡在BAL菌培養(yǎng)液中的污染種子。讓種子在32℃避光進(jìn)行萌發(fā)，變綠(greening)并在20℃人工氣候室內(nèi)持續(xù)管理，施用后16天，將整株植株拔出，檢查病害的發(fā)展(Sakumotsu byougenkinkenkyuu gihou no kiso-bunri/baiyo/sesshu(Basics of crop pathogenresearch techniques-separation/culture/introduction)，Kanichi Ohata(編著)，Japan Plant Protection Association)?？菸难砻绾秃稚砻绫徽J(rèn)為是病株。通過以下公式求出發(fā)病率并確定防治效價防治效價＝100-(處理組發(fā)病率/對照組發(fā)病率)×100結(jié)果見表13。實驗開始后16天的菌落外觀見圖12A。
表13污染莢殼伯克霍爾德氏菌的種子浸泡在BAL菌培養(yǎng)液中的效果

按照如上所述的方法，也對莢殼伯克霍爾德氏菌(Japan PlantProtection Association的原種)進(jìn)行實驗。對于細(xì)菌粒腐病，枯萎秧苗和病害嚴(yán)重的秧苗(健康植物的一半長度或更短)被認(rèn)為是病株。結(jié)果見表14。實驗開始后16天的樣品外觀見圖12B。
表14污染植物伯克霍爾德氏菌的種子浸泡在BAL菌培養(yǎng)液中的效果

實施例16對稻瘟病真菌(稻梨孢)孢子產(chǎn)生的抑制效果將未稀釋的BAL菌培養(yǎng)液、5倍稀釋的BAL菌培養(yǎng)液(在萌發(fā)試驗時為2倍或10倍的終濃度)和蒸餾水(對照組)用作樣品。將稻梨孢的孢子(讓菌群在加糖的麥片瓊脂培養(yǎng)基中生長并用BLB輻射而形成)懸浮于PS培養(yǎng)基(含2％糖和馬鈴薯浸汁的培養(yǎng)基)中，將20μl各樣品加入到有孔的載玻片(hole glass slide)中，讓它們充分混合，讓混合物在25℃保濕室中靜置24小時，在顯微鏡下檢查芽管是否存在。圖13顯示樣品混合后24小時的稻梨孢孢子。在原液和加入培養(yǎng)液的5倍稀釋液中，稻梨孢的孢子萌發(fā)被抑制，沒有觀察到萌發(fā)的孢子。
實施例17對水稻褐斑病真菌(宮部旋孢腔菌)孢子萌發(fā)的抑制效果向裝有100ml YPA培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd.)、1％聚胨(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.)和0.5％氯化鈉，pH7.00，高壓滅菌20分鐘)的300ml三角燒瓶中，加入一環(huán)量的培養(yǎng)在YPA斜面培養(yǎng)基中的BAL菌，在25℃振蕩培養(yǎng)72小時(120rpm)。所得培養(yǎng)液的原液、5倍稀釋液和10倍稀釋液用作樣品。同樣經(jīng)過蒸餾水處理的溶液用作對照組。加入懸浮于蒸餾水中的宮部旋孢腔菌孢子(通過將預(yù)培養(yǎng)的宮部旋孢腔菌加入到PSA培養(yǎng)基中并在25℃培養(yǎng)7-10天而制得)，其用量為每1ml樣品中加入100μl將它們充分混合，將50μl所得混合物加入到有孔的載玻片中，然后讓其在保濕室中、在25℃靜置24小時，在顯微鏡下觀察芽管結(jié)構(gòu)是否存在。樣品混合后24小時的宮部旋孢腔菌孢子見圖14。在培養(yǎng)液原液中沒有孢子萌發(fā)。在5倍和10倍稀釋液中芽管的延伸被抑制，發(fā)生腫脹變形，沒有觀察到芽管延伸。
實施例18地上施用BAL菌培養(yǎng)液對水稻褐斑病的防治將BAL菌培養(yǎng)液或蒸餾水(作為對照組)施用于在人工氣候室中生長的6葉期-7葉期水稻(品種Nihonbare)，讓植物在有光條件下、在25℃放置16小時，24小時后噴霧加入宮部旋孢腔菌孢子懸液。該孢子懸液制備如下提前將宮部旋孢腔菌培養(yǎng)在PSA培養(yǎng)基中，將蒸餾水倒入培養(yǎng)皿中，用刷子摩擦菌群，洗下孢子，用雙層紗布過濾所得產(chǎn)物，然后調(diào)節(jié)孢子濃度至100倍顯微鏡的每個視野下有10個，加入吐溫20，得到濃度為0.02％。然后，將水稻植株用塑料容器蓋上，構(gòu)成25℃保濕室，讓植株在其中靜置24小時。施用后6天，測定在施用時在充分發(fā)育的葉片上的損害總數(shù)和葉片面積，測定每1cm2的損害平均數(shù)，并根據(jù)以下公式測定防治效價。
防治效價＝100-(處理組的損害平均數(shù))/(對照組的損害平均數(shù))×100結(jié)果見表15。使用BAL菌培養(yǎng)液而得到的防治效價為89.7。這表明水稻褐斑病可以被抑制。
表15

實施例19BAL菌培養(yǎng)液對黃瓜灰霉病真菌(灰葡萄孢)的抑制效果從黃瓜胚軸部分切下子葉，將切下的子葉放在襯有濕紙巾的容器中，使切面接觸紙巾。提前讓灰葡萄孢在含2％蔗糖的馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基(PSA)中生長，將在使用BLB的條件下所產(chǎn)生的孢子懸浮于含2％蔗糖的馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基(PG)中。將懸液的孢子密度調(diào)節(jié)至2×107孢子/ml，每區(qū)放10片子葉，向其中心各滴加50μl懸液，將紙碟(Toyo Roshi，用于測定抗生素，厚，直徑8mm)貼附在其上。此外，通過紙碟，將50μl BAL菌培養(yǎng)液或防治物質(zhì)即蒸餾水或異菌脲可濕性粉劑(Rovral)(稀釋因子1,000)滴加在其上，將容器密封，讓其在有光條件下、在20℃放置16小時。
結(jié)果見表16和圖15。根據(jù)紙碟附近由感染引起的褐色直徑來表示結(jié)果。通過以下公式與蒸餾水進(jìn)行比較，測定防治效價。
防治效價＝100-(處理組平均褐色直徑)/(蒸餾水組的平均褐色直徑)×100施用3天后，子葉的褐變見圖15，10個子葉的平均褐變直徑見表16。與對照組相比，施用了培養(yǎng)液的植物的褐變直徑明顯更小。這表明黃瓜灰霉病被抑制。
表16

實施例20地上施用BAL菌培養(yǎng)液對黃瓜褐斑病的防治在2004年4月28目萌發(fā)的黃瓜植株(品種Matsukaze)在溫室中生長。在2片真葉發(fā)育時期，將足量的BAL菌培養(yǎng)液或防治物質(zhì)即蒸餾水或Daconil 1000(稀釋因子1,000)施用于秧苗。在25℃過5小時后，所用的溶液已干燥。然后將山扁豆生棒孢的孢子(Laboratory ofPathology and Biotechnology of the Musashino Seed Co.，Ltd.的原種)懸液調(diào)節(jié)至孢子密度為105孢子/ml，噴霧加入。懸液制備如下提前將孢子培養(yǎng)在PSA培養(yǎng)基中，將蒸餾水倒入培養(yǎng)皿中，用刷子摩擦菌群，洗下孢子，用雙層紗布過濾。這樣施用后，將黃瓜植株用塑料容器蓋上，構(gòu)成25℃保濕室，讓植株在其中靜置24小時，在有光條件下、在25℃監(jiān)控16小時。施用后20天，測定在施用時完全發(fā)育的葉片上的損害總數(shù)，測定每片葉片上損害的平均數(shù)，并通過以下公式測定防治效價。
防治效價＝100-(處理組平均損害數(shù))/(對照組平均損害數(shù))×100結(jié)果見表17。在表17中，有關(guān)數(shù)字1-1、1-2、2-1和2-2各自獨立代表第一株植物的第一片葉片、第一株植物的第二片葉片、第二株植物的第一片葉片和第二株植物的第二片葉片。實驗開始后20天處理組的外觀見圖16。使用BAL菌培養(yǎng)液而得到的防治效價以及使用Daconil 1000而得到的防治效價均為100。這表明，使用BAL菌培養(yǎng)液和使用Daconil 1000都可以抑制黃瓜褐斑病。
表17

實施例21BAL菌培養(yǎng)液對黑斑病(蕓苔鏈格孢)的效果的試驗從YPA斜面培養(yǎng)基上刮取一鉑環(huán)量的BAL菌，加入到裝有100ml豆腐渣提取物培養(yǎng)基的300ml三角燒瓶中，用振幅10cm的往復(fù)振蕩器于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)4天。用小型手動噴霧器，將該BAL菌培養(yǎng)液均勻噴霧在蕪菁(品種Natsumaki No.13，Kokabu；施用日期2004年3月10日；施用時的生長程度3片營養(yǎng)葉，栽培在75mm黑色塑料缽中達(dá)20天)葉片上，然后將其在保濕室中、在25℃放置24小時。將先前培養(yǎng)于PSA平板上的蕓苔鏈格孢(Laboratory of Pathologyand Biotechnology of the Musashino Seed Co.，Ltd.的原種)的孢子懸浮于蒸餾水中。用小型手動噴霧器，將所得懸液均勻噴霧在蕪菁葉片上，將其在保濕室中、在25℃放置24小時，在20℃管理，直到癥狀發(fā)展。在施用時，通過稀釋懸液來調(diào)節(jié)懸液中的孢子密度，從而達(dá)到在200x顯微鏡的每個視野下有約40個孢子。為了進(jìn)行比較，提供了以下兩組葉片上噴水而不是BAL菌培養(yǎng)液的一組(對照組)以及葉片上噴有1000倍異菌脲可濕性粉劑溶液作為現(xiàn)有防治劑的一組。按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，對每株植物的3片葉片進(jìn)行研究。
0無癥狀1表現(xiàn)出癥狀的面積占葉片面積的25％以下2表現(xiàn)出癥狀的面積占葉片面積的25％-50％3表現(xiàn)出癥狀的面積占葉片面積的50％以上4枯萎根據(jù)研究結(jié)果，按照以下公式求出發(fā)病率發(fā)病率＝(1n1+2n2+3n3+4n4)/(4×所研究的植物總數(shù))其中，n1、n2、n3和n4各自獨立代表按照以上標(biāo)準(zhǔn)分類的植物數(shù)量。
根據(jù)所計算的發(fā)病率，按照以下公式求出防治效價防治效價＝100-處理組發(fā)病率/對照組發(fā)病率×100結(jié)果見表18。圖17顯示在評價發(fā)病率時的葉片外觀。如表18和圖17所示，施用BAL菌培養(yǎng)液導(dǎo)致對黑斑病被完全抑制。
表18

實施例22BAL菌培養(yǎng)液對白銹病真菌(大孢白銹)的效果的試驗從YPA斜面培養(yǎng)基上刮取一鉑環(huán)量的BAL菌，加入到裝有100ml豆腐渣提取物的300ml三角燒瓶中，用振幅10cm的往復(fù)振蕩器于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)4天。用小型手動噴霧器，將該BAL菌培養(yǎng)液均勻噴霧在小白菜(品種Fukushoumi；施用日期2004年2月12日；施用時的生長程度5片營養(yǎng)葉，栽培在75mm黑色塑料缽中達(dá)30天)葉面上，將噴霧后的樣品在保濕室中、在25℃放置24小時。讓樣品在25℃再放置24小時，將從育種圃中在Brassica chinensiskomatsuna上自發(fā)形成的大孢白銹的分生孢子層上采集的游動孢子囊懸浮于蒸餾水中，用小型手動噴霧器，將懸液噴霧到樣品中，讓噴霧的樣品在保濕室中、在11℃放置24小時。施用時懸液中游動孢子囊濃度稀釋至在200x顯微鏡的每個視場下有約30個游動孢子囊。直到癥狀發(fā)展，僅在天黑后使用坑道(tunnel)和加熱室。為了進(jìn)行比較，提供了噴水而不是噴灑BAL菌培養(yǎng)液的一組(對照組)。研究了如上所述施用大孢白銹的各株植物的兩片葉片上單位面積上的分生孢子層數(shù)量。根據(jù)研究結(jié)果，通過以下公式求出處理組的防治效價。
防治效價＝100-(治療組中每1cm2的分生孢子層的數(shù)量/對照組中每1cm2的分生孢子層的數(shù)量)×100結(jié)果見表19。圖18顯示病葉外觀。施用BAL菌培養(yǎng)液所得到的防治效價高。這表明這樣的施用是有效的，證明了它的實用性。
表19

實施例23BAL菌培養(yǎng)液對蘿卜尖鐮孢(Fusarium oxysporum f.sp.raphani)的效果的試驗將Ecobran材料(40g，Chiba Seifun Co.，Ltd.銷售，麩皮成分29％N、38％P2O5、2.0％K5O、52.5％有機(jī)物和35％-40％水分；pH 7.5；C/N比10)和10g米糠充分混合，將混合物進(jìn)行高壓滅菌，121℃達(dá)1小時，隨后在24小時后在同樣條件下再進(jìn)行一次高壓滅菌。將無菌水(30ml)和用硅藻土稀釋10倍的BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末(0.6g，參見實施例6)加入到滅菌材料中，將它們充分混合，在30℃放置4天，所得產(chǎn)物稱為含BAL菌的材料。將提前在PSA平板上預(yù)先培養(yǎng)的蘿卜尖鐮孢(Laboratory of Pathology and Biotechnology of theMusashino Seed Co.，Ltd.的原種)切成5mm2的小塊，加入到裝有100mlPG培養(yǎng)基的300ml三角燒瓶中，用振幅10cm的往復(fù)振蕩器于120rpm、25℃振蕩培養(yǎng)5天。將培養(yǎng)液通過雙層紗布過濾，在3,000rpm離心10分鐘，回收孢子。將這些孢子懸浮于蒸餾水中，在同樣條件下離心，回收沉淀物。該步驟重復(fù)兩次，用于洗滌。將沉淀物懸浮于蒸餾水中，所得產(chǎn)物均勻摻入到滅菌土壤中，制備含有2×107孢子/ml蘿卜尖鐮孢的污染土壤。所得土壤在25℃放置24小時，將含BAL菌的材料與其充分混合至濃度達(dá)500kg/10a的材料(含有1×107cfu/gBAL菌)，將混合物在25℃放置6天，于2004年5月20日加入蕪菁(品種Natsumaki No.13，kokabu)，然后在25℃管理。為了進(jìn)行比較，也測試了滅菌土壤、不含BAL菌材料的污染土壤(對照組)和加入到污染土壤中的化學(xué)防治劑，然后灌溉31/m2苯菌靈可濕性粉劑的1000倍溶液。在施用后18天研究子葉發(fā)黃枯萎的程度。根據(jù)調(diào)查結(jié)果，通過以下公式求出發(fā)病率。
發(fā)病率＝病株數(shù)/調(diào)查個體總數(shù)。
根據(jù)所求的發(fā)病率，通過以下公式測定防治效價。
防治效價＝100-處理組的發(fā)病率/對照組的發(fā)病率×100結(jié)果見表20。圖19顯示實驗開始后18天的樣品外觀。施用含BAL菌培養(yǎng)液的防治材料的組，比起施用化學(xué)防治劑的組，表現(xiàn)出更高的抑制病害的效力。
表20

*在病株數(shù)中，“-”出現(xiàn)癥狀；其中的“+”無癥狀實施例24BAL菌對秧苗猝倒病真菌(立枯絲核菌(Rhizoctnia solani))的效果的試驗將Ecobran材料(40g，描述于實施例13)與10g米糠充分混合，進(jìn)行高壓滅菌，121℃達(dá)1小時，隨后在24小時后在同樣條件下再進(jìn)行一次高壓滅菌。將無菌水(30ml)和用硅藻土稀釋10倍的BAL菌豆腐渣培養(yǎng)物粉末(0.6g，參見實施例6)加入到滅菌材料中，將它們充分混合，在30℃放置7天，所得產(chǎn)物稱為含BAL菌的材料。將該材料摻入到滅菌土壤中，數(shù)量達(dá)到1t/10a(土壤中5×107cfu/gBAL菌)，讓其在黑暗中、在25℃放置10天。用打孔器，對在PSA平板上培養(yǎng)2天的秧苗猝倒病真菌(立枯絲核菌AG-4，IIIA，秧苗猝倒病真菌，Laboratory of Pathology and Biotechnology of the Musashino Seed Co.，Ltd.的原種)打孔，將3小片菌群以相同間距放在冰淇淋杯(長7cm；寬7cm；高5cm)底面上。填充含有所述材料的滅菌土壤(125ml)，覆蓋菌群片，加入100mg剪股穎(Yukijirusi)，在人工氣候室中、在28℃對其進(jìn)行管理。為了進(jìn)行比較，提供了以下兩組一組使用了其中既未加入BAL菌、也未加入秧苗猝倒病真菌的滅菌土壤(滅菌土壤組)，而另一組使用了其中未加入BAL菌、而加入秧苗猝倒病真菌的滅菌土壤(對照組)。對于這些組，除非另有說明，否則按照如上所述的相同方式進(jìn)行加入和管理。在施用BAL菌后11天，檢查存活株的數(shù)量，滅菌土壤中存活株的數(shù)量被認(rèn)為是每試驗組中施用了BAL菌的共同植株數(shù)量，通過以下公式測定存活株的比率和枯萎株的比率。
存活株的比率＝存活株數(shù)量/滅菌土壤中的存活株數(shù)量×100枯萎株的比率＝100-存活株的比率根據(jù)枯萎株的比率，再通過以下公式來測定防治效價。
防治效價＝100-(處理組的枯萎株比率/對照組的枯萎株比率)×100結(jié)果見表21。圖20顯示實驗開始后11天的樣品外觀。盡管防治效價低(因為有極高的污染程度)，但還是觀察到了效果。
表21

實施例25在煙草花葉病毒(TMV)感染的土壤中，使用含BAL菌的防治材料對TMV感染的抑制作用將TMV感染的葉片(4g，濕重)放入研缽中，在10ml 1/15M磷酸緩沖液(pH 6.98)中研磨，制備汁液待用。將該汁液等分到兩個50mlFalcon管中，加入磷酸緩沖液使溶液量達(dá)到50ml。將脫水的消毒土壤(100ml)、1.25g米糠(500kg/10a當(dāng)量)和50ml汁液加入到500ml燒杯中。作為BAL菌處理組，將在豆腐渣提取物中振蕩培養(yǎng)的20ml BAL菌培養(yǎng)液在3000rpm離心30分鐘以分離BAL菌，將分離到的BAL菌懸浮于50ml磷酸緩沖液中，所得懸液加入到以上土壤中，再用玻璃棒充分混合。作為對照組，混合50ml磷酸緩沖液。土壤表面用乙烯基(vinyl)覆蓋，將燒杯包起來，將開口處扎好，進(jìn)行簡單的曬太陽技術(shù)(solar technique)，將燒杯放置在38℃培養(yǎng)箱中。過程開始后4天，從各處理組分別取出3g土壤加入到燒杯中，讓燒杯靜置，借助于碳化硅粉將上清液加入到Nicotiana glutinosa中，該植物是TMV鑒別植物種并已經(jīng)建立了8片真葉植物病理學(xué)實驗法，Shoji Sato，Masao Goto和Yoji Doi(編著)，Kodansha Ltd.)。將Nicotiana glutinosa在20℃人工氣候室中進(jìn)行管理，計數(shù)施用后6天出現(xiàn)的局部損害數(shù)量，測定葉片面積，通過以下公式，根據(jù)每單位面積的損害數(shù)，測定防治效價。
防治效價＝100-(處理組每單位面積的損害數(shù)/對照組每單位面積的損害數(shù))×100結(jié)果見表22。圖21顯示發(fā)病時的樣品外觀。
表22

實施例26對甜瓜枯斑病毒感染的抑制將20粒甜瓜種子(品種Earl′s Miyabi)放入9cm培養(yǎng)皿中，該皿中襯有濾紙并加有4.25ml蒸餾水，讓它們在25℃萌發(fā)2天。將25孔小室中裝入50ml Kureha園土，將萌發(fā)的種子放在該土壤上，然后用50ml滅菌土壤覆蓋該小室。秧苗在25℃人工氣候室中培養(yǎng)。試驗所用的接種物制備如下將冷凍在-30℃的2g甜瓜枯斑病毒感染的葉片(病毒來源日本長崎的Isahaya的大田)放入研缽中，在10ml 1/15M的磷酸緩沖液(pH 6.98)中研磨葉片。所得研磨勻漿通過雙層紗布過濾，然后進(jìn)行以下試驗。
將研磨的勻漿(3ml)與用豆腐渣培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)8天的3ml BAL菌培養(yǎng)液混合在一起，容器用石蠟?zāi)っ芊?，然后放?5℃培養(yǎng)箱中。在5小時和22小時后，借助于碳化硅粉將其加入到甜瓜子葉上(按照實施例25)。作為對照組，提供了施用研磨勻漿和磷酸緩沖液的一組。施用后，植物在25℃人工氣候室中進(jìn)行管理。在應(yīng)用后7或8天，計數(shù)出現(xiàn)在子葉上的局部損害的數(shù)量，求出每片子葉上的損害數(shù)量，通過以下公式測定防治效價。混合5小時后的防治效價為3.3，混合22小時后的防治效價為80。
防治效價＝100-(處理組每片子葉上的損害數(shù)量/對照組每片子葉上的損害數(shù)量)×100結(jié)果見表23。圖21顯示發(fā)病時的樣品外觀。
表23

工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，可對由植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖所致植物病害進(jìn)行生物防治。
本文引用的所有出版物、專利及專利申請都通過引用全部結(jié)合到本文中。
序列表<110>ITSUKI Co.，Ltd.
<120>用芽孢桿菌屬細(xì)菌防治植物病害的方法和防治劑<130>PH-2257-PCT<150>JP 2004-55059<151>2004-02-27<150>JP 2004-216083<151>2004-07-23<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1545<212>DNA<213>Bacillus sp.
<400>1tggagagttt gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 60agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg120taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc180tgaacygcat ggttcagaca taaaaggtgg cttyggctac cacttacaga tggacccgcg240gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga300gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt360agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt420tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac480cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg540
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權(quán)利要求
1.一種植物病害防治劑或防治材料，所述防治劑或防治材料包含能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖的芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌。
2.權(quán)利要求1的防治劑或防治材料，其中能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒感染或增殖的所述芽孢桿菌屬細(xì)菌是DAIJU-SIID2550菌株或其突變體，該菌株的保藏號為FERM BP-10114。
3.權(quán)利要求1的防治劑或防治材料，其中所述植物病原細(xì)菌是土壤桿菌屬(Agrobacterium)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)或黃單胞菌屬(Xanthomonas)細(xì)菌，并且所述植物病害是由它們引起的。
4.權(quán)利要求1的防治劑或防治防治材料，其中所述植物病原真菌是氣傳真菌或土傳真菌，并且所述植物病害是由它們引起的。
5.權(quán)利要求1的防治劑或防治材料，其中所述植物病原病毒是煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus)、辣椒輕型斑駁病毒(Pepper mildmottle virus)、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus)、甜瓜枯斑病毒(Melonnecrotic spot virus)、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottlemosaic virus)或Kyuri綠斑駁花葉病毒(Kyuri green mottle mosaicvirus)，并且所述植物病害是由它們引起的。
6一種防治植物病害的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1的防治劑或防治材料施用于植物病原細(xì)菌、真菌或病毒的宿主植物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述植物屬于十字花科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、百合科(Liliaceae)、豆科(Leguminosae)、菊科(Asteraceae)、藜科(Chenopodiaceae)、禾本科(Grammeae)、薔薇科(Rosaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、報春花科(Primulaceae)、蕓香科(Rutaceae)、葡萄科(Vitaceae)、獼猴桃科(Actinidiaceae)、柿樹科(Ebenaceae)、傘形科(Umbelliferae)、旋花科(Convolvulaceac)或天南星科(Araceae)。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述防治劑或防治材料通過至少一種選自以下的處理施用于植物用所述細(xì)菌給植物種子包衣，將植物種子浸泡在含有所述細(xì)菌的懸液中，將所述細(xì)菌灌溉到植物栽培用土壤中，將所述細(xì)菌摻入到植物栽培用土壤中，將所述細(xì)菌噴灑在植物莖葉上，以及使所述細(xì)菌接觸植物損害。
9.一種新的芽孢桿菌屬菌株即DAIJU-SIID2550，其保藏號為FERM BP-10114。
全文摘要
提供用于生物防治由植物病原細(xì)菌、真菌或病毒所致的植物病害的防治劑或防治防治材料；提供使用所述防治劑或防治材料防治植物病害的方法；還提供其中所使用的細(xì)菌。換句話說，植物病害防治劑或防治材料含有屬于芽孢桿菌屬而且能夠抑制植物病原細(xì)菌、真菌或病毒的感染或其生長的細(xì)菌；將所述防治劑或防治材料施用于植物的方法；以及其中所使用的細(xì)菌。
文檔編號C12N1/20GK1946297SQ20058001289
公開日2007年4月11日 申請日期2005年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者油木大樹, 木曾皓 申請人:株式會社樹