專利名稱：用于植物中克隆表達(dá)的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于生成克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物與用于在這些細(xì)胞系和植物中表達(dá)基因產(chǎn)物的系統(tǒng)和方法。根據(jù)某些本發(fā)明方法，將含有一以可操作方式與一啟動(dòng)子連接的感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入一植物或其一部分。利用含有所述病毒載體的植物材料(例如，葉片部分)形成克隆根系，例如，通過使植物材料與發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)接觸以形成發(fā)根。所述發(fā)根源自單個(gè)祖細(xì)胞且因此為克隆的。這些克隆根系含有所述病毒載體且可表達(dá)所述感興趣多核苷酸。克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物自克隆根獲得。根據(jù)本發(fā)明某些其它方法，將含有一以可操作方式與一啟動(dòng)子連接的感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入保持在培養(yǎng)中的植物細(xì)胞系細(xì)胞(例如，預(yù)先存在或新近得到者)。通過(例如)連續(xù)多輪富集直至得到展現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞群體來獲得表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系。使用標(biāo)準(zhǔn)方法自所述克隆植物細(xì)胞系獲得其細(xì)胞含有所述病毒載體的克隆植物。本發(fā)明提供利用本發(fā)明方法生成的克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物。
背景技術(shù)：
鑒定有潛在預(yù)防和治療用途分子(抗體、酶、激素和疫苗抗原)的研究對(duì)于健康與醫(yī)療事業(yè)具有極為重要的意義。在歷史上，這些分子中有許多回收自人類或動(dòng)物來源。然而，來源材料中目標(biāo)產(chǎn)物的低含量加之高成本且更為重要的是安全性已限制了治療劑和疫苗在世界范圍內(nèi)諸多疾病預(yù)防與治療中的實(shí)用性。
在20世紀(jì)70年代中期，重組DNA技術(shù)使工藝發(fā)生了根本性改變且使在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中主要產(chǎn)生目標(biāo)分子成為可能。盡管原核表達(dá)系統(tǒng)仍是廣泛采用的用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，但這種平臺(tái)具有其局限性，原因在于(例如)不具備真核生物的轉(zhuǎn)譯后修飾和不能正確折疊諸多復(fù)雜的人類蛋白質(zhì)。在剛過去的30年間，許多研究實(shí)驗(yàn)室已將其注意力集中在研發(fā)能夠克服細(xì)菌系統(tǒng)缺點(diǎn)的表達(dá)重組蛋白質(zhì)的替代系統(tǒng)上。這些研究的成果是動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。盡管已利用這些系統(tǒng)生產(chǎn)了諸如單克隆抗體、疫苗和治療劑等許多產(chǎn)品，但就每一目標(biāo)蛋白質(zhì)而言高生產(chǎn)成本以及對(duì)高度復(fù)雜制造設(shè)備的需求仍推動(dòng)了人們對(duì)不同生產(chǎn)系統(tǒng)的探索。
在最近數(shù)年間，已逐漸利用植物作為用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的宿主系統(tǒng)。例如，可如下達(dá)成所述表達(dá)，通過將感興趣基因整合至植物基因組以形成能夠穩(wěn)定表達(dá)期望蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物，或通過將所述感興趣基因?qū)肽軌驅(qū)氩簳r(shí)保持在植物細(xì)胞中的植物載體中。已證明病毒載體系統(tǒng)特別有用。
然而，仍存在研發(fā)在植物中表達(dá)感興趣分子的改良系統(tǒng)的需求。例如，病毒會(huì)感染非目標(biāo)植物，從而可能會(huì)造成明顯的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)性。并且，許多可用的工程植物病毒不能以期望水平及/或在期望的目標(biāo)植物或組織中表達(dá)插入基因。此外，各種現(xiàn)有病毒載體系統(tǒng)的一缺點(diǎn)是病毒穩(wěn)定性未得到解決。一般而言，業(yè)內(nèi)需要能夠使靈活性和可控性更強(qiáng)的植物表達(dá)系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涵蓋以下認(rèn)識(shí)，用于植物的克隆表達(dá)系統(tǒng)的利用能夠提供多種明顯優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供用于生成多種源自植物的克隆實(shí)體的方法和試劑。這些克隆實(shí)體包括克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于在源自各種植物組織(例如，根，葉)的克隆細(xì)胞系中與在源自單個(gè)細(xì)胞的完整植物(克隆植物)中表達(dá)多核苷酸和多肽產(chǎn)物的方法和試劑。所述方法基于各種類型植物病毒載體的使用。
例如，一方面，本發(fā)明提供一種獲得一可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆根系的方法，其包括以下步驟(i)將一含有一感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入一植物或其一部分；和(ii)自所述植物生成一或多種克隆根系。例如，可通過用可引起發(fā)根形成的土壤桿菌(例如，發(fā)根土壤桿菌)感染植物或植物一部分(例如，收獲到的一片葉片)生成所述克隆根系?？梢愿鞣N方式對(duì)克隆根系加以篩選以鑒定出保留病毒的各系、高水平表達(dá)感興趣多核苷酸的各系，等等。本發(fā)明進(jìn)一步提供克隆根系(例如，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的克隆根系)且進(jìn)一步涵蓋使用所述克隆根系表達(dá)多核苷酸和產(chǎn)生感興趣多肽的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種生成一可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆根細(xì)胞系的方法，其包括以下步驟(i)生成一克隆根系，所述克隆根系的細(xì)胞包含一其基因組含有一感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)自所述克隆根釋放各個(gè)細(xì)胞系；和(iii)在適于根細(xì)胞增殖的條件下保持所述細(xì)胞。本發(fā)明提供克隆根細(xì)胞系和使用所述克隆根細(xì)胞系表達(dá)多核苷酸和產(chǎn)生多肽的方法。
另一方面，本發(fā)明提供一種生成一可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系的方法，其包括以下步驟(i)生成一克隆根系，所述克隆根系細(xì)胞包含一其基因組含有一感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)自所述克隆根釋放各個(gè)細(xì)胞系；和(iii)在適于植物細(xì)胞增殖的條件下將所述細(xì)胞保持培養(yǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種生成一可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系的方法，其包括以下步驟(i)將含有一感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入一保持在培養(yǎng)中的植物細(xì)胞系的細(xì)胞中；和(ii)富集含有所述病毒載體的細(xì)胞。例如，富集可如下實(shí)施(i)自所述培養(yǎng)物中取出一部分所述細(xì)胞；(ii)稀釋所述取出的細(xì)胞以降低細(xì)胞濃度；(iii)使經(jīng)稀釋的細(xì)胞進(jìn)行增殖；和(iv)篩選含有所述病毒載體的細(xì)胞。可使用克隆植物細(xì)胞系產(chǎn)生感興趣多肽。
本發(fā)明特征是用于生成克隆植物的多種方法，所述克隆植物的細(xì)胞包含一含有一感興趣多核苷酸的病毒載體。例如，本發(fā)明提供一種生成一可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆植物的方法，其包括以下步驟(i)生成一克隆根系，所述克隆根系的細(xì)胞包含一其基因組含有一感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)自所述克隆根釋放各個(gè)細(xì)胞系；和(iii)在適于形成植株的條件下保持所述細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種生成一可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆植物的方法，其包括以下步驟(i)生成一克隆植物細(xì)胞系，所述克隆植物細(xì)胞系的細(xì)胞包含一其基因組含有一感興趣多核苷酸的病毒載體；和(ii)在適于形成植株的條件下保持所述細(xì)胞。一般而言，所述克隆植物可表達(dá)任何感興趣多核苷酸。所述克隆植物可用于產(chǎn)生感興趣多肽。
本申請(qǐng)案參閱了各種專利、專利申請(qǐng)案和公開案。這些專利案的內(nèi)容均以引用方式并入本文中。此外，下列出版物也以引用方式并入本文中Current Protocols inMolecular Biology、Current Protocols in Immunology、Current Protocols in Protein Science和Current Protocols in Cell Biology，均由John Wiley&Sons，N.Y.出版，2002年7月的版本；Sambrook、Russell和Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，2001；Slater，A.、Scott，N.W.和Fowler，M.R.，Plant Biotechnology，Oxford University Press，2003。當(dāng)本發(fā)明說明書與并入的參考文獻(xiàn)間存在沖突時(shí)，以本說明書為準(zhǔn)。
圖1呈現(xiàn)構(gòu)建含有一感興趣多核苷酸的基于TMV的病毒構(gòu)造的示意圖。所述圖的上部分顯示基于TMV的病毒構(gòu)造的基因組組構(gòu)的圖解(D4)，且下部分顯示插入感興趣多核苷酸(例如，編碼hGH、GCSF、GFP等的基因，以“目標(biāo)”表示)后的相同構(gòu)造。對(duì)于病毒復(fù)制需要126/183kDa蛋白質(zhì)。30kD蛋白質(zhì)是可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間移動(dòng)的移動(dòng)蛋白(MP)。箭頭指示次基因組啟動(dòng)子的位置。經(jīng)插入多核苷酸的轉(zhuǎn)錄受TMVCP次基因組啟動(dòng)子控制。所述構(gòu)造的3’部分包括TMV外被蛋白序列和非轉(zhuǎn)譯區(qū)。這些部分是可選的。
圖2呈現(xiàn)構(gòu)建含有一感興趣多核苷酸的基于TMV的病毒構(gòu)造的示意圖。所述圖的上部分顯示基于TMV的病毒構(gòu)造的基因組組構(gòu)的示意圖(30B)。下部分顯示插入感興趣多核苷酸(例如，編碼hGH、GCSF、GFP等的基因，以“目標(biāo)”表示)后的相同構(gòu)造。對(duì)于病毒復(fù)制需要126/183kDa蛋白質(zhì)。30kD蛋白質(zhì)是可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間移動(dòng)的移動(dòng)蛋白(MP)。CP可介導(dǎo)系統(tǒng)擴(kuò)散的外被蛋白。箭頭指示次基因組啟動(dòng)子的位置。經(jīng)插入多核苷酸的轉(zhuǎn)錄受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。CP表達(dá)受內(nèi)源CP啟動(dòng)子控制。所述構(gòu)造的3’部分包括TMV外被蛋白序列和非轉(zhuǎn)譯區(qū)。這些部分是可選的。
圖3呈現(xiàn)一構(gòu)建基于TMV的病毒構(gòu)造的示意圖，所述構(gòu)造含有一感興趣多核苷酸和一編碼用于檢測(cè)及/或選擇的標(biāo)記物的基因。所述圖的上部分顯示基于TMV的病毒構(gòu)造的基因組組構(gòu)(D4)。所述圖的中間部分顯示插入一替代MP編碼序列的可檢測(cè)標(biāo)記物(GFP)編碼基因后的相同構(gòu)造。所述圖的下部分顯示插入感興趣多核苷酸(例如，編碼hGH、GCSF、GFP等的基因，以“目標(biāo)”表示)后的相同構(gòu)造。對(duì)于病毒復(fù)制需要126/183kDa蛋白質(zhì)。箭頭指示次基因組啟動(dòng)子的位置。所述可檢測(cè)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄受MP次基因組啟動(dòng)子控制。經(jīng)插入感興趣多核苷酸的轉(zhuǎn)錄受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制。所述構(gòu)造的3’部分包括TMV外被蛋白序列和非轉(zhuǎn)譯區(qū)。這些部分是可選的。
圖4呈現(xiàn)一構(gòu)建基于TMV的病毒構(gòu)造的示意圖，所述構(gòu)造含有一感興趣多核苷酸和一編碼用于檢測(cè)及/或選擇的標(biāo)記物基因。所述圖的上部分顯示基于TMV的病毒構(gòu)造基因組組構(gòu)(D4)。所述圖的中間部分顯示插入一替代MP編碼序列的選擇標(biāo)記物(編碼卡那霉素抗性的基因)編碼基因后的相同構(gòu)造。所述圖的下部分顯示插入感興趣多核苷酸(例如，編碼hGH、GCSF、GFP等的基因，以“目標(biāo)”表示)后的相同構(gòu)造。對(duì)于病毒復(fù)制需要126/183kDa蛋白質(zhì)。箭頭指示次基因組啟動(dòng)子的位置。所述選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄受TMV MP次基因組啟動(dòng)子控制。經(jīng)插入感興趣多核苷酸的轉(zhuǎn)錄受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制。所述構(gòu)造的3’部分包括TMV外被蛋白序列和非轉(zhuǎn)譯區(qū)。這些部分是可選的。
圖5呈現(xiàn)一構(gòu)建基于AlMV的病毒構(gòu)造的示意圖，所述構(gòu)造含有一作為獨(dú)立開放閱讀框或作為與AlMV CP編碼序列的基因融合體的感興趣多核苷酸。所述圖的上部分顯示AIMV的RNA3基因組組構(gòu)，其包含編碼CP和MP的基因且含有5’及3’UTR和一次基因組啟動(dòng)子。所述圖的左側(cè)顯示一構(gòu)造，其中含有編碼感興趣多肽(以“目標(biāo)”表示)和AlMV CP的分開的開放閱讀框的mRNA轉(zhuǎn)錄受AlMV次基因組啟動(dòng)子控制。所述圖的右側(cè)顯示一構(gòu)造，其中包含一含有感興趣多核苷酸和CP編碼序列的單個(gè)開放閱讀框的mRNA轉(zhuǎn)錄受AlMV CP次基因組啟動(dòng)子控制。所述開放閱讀框編碼一其中感興趣多肽與CP融合的融合蛋白。
圖6A至6E闡明用于生成表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆根系方法中的步驟(在圖中以“目標(biāo)”表示)。圖6E顯示克隆根系。圖6F以較高放大率水平顯示克隆根系。圖6G顯示克隆根系中的GFP表達(dá)，所述克隆根系的細(xì)胞包含一編碼GFP的病毒載體。
圖7A至7C顯示證明3個(gè)源自植物細(xì)胞的克隆根系中GFP產(chǎn)生的Western印跡分析，所述細(xì)胞中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的GFP編碼基因的病毒載體。圖7A顯示在培養(yǎng)物中繁殖30天后(即，自其來源的葉片上分離下根后30天)的克隆根系中的GFP表達(dá)。圖7B顯示在培養(yǎng)物中繁殖60天后(即，自其來源的葉片上分離下根后60天)的克隆根系中的GFP表達(dá)。C-代表不含蛋白質(zhì)的對(duì)照泳道。MWM代表分子量標(biāo)準(zhǔn)。GFP-R代表來自克隆根系的樣品。GFP-P代表分離自與生成克隆根系所用者相同的構(gòu)造感染的植物葉片組織的GFP。圖7C是顯示抗GFP抗體識(shí)別市售GFP蛋白質(zhì)的對(duì)照。圖8A和8B顯示產(chǎn)生hGH和GFP的克隆根系的照片。圖8A顯示在正常光照條件下拍攝的兩個(gè)克隆根系的照片。左側(cè)皿顯示源自一植物細(xì)胞的克隆根系，所述植物細(xì)胞中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的人類生長激素(hGH)編碼基因的病毒載體。右側(cè)皿顯示源自另一植物細(xì)胞的克隆根系，所述植物細(xì)胞中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因的病毒載體。圖8B顯示在UV燈下拍攝的與圖8A中所示相同的克隆根系的照片，其展現(xiàn)GFP的表達(dá)。
圖9顯示篩選各自源自各個(gè)植物細(xì)胞的克隆根系的Western印跡分析，所述植物細(xì)胞用其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的人類生長激素(hGH)編碼基因的病毒載體感染。在自其來源的葉片上分離下根后30天篩選根系。展現(xiàn)高水平表達(dá)的根系以箭頭表示。C-代表不含蛋白質(zhì)的對(duì)照泳道。MWM代表分子量標(biāo)準(zhǔn)。hGH代表重組的人類生長激素。
圖10顯示展現(xiàn)所選源自植物細(xì)胞的克隆根系中hGH產(chǎn)生的Western印跡分析，所述植物細(xì)胞中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的hGH編碼基因的病毒載體。在自其來源的葉片上分離下根后進(jìn)行10次繼代培養(yǎng)后實(shí)施所述分析。C-代表不含蛋白質(zhì)的對(duì)照泳道。MWM代表分子量標(biāo)準(zhǔn)。hGH代表重組的人類生長激素。
圖11A和11B顯示篩選各自源自各個(gè)植物細(xì)胞的克隆根系的Western印跡分析，所述植物細(xì)胞用其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的人類生長激素(GCSF)編碼基因的病毒載體感染。自其來源的葉片上分離下根后30天篩選根系。展現(xiàn)高水平表達(dá)的根系以箭頭表示。C-代表不含蛋白質(zhì)的對(duì)照泳道。MWM代表分子量標(biāo)準(zhǔn)。GCSF代表重組的人類粒細(xì)胞集落刺激因子。
圖12顯示展現(xiàn)所選源自植物細(xì)胞的克隆根系中GCSF產(chǎn)生的Western印跡分析，所述植物細(xì)胞中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的GCSF編碼基因的病毒載體。在自其來源的葉片上分離下根后進(jìn)行10次繼代培養(yǎng)后實(shí)施所述分析。C-代表不含蛋白質(zhì)的對(duì)照泳道。MWM代表分子量標(biāo)準(zhǔn)。GCSF代表重組的人類粒細(xì)胞集落刺激因子。
圖13闡明生成表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系和鑒定可展示表達(dá)的細(xì)胞系的方法。圖13A顯示其中插入的感興趣多核苷酸受TMV CP啟動(dòng)子控制的病毒載體。圖13B顯示其中導(dǎo)入所述載體的原生質(zhì)體懸浮液(左側(cè)皿)或其中導(dǎo)入不含GFP編碼多核苷酸的載體的對(duì)照原生質(zhì)體懸浮液(右側(cè)皿)。所述照片在UV燈下拍攝且顯示出含有所述GFP編碼表達(dá)載體的原生質(zhì)體中GFP的表達(dá)。圖13C顯示其中導(dǎo)入GFP編碼載體的原生質(zhì)體懸浮液。所述照片在UV燈下拍攝。插圖(圖13D)顯示更高放大率的GFP-表達(dá)細(xì)胞，同樣在UV燈下拍攝。圖13E是照片顯示可表達(dá)GFP的植物細(xì)胞系的富集。所述照片在正常光照下拍攝，源自所述原生質(zhì)體懸浮液的各個(gè)植物細(xì)胞系示于圖13C中。圖13F是在UV燈下拍攝的與圖13C中所示相同皿的照片。對(duì)表達(dá)GFP細(xì)胞系進(jìn)行富集的培養(yǎng)物明顯有綠色熒光斑點(diǎn)。
圖14顯示展現(xiàn)源自植物細(xì)胞的克隆植物細(xì)胞系中GCSF產(chǎn)生的Western印跡分析，所述植物細(xì)胞中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的GCSF編碼基因的病毒載體。圖14A顯示導(dǎo)入所述載體后48小時(shí)實(shí)施的Western印跡分析。圖14B顯示接種后57天實(shí)施的使用與圖14A中所示相同細(xì)胞系實(shí)施的Western印跡分析。GCSF-COM指示其中上樣作為陽性對(duì)照的重組GCSF蛋白質(zhì)的泳道。MWM表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。C-表示上樣來自不表達(dá)GCSF的植物的植物提取物的泳道。
圖15顯示源自植物細(xì)胞的植物細(xì)胞系中的GFP產(chǎn)生，所述植物細(xì)胞中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的GFP編碼基因的病毒載體。圖15A顯示對(duì)可表達(dá)GFP植物細(xì)胞系的富集。圖15B顯示源自一克隆植物細(xì)胞系的愈傷組織，所述克隆植物細(xì)胞系中導(dǎo)入了類似但不編碼GFP的病毒載體。這些照片在將所述載體導(dǎo)入細(xì)胞(圖15A中克隆來源于所述細(xì)胞)后3個(gè)月時(shí)拍攝。兩種照片均在UV燈下拍攝。
圖16A顯示自源自植物細(xì)胞的克隆根系得到克隆植物，所述植物細(xì)胞中導(dǎo)入了編碼hGH的病毒載體。圖16B顯示敏感性宿主植物中的損傷形成，所述宿主植物用來自所述克隆植物的小葉片樣品接種，表明自所述克隆根系再生的克隆植物保持著活躍的病毒復(fù)制。為測(cè)試所述植物是否保持病毒復(fù)制，用小葉片樣品接種作為用于形成局部損傷宿主的煙草品種。接種2天內(nèi)的損傷形成(見箭頭)表明自克隆根系再生的克隆植物系保持著活躍的病毒復(fù)制。
圖17呈現(xiàn)可感染植物的某些病毒家族的圖示。
圖18顯示煙草花葉病毒基因組的代表性實(shí)例。
具體實(shí)施例方式
定義約提及數(shù)值時(shí)“約”包括在任一方向(大于或小于)上介于該數(shù)值5％范圍內(nèi)的數(shù)值，但上下文中另有明確說明或指明者除外(除非此數(shù)值超過一可能數(shù)值的100％)。當(dāng)提及范圍時(shí)，兩端數(shù)值均包括在所述范圍內(nèi)，但上下文中另有明確說明或指明者除外。
克隆的就本發(fā)明目的而言，術(shù)語克隆的當(dāng)應(yīng)用于(例如)植物或諸如根、葉、莖等植物組織時(shí)表示，所述植物或植物組織源自單個(gè)祖細(xì)胞。一般而言，除可能在后代細(xì)胞出現(xiàn)的體細(xì)胞突變或其它基因改變外(例如，通過在后代細(xì)胞中天然或人工導(dǎo)入新基因、端?？s短，等等)所述細(xì)胞或克隆植物或植物組織在遺傳上是相同的。通常所述細(xì)胞的基因組會(huì)具有至少95％的一致性、至少98％的一致性、至少99％的一致性、至少99.5％的一致性、至少99.9％的一致性。
基因就本發(fā)明目的而言，術(shù)語基因具有其業(yè)內(nèi)習(xí)知含義。一般而言，除編碼序列(開放閱讀框)外用基因來涵蓋基因調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，等等)及/或內(nèi)含子序列。應(yīng)進(jìn)一步了解的是，基因的定義可包括如下核酸，其并不編碼蛋白質(zhì)而是提供轉(zhuǎn)錄功能RNA分子(諸如tRNA、rRNA、微小RNA(miRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、短干擾RNA(siRNA)，等等)的模板。為清楚起見我們指出，本申請(qǐng)案所用術(shù)語“基因”一般指包括編碼蛋白質(zhì)部分的核酸；所述術(shù)語可視情況涵蓋調(diào)控序列，諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子，等等。此定義并非意欲排除術(shù)語“基因”在非蛋白質(zhì)編碼表達(dá)單元方面的應(yīng)用，而是意欲闡明，在大多數(shù)情形中，本案所用術(shù)語基因指蛋白質(zhì)編碼核酸。
基因產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物一般而言，基因產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物是由基因或多核苷酸轉(zhuǎn)錄而來的RNA或由自基因或多核苷酸轉(zhuǎn)錄而來的RNA編碼的多肽?；蚧蚨嗪塑账岬谋磉_(dá)指(i)由所述基因或多核苷酸轉(zhuǎn)錄成RNA；(ii)由所述基因或多核苷酸轉(zhuǎn)錄的RNA的轉(zhuǎn)譯，或指(i)和(ii)二者。諸如加工、移位等其它步驟也可在表達(dá)過程中或隨后發(fā)生。
分離的本文所用術(shù)語“分離的”指化合物或?qū)嶓w以下列方式得到1)與至少某些通常與其結(jié)合的組份分開(例如，純化的)；2)活體外合成；及/或3)通過涉及人工操作的方法產(chǎn)生或制備。
天然地本文所用術(shù)語“天然地”或“天然存在的”指在天然狀態(tài)下以其相關(guān)形式發(fā)生的過程、事件或事情。相反，“非天然存的”、“人工的”或“合成的”指其存在或形式涉及人工操作的過程、事件或事情。
以可操作方式連接的本文所用術(shù)語以可操作方式連接的指兩個(gè)核酸或兩個(gè)多肽之間的關(guān)系，其中一個(gè)核酸或多肽的表達(dá)受到另一核酸或多肽的控制、調(diào)控、調(diào)節(jié)等等。例如，核酸序列的轉(zhuǎn)錄由以可操作方式連接的啟動(dòng)子序列引導(dǎo)；核酸序列的轉(zhuǎn)錄后加工由以可操作方式連接的加工序列引導(dǎo)；核酸序列的轉(zhuǎn)譯由以可操作方式連接的轉(zhuǎn)譯調(diào)控序列引導(dǎo)；核酸或多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)或定位由以可操作方式連接的轉(zhuǎn)運(yùn)或定位序列引導(dǎo)；且多肽的轉(zhuǎn)譯后加工由以可操作方式連接的加工序列引導(dǎo)。較佳地，以可操作方式連接于另一核酸或多肽的核酸或多肽序列是以直接或間接方式共價(jià)連接于此一序列上，但亦可接受任何有效的三維聯(lián)系。需注意的是，單個(gè)核酸或多肽序列可以可操作方式與多個(gè)其它序列連接。例如，單個(gè)啟動(dòng)子可引導(dǎo)多個(gè)RNA物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。
百分比(％)一致性提及多核苷酸時(shí)，將“百分比(％)一致性”定義為，在比對(duì)所述序列且引入空位(需要時(shí))以達(dá)成最大百分比序列一致性后，一多核苷酸序列中同與之進(jìn)行比較的特定核酸序列中核苷酸殘基相一致的核苷酸殘基的百分比。提及多肽時(shí)，將“百分比(％)一致性”定義為，在比對(duì)所述序列且引入空位(需要時(shí))以達(dá)成最大百分比序列一致性后，一多肽序列中同與之進(jìn)行比較的特定多肽序列中氨基酸殘基相一致的氨基酸殘基百分比。
可以所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的多種方法實(shí)施比對(duì)，例如可使用公用計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于測(cè)量比對(duì)的適宜參數(shù)，包括在經(jīng)比較的全長序列上達(dá)成最大比對(duì)所需要的任何演算法。美國專利公開案第20030211568號(hào)闡述了諸多適宜方法。
感興趣多核苷酸本文所用術(shù)語“感興趣多核苷酸”指如本文所述擬在植物細(xì)胞中表達(dá)的任何目標(biāo)核酸序列。在許多實(shí)施例中，所述感興趣多核苷酸會(huì)是編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸(在此情形中經(jīng)編碼多肽可稱作感興趣多肽或蛋白質(zhì))，但也可是為結(jié)構(gòu)RNA或活性RNA(諸如核糖酶、干擾RNA鏈，等等)的轉(zhuǎn)錄提供模板的序列。如本文所述，所述多核苷酸常常是并非在自然界中于相關(guān)類型植物細(xì)胞中表達(dá)的基因，或者是當(dāng)通過人工操作干預(yù)達(dá)成表達(dá)時(shí)并非以所述多核苷酸表達(dá)水平表達(dá)的基因。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述多核苷酸包括天然狀態(tài)下相關(guān)植物細(xì)胞中根本不存在的基因序列；常常包括在天然狀態(tài)下存在于其它細(xì)胞類型或生物體中的基因序列?；蛘呋虼送?，感興趣多核苷酸是在天然狀態(tài)下不與根據(jù)本發(fā)明與之相連的載體序列相連接的多核苷酸。詞語多核苷酸在本文中可與“核酸”或“核酸分子”互換使用。
純化的本文所用“純化的”表示一或多種化合物或?qū)嶓w(例如，一或多種化合物或?qū)嶓w)與其天然存在的環(huán)境分開?；衔锘?qū)嶓w可經(jīng)部分純化、大體純化或是純凈的，當(dāng)其自大體所有其它化合物或物質(zhì)中分離出來時(shí)為純凈的，即，較佳至少為至少約90％、更佳至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99％以上純。在述及核酸分子制劑時(shí)，如果以分子/分子計(jì)、w/w計(jì)或以二者計(jì)所述核酸占制劑中所有核酸分子的至少50％、較佳至少75％、更佳至少90％或更高(如上所列示)，則可認(rèn)為所述制劑大體上是純凈的。在述及多肽制劑時(shí)，如果以分子/分子計(jì)、w/w計(jì)或以二者計(jì)所述多肽占制劑中所有多肽的至少50％、較佳至少75％、更佳至少90％或更高(如上所列示)，則可認(rèn)為所述制劑大體上是純凈的。部分或大體純凈的核酸或多肽可自其天然共存物質(zhì)(例如，細(xì)胞物質(zhì)，諸如其它細(xì)胞蛋白質(zhì)及/或核酸)以至少50％、至少60％、至少70％或至少80％、至少90％等百分比加以分離。
重組的“重組”分子指曾通過人工操作加以改造或源自此一分子(例如，由其復(fù)制)的分子。重組多核苷酸通常包含在天然狀態(tài)下不與之連在一起的序列及/或不同于天然存在序列的序列?？蓪⒔?jīng)擴(kuò)增或組裝的重組多核苷酸納入適宜載體中，且所述載體可用于轉(zhuǎn)化適宜細(xì)胞，可將所述細(xì)胞稱作“重祖細(xì)胞”。然后可在重祖細(xì)胞中表達(dá)所述核苷酸以產(chǎn)生(例如)“重組多肽”。重組多核苷酸還可行使非編碼功能(例如，啟動(dòng)子，復(fù)制起始點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，等等)。重組核酸(例如，重組病毒核酸)可以是其中一或多個(gè)以天然存在形式存在的序列已經(jīng)刪除或由不同序列取代或其中已插入非天然序列的病毒核酸。“重組多肽”通常包含天然狀態(tài)下不與之連在一起的序列及/或不同于天然存在序列的序列。重組多肽的一實(shí)例是融合蛋白，例如，含有兩個(gè)或兩個(gè)以上不同蛋白質(zhì)或肽(其可以是天然或合成的且可以是天然存在或合成多肽的一部分)的蛋白質(zhì)。可如下形成編碼一融合蛋白的重組多核苷酸，自編碼第一蛋白質(zhì)或肽的多核苷酸上去除終止密碼子并在框內(nèi)加入編碼第二蛋白質(zhì)或肽的多核苷酸，以使所得重組多核苷酸編碼含有兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽的單個(gè)重組多肽。
提及核酸時(shí)，術(shù)語“調(diào)控元件”或“調(diào)控序列”在本文中用來描述可引導(dǎo)或增強(qiáng)與之以可操作方式連接的核酸序列的一或多個(gè)表達(dá)步驟(特別是轉(zhuǎn)錄，但在一些情形中包括其它事件，諸如剪接或其它加工)的核酸的一部分。所述術(shù)語包括啟動(dòng)子且也指增強(qiáng)子和其它轉(zhuǎn)錄控制元件。啟動(dòng)子是如下核酸區(qū)，其包括在起始轉(zhuǎn)錄之前RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)且通常是發(fā)生轉(zhuǎn)錄(即使是基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄)所必需的。通常這些元件包含一TATA框。增強(qiáng)子是包括可提高近處或遠(yuǎn)處啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(通常高于沒有增強(qiáng)子時(shí)存在的某一基礎(chǔ)表達(dá)水平)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)的核酸區(qū)。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，調(diào)控序列可引導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)(例如，大部分或所有細(xì)胞類型在典型生理?xiàng)l件下于培養(yǎng)物中或于生物體中的表達(dá))；在其它實(shí)施例中，調(diào)控序列可引導(dǎo)細(xì)胞或組織特異性及/或誘導(dǎo)型表達(dá)。例如，可通過誘導(dǎo)劑(諸如激素或其它小分子)的存在或加入、溫度增加等誘導(dǎo)表達(dá)。調(diào)控元件也可抑制或降低以可操作方式連接的核酸的表達(dá)。
一般而言，可使用用于測(cè)量mRNA或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定表達(dá)水平。這些方法包括Northern印跡分析、原位雜交、RT-PCR、測(cè)序、免疫學(xué)方法，諸如免疫印跡、免疫檢測(cè)或用熒光標(biāo)記抗體染色后的熒光檢測(cè)、寡核苷酸或cDNA微陣列或膜陣列、蛋白質(zhì)陣列分析、質(zhì)譜法，等等。測(cè)定表達(dá)水平的方便方法是將與調(diào)控元件以可操作方式連接的編碼易于檢測(cè)的標(biāo)記物(例如，諸如綠色熒光蛋白或熒光素酶等熒光或發(fā)光蛋白、諸如堿性磷酸酶等酶，等等)的核酸置于表達(dá)載體中；將所述載體導(dǎo)入感興趣細(xì)胞類型或生物體中；將所述細(xì)胞或生物體培養(yǎng)一段時(shí)間；且隨后測(cè)量易于檢測(cè)的標(biāo)記物的表達(dá)，可利用任何使其易于檢測(cè)的性質(zhì)(例如，熒光、發(fā)光、底物光學(xué)性質(zhì)的改變，等等)。比較調(diào)控元件不存在或存在時(shí)的表達(dá)可顯示所述調(diào)控元件影響以可操作方式連接的序列表達(dá)的程度。
自我復(fù)制本文所用“自我復(fù)制”指載體在宿主細(xì)胞復(fù)制自身的能力?？伞白晕覐?fù)制”的載體在其自身基因元件中帶有足夠的信息使其在復(fù)制時(shí)不會(huì)依賴其它基因元件(例如，宿主細(xì)胞進(jìn)行自身基因組復(fù)制所使用的元件)。一般而言，能夠自我復(fù)制的載體是包含至少一個(gè)復(fù)制酶(諸如RNA聚合酶)基因和可能的額外復(fù)制酶基因(諸如解旋酶、甲基轉(zhuǎn)移酶，等等)的載體。在某些情形中，需以順式存在(即，作為載體序列的一部分)的額外序列或其可促進(jìn)自我復(fù)制。應(yīng)了解，自我復(fù)制載體通常會(huì)利用宿主細(xì)胞組份，諸如核苷酸、氨基酸等，且會(huì)依賴于提供所述組份的宿主細(xì)胞的某些功能及/或酶。
載體“載體”指能夠運(yùn)送已與其相連的另一核酸的核酸分子且可包括質(zhì)粒、粘?；虿《据d體。所述載體應(yīng)能夠自主復(fù)制?；蛘呋虼送?，載體可提供一或多種必要或足以進(jìn)行自我復(fù)制或復(fù)制或整合另一個(gè)核酸的組份。載體通常是核酸且可包括DNA及/或RNA。較佳載體保持在染色體之外。
病毒核酸術(shù)語“病毒核酸”指病毒基因組或其一部分(或者，在病毒基因組包括多個(gè)片段的情況下，指所述片段的任一部分或此一片段的一部分)。所述術(shù)語既涵蓋這些核酸的RNA和DNA形式也涵蓋具有互補(bǔ)序列的分子。認(rèn)為與病毒RNA核酸相同或互補(bǔ)的DNA分子是病毒核酸且認(rèn)為與病毒DNA核酸相同或互補(bǔ)的RNA分子是病毒核酸，應(yīng)了解DNA和RNA會(huì)分別在相應(yīng)位置包含T和U。
病毒核酸可包含非病毒來源的一或多個(gè)部分(例如，一部分或所有天然存在的基因、完整人工序列或天然存在序列和人工序列的組合)且可包括來自多個(gè)不同病毒類型的部分。
病毒復(fù)制子術(shù)語“病毒復(fù)制子”指含有足以由病毒復(fù)制酶基因進(jìn)行所述核酸復(fù)制的一部分或多個(gè)部分(順式序列)的核酸分子。通常這些序列包括病毒聚合酶(例如，在基于病毒復(fù)制子的RNA病毒情形中為病毒RNA聚合酶)的識(shí)別位點(diǎn)。
I.克隆植物和植物組織表達(dá)系統(tǒng)如上所述，本發(fā)明提供用于在克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系(例如，源自葉、莖等的細(xì)胞系)和克隆植物中表達(dá)一或多個(gè)感興趣多核苷酸的系統(tǒng)。借助其基因組包括以可操作方式與啟動(dòng)子連接(即，受啟動(dòng)子控制)的感興趣多核苷酸的植物病毒載體將感興趣多核苷酸導(dǎo)入植物祖細(xì)胞中。根據(jù)下文進(jìn)一步闡述的若干技術(shù)中的任一種由含有所述病毒的細(xì)胞構(gòu)建克隆根系或克隆植物細(xì)胞系。可通過注射、用病毒轉(zhuǎn)錄物或感染性cDNA克隆接種、電穿孔、T-DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等將植物病毒載體或其各部分導(dǎo)入植物細(xì)胞。
以下部分闡述植物病毒、植物病毒載體和形成用于本發(fā)明的植物病毒載體的方法。然后闡述本發(fā)明用于生成可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物的方法?！案怠辈煌凇案?xì)胞系”，原因在于根系可產(chǎn)生真實(shí)根狀結(jié)構(gòu)或根而根細(xì)胞系則由不會(huì)形成根狀結(jié)構(gòu)的根細(xì)胞構(gòu)成。術(shù)語“系”的使用意欲表示，所述系的細(xì)胞可增殖且可將遺傳信息傳遞給后代細(xì)胞。細(xì)胞系的細(xì)胞通常在培養(yǎng)物中增殖而不作為有組織結(jié)構(gòu)(諸如那些完整植物中所見者)的一部分。術(shù)語“根系”的使用意欲表示，根結(jié)構(gòu)中細(xì)胞可在作為完整植物一部分的情況下增殖。需注意，術(shù)語“植物細(xì)胞”涵蓋根細(xì)胞。然而，為對(duì)本發(fā)明用于生成根系和根細(xì)胞系的方法與那些用于直接自非根組織生成植物細(xì)胞系(與自克隆根系或源自克隆根系的克隆植物生成克隆植物細(xì)胞系相對(duì))的方法加以區(qū)分，本文所用術(shù)語“植物細(xì)胞”和“植物細(xì)胞系”一般指構(gòu)成非根植物組織的細(xì)胞和細(xì)胞系。植物細(xì)胞可來自(例如)葉、莖、芽、花部分，等等。應(yīng)注意，種子可源自本文所產(chǎn)生的克隆植物。這些種子也會(huì)含有所述病毒載體，由此類種子獲得的的植物也如此。用于獲得種子儲(chǔ)備物的方法為業(yè)內(nèi)熟知。參見(例如)U.S.S.N.10/294,314。
A.植物病毒和植物病毒載體已知有許多病毒可感染各種植物種類，且可用于本發(fā)明的多核苷酸表達(dá)。圖17呈現(xiàn)某些可感染植物的病毒家族的圖示。附錄A提供植物病毒家族的代表性列表，其根據(jù)構(gòu)成病毒基因組的核酸類型(例如，dsDNA、ssDNA、ssRNA、dsRNA或未給定者)列出。額外信息可參見(例如)“The Classification and Nomenclature of Viruses，Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses”(Murphy等人編輯)，Springer VerlagNew York，1995，其全文內(nèi)容以應(yīng)用方式并入本文中；也可參見，Grierson等人，Plant Molecular Biology，Blackie，London，第126-146頁，1984；Gluzman等人，Communications in Molecular BiologyViral Vectors，Cold Spring HarborLaboratory，NY，第172-189頁，1988；Mathew，Plant Viruses Online(http//image.fs.uidaho.edu/vide/)。
天然狀態(tài)下，為進(jìn)入并感染植物細(xì)胞，植物病毒需要穿過細(xì)胞壁以及各個(gè)保護(hù)性的蠟質(zhì)和果膠層。據(jù)認(rèn)為大部分或所有植物病毒是依賴于所述細(xì)胞壁的機(jī)械破裂而不是依賴于細(xì)胞壁表面受體進(jìn)入細(xì)胞的?？赏ㄟ^(例如)細(xì)胞的物理損傷、通過諸如細(xì)菌、真菌、線蟲、昆蟲或螨等可遞送病毒的生物體來造成這一破裂。在實(shí)驗(yàn)室中，通常可簡單地通過在植物上摩擦病毒來將病毒投與給植物細(xì)胞。
某些植物病毒具有分段基因組，其中兩個(gè)或兩個(gè)以上在物理上分開的核酸種類會(huì)一起補(bǔ)充至植物基因組上。例如，可將許多RNA植物病毒基因組分類為單部分、兩部分或三部份基因組，即，其可分別由1、2或3個(gè)核酸組成。在某些情形中，這些分開的片段可一起包裝在同一病毒外被中；在另一些情形中(即，具有分成多份的基因組的病毒)，每一基因組片段可包裝至其各自病毒顆粒中。通?？赏ㄟ^遞送植物病毒核酸(例如，RNA)或含有所述核酸的外被中的任一種來實(shí)現(xiàn)感染。
病毒已進(jìn)入(感染)細(xì)胞后，其通常就會(huì)在經(jīng)感染細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制且隨后局部擴(kuò)散(即，在初始感染的葉片中由一個(gè)細(xì)胞進(jìn)入另一細(xì)胞)。局部擴(kuò)散后，病毒可移動(dòng)至未感染的葉片(例如，植物的上部葉片)，這稱作系統(tǒng)性感染或系統(tǒng)性擴(kuò)散。一般而言，許多植物病毒的細(xì)胞細(xì)胞間擴(kuò)散需要功能性移動(dòng)蛋白(其可使病毒轉(zhuǎn)錄物發(fā)生移動(dòng))而系統(tǒng)性擴(kuò)散需要功能性外被蛋白(且通常也稱作功能性移動(dòng)蛋白，其可促進(jìn)病毒顆粒形成)。
除功能性移動(dòng)和外被蛋白編碼組份外，病毒基因組會(huì)包含局部(例如，細(xì)胞細(xì)胞間)或長距離(例如，系統(tǒng)性)擴(kuò)散所需要或促進(jìn)這種擴(kuò)散所需要的額外組份。這些順式作用組份可以是編碼或非編碼組份。例如，其可對(duì)應(yīng)于病毒轉(zhuǎn)錄物3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)(UTR，也稱作NTR)的部分(即，其可為病毒轉(zhuǎn)錄物3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)的轉(zhuǎn)錄提供模板)。如此重要的病毒組份可以是病毒基因組的編碼或非編碼區(qū)且包括多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)。這些區(qū)可在mRNA的復(fù)制及/或加工或表達(dá)過程中發(fā)揮作用。“功能性蛋白質(zhì)編碼組份”意指含有編碼一功能活性蛋白質(zhì)的編碼部分的多核苷酸，其以可操作方式與充足的諸如啟動(dòng)子等調(diào)控元件連接以便實(shí)現(xiàn)表達(dá)。
為成功建立局部(葉片內(nèi))或系統(tǒng)性感染，病毒必須能夠復(fù)制。許多病毒均包含編碼一或多種可參與復(fù)制過程蛋白質(zhì)(本文稱作復(fù)制蛋白或復(fù)制酶蛋白)的基因。例如，許多RNA植物病毒可編碼RNA聚合酶。也會(huì)需要其它蛋白質(zhì)，例如，解旋酶或甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白。除編碼復(fù)制蛋白的功能基因外，病毒基因組或片段會(huì)包含復(fù)制或促進(jìn)復(fù)制同樣需要的多種序列組份(例如，順式作用序列)。病毒基因組或片段也可包含可促成高水平轉(zhuǎn)錄及/或表達(dá)的順式作用序列。應(yīng)注意，編碼多種病毒蛋白質(zhì)(例如，復(fù)制酶蛋白、移動(dòng)蛋白、外被蛋白)的核酸可存在于不同的病毒核酸分子內(nèi)，其彼此以反式互補(bǔ)。(參見例如，WO 00/25574和同在申請(qǐng)中的美國專利國家申請(qǐng)案第10/770,600號(hào)，題目為“SYSTEM FOR EXPRESSION OF GENES IN PLANTS”，2004年2月3日提出申請(qǐng)。因此在本發(fā)明某些實(shí)施例中，向植物細(xì)胞遞送可共同允許病毒載體復(fù)制(及視情況細(xì)胞至細(xì)胞間及/或長距離移動(dòng))的多個(gè)不同載體，而不是遞送單個(gè)病毒載體。某些或所有所述蛋白質(zhì)可由轉(zhuǎn)基因植物基因組編碼。
可使用基于任何可感染植物的病毒的病毒載體根據(jù)本發(fā)明生成能夠表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆根系、克隆植物細(xì)胞系或克隆植物。尤其較佳病毒是ssRNA病毒，最佳具有一(+)-鏈基因組。用于操作存在于所述病毒中的基因材料的技術(shù)和試劑為業(yè)內(nèi)熟知。通常，例如，制備病毒基因組的DNA拷貝并克隆至微生物載體，特別是細(xì)菌載體。也可使用某些ssDNA病毒，特別包括雙生病毒。應(yīng)了解，一般而言植物病毒載體和病毒核酸(諸如病毒基因組)可以RNA或DNA形式存在。此外，應(yīng)了解，當(dāng)提及存在于DNA載體中的諸如RNA病毒基因組或其一部分等組件時(shí)，所述組件是以RNA形式的DNA拷貝存在。
較佳載體是基于以下病毒，諸如雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)(例如，雀麥花葉病毒屬、苜蓿花葉病毒屬、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒屬)和煙草花葉病毒科(Tobamoviridae)的成員。某些較佳病毒種類包括(例如)苜?；ㄈ~病毒(AlMV)、蘋果萎黃葉斑病毒、蘋果莖溝病毒、大麥條斑花葉病毒、大麥黃矮病毒、甜菜黃化病毒、蠶豆斑駁病毒、蠶豆萎蔫病毒、雀麥花葉病毒(BMV)、康乃馨潛伏病毒、康乃馨斑駁病毒、康乃馨環(huán)斑病毒、胡蘿卜斑駁病毒、木薯潛伏病毒(CLV)、豇豆萎黃斑駁病毒、豇豆花葉病毒(CPMV)、黃瓜綠斑駁花葉病毒病、黃瓜花葉病毒、萵苣傳染黃化病毒、玉米萎黃斑駁病毒、玉米雷亞多精致病毒、玉米條紋病毒(MSV)、歐防風(fēng)黃點(diǎn)病毒、豌豆耳突花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、懸鉤子叢矮病毒、水稻壞死病毒(RNV)、水稻條紋葉枯病毒、水稻東格魯球狀病毒、黑麥草花葉病毒、土傳小麥花葉病毒、南方豆花葉病毒、煙草蝕紋病毒(TEV)、煙草花葉病毒(TMV)、煙草壞死病毒、煙草脆裂病毒、煙草脆裂病毒、蕃茄叢矮病毒、番茄金色花葉病毒(TGMV)和蕪菁黃化花葉病毒(TYMV)。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，使用基于TMV的病毒載體(病毒核酸)。TMV是煙草花葉病毒屬的典型成員。煙草花葉病毒具有單-(+)-鏈RNA基因組，且可產(chǎn)生由RNA基因組和外被蛋白(CP)多肽構(gòu)成的桿狀病毒粒子。煙草花葉病毒基因組編碼4至5條多肽。所述多肽中有兩個(gè)由相同的5’-近端起始密碼子轉(zhuǎn)譯而來且在病毒復(fù)制中發(fā)揮作用。這些多肽包括依賴于RNA的RNA聚合酶。此外，通常編碼具有甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA解旋酶活性的多肽。其它經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)通常包括移動(dòng)蛋白和外被蛋白，二者均由分開的次基因組RNA轉(zhuǎn)譯而來。煙草花葉病毒基因組的代表性實(shí)例繪示于圖18。在本發(fā)明各種實(shí)施例中也可使用TMV以外的煙草花葉病毒。
TMV基因組有6395個(gè)核苷酸長且由17.5kD CP包裹，可產(chǎn)生300nm長桿。除CP外，TMV具有3個(gè)非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)183和126kD蛋白質(zhì)，由基因組RNA轉(zhuǎn)移而來且為病毒復(fù)制所需要；30kD移動(dòng)蛋白，可促成病毒RNA在細(xì)胞細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移。對(duì)TMV感染敏感的植物種類包括甜菜(Beta vulgaris)、辣椒(Capsicum frutescens)、莧色藜(Chenopodium amaranticolor)、雜配藜(Chenopodium hybridum)、奎藜(Chenopodium quinoa)、香瓜(Cucumis melo)、黃瓜(Cucumis sativus)、西葫蘆(cucurbita pepo)、曼陀羅(Datura stramonium)、萵苣(Lactuca sativa)、蕃茄(Lucopersicon esculentum)、醋栗番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)、本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)、比格洛氏煙草(Nicotiana bigelovii)、克利夫蘭煙草(Nicotianaclevelandii)、德伯納煙草(Nicotiana debneyi)、心葉煙(Nicotiana glutinosa)、黃花煙(Nicotiana rustica)、林生煙草(Nicotiana sylvestris)、煙草(Nicotiana tabacum)、虞美人(Papaver nudicaule)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、佛羅里達(dá)酸漿(Physalisfloridana)、秘魯酸漿(Physalis peruviana)和三倍體馬鈴薯(Solarium tuberosum)。
在本發(fā)明各種其它實(shí)施例中，使用基于AlMV的病毒載體(病毒核酸)。AlMV是苜?；ㄈ~病毒，其與等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒屬關(guān)系緊密且是雀麥花葉病毒科的一成員。AIMV的基因組又三個(gè)正義RNA(RNA1至3)構(gòu)成。RNA1和2分別編碼復(fù)制酶蛋白P1和P2；RNA3編碼細(xì)胞細(xì)胞間移動(dòng)蛋白P3。次基因組RNA-RNA4由RNA3合成得到。此次基因組RNA4編碼病毒外被蛋白(CP)。CP參與病毒基因組激活以起始感染、RNA復(fù)制、病毒組裝、病毒RNA穩(wěn)定、病毒RNA的長距離移動(dòng)和癥狀形成。對(duì)于細(xì)胞細(xì)胞間移動(dòng)AlMV依賴于功能性P3蛋白質(zhì)，且在整個(gè)感染過程中需要CP蛋白質(zhì)。根據(jù)經(jīng)CP包裹的病毒RNA的大小，AlMV病毒顆粒在大小上(例如，長度上由30nm至60nm且直徑為18nm)和形狀上(例如，球形、橢圓體或桿狀)有很大變化。
AlMV的宿主范圍相當(dāng)廣泛且包括有農(nóng)藝價(jià)值的農(nóng)作物紫花苜蓿(Medicagosativa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、萵苣(Lactuca sativa)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、馬鈴薯(Solarium tuberosum)、白三葉草(Trifolium repens)和大豆(Glucinemax)。特別敏感的宿主種類包括(例如)咖啡黃葵(Abelmoschus esculentus)、霍香薊(Ageratum conyzoides)、尾穗莧(Amaranthus caudatus)、反枝莧(Amaranthusretroflexus)、金魚草(Antirrhinum majus)、旱芹(Apium graveolens)、根芹菜(Apiumgraveolens var.rapaceum)、落花生(Arachis hypogaea)、野生甘草(Astragalusglycyphyllos)、甜菜(Beta vulgaris)、蕪菁(Brassica campestris ssp.rapa)、金盞菊(Calendula officinalis)、菜椒(Capsicum annuum)、辣椒(Capsicum frutescens)、蘭香草(Caryopteris incana)、長春花(Catharanthus roseus)、青葙(Celosia argentea)、桂竹香(Cheiranthus cheiri)、藜(Chenopodium album)、莧色藜(Chenopodiumamaranticolor)、綠藜(Chenopodium murale)、奎藜(Chenopodium quinoa)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)、菊苣(Cichorium endiva)、芫荽(Coriandrum sativum)、紫花野百合(Crotalaria spectabilis)、香瓜(Cucumis melo)、黃瓜(Cucumis sativus)、西葫蘆(cucurbita pepo)、瓜爾豆(Cyamopsis tetragonoloba)、胡蘿卜(Daucus carota var.sativa)、美國石竹(Dianthus barbatus)、香石竹(Dianthus caryophyllus)、一點(diǎn)紅(Emiliasagittata)、蕎麥(Fagopyrum esculentum)、千日紅(Gomphrena globosa)、向日葵(Helianthus annuus)、扁豆(Lablab purpureus)、香豌豆(Lathyrus odoratus)、兵豆(Lensculinaris)、亞麻(Linum usitatissimum)、白羽扇豆(Lupinus albus)、寬翼豆(Macroptiliumlathyroides)、菟葵(Malva parviflora)、紫羅蘭(Matthiola incana)、南苜蓿(Medicagohispida)、白香草木樨(Melilotus albus)、比格洛氏煙草(Nicotiana bigelovii)、克利夫蘭煙草(Nicotiana clevelandii)、德伯納煙草(Nicotiana debneyi)、心葉煙(Nicotianaglutinosa)、麥格隆熄豐煙(Nicotiana megalosiphon)、黃花煙(Nicotiana rustica)、林生煙草(Nicotiana sylvestris)、煙草(Nicotiana tabacum)、羅勒(Ocimum basilicum)、矮牽牛(Petunia x hybrida)、金甲豆(Phaseolus lunatus)、山梅花屬(Philadelphus)、佛羅里達(dá)酸漿(Physalis floridana)、秘魯酸漿(Physalis peruviana)、美洲商陸(Phytolaccaamericana)、碗豆(Pisum sativum)、德米蘇馬鈴薯(Solanum demissum)、茄子(Solanummelongena)、龍葵(Solanum nigrum)、莨菪(solanum nodifiorum)、刺萼龍葵(Solanumrostratum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、菠菜(Spinacia oleracea)、繁縷(Stellariamedia)、番杏(Tetragonia tetragonioides)、黃花苜蓿(Trifolium dubium)、雜三葉(TrifoliumHybridum)、絳三葉(Trifolium incarnatum)、紅三葉(Trifolium Pratense)、地三葉(Trifolium subterraneum)、旱金蓮(Tropaeolum majus)、歐洲莢蒾(Viburnum opulus)、蠶豆(Viciafaba)、綠豆(Vigna radiata)、豇豆(Vigna unguiculata)、長豇豆(Vignaunguiculata ssp.sesquipedalis)和百日菊(Zinnia elegans)。盡管AlMV是一較佳病毒載體，但在本發(fā)明各種實(shí)施例中也可使用其它苜?；ㄈ~病毒。也可使用相關(guān)病毒，諸如等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒屬。
B.植物病毒表達(dá)載體的形成這些植物病毒的元件可根據(jù)已知技術(shù)經(jīng)基因工程構(gòu)建(參見例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Press，NY，1989；Clover等人，MolecularCloning，IRL Press，Oxford，1985；Dason等人，Virology，172285-292，1989；Takamatsu等人EMBOJ，6307-311，1987；French等人，Science 2311294-1297，1986；Takamatsu等人，F(xiàn)EBS Lett.26973-76，1990；Yusibov和Loesch-Fries，Virology，208(1)405-7，1995；Spitsin等人，Proc NatlAcad Sci USA，96(5)2549-53，1999，等等)以形成根據(jù)本發(fā)明使用的病毒載體。一般而言，病毒載體是一病毒核酸。通常所述病毒載體是病毒基因組或其大部分(即，至少50％的基因組)或在堿基序列上與此一核酸分子互補(bǔ)的核酸分子。在片段化病毒的情形中，所述病毒載體可以是基因組片段或其大部分。所述病毒載體可呈RNA或DNA形式。
較佳地，所述病毒載體包括足以在適宜病毒復(fù)制酶蛋白存在下支持病毒載體復(fù)制的部分，即，構(gòu)成病毒復(fù)制子。病毒基因組任何特定部分支持包含所述部分的核酸在病毒復(fù)制酶蛋白存在下進(jìn)行復(fù)制的能力可容易地使用業(yè)內(nèi)已知方法測(cè)定，例如，通過形成缺失突變體、將所述部分轉(zhuǎn)移至不支持復(fù)制的核酸中并測(cè)定是否出現(xiàn)復(fù)制，等等。所述復(fù)制酶蛋白可由所述載體、另一載體或所述載體導(dǎo)入其中的植物編碼。在本發(fā)明某些較佳實(shí)施例中，所述載體能夠自我復(fù)制，即，其可在適宜植物宿主中編碼病毒復(fù)制所必需的病毒蛋白質(zhì)。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述載體包含MP基因。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述載體包含CP基因。然而，在本發(fā)明某些實(shí)施例中，在所述載體中既不存在MP基因亦不存在CP基因。由于克隆根系、克隆植物系和克隆植物源自其中已導(dǎo)入所述載體的單個(gè)祖細(xì)胞，因此對(duì)于病毒載體沒必要具有細(xì)胞細(xì)胞間或長距離移動(dòng)能力。特定而言，即使病毒轉(zhuǎn)錄物不會(huì)移動(dòng)克隆植物也可在整個(gè)植物中表達(dá)感興趣多核苷酸，原因在于每一細(xì)胞均源自包含所述病毒載體的單個(gè)祖細(xì)胞。
一般而言，將感興趣多核苷酸插入受可引導(dǎo)所述多核苷酸在感興趣植物細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子控制(即，以可操作方式與之連接)的病毒載體。在本發(fā)明某些較佳實(shí)施例中，使用植物病毒啟動(dòng)子，例如，外被蛋白、移動(dòng)蛋白等的啟動(dòng)子?？纱鎯?nèi)源MP或CP編碼序列插入所述感興趣多核苷酸。例如，如在實(shí)例中更詳細(xì)闡述，可使用基于TMV的受TMV CP啟動(dòng)子控制的載體，其中TMV CP編碼序列已由感興趣多核苷酸取代。或者，經(jīng)插入的多核苷酸可包括其自身啟動(dòng)子(其可與天然存在的病毒啟動(dòng)子之一相同或類似)；可來自不同病毒(例如，花椰菜花葉病毒)；可以是非病毒啟動(dòng)子(諸如植物基因啟動(dòng)子或合成啟動(dòng)子)。在本發(fā)明某些實(shí)施例中使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。已知多種可在植物中發(fā)揮作用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。參見例如，Zuo，J.和Chua，N-H.“Chemical-inducible systems for regulated Expression of plant genes”，Curr.Op.inBiotechnol，11146-51，2000。例如，可使用由金屬(諸如銅)誘導(dǎo)或響應(yīng)于激素(諸如雌激素)的啟動(dòng)子或響應(yīng)于其它小分子(諸如四環(huán)素)的系統(tǒng)?？墒褂弥T如熱、光等其它刺激。參見U.S.S.N.10/294,314。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，在其任一態(tài)樣中，使用反式激活來誘導(dǎo)或增加感興趣多核苷酸的表達(dá)。例如，含有所述多核苷酸的表達(dá)盒可呈非活性表達(dá)盒形式，所述非活性表達(dá)盒包含一非活性或沉默的外源核酸序列，當(dāng)所述外源核酸序列受到激活時(shí)其能夠引導(dǎo)感興趣多核苷酸的表達(dá)。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，反式激活可通過導(dǎo)入能夠激活或促進(jìn)非活性或沉默的多核苷酸序列在所述克隆實(shí)體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的因子來實(shí)現(xiàn)。將可以此一方式反式激活的啟動(dòng)子稱作是“可反式激活的”。對(duì)于某些適宜方法的進(jìn)一步詳細(xì)資料參見題目為“Expression of Foreign Sequences in Plants UsingTrans-Activation System”的U.S.S.N.10/832,603，其以引用方式并入本文中。這些方法包括基于重組的技術(shù)(例如，使用Lox/Cre或Flp/Frt重組酶系統(tǒng))和基于含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(諸如GAL4)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(諸如VP16)的蛋白質(zhì)的技術(shù)?？衫枚喾N其它方法實(shí)現(xiàn)反式激活。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，插入所述多核苷酸以形成一獨(dú)立的開放閱讀框，而在本發(fā)明其它實(shí)施例中，插入所述多核苷酸以形成一其中在框內(nèi)插入缺少終止密碼子的多核苷酸以及編碼一部分或所有病毒蛋白質(zhì)(諸如CP)的序列以便在轉(zhuǎn)譯時(shí)產(chǎn)生一融合蛋白的開放閱讀框?？刹迦攵鄠€(gè)多核苷酸。在本發(fā)明某些較佳實(shí)施例中，所述TMV載體保留一部分或所有其3’UTR及/或所有或部分CP編碼序列。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述感興趣多核苷酸或其中插入感興趣多核苷酸的病毒載體包括編碼靶向序列(例如，使經(jīng)編碼多肽靶向特定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或組份的序列)的部分。例如，會(huì)需要使感興趣多肽靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，此會(huì)最終引起所述多肽的分泌。然后肽可自培養(yǎng)基或自植物組織間質(zhì)液中收獲經(jīng)分泌多肽。
圖1至5顯示構(gòu)建各種適用于本發(fā)明的植物病毒載體的實(shí)例。圖1顯示基于TMV的病毒構(gòu)造(D4)和插入其轉(zhuǎn)錄受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制的感興趣多核苷酸(例如，編碼hGH、GCSF、GFP等的基因，以“目標(biāo)”表示)的相同構(gòu)造。有關(guān)這些載體形成的詳細(xì)資料在實(shí)例1中給出。
圖2呈現(xiàn)構(gòu)建含有一感興趣多核苷酸的基于TMV的病毒構(gòu)造的示意圖。所述圖的上部分顯示基于TMV的病毒構(gòu)造基因組組構(gòu)，30B(Yusibov，V.、Shivprasad，S.、Turpen，T.H.、Dawson，W.和Koprowski，H.，“Plant viral vectors based on tobamoviruses”，in Plant BiotechnologyNew Products and Applications(J.Hammond、P.McGarvey和V.Yusibov編寫)，第81-94頁，Springer-Verlag，1999)。下部分顯示插入感興趣多核苷酸(例如，編碼hGH、GCSF、GFP等的基因，以“目標(biāo)”表示)后的相同構(gòu)造。對(duì)于病毒復(fù)制需要126/183kDa蛋白質(zhì)。30kD蛋白質(zhì)是可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間移動(dòng)的移動(dòng)蛋白(MP)。CP可介導(dǎo)系統(tǒng)擴(kuò)散的外被蛋白。箭頭指示本發(fā)明某些實(shí)施例中次基因組啟動(dòng)子的位置。經(jīng)插入多核苷酸的轉(zhuǎn)錄受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。在示于圖2的構(gòu)造中CP表達(dá)受內(nèi)源CP啟動(dòng)子控制。
也可使用其中感興趣多核苷酸與CP編碼序列在同一框內(nèi)以便編碼融合蛋白的類似載體。一般而言，感興趣多核苷酸(及其編碼蛋白)可以獨(dú)立開放閱讀框形式表達(dá)(參見例如，Pogue，G.P.、Lindbo，J.A.、Dawson，W.O.和Turpen，T.H.“Antigens producedin plants by infection with chimeric plant viruses immunize against rabies virus andHIV-1”，PL Mol.Biol.Manual.L4，1-27.，1998)或以與外被蛋白的融合體形式表達(dá)(Yusibov，V.、Modelska，A.，Steplewski，K.、Agadjanyan，M.、Weiner，D.、Hooper，C.和Koprowski，H.，“Antigens produced in plants by infection with chimeric plant virusesimmunize against rabies virus and HIV-1”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，5784-5788，1997)。在后者所述的載體中，目標(biāo)序列的復(fù)制可受另一次基因組啟動(dòng)子的控制。一般而言，感興趣多核苷酸及/或內(nèi)源基因(諸如MP或CP)的轉(zhuǎn)錄可由內(nèi)源啟動(dòng)子或插入的啟動(dòng)子(其可與來自相同或不同病毒的天然存在載體相同或可是合成序列或是天然和合成序列的組合)驅(qū)動(dòng)。
所述構(gòu)造的3’部分較佳包括TMV 3’UTR，其可如所示形成一或多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所述構(gòu)造的3部分也可包括包含一為最佳復(fù)制所需要的順式元件的TMV外被蛋白序列。此序列是可選序列。
圖3呈現(xiàn)一構(gòu)建基于TMV的病毒構(gòu)造的示意圖，所述病毒構(gòu)造含有一感興趣多核苷酸和一標(biāo)記物(例如，供檢測(cè)及/或選擇使用的標(biāo)記物)的編碼基因。所述圖的上部分顯示基于TMV的病毒構(gòu)造基因組組構(gòu)(D4)。所述圖的中間部分顯示插入一替代MP編碼序列的可檢測(cè)標(biāo)記物(GFP)的編碼基因后的相同構(gòu)造。所述圖的下部分顯示插入感興趣多核苷酸(例如，編碼hGH、GCSF、GFP等的基因，以“目標(biāo)”表示)后的相同構(gòu)造。對(duì)于病毒復(fù)制需要126/183kDa蛋白質(zhì)。箭頭指示次基因組啟動(dòng)子的位置。所述可檢測(cè)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄受MP次基因組啟動(dòng)子控制。經(jīng)插入感興趣多核苷酸的轉(zhuǎn)錄受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制。然而，可如上所述使用其它啟動(dòng)子。所述構(gòu)造的3’部分包括包含一最佳復(fù)制所需要且可如所示形成一或多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的順式元件的TMV外被蛋白序列。
圖4顯示一類似于圖3中所示者的載體，不同之處在于插入了選擇標(biāo)記物(可賦予卡那霉素抗性的蛋白質(zhì)的編碼基因)而非插入GFP編碼基因。除感興趣多核苷酸外納入編碼一可檢測(cè)或可選擇標(biāo)記物的基因有助于鑒定含有所述載體的克隆根系和克隆植物細(xì)胞系及/或用于鑒定那些展現(xiàn)高水平及/或穩(wěn)定水平表達(dá)的各系。
一般而言，根據(jù)本發(fā)明可使用多種不同標(biāo)記物。一般而言，用于本發(fā)明的適宜標(biāo)記物是可檢測(cè)標(biāo)記物或可選擇標(biāo)記物。應(yīng)注意，根據(jù)業(yè)內(nèi)實(shí)踐，術(shù)語“標(biāo)記物”可指核苷酸序列(例如，編碼一供檢測(cè)或選擇使用的檢測(cè)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的基因)或可用來指蛋白質(zhì)本身。術(shù)語“選擇標(biāo)記物”在本文中使用其業(yè)內(nèi)通常理解的含義且指如下標(biāo)記物，所述標(biāo)記物存在于一細(xì)胞或生物體中可使所述細(xì)胞或生物體在某些指定培養(yǎng)條件(選擇性條件)下具有明顯的生長或存活優(yōu)勢(shì)或劣勢(shì)。例如，所述條件可以是存在或不存在特定化合物或特定環(huán)境條件，諸如升高的溫度、增強(qiáng)的輻射、不存在標(biāo)記物時(shí)具有毒性的化合物的存在，等等。將所述一或多種化合物或環(huán)境條件的存在或不存在稱作一或多種“選擇性條件”。“生長優(yōu)勢(shì)”意指增強(qiáng)的生存力(例如，具有所述生長優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞或生物體平均起來較在其它方面相同的細(xì)胞具有延長的生存期)、較其它方面相同的細(xì)胞或生物體具有增加的增殖率(本文也稱作“生長率”)或指二者。一般而言，具有生長優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞群體會(huì)較缺乏所述生長優(yōu)勢(shì)而其它方面相同的細(xì)胞群體展現(xiàn)更少的死亡或不能生存的細(xì)胞及/或更高的細(xì)胞增殖率。盡管選擇標(biāo)記物通常會(huì)賦予細(xì)胞以生長優(yōu)勢(shì)，但某些選擇標(biāo)記物也會(huì)賦予細(xì)胞以生長劣勢(shì)，例如，其會(huì)所使細(xì)胞較不表達(dá)所述標(biāo)記物而在其它方面相同的細(xì)胞對(duì)某些化合物或環(huán)境條件的有害影響更為敏感。
抗生素抗性標(biāo)記物是一類可用來選擇可表達(dá)標(biāo)記物細(xì)胞的選擇標(biāo)記物的非限制性實(shí)例。在適宜濃度抗生素存在下(選擇性條件)，此一標(biāo)記物可賦予可表達(dá)所述標(biāo)記物細(xì)胞以生長優(yōu)勢(shì)。所以表達(dá)抗生素抗性標(biāo)記物的細(xì)胞能夠在抗生素存在下存活及/或增殖而不表達(dá)抗生素抗性標(biāo)記物的細(xì)胞在所述抗生素存在下則不能存活及/或不能增殖。例如，常用于植物細(xì)胞中的此類選擇標(biāo)記物是NPTII蛋白，其編碼可提供針對(duì)抗生素卡那霉素抗性的蛋白質(zhì)。額外選擇標(biāo)記物包括可賦予針對(duì)羧芐青霉素抗性的蛋白質(zhì)(例如，(3-內(nèi)酰胺酶))、可賦予針對(duì)慶大霉素、潮霉素等抗性的蛋白質(zhì)。
另一非限制性類別的選擇標(biāo)記物是營養(yǎng)標(biāo)記物。這些標(biāo)記物通常是可在生物合成途徑中發(fā)揮作用以產(chǎn)生細(xì)胞生長或存活所需化合物的酶。一般而言，在非選擇性條件下，所需化合物存在于環(huán)境中或由細(xì)胞中一替代途徑產(chǎn)生。在選擇性條件下，其中所述標(biāo)記物參與的生物合成途徑的運(yùn)行需要產(chǎn)生所述化合物。
一般而言，可檢測(cè)標(biāo)記物是一如下標(biāo)記物，其在細(xì)胞內(nèi)的存在可借助除使細(xì)胞接受選擇性條件檢測(cè)以外的方式得以檢測(cè)或通過直接測(cè)量標(biāo)記物自身的含量來檢測(cè)。因此一般而言，細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)標(biāo)記物的表達(dá)會(huì)引起能夠得以檢測(cè)及/或測(cè)量的信號(hào)的產(chǎn)生。檢測(cè)或測(cè)量過程會(huì)涉及使用額外試劑且涉及處理所述細(xì)胞。例如，當(dāng)可檢測(cè)標(biāo)記物是酶時(shí)，標(biāo)記物得檢測(cè)或測(cè)量通常會(huì)涉及提供所述酶得底物。較佳地，信號(hào)是一易于檢測(cè)的信號(hào)，例如光、熒光、發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、酶促反應(yīng)產(chǎn)物、可染色產(chǎn)物或顏色。因此用于本發(fā)明的較佳可檢測(cè)標(biāo)記物包括熒光蛋白質(zhì)，諸如綠色熒光蛋白(GFP)及其變體。其它適宜標(biāo)記物包括熒光素酶、黃色熒光蛋白質(zhì)(YFP)、地衣多糖酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶，等等。較佳地，可檢測(cè)標(biāo)記物是可在完整存活根及/或植物細(xì)胞中檢測(cè)到的標(biāo)記物。
用于本發(fā)明的較佳病毒載體的另一實(shí)例是其中插入感興趣多核苷酸的AlMV載體，如圖5所示。例如，所述感興趣多核苷酸可替代AlMV RNA3中原有的AlMV CP編碼組份。所述感興趣多核苷酸的轉(zhuǎn)錄可處于AlMV CP啟動(dòng)子的控制之下?；蛘?，所述多核苷酸可替代AlMV MP編碼組份，且其轉(zhuǎn)錄可處于AlMV MP啟動(dòng)子的控制之下。在其它實(shí)施例中，經(jīng)插入多核苷酸未替代內(nèi)源病毒序列。可將感興趣多核苷酸與CP編碼序列(完整或部分)插入同一框內(nèi)，以便產(chǎn)生融合蛋白。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，融合蛋白在CP部分和其余部分之間包含一裂解位點(diǎn)，以便可將所述融合蛋白裂解從而產(chǎn)生不含CP序列(或僅含有少量這些序列)的感興趣蛋白質(zhì)。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述融合蛋白組裝成顆粒，此會(huì)利于純化及/或抗原呈遞(參見例如，美國專利第6,042,832號(hào)和第6,448,070號(hào))。
用于實(shí)施本發(fā)明的載體的另一實(shí)例是花椰菜花葉病毒(CMV)病毒載體，其中插入受CMV CP啟動(dòng)子控制的感興趣多核苷酸，以替代天然存在的CMV基因組中具有的CMV CP編碼組份。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，需要將來自一病毒類型的病毒載體的編碼或非編碼序列部分插入另一類型的病毒載體中。例如，某些序列可增強(qiáng)復(fù)制或表達(dá)，等等。這些序列會(huì)包含(例如)病毒轉(zhuǎn)錄物的5’或3’UTR中的一一部分或所有。
一般而言，為保留病毒功能且同時(shí)僅為簡化基因操作，會(huì)通過改變現(xiàn)有的植物病毒基因組來制備病毒載體，例如通過去除特定基因及/或通過破壞或取代特定序列以使其失活或受到取代。在所述情形中，載體會(huì)顯示出與天然病毒基因組相當(dāng)高的序列一致性。當(dāng)然，也可使用全新載體，例如，通過分開分離各個(gè)期望的基因元件并將其連在一起，視情況納入額外元件。應(yīng)注意，當(dāng)提出植物病毒載體肯定能夠表達(dá)病毒復(fù)制、移動(dòng)或某種其它病毒功能所需的特定蛋白質(zhì)或活性時(shí)，則沒必要使相關(guān)基因與天然狀態(tài)下存在的相應(yīng)基因保持一致。只要蛋白質(zhì)具有功能，就可根據(jù)本發(fā)明加以使用。然而，與天然蛋白質(zhì)具有相當(dāng)高的序列一致性通常是較佳的。例如，根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施例一般應(yīng)避免大的缺失(例如，大于約25個(gè)氨基酸)。通常，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的病毒蛋白質(zhì)會(huì)顯示出與相應(yīng)的天然病毒蛋白質(zhì)具有至少50％、較佳60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。更特定而言，本發(fā)明病毒蛋白質(zhì)通常應(yīng)顯示出與相關(guān)天然病毒蛋白質(zhì)的關(guān)鍵功能部分(通常具有至少數(shù)個(gè)氨基酸，常具有至少10、20、30、40、50或更多的氨基酸)具有100％一致性。
應(yīng)注意，在許多蛋白質(zhì)的情形中，可在不明顯影響蛋白質(zhì)功能活性及/或各種其它性質(zhì)(諸如穩(wěn)定性等)的情況下進(jìn)行大量氨基酸改變。特定而言，許多蛋白質(zhì)能夠忍受保守氨基酸改變，即，在不明顯降低活性的情況下于許多位置處用具有類似性質(zhì)的不同氨基酸取代一氨基酸(保守取代)。保守氨基酸取代為業(yè)內(nèi)熟知且代表一種在改變氨基酸序列的同時(shí)獲得一具有與指定多肽性質(zhì)類似或大體類似性質(zhì)的多肽的方法。一般而言，根據(jù)(1)電荷(正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷)；(2)體積和極性；(3)Grantham物理化學(xué)距離；和這些的組合已對(duì)氨基酸進(jìn)行分類并劃分成組。參見例如，Zhang，J.，J.Mol.Evol.，5056-68，2000；Grantham R.，Science，85862-864，1974；Dagan，T.等人，Mol.Biol.Evol.，19(7)，1022-1025，2002；Biochemistry，第4版，Stryer，L.等人，W.Freeman and Co.，1995；和美國專利第6,015,692號(hào)。例如，根據(jù)體積和極性可將氨基酸分成下列6個(gè)類別特殊類型氨基酸(C)；中性小氨基酸(A、G、P、S、T)；極性相對(duì)較小氨基酸(N、D、Q、E)；極性相對(duì)較大氨基酸(R、H、K)；非極性相對(duì)較小氨基酸(I、L、M、V)和非極性相對(duì)較大氨基酸(F、W、Y)?？蓪⒈Ｊ匕被崛〈x為用相同組別的氨基酸取代一氨基酸的取代。因此可通過在指定病毒蛋白質(zhì)中進(jìn)行一或多種氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)來獲得多種功能等效蛋白質(zhì)。
C.克隆根系本發(fā)明提供用于生成其中使用植物病毒載體引導(dǎo)感興趣多核苷酸表達(dá)的克隆根系的方法。圖6A至6E顯示本發(fā)明某些實(shí)施例中所述方法的步驟。如圖6所示，根據(jù)各種已知方法中的任一種將一或多個(gè)含有以可操作方式與啟動(dòng)子連接的感興趣多核苷酸的病毒表達(dá)載體導(dǎo)入植物或其一部分中。例如，如實(shí)例2中所述，可用病毒轉(zhuǎn)錄物接種植物葉片。可將載體自身直接施加至植物(例如，經(jīng)由打磨接種、機(jī)械噴霧接種、真空滲透、粒子轟擊或電穿孔)?；蛘?，可制備病毒顆粒(例如，有已經(jīng)感染的植物制備)，且可根據(jù)已知技術(shù)將之施加至其它植物。
當(dāng)通過將病毒基因組直接施加至植物上來實(shí)現(xiàn)感染時(shí)，可利用任何可用技術(shù)制備所述基因組。例如，許多可根據(jù)本發(fā)明有效使用的病毒具有ssRNA基因組?？赏ㄟ^在活體內(nèi)或活體外轉(zhuǎn)錄基因組的DNA拷貝或通過復(fù)制RNA拷貝來制備ssRNA。鑒于容易使用的活體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(例如，SP6、T7、網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物，等等)的易于使用性以及保持RNA載體DNA拷貝的方便性，所以預(yù)期本發(fā)明ssRNA載體通?？赏ㄟ^活體外轉(zhuǎn)錄(尤其利用T7或SP6聚合酶)來制備。也可使用感染性cDNA克隆?？筛鶕?jù)業(yè)內(nèi)已知方法利用土壤細(xì)菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移使用(例如)土壤桿菌浸潤法將病毒核酸(諸如病毒載體，完整病毒基因組或其各部分)轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞。
較佳地，隨后將植物或植物部分保持(例如，經(jīng)培養(yǎng)或使之生長)在適于病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄物的條件下。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，病毒擴(kuò)散超過了初始接種的細(xì)胞，例如，由細(xì)胞到細(xì)胞的局部擴(kuò)散及/或由初始接種的葉片進(jìn)入其它葉片的系統(tǒng)性擴(kuò)散。然而，在本發(fā)明其它實(shí)施例中，所述病毒沒有擴(kuò)散。因此所述病毒載體可包含功能性MP及/或CP的編碼基因，但可缺少一或兩個(gè)所述基因。一般而言，將病毒載體導(dǎo)入(感染)植物或其一部分的多個(gè)細(xì)胞中。圖6B顯示一其中已導(dǎo)入病毒載體的植株(以示意圖方式繪示于圖6A中)。
在向植物導(dǎo)入病毒載體之后，收獲葉片。圖6C顯示由經(jīng)病毒感染植物收獲后的葉片部分。一般而言，可在導(dǎo)入病毒載體之后的任何時(shí)間收獲葉片。然而，較佳是在將病毒載體導(dǎo)入植物之后將所述植物保持一段時(shí)間，例如，保持一段足以使病毒復(fù)制且(視情況)使病毒由病毒最初導(dǎo)入的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)散的時(shí)間。通過(例如)下文和實(shí)例2中進(jìn)一步闡述的已知方法制備克隆根培養(yǎng)物(或多個(gè)培養(yǎng)物)。
一般而言，可利用任何可用方法由其中已導(dǎo)入病毒載體的植物或植物組織制備克隆根培養(yǎng)。一種所述方法利用存在于某種細(xì)菌質(zhì)粒中的基因。這些質(zhì)粒存在于各種種類可感染多種生物體并向其轉(zhuǎn)移DNA的土壤桿菌中。作為菌屬土壤桿菌可將DNA轉(zhuǎn)移至廣泛且多樣的植物類型組中，包括大量雙子葉單子葉被子植物種類和裸子植物(參見Gelvin，S.B.，“Agrobacterium-Mediated Plant Transformationthe Biology behind the“Gene-Jockeying”Tool”，Microbiology and Molecular Biology Reviews，67(1)16-37(2003)和其中的參考文獻(xiàn)，所有這些參考文獻(xiàn)均以引用方式并入本文中)。植物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)是，存于各種土壤桿菌種類內(nèi)的大型瘤誘導(dǎo)(Ti)或生根(Ri)質(zhì)粒一個(gè)區(qū)域自細(xì)菌轉(zhuǎn)移出并整合至植物核基因組上。存在于所述質(zhì)粒中時(shí)這個(gè)區(qū)域稱作T-區(qū)而自所述質(zhì)粒切除后稱作T-DNA。一般而言，在天然存在的土壤桿菌感染中將單鏈T-DNA分子轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞且最終并入(以雙鏈形式)基因組中。基于Ti質(zhì)粒的系統(tǒng)廣泛用于外源遺傳物質(zhì)向植物的導(dǎo)入且用于轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。
利用各種土壤桿菌種類和T-DNA的轉(zhuǎn)移感染植物具有多種作用。例如，根瘤土壤桿菌會(huì)引起冠癭病而發(fā)根土壤桿菌會(huì)在感染部位引起發(fā)根，一種稱作“發(fā)根病”的病癥。每一個(gè)根可由經(jīng)基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生。因此根中根細(xì)胞是克隆的，且每一根代表一克隆細(xì)胞群。由發(fā)根土壤桿菌感染產(chǎn)生的根特征為高生長率和遺傳穩(wěn)定性(Giri，A.和Narasu，M.L.，Biotechnology Advances，181-22(2000)和其中的參考文獻(xiàn)，所有這些參考文獻(xiàn)均以引用方式并入本文中)。此外，這些根能夠再生出遺傳穩(wěn)定的植物(Giri 2000)。一般而言，本發(fā)明涵蓋任何土壤桿菌菌株(尤其是發(fā)根土壤桿菌菌株)的應(yīng)用，其能夠自植物細(xì)胞誘導(dǎo)根的形成。如上所述，質(zhì)粒的一部分(Ri T-DNA)是引起發(fā)根病的原因。而Ri質(zhì)粒此部分向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可方便地通過用攜帶Ri質(zhì)粒的土壤桿菌感染來實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明還涵蓋使用將相關(guān)區(qū)域?qū)胫参锛?xì)胞的替代方法。所述方法包括任何可將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物細(xì)胞的可用方法，包括基因槍法、電穿孔、PEG介導(dǎo)的DNA攝取、基于Ti的載體，等等。也可借助病毒載體將Ri T-DNA的相關(guān)部分導(dǎo)入植物細(xì)胞中?？蓪i基因納入包含感興趣多核苷酸的同一載體或納入不同病毒載體，其與包含感興趣多核苷酸載體的類型可相同或不同。應(yīng)注意，對(duì)于產(chǎn)生發(fā)根可能不需要整個(gè)Ri T-DNA，且本發(fā)明涵蓋Ri T-DNA各部分的應(yīng)用，但限制條件是所述部分含有足以誘發(fā)根形成的遺傳物質(zhì)，如業(yè)內(nèi)所已知。根據(jù)本發(fā)明也可將額外遺傳物質(zhì)(例如，存在于Ri質(zhì)粒但不存在于T-DNA中的基因)轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，所述額外遺傳物質(zhì)特別是其表達(dá)產(chǎn)物可促進(jìn)T-DNA整合入植物細(xì)胞DNA的基因。
為根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施例制備克隆根系，使收獲的葉片部分與發(fā)根土壤桿菌在適于感染和轉(zhuǎn)化的條件下接觸。實(shí)例2闡述一種用于由其中已導(dǎo)入病毒載體的葉片生成根系的方法。使所述葉片部分保持在培養(yǎng)物中以使發(fā)根形成。圖6D顯示由用發(fā)根土壤桿菌感染的葉片部分中的各個(gè)細(xì)胞生成的發(fā)根。每一根均是克隆的，即，所述根中細(xì)胞源自其中轉(zhuǎn)入Ri T-DNA的單個(gè)祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述祖細(xì)胞的一部分也會(huì)含有病毒載體。因此，源自此一祖細(xì)胞的根中細(xì)胞也會(huì)含有病毒載體，原因在于其會(huì)復(fù)制且會(huì)在細(xì)胞分裂過程中進(jìn)行傳遞。因此高比例(較佳至少50％、更佳至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或所有(100％)或大體上所有(至少98％))的所述細(xì)胞會(huì)含有病毒載體。應(yīng)注意，由于病毒載體在克隆根內(nèi)可由子細(xì)胞繼承，所以根內(nèi)病毒載體的移動(dòng)對(duì)于將病毒載體保持在整個(gè)根內(nèi)并非是必要的。
可自所述葉片部分取下各個(gè)克隆發(fā)根且進(jìn)一步培養(yǎng)，如圖6E和6F所示。所述根在本文中也稱作根系。圖6E顯示在培養(yǎng)皿中排列成直線的各個(gè)克隆根。圖6F以更大放大率顯示相同根系。所述根繼續(xù)生長。這些根源自其中已導(dǎo)入含有一GFP基因的病毒載體的植物。圖6G顯示在UV燈下拍攝的單個(gè)根的照片。顯示出整個(gè)根內(nèi)的GFP表達(dá)。
如實(shí)例2至4中所述，已利用本發(fā)明方法形成了多種不同的克隆根系。利用含有感興趣的編碼GFP、hGH和GCSF的多核苷酸的病毒載體生成這些根系。所述根系通過Western印跡分析加以測(cè)試。根系展現(xiàn)出各多肽多種不同的表達(dá)水平。選出展現(xiàn)高表達(dá)的根系且進(jìn)一步培養(yǎng)。隨后對(duì)這些根系進(jìn)行再次測(cè)試，且顯示可隨時(shí)間延長保持高水平的表達(dá)，表明具有穩(wěn)定性。表達(dá)水平相當(dāng)于或大于用與生成克隆根系所用者相同的病毒載體感染的完整植物中的表達(dá)。此外，根系表達(dá)的穩(wěn)定性優(yōu)于用相同病毒載體感染的植物中所達(dá)成的穩(wěn)定性。多達(dá)80％的所述經(jīng)病毒感染植物在2至3次傳代后復(fù)原成野生型。(所述傳代包括用轉(zhuǎn)錄物接種植物，使感染(局部或系統(tǒng)性)得到確立，采取葉片樣品，并接種隨后用于表達(dá)測(cè)試的新鮮植物。)
對(duì)于產(chǎn)生感興趣多肽可大規(guī)模培養(yǎng)根系，如下文進(jìn)一步論述。應(yīng)注意，通常將克隆根系(和源自所述克隆根系的細(xì)胞系)保持在不含通常在根和植物細(xì)胞培養(yǎng)中采用的各種化合物(例如，諸如植物生長素、細(xì)胞分裂素等植物生長激素)的培養(yǎng)基中。此特征大大降低了與組織培養(yǎng)相關(guān)的費(fèi)用，且發(fā)明者預(yù)計(jì)此會(huì)對(duì)利用植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)可行性起到明顯作用。
可使用多種方法中的任一中來選擇可表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆根。Western印跡分析、ELISA分析等均可用來檢測(cè)經(jīng)編碼多肽。在可檢測(cè)標(biāo)記物(諸如GFP)的情形中，可實(shí)施替代方法，諸如視覺篩選。如果使用包含編碼一選擇標(biāo)記物的多核苷酸的病毒載體，則可進(jìn)行適當(dāng)選擇(例如，可在適宜抗生素存在下或營養(yǎng)條件存在下培養(yǎng)源自于其的葉片材料及/或根且鑒定并分離存活根)。某些病毒載體包含兩個(gè)或兩個(gè)以上感興趣多核苷酸，例如，兩個(gè)或兩個(gè)以上編碼不同多肽的多核苷酸。如果這些中有一個(gè)是可選擇或可檢測(cè)標(biāo)記物，則可通過選擇或檢測(cè)標(biāo)記物的表達(dá)來選擇或檢測(cè)的克隆根會(huì)很有可能同時(shí)表達(dá)另一多核苷酸。也可使用PCR和其它核酸檢測(cè)方法實(shí)施包含特定多核苷酸根系的篩選。
或者，也可通過接種病毒感染后結(jié)果是形成局部損傷的宿主植物(例如，超敏宿主植物)來就病毒存在篩選克隆根系。例如，可將5mg根組織在50μl磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行勻漿并用來接種煙草植物的單個(gè)葉片。如果所述病毒存在于根培養(yǎng)物中，則2到3天內(nèi)經(jīng)感染葉片上就會(huì)出現(xiàn)特征損傷。此意味著，所述根系含有攜帶感興趣多核苷酸(目標(biāo)基因)的重組病毒。如果未形成局部損傷，則不存在病毒，且因是陰性而將所述根系舍棄。此方法在時(shí)間和成本方面都是相當(dāng)有效率的。初步進(jìn)行對(duì)病毒存在的篩選后，使含有所述病毒的根接受進(jìn)一步的篩選，例如，通過Western印跡分析或ELISA選擇高水平表達(dá)者。也可應(yīng)用額外篩選，例如，對(duì)快速生長的篩選，特定培養(yǎng)基中或特定環(huán)境條件下的生長，等等。一般而言，這些篩選方法可在本文所述克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系及/或克隆植物中任一種形成過程中應(yīng)用。
如所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解，可對(duì)上文有關(guān)本發(fā)明生成包含一病毒載體的克隆根系的方法的闡述進(jìn)行多種修改。所述修改涵蓋于本發(fā)明范疇內(nèi)。例如，盡管通常較佳的是在導(dǎo)入Ri T-DNA基因之前將病毒載體導(dǎo)入完整植物或其一部分中，但在本發(fā)明某些實(shí)施例中則是在導(dǎo)入所述病毒載體之前導(dǎo)入Ri-DNA。此外，也可能使完整植物與發(fā)根土壤桿菌接觸，而不是收獲葉片部分且隨后將其暴露于所述細(xì)菌中。
也可使用由攜帶病毒載體的植物或其一部分的單個(gè)細(xì)胞生成克隆根系的其它方法(即，不使用發(fā)根土壤桿菌或來自所述Ri質(zhì)粒的遺傳物質(zhì)的方法)。例如，已知用某些植物激素或植物激素的組合進(jìn)行處理可引起植物組織上根的形成。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，不是向植物中導(dǎo)入單個(gè)病毒載體類型，而是導(dǎo)入多個(gè)不同病毒載體。對(duì)于諸如復(fù)制、細(xì)胞細(xì)胞間移動(dòng)及/或長距離移動(dòng)等功能，所述載體可(例如)彼此反式互補(bǔ)。所述載體會(huì)包含不同感興趣多核苷酸，例如，編碼連在一起形成諸如抗體等單個(gè)蛋白復(fù)合體的各個(gè)多肽的多核苷酸或編碼生物合成途徑中不同酶的多核苷酸。表達(dá)多個(gè)感興趣多肽的根的選擇可如上對(duì)單個(gè)多核苷酸或多肽所述來實(shí)施。
D.源自克隆根系的克隆細(xì)胞系如上所述，本發(fā)明提供生成克隆根系的方法，其中根系中細(xì)胞包含一病毒載體。如業(yè)內(nèi)所熟知，可由根生成多種不同細(xì)胞系。例如，可使用多種已知方法自由根得到的各個(gè)根細(xì)胞生成根細(xì)胞系。所述根細(xì)胞系可由根內(nèi)各種不同根細(xì)胞類型獲得。一般而言，根材料經(jīng)收獲和離解(例如，經(jīng)物理及/或酶促消化)以釋放各個(gè)根細(xì)胞，隨后進(jìn)一步培養(yǎng)根細(xì)胞。通常并不需要完整的原生質(zhì)體形成。需要時(shí)，可以相當(dāng)稀的細(xì)胞濃度對(duì)根細(xì)胞加以鋪板，以自根細(xì)胞獲得根細(xì)胞系。以此方式來源的根細(xì)胞系是含有所述病毒載體的克隆根細(xì)胞系。因此所述根細(xì)胞系展現(xiàn)出感興趣多核苷酸的穩(wěn)定表達(dá)?？寺≈参锛?xì)胞系也可以類似方式自克隆根獲得，例如，通過在適宜植物激素存在下培養(yǎng)經(jīng)離解的根細(xì)胞。篩選和連續(xù)多輪富集可用來鑒定高水平表達(dá)感興趣多核苷酸的細(xì)胞系。然而，如果細(xì)胞系源自其中的克隆根系已高水平表達(dá)，則無需進(jìn)行所述額外篩選。
與克隆根系的情形中一樣，克隆根細(xì)胞系的細(xì)胞源自包含病毒載體的單個(gè)祖細(xì)胞且因此也會(huì)含有所述病毒載體，原因在于其會(huì)復(fù)制且在分裂過程中進(jìn)行傳遞。因此高比例(較佳至少50％、更佳至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或所有(100％)或大體上所有(至少98％))細(xì)胞會(huì)含有所述病毒載體。應(yīng)注意，由于所述病毒載體可由克隆根細(xì)胞系內(nèi)子細(xì)胞繼承，因此所述細(xì)胞中病毒載體的移動(dòng)對(duì)于維持病毒載體并非是必要的。如下文所述，克隆根細(xì)胞系可用于生產(chǎn)感興趣多核苷酸。
E.克隆植物細(xì)胞系本發(fā)明提供用于生成一其中使用植物病毒載體引導(dǎo)感興趣多核苷酸表達(dá)的克隆植物細(xì)胞系的方法。根據(jù)本發(fā)明方法，將一或多個(gè)含有以可操作方式與啟動(dòng)子連接的感興趣多核苷酸的病毒表達(dá)載體導(dǎo)入保持在細(xì)胞培養(yǎng)物中的植物細(xì)胞系細(xì)胞中。來自各種植物類型的大量植物細(xì)胞系為業(yè)內(nèi)已知，可使用其中的任一種。新近獲得的細(xì)胞系也可根據(jù)用于實(shí)施本發(fā)明的已知方法生成。根據(jù)多種方法中的任一種將病毒載體導(dǎo)入植物細(xì)胞系細(xì)胞中。例如，如實(shí)例5中所述，可形成原生質(zhì)體且隨后經(jīng)由電穿孔將病毒轉(zhuǎn)錄物導(dǎo)入細(xì)胞。也可使用將植物病毒載體導(dǎo)入植物細(xì)胞系細(xì)胞的其它方法。
圖13顯示用于根據(jù)本發(fā)明生成克隆植物細(xì)胞系方法中的步驟。圖13A顯示一適于導(dǎo)入植物細(xì)胞(例如，原生質(zhì)體)的病毒載體。在導(dǎo)入病毒載體之后，可使植物細(xì)胞系保持在組織培養(yǎng)中，例如，如圖13B和13C所示。在此段時(shí)間內(nèi)，病毒載體會(huì)復(fù)制且感興趣多核苷酸會(huì)得到表達(dá)?？赏ㄟ^(例如)連續(xù)富集過程自所述培養(yǎng)物中獲得克隆植物細(xì)胞系。例如，如圖13E所示，可自所述培養(yǎng)物中取出樣品，視情況加以稀釋以使細(xì)胞濃度降低，并以單個(gè)液滴鋪板于培養(yǎng)皿上。然后將所述液滴加以培養(yǎng)以使細(xì)胞分裂。
應(yīng)了解，所述會(huì)包含可變數(shù)目的細(xì)胞，需視培養(yǎng)物初始密度和稀釋量而定。如果需要僅在一輪富集后即獲得表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆細(xì)胞系，則可將細(xì)胞稀釋以使大部分液滴包含0或1個(gè)細(xì)胞。然而，可能更為有效的是，選擇可使多個(gè)細(xì)胞存在于每一液滴中的濃度且隨后篩選各液滴以鑒定出含有表達(dá)細(xì)胞者。一般而言，可采用任何適宜的篩選程序。例如，可使用可檢測(cè)標(biāo)記物(諸如GFP)的選擇或檢測(cè)。圖13F是一在UV燈下拍攝的照片且顯示出其中存在表達(dá)來自病毒載體的GFP的細(xì)胞系的各個(gè)液滴。也可使用Western印跡分析或ELISA分析。各個(gè)液滴(100μl)包含過多用于實(shí)施這些分析的細(xì)胞。實(shí)施多輪富集以分離表達(dá)水平持續(xù)較高的細(xì)胞系?？赏ㄟ^使用用于單細(xì)胞克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步限制稀釋來產(chǎn)生單克隆植物細(xì)胞系(即，源自單個(gè)祖細(xì)胞的群體)。然而，沒必要分離各個(gè)克隆系。含有多個(gè)克隆細(xì)胞系的群體也可用于表達(dá)感興趣多核苷酸。
一般而言，用于生成克隆根系的某些上述考慮因素也可應(yīng)用于克隆植物細(xì)胞系的生成中。例如，可使用各種含有一或多種感興趣多核苷酸的病毒載體，也可使用多種不同載體的組合。也可使用類似的篩選方法。與克隆根系和克隆根細(xì)胞系的情形中一樣，克隆植物細(xì)胞系的細(xì)胞源自包含所述病毒載體的單個(gè)祖細(xì)胞且因此也會(huì)含有所述病毒載體，原因在于其會(huì)復(fù)制且可在細(xì)胞分裂過程中進(jìn)行傳遞。因此有高比例(較佳至少50％、更佳至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或所有(100％)或大體上所有(至少98％))的細(xì)胞會(huì)含有所述病毒載體。應(yīng)注意，由于所述病毒載體可由克隆植物細(xì)胞系內(nèi)的子細(xì)胞繼承，因此所述細(xì)胞中病毒載體的移動(dòng)對(duì)于保持病毒載體并不必要。如下文所述，所述克隆植物細(xì)胞系可用于生產(chǎn)感興趣多肽。
F.克隆植物可自根據(jù)上文所述各種方法產(chǎn)生的克隆根、克隆根細(xì)胞系及/或克隆植物細(xì)胞系生成克隆植物。用于自根、根細(xì)胞系和植物細(xì)胞系(諸如本文所述克隆根系、克隆根細(xì)胞系和克隆植物細(xì)胞系)生成植物的方法為業(yè)內(nèi)熟知，參見例如，Peres等人，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 65，37-44，2001和本文其它地方引用的有關(guān)植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方面的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)。因此本發(fā)明提供一種生成一克隆植物的方法，所述方法包括以下步驟(i)根據(jù)任一本發(fā)明上述方法生成一克隆根系、克隆根細(xì)胞系或克隆植物細(xì)胞系；和(ii)自所述克隆根系、克隆根細(xì)胞系或克隆植物生成一完整植株?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使克隆植物進(jìn)行繁殖和生長。實(shí)例7闡述如何自含有編碼人類生長激素的病毒載體的克隆根系生成克隆植物。
與克隆根系、克隆根細(xì)胞系和克隆植物細(xì)胞系的情形中一樣，克隆植物的細(xì)胞源自包含所述病毒載體的單個(gè)祖細(xì)胞且因此也會(huì)含有所述病毒載體，原因在于其會(huì)復(fù)制且會(huì)在細(xì)胞分裂過程中進(jìn)行傳遞。因此高比例(較佳至少50％、更佳至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或所有(100％)或大體上所有(至少98％))細(xì)胞會(huì)含有所述病毒載體。應(yīng)注意，由于所述病毒載體可由克隆植物內(nèi)子細(xì)胞繼承，因此病毒載體的移動(dòng)對(duì)于保持所述病毒載體并非是必要的。
II.植物種類根據(jù)本發(fā)明可使用任何對(duì)病毒感染敏感的植物。一般而言，經(jīng)常會(huì)需要使用在指定條件下(例如溫室及/或水性系統(tǒng)中)能夠順從生長的植物。也會(huì)需要選擇通常不由人類或家養(yǎng)動(dòng)物所消耗及/或通常不作為人類食物鏈一部分的植物，以致其在外面生長時(shí)無需考慮經(jīng)表達(dá)多核苷酸受到不利攝取。然而，在其它實(shí)施例中，會(huì)需要采用可食用植物。
某些合乎需要的植物特征常常取決于擬表達(dá)的特定多核苷酸。僅作為數(shù)個(gè)實(shí)例，當(dāng)所述多核苷酸編碼擬以高產(chǎn)率生產(chǎn)的蛋白質(zhì)時(shí)(如常是如下情形，例如，當(dāng)擬表達(dá)治療用蛋白質(zhì)時(shí))，常會(huì)需要選擇生物量相對(duì)較高的植物(例如，煙草，具有對(duì)病毒感染高度敏感的額外優(yōu)勢(shì)，具有短的生長期且不處于人類事務(wù)鏈中)。當(dāng)多核苷酸編碼其完整活性需要特殊轉(zhuǎn)錄后修飾(或受其抑制)的蛋白質(zhì)時(shí)，則可直接選擇某些有能力(或無能力)達(dá)成相關(guān)修飾(例如，特定糖基化作用)的植物種類。
在本發(fā)明某些較佳實(shí)施例中，使用農(nóng)作物植物或農(nóng)作物相關(guān)植物在一些尤其較佳實(shí)施例中，使用可食用植物。
用于本發(fā)明的較佳植物包括被子植物、苔蘚植物(例如，苔綱、蘚綱，等等)、蕨類植物(例如，蕨類、木賊類、石松類)、裸子植物(例如，松柏類、蘇鐵類、銀杏類、買麻藤類)和藻類(例如，綠藻綱、褐藻綱、紅藻綱、藍(lán)藻綱、黃藻綱和裸藻綱)。尤其較佳者是以下各科的成員豆科(Leguminosae(Fabaceae))，例如，豌豆、苜蓿、大豆)；禾本科(Gramineae(Poaceae)，例如，玉米、小麥、水稻)；茄科(Solanaceae)，尤其是以下各屬番茄屬(Lycopersicon)，例如，番茄)；茄屬(Solanum)，例如，馬鈴薯、茄子；辣椒屬(Capsium)，例如，胡椒或煙草屬(Nicotiana)，例如，煙草；傘形科(Umbelliferae)，尤其是以下各屬胡蘿卜屬(Daucus)，例如，胡蘿卜；旱芹屬(Apium)，例如，芹菜；或蕓香科(Rutaceae)，例如，柑桔類；菊科(Compositae)，尤其是以下各屬萵苣屬(Lactuca)，例如，萵苣；十字花科(Brassicaceae(Cruciferae))，尤其是以下各屬蕓苔屬(Brassica)或歐白芥屬(Sinapis)。尤其較佳十字花科成員包括、(Brassica campesris)、埃塞俄比亞芥(B.carinata)、芥菜(B.juncea)、甘藍(lán)型油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘藍(lán)(B.oleraceae)、撒哈拉芥(B.toumifortii)、白芥(Sinapis alba)和蘿卜(Raphanus sativus)。
III.感興趣多核苷酸和多肽利用本發(fā)明教示將任何感興趣多核苷酸遞送至植物細(xì)胞中及/或使之在所述植物細(xì)胞中表達(dá)。例如，編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸可表達(dá)酶、抗體、激素、細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)因子、結(jié)構(gòu)蛋白或任何其它感興趣蛋白質(zhì)或多肽。經(jīng)編碼蛋白質(zhì)可以是天然存在的蛋白質(zhì)，或可以是經(jīng)設(shè)計(jì)或經(jīng)構(gòu)建蛋白質(zhì)，包括(例如)融合蛋白(例如，納入一部分或所有植物病毒蛋白質(zhì)(諸如MP或CP)的融合蛋白)。參見例如，美國專利第號(hào)6,448,070號(hào)和第6,660,500號(hào)。可編碼諸多類型的融合蛋白?？蓪愒葱蛄腥诤现林参锊《镜鞍椎?’或3’末端或定位在內(nèi)部。在單個(gè)融合蛋白中可納入多種不同來源的序列。經(jīng)編碼蛋白質(zhì)可包含一裂解位點(diǎn)，其可由經(jīng)插入多核苷酸或病毒載體編碼。參見(例如)美國專利第6,740,740號(hào)。例如，所述載體可包含一位于CP編碼部分上游的裂解位點(diǎn)的編碼部分，以在將感興趣多核苷酸插入CP啟動(dòng)子與裂解位點(diǎn)編碼部分中間時(shí)，所得開放閱讀框可編碼一含有經(jīng)所述感興趣多核苷酸編碼的部分、裂解位點(diǎn)和一部分或所有CP的融合蛋白。在裂解位點(diǎn)裂解所述融合蛋白可釋放經(jīng)編碼的感興趣多肽。所述裂解位點(diǎn)可以是用于通過化學(xué)方式(例如，溴化氰)或酶促方式(例如，通過諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶、胃蛋白酶、金黃色葡萄球菌V8蛋白酶和因子Xa蛋白酶等蛋白酶)進(jìn)行裂解的位點(diǎn)。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述感興趣多核苷酸包括編碼標(biāo)簽的部分，例如，6X-His標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、Myc標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽，等等。所述標(biāo)簽可簡化蛋白質(zhì)的檢測(cè)、分離及/或純化。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述標(biāo)簽是一可裂解標(biāo)簽，例如，可通過上述化學(xué)方式或酶促方式裂解的標(biāo)簽。納入裂解位點(diǎn)使得所述標(biāo)簽易于自所述經(jīng)轉(zhuǎn)譯多肽上去除(例如，在純化后去除)，從而得到具有野生型序列的蛋白質(zhì)。應(yīng)了解，所述標(biāo)簽及/或裂解位點(diǎn)可存在于其中擬插入特定感興趣多核苷酸的病毒載體中且無需存在于經(jīng)插入的多核苷酸自身內(nèi)。插入所述多核苷酸后，將含有編碼標(biāo)簽、裂解位點(diǎn)和新插入的多核苷酸的各個(gè)區(qū)的部分視作感興趣多核苷酸。
在一些實(shí)例中，例如，為產(chǎn)生含有多個(gè)單體的蛋白質(zhì)或同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)不同蛋白質(zhì)(諸如一感興趣蛋白質(zhì)和一可檢測(cè)或可選擇標(biāo)記物)，則會(huì)需要利用本發(fā)明系統(tǒng)在相同克隆根或植物細(xì)胞系或克隆植物中表達(dá)一種以上的多肽鏈(例如，使用兩個(gè)不同病毒載體(其中每一個(gè)均可引導(dǎo)多核苷酸的表達(dá))、在一個(gè)病毒載體中插入兩個(gè)不同的多核苷酸、利用表達(dá)一或多個(gè)多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物以生成克隆根或植物細(xì)胞系或克隆植物)。
在本發(fā)明某些較佳實(shí)施例中，采用編碼有治療活性蛋白質(zhì)的多核苷酸。經(jīng)批準(zhǔn)具有治療用途的例示性蛋白質(zhì)包括(例如)胰島素、人類生長激素、干擾素、白蛋白、tPA、紅細(xì)胞生成素、白介素、因子VIII、DNA酶、因子IX、PDGF、FSH、TNF受體(可溶形式)、降鈣素和各種免疫球蛋白。當(dāng)然，本發(fā)明并不僅限于所述經(jīng)批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)，而是涵蓋任何多核苷酸的表達(dá)，不論是蛋白質(zhì)編碼序列還是非蛋白質(zhì)編碼序列，且尤其涵蓋表達(dá)編碼任何有治療活性蛋白質(zhì)的任何多核苷酸，不論是原核生物來源還是真核生物來源，等等。
一般而言，感興趣的醫(yī)藥蛋白質(zhì)包括但不限于激素(胰島素、甲狀腺激素、兒茶酚胺、促性腺激素、營養(yǎng)激素、催乳素、催產(chǎn)素、多巴胺、牛生長激素、瘦素及諸如此類)、生長激素(例如，人類生長激素)、生長因子(例如，表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、胰島素樣生長因子及諸如此類)、生長因子受體、細(xì)胞因子和免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)(例如，白介素、集落刺激因子(CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素、整合素、地址素、選擇素、歸巢受體、T細(xì)胞受體、免疫球蛋白、可溶性主要組織相容性復(fù)合體抗原、免疫活性抗原，諸如細(xì)菌、寄生蟲或病毒抗原或過敏原、自身抗原、抗體)、酶(組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、鏈激酶、膽固醇生物合成酶或降解酶、類固醇生成酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、脫甲基酶、脫氫酶、纖維素酶、蛋白酶、脂酶、磷脂酶、芳香酶、細(xì)胞色素、腺苷酸環(huán)化酶或鳥苷酸環(huán)化酶、神經(jīng)氨酸酶及諸如此類)、受體(類固醇激素受體、肽受體)、結(jié)合蛋白(類固醇結(jié)合蛋白、生長激素或生長因子結(jié)合蛋白及諸如此類)，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯因子、癌蛋白或原癌蛋白(例如，細(xì)胞循環(huán)蛋白)、肌肉蛋白(肌球蛋白或原肌球蛋白及諸如此類)、脊髓蛋白、神經(jīng)活性蛋白、腫瘤生長抑制蛋白(血管抑素或血管內(nèi)皮抑素，二者均可抑制血管發(fā)生)、抗敗血癥蛋白(殺菌滲透性增強(qiáng)蛋白)、結(jié)構(gòu)蛋白(諸如膠原、絲心蛋白、纖維蛋白原、彈性蛋白、微管蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰島素、因子IX、因子X、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、蛋白質(zhì)C、血管假性血友病因子、抗凝血酶III、葡糖腦苷脂酶、紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)或改造因子VIII、抗凝劑諸如水蛭素)及諸如此類。
在一特定實(shí)例中，可利用本發(fā)明生產(chǎn)疫苗組份。一般而言，需要在疫苗中納入蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的各部分，當(dāng)人類或動(dòng)物受到病原體感染或遭受某種其它不利事件(例如，形成腫瘤)時(shí)，可將所述人類或動(dòng)物免疫系統(tǒng)暴露于所述蛋白質(zhì)及其各部分中。因此，可調(diào)配在疫苗中的蛋白質(zhì)或多肽可實(shí)質(zhì)包括任何具潛在抗原性的蛋白質(zhì)或其一部分，例如，病毒外被蛋白、病毒融合蛋白、病毒包膜蛋白、病毒糖蛋白、細(xì)菌或真菌細(xì)胞壁蛋白、毒素蛋白、寄生蟲外被蛋白、腫瘤特異性抗原等，或上述任一個(gè)的各部分。參見例如，WO9640229。病毒感興趣包括HIV、呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、肺炎病毒、間質(zhì)肺病毒、流感病毒、痘病毒(包括天花)、鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、皰疹病毒、漢坦病毒、埃博拉病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒、肝炎病毒(例如，A型、B型、C型、D型、E型、F型或G型肝炎病毒)等等。感興趣的細(xì)菌包括奈瑟氏菌屬(Neisseria)、肺炎球菌屬(Pneumococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、炭疽病毒，等等。感興趣的寄生蟲包括瘧原蟲屬(Plasmodium)、利什曼蟲屬(Leishmania)、弓形蟲屬(Toxoplasma)、蛔蟲屬(Ascaris)、鉤蟲和其它線蟲類、變形蟲類、吸蟲類，等等。
在其它實(shí)施例中，可利用本發(fā)明系統(tǒng)表達(dá)編碼可合成或修飾生物活性劑的酶的多核苷酸。例如，某些酶(例如，聚酮合成酶、多肽合成酶、萜合成酶，等等)可合成具有感興趣生物活性(包括治療活性，例如，抗生素、抗癌、免疫抑制活性，等等)的小分子。同樣，已知大量可修飾蛋白質(zhì)或小分子底物的酶(例如，激酶、水解酶、轉(zhuǎn)移酶，等等)。對(duì)于能夠使用本文所述的本發(fā)明系統(tǒng)合乎需要地在植物中表達(dá)的其它蛋白質(zhì)可參見美國專利第6,500,644號(hào)。
在本發(fā)明某些實(shí)施例中，所述多核苷酸編碼生物合成途徑中一組份(例如，酶)。植物是許多可用于醫(yī)藥及/或工業(yè)目的和其它目的的天然產(chǎn)物的來源。有益的是可通過提高水平或效率來生產(chǎn)所述產(chǎn)物。所以，感興趣多核苷酸可編碼一生物合成酶，例如，可催化生物合成途徑中限速步驟的酶，通過其可合成所述天然產(chǎn)物。
在其它實(shí)施例中，可利用本發(fā)明系統(tǒng)來生產(chǎn)包括(例如)抗體在內(nèi)的診斷或研究試劑。
在本發(fā)明另一些實(shí)施例中，所述多核苷酸編碼可以多種方式中任一種增強(qiáng)植物生長或存活的蛋白質(zhì)。例如，所述蛋白質(zhì)可增強(qiáng)植物由土壤或培養(yǎng)基中吸取營養(yǎng)物質(zhì)的能力，可賦予針對(duì)環(huán)境條件(諸如溫度、鹽度，等等)的抗性，或可賦予針對(duì)病原體(諸如病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲、昆蟲，等等)的抗性。一實(shí)例是各種稱作防御素的植物肽(Thomma，B.P.等人，Planta，216(2)193-202，2002)所述蛋白質(zhì)既包括內(nèi)源植物蛋白(即，在所述克隆根系、克隆植物細(xì)胞系或克隆植物源自于其的植物中天然表達(dá)的蛋白質(zhì))又包括非內(nèi)源蛋白質(zhì)。
在又一些實(shí)施例中，可利用本發(fā)明系統(tǒng)生產(chǎn)營養(yǎng)相關(guān)蛋白或其它產(chǎn)品。營養(yǎng)相關(guān)蛋白包括(例如)人類或飼養(yǎng)動(dòng)物(例如，貓、狗)所消耗的動(dòng)物中天然存在的蛋白質(zhì)。其它實(shí)例包括具有平衡氨基酸組成的蛋白質(zhì)，例如，具有包括用于全胃腸外營養(yǎng)(TPN)者在內(nèi)的氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
在另一些實(shí)施例中，可利用本發(fā)明系統(tǒng)表達(dá)不一定編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，例如利用其產(chǎn)生活性RNA物質(zhì)，例如，核糖酶或可使基因表達(dá)沉默的干擾RNA、長的雙鏈RNA或短的干擾RNA(siRNA)、微小RNA或微小RNA前體，短發(fā)夾RNA(shRNA)，等等。參見例如，美國專利第6,531,647號(hào)；第6,635,805號(hào)和美國專利公開案第20040019930號(hào)。在一些實(shí)施例中，核糖酶或干擾RNA可產(chǎn)生于目標(biāo)植物基因中，以形成經(jīng)改造的植物，例如不表達(dá)植物病原體或特定過敏原蛋白的特定受體的植物。
IV.克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物的培養(yǎng)或生長一般而言，可使用業(yè)內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法所進(jìn)行本發(fā)明克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物的培養(yǎng)或生長。曾采用多種培養(yǎng)基和生物反應(yīng)器來培養(yǎng)發(fā)根細(xì)胞、根細(xì)胞系和植物細(xì)胞。參見例如，Giri，A.和Narasu，M.L.，Biotechnol.Adv.181-22，2000；Rao，S.R.和Ravishankar，G.A.，Biotechnol.Adv.20101-153，2002，和上述二文獻(xiàn)中引用的參考文獻(xiàn)，所有這些參考文獻(xiàn)均以引用方式并入本文中?？梢匀魏芜m宜方式使克隆植物生長。
V.多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物的分離及/或調(diào)配在本發(fā)明許多實(shí)施例中，會(huì)需要自可表達(dá)其的植物組織(例如，根、根細(xì)胞、植物、植物細(xì)胞)中分離多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物。也會(huì)需要調(diào)配所述經(jīng)分離產(chǎn)物以用于其預(yù)期用途(例如，作為醫(yī)藥劑或診斷劑或作為試劑，等等)。在其它實(shí)施例中，會(huì)需要將所述產(chǎn)物與某些或所有表達(dá)其的植物組織調(diào)配在一起。
當(dāng)需要自某些或所有表達(dá)其的植物細(xì)胞或組織中分離所述表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，可使用任何可用的純化技術(shù)。所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟習(xí)大量分餾和分離程序(參見例如，Scopes等人，Protein PurificationPrinciples and Practice，第3版；Janson等人，1993；Protein PurificationPrinciples，High Resolution Methods，and Applications，Wiley-VCH，1998；Springer-Verlag，NY，1993；Roe，Protein Purrication Techniques，Oxford UniversityPress，2001，上述文獻(xiàn)以引用方式并入本文中)。通常會(huì)需要使產(chǎn)物純度在約50％以上、較佳約60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上。有關(guān)可用來從植物組織或液體中純化物質(zhì)的某些方法的論述參見(例如)美國專利第6,740,740號(hào)和第6,841,659號(hào)。
當(dāng)需要將所述產(chǎn)物與植物材料調(diào)配在一起時(shí)，常會(huì)需要采用對(duì)相關(guān)接受者(例如，人類或其它動(dòng)物)無毒的植物。相關(guān)植物組織(例如，細(xì)胞、根、葉)可根據(jù)業(yè)內(nèi)已知技術(shù)經(jīng)簡單收獲和加工，其中需適當(dāng)考慮保持經(jīng)表達(dá)產(chǎn)物的活性。在本發(fā)明某些實(shí)施例中，需要在可食用植物(且具體而言在所述植物的可食用部分)中表達(dá)所述多核苷酸以使所述材料隨后可食用。例如，當(dāng)所述多核苷酸編碼在經(jīng)口(經(jīng)適當(dāng)調(diào)配時(shí))遞送后具有活性的營養(yǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)或治療用蛋白質(zhì)時(shí)，會(huì)需要在可食用植物部分產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并將用于經(jīng)口遞送的經(jīng)表達(dá)多核苷酸與所述多核苷酸借助其進(jìn)行表達(dá)的某些或所有植物材料調(diào)配在一起。
當(dāng)所述多核苷酸編碼或產(chǎn)生治療劑時(shí)，則可根據(jù)已知技術(shù)對(duì)其進(jìn)行調(diào)配。例如，可將有效量的醫(yī)藥活性產(chǎn)物與一或多種有機(jī)或無機(jī)、液態(tài)或固態(tài)的醫(yī)藥上適宜的載劑物質(zhì)調(diào)配在一起?？梢韵铝袆┬褪褂酶鶕?jù)本發(fā)明生產(chǎn)的醫(yī)藥活性產(chǎn)物包括片劑、膠囊、錠劑、分散液、懸浮液、溶液、膠囊、乳霜、軟膏、氣溶膠、粉狀產(chǎn)品袋、液體溶液、溶劑、稀釋劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑和固體粘結(jié)劑，只要蛋白質(zhì)的生物活性不會(huì)受到所述劑型的破壞即可。
可用作醫(yī)藥上可接受載劑的物質(zhì)包括(但不限于)糖(例如，乳糖、葡萄糖和蔗糖)；淀粉(例如，玉米淀粉和馬鈴薯淀粉)；纖維素及其衍生物(例如，羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素)；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑(例如，可可油和栓劑蠟)；油(例如，花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油)；二醇類(例如，丙二醇)；酯類(例如，油酸乙酯和月桂酸乙酯)；瓊脂；緩沖劑(例如，氫氧化鎂和氫氧化鋁)；海藻酸；無致熱原的水；等滲鹽水；林格(Ringer)溶液；根據(jù)調(diào)配師的判斷，該組合物中亦可含有乙醇和磷酸鹽緩沖液與其它無毒的相容性潤滑劑(例如，月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂)以及著色劑、釋放劑、涂布劑、甜味劑、調(diào)味劑和加香劑、防腐劑與抗氧化劑。例如，可借助習(xí)用的混合、?；?、糖衣丸形成、溶解、冷凍干燥或類似方法以醫(yī)藥組合物形式提供所述多核苷酸表達(dá)產(chǎn)物。
在某些較佳實(shí)施例中，會(huì)需要通過減慢經(jīng)皮下或肌內(nèi)注射的醫(yī)藥活性產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的吸收來延長醫(yī)藥制劑的作用。此可通過使用水溶性差的晶體或無定形物質(zhì)的液態(tài)懸浮液來達(dá)成。因此，產(chǎn)物的吸收速率取決于其溶解速度，而其溶解速度又取決于大小和形式?；蛘?，可通過將該產(chǎn)物溶解或懸浮于油性媒劑中來達(dá)成非經(jīng)腸投與藥物的延時(shí)吸收?？赏ㄟ^在生物可降解聚合物(例如，聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成蛋白質(zhì)的微囊基質(zhì)來制備可注射儲(chǔ)積形式?？筛鶕?jù)產(chǎn)物與聚合物的比例和所用特定聚合物的性質(zhì)控制釋放速率。其它生物可降解聚合物之實(shí)例包括聚(原酸酯)及聚(酐)。注射用儲(chǔ)積調(diào)配物亦通過將產(chǎn)物包裹入與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳劑中來制備。
經(jīng)腸投與的醫(yī)藥活性產(chǎn)物制劑可以固體、半固體、懸浮液或乳液形式引入且可與任何醫(yī)藥上接受的載劑(諸如水、懸浮劑和乳化劑)混合在一起。表達(dá)產(chǎn)物也可借助泵或緩釋形式投與，尤其是當(dāng)作為預(yù)防措施加以投與時(shí)，以能夠在受試者中預(yù)防疾病形成或改善或延緩已確認(rèn)的疾病。
醫(yī)藥活性產(chǎn)物視情況與植物組織一起尤其適用于作為醫(yī)藥組合物經(jīng)口投與。收獲的植物材料可以多種方法的任一種(例如，空氣干燥、冷凍干燥、提取等)加以處理，需視期望治療產(chǎn)物的性質(zhì)及其期望形式而定。在較佳實(shí)施例中，如上所述的這些組合物可單獨(dú)經(jīng)口攝取或連同食物或飼料或飲料一起攝取。用于經(jīng)口投與的組合物包括以干粉、糧食、水性或非水性溶劑、懸浮液或乳液形式提供的植物、植物提取物和由經(jīng)感染植物純化的蛋白質(zhì)。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油和可注射有機(jī)酯。水性載劑包括水、水-乙醇溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和經(jīng)緩沖醫(yī)用非經(jīng)腸媒劑，包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖-氯化鈉溶液、含有乳糖或固定油的林格溶液。干粉實(shí)例包括已干燥(例如，經(jīng)冷凍干燥、空氣干燥或噴霧干燥)的任何植物生物量。例如，將植物置于約120的市售空氣干燥器中直至以重量計(jì)生物量所含水分小于5％，藉此對(duì)所述植物進(jìn)行空氣干燥。經(jīng)干燥植物可以大塊固體形式保存起來以待進(jìn)一步加工或通過研磨進(jìn)一步加工成期望網(wǎng)目大小的粉末?；蛘?，對(duì)于對(duì)空氣干燥敏感的產(chǎn)物可使用冷凍干燥。將產(chǎn)物置于真空干燥器中并在真空下進(jìn)行冷凍干燥直至以重量計(jì)生物量所含水分小于約5％，藉此對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥。經(jīng)干燥材料可如本文所述得到進(jìn)一步加工。
源于植物的材料可作為草藥制劑或與一或多種草藥制劑一起投與?？捎玫牟菟幹苿┌ㄒ簯B(tài)和故態(tài)草藥制劑。草藥制劑的某些實(shí)例包括酊劑、提取物(例如，水性提取物、醇提取物)、煎劑、干燥制劑(例如，經(jīng)空氣干燥、噴霧干燥、冷凍或冷凍干燥)、粉劑(例如，冷凍干燥的粉劑)和液體。草藥制劑可以任何標(biāo)準(zhǔn)遞送媒劑提供，諸如膠囊、片劑、栓劑、液體劑，等等。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)了解可應(yīng)用于本發(fā)明的遞送草藥制劑的各種調(diào)配物和用藥程式。
所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員也會(huì)了解，獲得期望醫(yī)藥活性產(chǎn)物的尤其較佳方法是提取。植物材料(例如，根、葉，等等)可經(jīng)提取以自所述剩余生物量中獲取期望產(chǎn)物，從而增加產(chǎn)物濃度和純度。植物也可在緩沖溶液中加以提取。例如，可按一對(duì)一的重量比將植物材料轉(zhuǎn)移至一定量已經(jīng)(例如)磷酸鹽緩沖液緩沖的的冰冷水中。需要時(shí)也可添加蛋白酶抑制劑。通過劇烈混合或研磨來打碎植物材料，同時(shí)懸浮于緩沖溶液中并通過過濾或離心獲取經(jīng)提取的生物量?？赏ㄟ^額外步驟進(jìn)一步純化存于溶液中的產(chǎn)物或通過冷凍干燥或沉淀將其轉(zhuǎn)化成干粉。提取也可通過壓榨進(jìn)行。植物或根也可通過在壓榨機(jī)中進(jìn)行壓榨來提取或當(dāng)植物或根通過距離很近的輥時(shí)加以碾碎來提取。收集自所述經(jīng)碾碎的植物或根中榨出的液體并根據(jù)業(yè)內(nèi)熟知方法進(jìn)行加工。壓榨提取可使產(chǎn)物以更為濃縮的形式釋放。然而，產(chǎn)物的總產(chǎn)量會(huì)低于在溶液中提取的產(chǎn)物產(chǎn)量。
本發(fā)明根系、細(xì)胞系、植物、提取物、粉末、干燥制劑和純化的蛋白質(zhì)或核酸產(chǎn)物等也可呈含有或不含一或多種如上所述賦形劑的由包膜形式。片劑、糖衣丸、膠囊、丸劑和顆粒劑等固體劑型可用包膜或外殼(諸如腸溶包膜、控制釋放包膜和醫(yī)藥調(diào)配業(yè)內(nèi)熟知的其它包膜)加以制備。在所述固體劑型中，活性產(chǎn)物可與至少一種惰性稀釋劑(諸如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。在正常情況下這些劑型也可包含除惰性稀釋劑以外的額外物質(zhì)，例如，片劑潤滑劑和其它片劑助劑(例如，硬脂酸鎂和微晶纖維素)。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，所述劑型也可包含緩沖劑。其可視情況包含遮光劑且也可為視情況以延遲方式僅(或優(yōu)先)在腸道的某一部分釋放活性成份的組合物?？捎玫陌窠M合物之實(shí)例包括聚合物和蠟。
在其它尤其較佳實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)一醫(yī)藥活性產(chǎn)物的植物或其一部分或其生物量可作為藥用食物經(jīng)口投與。所述可食用組合物可通過以原狀食用(呈固體形式時(shí))或通過飲用(呈液體形式時(shí))來消耗。在一較佳實(shí)施例中，所述植物材料可在不存在預(yù)處理步驟的情況下或在最小限度的廚房制備后直接攝取。在一替代實(shí)施例中，植物生物量經(jīng)加工且攝取加工步驟后回收的材料。
較佳用于本發(fā)明的加工方法是食物或飼料工業(yè)內(nèi)常用方法。所述方法的最終產(chǎn)物仍包含大量經(jīng)表達(dá)的醫(yī)藥活性多核苷酸或多肽且較佳地方便食用或飲用。最終產(chǎn)物也可與其它食物或飼料形式(諸如鹽類、載劑、調(diào)味劑、抗生素及諸如此類)混合，并以固體、半固體、懸浮液、乳液或液體形式消耗。在另一較佳實(shí)施例中，所述方法包括保存步驟，例如，巴斯德殺菌、烹調(diào)或加入保存劑或防腐劑。在本發(fā)明中可使用和加工任何植物以產(chǎn)生可食用或可引用的植物物質(zhì)。源于植物的制劑中醫(yī)藥活性多核苷酸或多肽表達(dá)產(chǎn)物的量可通過業(yè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，凝膠電泳，ELISA或Western印跡分析)利用對(duì)產(chǎn)物具有特異性的探針或抗體測(cè)試。此測(cè)定可用來使攝取的多核苷酸或蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、例如，治療用活性產(chǎn)物的量可通過(例如)將各批具有不同產(chǎn)物含量的產(chǎn)物混合加以測(cè)定和調(diào)節(jié)，以使經(jīng)飲用或食用攝取的單個(gè)劑量的材料量標(biāo)準(zhǔn)化。
在植物細(xì)胞或組織產(chǎn)生且由宿主食用的醫(yī)藥活性多核苷酸或蛋白質(zhì)較佳可由消化系統(tǒng)吸收。攝取僅接受最小程度加工的植物組織的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可在植物細(xì)胞中提供多核苷酸或蛋白質(zhì)的微囊化或隔離。因此，所述產(chǎn)物可接受至少某種保護(hù)以免在到達(dá)胃或小腸之前于上部消化道中受到消化且會(huì)有較高比例的活性產(chǎn)物用于吸收。
本發(fā)明醫(yī)藥組合物可以治療方式或預(yù)防方式投與。在某些較佳實(shí)施例中，可利用所述組合物來治療或預(yù)防疾病、例如，可治療任何患有疾病或處于疾病形成風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體。應(yīng)了解，在未經(jīng)診斷具有任何疾病癥狀的情況下可認(rèn)為個(gè)體是處于形成疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。例如，如果所述個(gè)體具有經(jīng)鑒定與形成特定疾病的風(fēng)險(xiǎn)性增加有關(guān)的特殊基因標(biāo)記物，則會(huì)認(rèn)為所述個(gè)體處于形成所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。同樣地，如果個(gè)體家族成員曾被診斷出患有特定疾病(例如，癌癥)，則會(huì)認(rèn)為所述個(gè)體處于形成所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
用于經(jīng)口投與的液體劑型包括(但不限于)醫(yī)藥上可接受的乳液、微乳劑、溶液、懸浮液、漿液和酏劑。除所述活性化合物外，液體劑型可含有業(yè)內(nèi)常用的惰性稀釋劑，例如(舉例而言)水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物也可包括佐劑，諸如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑和加香劑。
用于直腸或陰道投與的組合物較佳為栓劑，其可通過將本發(fā)明組合物與適宜無刺激性賦形劑或載劑(諸如可可油、聚乙二醇或栓劑蠟)進(jìn)行混合來制備，這些賦形劑或載劑在環(huán)境溫度下為固體但在體溫下為液體，因而其可在直腸或陰道腔內(nèi)融化并釋放活性蛋白質(zhì)。
用于外敷或經(jīng)皮投與本發(fā)明醫(yī)藥化合物的劑型包括軟膏、膏劑、乳霜、洗劑、凝膠、粉劑、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼片。所述活性產(chǎn)物或其制劑可在無菌條件下與一醫(yī)藥上可接受載劑和(需要時(shí))任一所需防腐劑與緩沖劑混合。眼用調(diào)配物、滴耳劑和滴眼劑也涵蓋在本發(fā)明范疇內(nèi)。此外，本發(fā)明涵蓋使用皮膚貼片，其具有以控制方式將醫(yī)藥活性蛋白遞送至身體的附加優(yōu)點(diǎn)。這些劑型可通過將醫(yī)藥活性產(chǎn)物懸浮或分散于適宜介質(zhì)中制備。也可使用吸收促進(jìn)劑來增加醫(yī)藥活性蛋白質(zhì)穿過皮膚的流量。速率可通過提供速率控制膜或通過將醫(yī)藥活性蛋白質(zhì)分散于聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制。
所述組合物需以達(dá)成期望結(jié)果所需的量和時(shí)間進(jìn)行投與。如上所述，在本發(fā)明某些實(shí)施例中，醫(yī)藥組合物的“治療有效量”是指使用所述量可有效治療、減輕或預(yù)防宿主疾病。因此，本文所用“有效治療、減輕或預(yù)防疾病的量”指無毒且足以治療、減輕或預(yù)防任一宿主中疾病的醫(yī)藥組合物的量。僅作為一實(shí)例，“治療有效量”可以是治療、減輕或預(yù)防糖尿病、生長激素缺乏等等的量。作為另一實(shí)例，“治療有效量”可以是足以在受試者體內(nèi)引起免疫反應(yīng)(例如，產(chǎn)生可結(jié)合特定抗原的抗體)的量。較佳地，所述抗體可防止感染或降低感染嚴(yán)重性，或防止可能因暴露于所述抗原而引起的疾病或病癥。
視受試者物種、年齡和一般健康狀況、疾病狀態(tài)、特定醫(yī)藥混合物、其投與模式及諸如此類，所需確切量在受試者與受試者之間會(huì)有所不同。本發(fā)明經(jīng)感染植物及/或其蛋白質(zhì)制劑較佳調(diào)配成單位劑型以方便投與和保證劑量的一致性。本文所用表達(dá)法“單位劑型”是指適用于擬治療患者的醫(yī)藥活性多核苷酸或多肽表達(dá)產(chǎn)物的物理離散單位。然而，應(yīng)了解，本發(fā)明組合物的總?cè)沼昧繎?yīng)由主治醫(yī)生在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。用于任一特定患者或生物體的具體治療有效劑量水平應(yīng)根據(jù)各種因素確定，包括所治療疾病及疾病嚴(yán)重程度；所用具體化合物的活性；所用具體組合物；患者年齡、體重、一般健康狀況、性別；患者飲食；患者的藥物動(dòng)力學(xué)狀況；所用具體化合物的投與時(shí)間、投與途徑和排泄速率；治療持續(xù)時(shí)間；與所用具體化合物組合或同時(shí)使用的藥物；和醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域中熟知的類似因素。
亦應(yīng)了解，本發(fā)明醫(yī)藥組合物可用于組合治療，即，所述醫(yī)藥組合物可與一或多種其它期望的療法或醫(yī)療程序同時(shí)、先于其或在其之后投與。在一組合療法中采用特定療法(療法或程序)組合應(yīng)考慮所期望療法及/或程序的相容性和欲達(dá)成的期望治療效果。亦應(yīng)了解，所用療法對(duì)于同一疾病可達(dá)成期望效果(例如，本發(fā)明化合物可與另一抗癌劑同時(shí)投與)，或其可達(dá)成不同效果。
實(shí)例實(shí)例1重組植物病毒載體的構(gòu)建我們采用基于煙草花葉病毒的載體，其適合插入感興趣多核苷酸以形成用于生成可根據(jù)本發(fā)明表達(dá)一感興趣多核苷酸的克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系、及/或克隆植物的載體。圖1顯示基于TMV的載體(D4)的示意圖，所述載體經(jīng)構(gòu)建接受感興趣多核苷酸的插入(Shivprasad等人，Virology，255(2)312-23，1999)，并闡明多種感興趣多核苷酸向所述載體中的插入。D4具有TMV外被蛋白(CP)編碼序列的缺失但保留了TMV CP次基因組啟動(dòng)子和TMV 3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)(UTR)，如圖上所指示。對(duì)于TMV復(fù)制需要126和183kD蛋白質(zhì)。30kD蛋白質(zhì)是移動(dòng)蛋白(MP)，用于細(xì)胞細(xì)胞間移動(dòng)。D4在CP次基因組啟動(dòng)子下游包含Pac I和Xho I位點(diǎn)，為方便插入感興趣多核苷酸提供位點(diǎn)。下文闡述通過在D4中插入多種感興趣多核苷酸形成的特定載體。
D4C3GFP是一基于TMV的表達(dá)載體，其無法產(chǎn)生CP(Shivprasad等人，1999TTT-GFP)，原因在于缺失TMV CP編碼區(qū)且用C3GFP基因替代其(將C3GFP基因置于TMV CP次基因組啟動(dòng)子的控制之下)。通過重疊PCR將C3GFP基因重新克隆至D4中以消除C3GFP核苷酸序列中的NcoI和XhoI以簡化進(jìn)一步的克隆步驟。在C3GFP基因3’端引入多位點(diǎn)接頭PstI-NotI-XhoI。將經(jīng)PacI-XhoI消化的PCR產(chǎn)物克隆至D4中，從而得到D4C3GFP1。
用于修飾C3GFP基因并消除NcoI和XhoI位點(diǎn)的引物是1)C3GFP.PacI.For(N)GGGAG.ATCTT.AATTA.ATGGC.TAGCA.AAGGA.GAAGA.A 36nt2)C3GFP.XhoI.Rev(N)CCCCT.CGAGC.GGCCG.CTGCA.GTTAT.TTGTA.GAGCT.CATCC.ATGCC 45nt3)C3GFP.NcoI.ForGTTCC.CTGGC.CAACA.CTTGT.CAC 23nt4)C3GFP.NcoI.RevTAGTG.ACAAG.TGTTG.GCCAG.GG 22nt5)C3GFP.XhoI.ForGGACA.CAAAC.TGGAG.TACAA.CTATA 25nt6)C3GFP.XhoI.RevAGTTA.TAGTT.GTACT.CCAGT.TTGTG 25nt
7)(BgIII)-PacI＞AUG...HindIII...NcoI...NdeI...BsrGI...MluI...XhoI...BamHI...MfeI(MunI)...SalI...SacI...TAA＜PstI...NotI...XhoI還生成了含有AlMV RNA3的全長或部分3’-非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3’UTR)的3個(gè)構(gòu)造。在這些構(gòu)造的每一個(gè)中，受次基因組TMV CP啟動(dòng)子控制的C3GFP編碼序列存在于AlMV RNA33’-UTR序列(全長或部分UTR)的上游，使得我們能夠精確鑒別出TMV基因組RNA(反式或順式)組裝和移動(dòng)所需的AlMV RNA33’UTR序列。將RNA3序列作為NotI-SalI片段插入新D4C3GFP載體的NotI與XhoI位點(diǎn)之間，從而得到構(gòu)造SR25(RNA3的1859至1941nt)，SR26(RNA3的1859至1969nt)和SR27(RNA3的1859至2037nt，即，整個(gè)3’UTR)(圖11d)。除來自所述AlMV RNA33’UTR、SR25、SR26和SR27的序列外還包括位于經(jīng)插入的AlMV序列下游的來自所述TMV 3’UTR(即，來自所述TMV基因組轉(zhuǎn)錄物的UTR)的序列。這些序列是TMV的核苷酸6192至6395，與D4構(gòu)造中相同?；赥MV的病毒(SR25、SR26和SR27)無法進(jìn)行長距離移動(dòng)，原因在于TMV外被蛋白對(duì)于有效進(jìn)行韌皮部介導(dǎo)的TMV長距離運(yùn)輸和系統(tǒng)性感染具有重要作用。
用于以AlMV RNA33’-UTR序列生成基于D4構(gòu)造引物是1)SR-52在nt 1859處具有XhoI-PstI位點(diǎn)的5’引物(正義)5’-CCGCTCGAGCTGCAGTGTACCCCATTAATTTGG-3’2)SR-53在AlMV RNA3的nt 1941處具有NotI-SalI位點(diǎn)的3’引物(反義)5’-CGGGTCGACGCGGCCGCGAATAGGACTTCATACCT-3’3)SR-54在AlMV RNA3的nt 1969處具有NotI-SalI位點(diǎn)的3’引物(反義)5’-CGGGTCGACGCGGCCGCAATATGAAGTCGATCCTA-3’4)SR-55在nt 2037處具有NotI-SalI位點(diǎn)的3’引物(反義)5’-CGGGTCGACGCGGCCGCGCATCCCTTAGGGGCATT-3’。
其中將感興趣多核苷酸(例如，GFP、hGH、GCSF)插入SR25、SR26及/或SR27的病毒載體處于對(duì)生成本文所述克隆根系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物的測(cè)試過程中。
為生成適于表達(dá)人類生長激素(hGH)的基于TMV的構(gòu)造，我們將hGH的基因插入D4載體中PacI和XhoI位點(diǎn)之間。在用于擴(kuò)增來自質(zhì)粒的基因的5’引物中引入AUG，并在編碼序列的3’末端引入氨基酸KDEL以借助在ER中的滯留來增強(qiáng)轉(zhuǎn)譯。對(duì)于本文所述實(shí)驗(yàn)，克隆不具有其天然前導(dǎo)序列的hGH，從而得到D4-hGH，其可用于本文所述實(shí)驗(yàn)。
引物SR22(5’-CCG TTAATTAATG TTC CCAACT ATT CCA)用于克隆不具有其前導(dǎo)序列并在5’末端引入PacI位點(diǎn)的hGH；引物SR23(5’-CCG TTA ATTAATG GCAACT GGATCA AGG)用于克隆具有其前導(dǎo)序列的hGH。引物SR24(5’-CGG CTC GAGTTA AAA ACC ACA TGA)用于克隆不具有KDEL并在3’末端引入XhoI位點(diǎn)的hGH基因；引物SR25(5’-CGG CTC GAG TTC ATC TTT AAA ACC TGA TCC)用于克隆具有KDEL的基因。
為生成適合表達(dá)人類粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)的基于TMV的構(gòu)造，我們首先合成編碼GCSF且不具有信號(hào)肽的完整開放閱讀框(ORF)。所述合成基因的序列需就植物中表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。。ORF用分別位于5’和3’末端的PacI和XhoI位點(diǎn)合成。通過PacI/XhoI消化切下所述基因并連入D4載體，所述載體可用PacI和XhoI線性化。所得載體(D4-GCSF)用于本文所述實(shí)驗(yàn)。
實(shí)例2表達(dá)GFP的克隆根系的生成和測(cè)試材料和方法病毒轉(zhuǎn)錄物的合成和病毒感染。利用T7聚合酶合成上述載體D4C3GFP的活體外轉(zhuǎn)錄物，所述載體D4C3GFP包含編碼受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制的GFP的開放閱讀框。在100μl的反應(yīng)體積中用30單位的KpnI過夜消化以使約10μgDNA線性化。使用所述AmpliCap T7 High Yield Message Maker Kit(Epicentre)根據(jù)制造商推薦用4μl限制酶消化液生成活體外轉(zhuǎn)錄物。使用來自一個(gè)所述反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物通過將溶于FES的轉(zhuǎn)錄物人工施加至新生全展葉片上來感染6周齡的本塞姆氏煙草植株。
發(fā)根土壤桿菌刺激根形成。使發(fā)根土壤桿菌菌株A4RSII生長至OD600為0.8至1。沉淀細(xì)菌細(xì)胞并重懸于MS-2培養(yǎng)基(MS鹽、2％蔗糖，10mM MES，pH5.5)以使終OD600為0.5。轉(zhuǎn)化前1小時(shí)加入乙酰丁香酮至終濃度為200μM。用轉(zhuǎn)錄物接種后5至14天收獲經(jīng)局部或系統(tǒng)性感染的本塞姆氏煙草葉片。用10％Clorox對(duì)葉片進(jìn)行6min的表面消毒并用無菌蒸餾水洗滌數(shù)次。
將經(jīng)表面消毒的本塞姆氏煙草葉片切成約1cm的小塊。將葉片小塊浸入細(xì)菌懸浮液中保持5min，在濾紙上瀝干并置于經(jīng)固化MS-2培養(yǎng)基的表面上。使各平板于24℃在暗光條件下條件保持48小時(shí)。48小時(shí)后，去除過量的土壤桿菌懸浮液，并將葉片外植體葉置于根據(jù)Nagy與Maliga(Nagy J.J.和Maliga P.，Z.Pflanzenphysiol.78453-455，1976)和Menczel等人(Menczel L.、Nagy F.、Kiss L.R.和Maliga P.，Theor.Appl.Genet 59191-195，1981)加以修改的不含激素的固體K3(Kao K.N.和MichaylukM.R.，Plants，115355-367，1974)培養(yǎng)基上。將各平板保持在25℃下，使用16小時(shí)日光照/8小時(shí)夜光照方案。
轉(zhuǎn)化后3周，切下發(fā)根并在不含激素的固體K3培養(yǎng)基上排列成一行。4至6天后，分離出大部分活躍生長的根并轉(zhuǎn)移至存于各個(gè)培養(yǎng)皿的液體K3培養(yǎng)基中。將所述根培養(yǎng)在24℃的旋轉(zhuǎn)振蕩器中并如下每周繼代一次分割并收獲根群的一部分并將收獲的根轉(zhuǎn)移至含有新鮮K3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。通過Western印跡分析及/或UV燈下的熒光(取決于特定感興趣多核苷酸)就感興趣蛋白質(zhì)的存在對(duì)根加以篩選。
Western印跡分析對(duì)于Western印跡分析，將10mg新鮮根材料置于Eppendorf管中并于50μl磷酸鹽中進(jìn)行勻漿，隨后加入followed 20μl的5x上樣緩沖液且煮沸10分鐘。煮沸完成后，將勻漿液離心5至10分鐘以去除碎片。離心后，將10μl樣品上樣于SDS聚丙烯酰胺凝膠上，并通過電泳分離蛋白質(zhì)。上樣市售GFP蛋白質(zhì)(5ng)(BD Biosciences Clontech)作為陽性對(duì)照。在峰表達(dá)時(shí)收獲來自經(jīng)相同載體(D4C3GFP)系統(tǒng)性感染的本塞姆氏煙草植株的葉片樣片(10mg)，并用與上述用于根材料的方式相同的方式制備提取物并上樣于凝膠以同根細(xì)胞系加以比較。電泳完成后，將蛋白質(zhì)電印跡至尼龍膜上，用酪蛋白封阻并與GFP特異性抗體反應(yīng)(BDBiosciences Clontech)。使用化學(xué)發(fā)光底物顯現(xiàn)與抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
結(jié)果圖6A至6E顯示用于生成克隆根系的整體方法(參見說明)。圖6G顯示如下獲得的表達(dá)GFP的克隆根系的照片，通過用病毒載體D4C3GFP感染本塞姆氏煙草，自所述感染區(qū)收獲葉片組織，用發(fā)根土壤桿菌感染并培養(yǎng)各小塊以形成發(fā)根，所述發(fā)根可經(jīng)分離和進(jìn)一步培養(yǎng)。
圖7A至7C顯示展現(xiàn)3個(gè)其中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的GFP編碼基因的病毒載體(D4C3GFP)克隆根系源自植物細(xì)胞中GFP產(chǎn)生的Western印跡分析。圖7A顯示在培養(yǎng)物中繁殖30天后(即，自其來源的葉片上分離下根后30天)克隆根系中的GFP表達(dá)。圖7B顯示在培養(yǎng)物中繁殖60天后(即，自其來源的葉片上分離下根后60天)的克隆根系中的GFP表達(dá)。C-代表不含蛋白質(zhì)的對(duì)照泳道。MWM代表分子量標(biāo)準(zhǔn)。GFP-R代表來自克隆根系的樣品。GFP-P代表分離自用生成克隆根系所用的相同構(gòu)造感染的植物葉片組織的GFP。圖7C是一顯示抗GFP抗體識(shí)別市售GFP蛋白質(zhì)的對(duì)照。這些結(jié)果證明，所述克隆根系隨時(shí)間延長可保持感興趣蛋白質(zhì)(GFP)的高水平表達(dá)，表明病毒轉(zhuǎn)錄物在克隆根系中的穩(wěn)定性。
圖8A和8B顯示產(chǎn)生hGH(參見實(shí)例4)或GFP的克隆根系的照片。圖8A顯示在正常光照條件下拍攝的兩個(gè)克隆根系的照片。左側(cè)皿顯示源自一其中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的人類生長激素(hGH)編碼基因的病毒載體的植物細(xì)胞的克隆根系。右側(cè)皿顯示的源自一其中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白(GFP)的編碼基因的病毒載體的植物細(xì)胞的克隆根系。圖8B顯示在UV燈下拍攝的與圖8A所示相同的克隆根系的照片，展現(xiàn)GFP的表達(dá)。這些結(jié)果證明在根群中存在GFP的旺盛表達(dá)且闡明用于感興趣多核苷酸表達(dá)的基于熒光篩選的方便性。
應(yīng)注意，Western分析展現(xiàn)了所有根群部分中GFP的表達(dá)。然而，當(dāng)使用目測(cè)法篩選時(shí)，在根群更為成熟部分中的表達(dá)通常顯得強(qiáng)于其中細(xì)胞分裂快速進(jìn)行的生長中根尖部分。此似乎是由于新細(xì)胞合成足夠可見的GFP所需的時(shí)間和當(dāng)由上方觀察時(shí)人們是透過根較厚部分中的多層細(xì)胞進(jìn)行觀察的這一事實(shí)。還應(yīng)注意，根的大部分成熟部分會(huì)變得稍微“木質(zhì)化”，此會(huì)妨礙GFP目測(cè)檢測(cè)。
實(shí)例3表達(dá)hGH的克隆根系的生成和測(cè)試用基于TMV的載體(D4-hGH)接種本塞姆氏煙草植株，所述載體含有受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制的編碼hGH的開放閱讀框?；旧先鐚?shí)例2中所述獲得和繼代培樣發(fā)根。自葉盤上分離下兩周后，在第3輪繼代培養(yǎng)期間，基本如實(shí)例2中所述通過Western印跡分析根節(jié)段中hGH的表達(dá)(圖9)。在所有其中測(cè)試hGH表達(dá)的Western印跡分析中用5ng hGH蛋白質(zhì)(Research Diagnostics)作為對(duì)照。抗hGH抗體購自Research Diagnostic。
由圖9中可見，多達(dá)80％的克隆根系中具有可檢測(cè)水平的hGH。我們選擇產(chǎn)量最高者并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的繁殖。10代(繼代培養(yǎng))后，采取樣品并分析hGH的積累。圖10顯示W(wǎng)estern印跡分析，其展現(xiàn)10代后克隆根系保持了hGH的穩(wěn)定表達(dá)，其中當(dāng)通過Western印跡分析比較時(shí)，所選系中的hGH表達(dá)(250微克/克鮮根組織)較用相同病毒構(gòu)造感染的葉片中表達(dá)(70微克/克鮮葉組織)高若干倍。
圖8A和8B顯示產(chǎn)生hGH和GFP的克隆根系的照片。圖8A顯示在正常光照條件下拍攝的兩個(gè)克隆根系的照片。左側(cè)皿顯示源自一其中導(dǎo)入了其基因組含有受TMVCP啟動(dòng)子控制的人類生長激素(hGH)編碼基因的病毒載體的植物細(xì)胞的克隆根系。右側(cè)皿顯示源自一其中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白(GFP)的編碼基因的病毒載體的植物細(xì)胞的克隆根系。圖8B顯示在UV燈下拍攝的與圖8A所示相同克隆根系的照片，展現(xiàn)GFP的表達(dá)。
實(shí)例4克隆根系表達(dá)GCSF的生成和測(cè)試用基于TMV的載體(D4-GCSF)接種本塞姆氏煙草植株，所述載體含有受TMVCP次基因組啟動(dòng)子控制的編碼GCSF的開放閱讀框，且基本上如實(shí)例2中所述獲得發(fā)根。自葉盤上分離下后2周，通過Western印跡分析根節(jié)段中GCSF表達(dá)(圖11)。如由圖11所見，多達(dá)80的克隆根系具有可檢測(cè)水平的GCSF。我們選擇產(chǎn)量最高者并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的繁殖。10代后(其中收獲根群各部分并將其轉(zhuǎn)移至含有新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿中)，采取樣品并分析GCSF的積累。圖12顯示W(wǎng)estern印跡分析，其展現(xiàn)10代(繼代培樣)后克隆根系保持著GCSF的穩(wěn)定表達(dá)。在所有其中測(cè)試GCSF表達(dá)的Western中用使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的5ng重組GCSF作為對(duì)照?？笹CSF抗體購自O(shè)ncogene Science。
實(shí)例5表達(dá)GCSF的克隆植物細(xì)胞系的生成和測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)和電穿孔。將源自煙草品種Bright yellow(BY-2)的細(xì)胞系培養(yǎng)在補(bǔ)充有0.2mg/l 2，4-D和0.1mg/l激動(dòng)素、20mM MES且pH為5.6至5.8的MS培養(yǎng)基(Murashige T.和Skoog F.，Physiol.Plants.15473-497，1962)中，并于25℃140rpm的振蕩器上振蕩，且每周繼代一次。對(duì)于電穿孔，由已繼代3至4天的細(xì)胞形成原生質(zhì)體。將細(xì)胞以1000rpm離心8min，用甘露醇(0.4M)和MES(20mM)，pH 5.5洗滌2次。然后用經(jīng)過濾滅菌的原生質(zhì)體化溶液(0.4M甘露醇、MES 20mM，pH5.5，纖維素酶Onozuka RS(Yakult Honsha公司)1％，果膠酶Y23(Seishin Pharmaceutical公司)0.1％)使細(xì)胞成30至50毫升。將細(xì)胞在250ml培養(yǎng)瓶中于25℃下培育20至25min。通過100/μm篩過濾原生質(zhì)體溶液，以700rpm離心6min，并用冰冷的0.4M甘露醇洗滌2次。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)原生質(zhì)體并重懸于電穿孔緩沖液(10mMHEPES，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.4M甘露醇，pH 7.2)至終濃度為1×106個(gè)原生質(zhì)體/毫升。
將轉(zhuǎn)錄物(25至30μl)置于放于冰上的電穿孔比色杯0.4cm(Biorad)中，且在10至15min后借助巴斯德吸管(Pasteur pipette)將其與0.5ml原生質(zhì)體懸浮液混合并立即用于電穿孔細(xì)胞。使用Biorad Gene Pulser在250伏和175電容下實(shí)施電穿孔。將經(jīng)電穿孔的原生質(zhì)體重懸于8ml含有.4M甘露醇的PBS緩沖液中并培養(yǎng)以形成細(xì)胞壁。
穩(wěn)定產(chǎn)生者細(xì)胞系的富集。在電穿孔后4至5天內(nèi)，將分裂細(xì)胞稀釋并取樣(將10μl經(jīng)感染細(xì)胞置于100μl培養(yǎng)基中)以富集高水平表達(dá)感興趣多核苷酸(目標(biāo)分子)的細(xì)胞。將經(jīng)稀釋細(xì)胞點(diǎn)在一培養(yǎng)皿的各個(gè)分區(qū)上，如圖13E所示。2至3周后，通過目測(cè)或其它方式(例如，Western印跡分析)測(cè)試每一樣品中目標(biāo)分子(例如，GFP、GCSF、hGH、等等)的存在。選擇產(chǎn)生目標(biāo)分子的經(jīng)穩(wěn)定感染的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步富集直至獲得產(chǎn)生者細(xì)胞系。
結(jié)果通過將含有受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制的編碼GCSF的開放閱讀框的基于TMV的病毒載體引入BY-2細(xì)胞來獲得克隆植物細(xì)胞系。整個(gè)過程示于圖13中。使用Western印跡分析實(shí)施表達(dá)GCSF細(xì)胞的富集直至獲得細(xì)胞群(單個(gè)克隆細(xì)胞系或含有若干克隆細(xì)胞系的群體)。圖14顯示W(wǎng)estern印跡分析，其展現(xiàn)源自其中導(dǎo)入了其基因組含有受TMV CP啟動(dòng)子控制的GCSF的編碼基因的病毒載體的植物細(xì)胞的植物細(xì)胞群體中GCSF的產(chǎn)生。應(yīng)注意，經(jīng)富集植物細(xì)胞群體會(huì)包含單個(gè)克隆細(xì)胞系或多個(gè)系。使用更為稀釋的樣品進(jìn)行進(jìn)一步富集會(huì)得到克隆細(xì)胞系。圖14A顯示導(dǎo)入所述載體后48小時(shí)實(shí)施的Western印跡分析。圖14B顯示進(jìn)一步在培養(yǎng)物中培養(yǎng)細(xì)胞后(即，接種后57天)使用與圖14A所示者相同的細(xì)胞群體實(shí)施的Western印跡分析。GCSF-COM表示其中上樣作為陽性對(duì)照的重組GCSF蛋白質(zhì)的泳道。MWM表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。C-表示上樣來自不表達(dá)GCSF的植物的植物提取物的泳道。
實(shí)例6表達(dá)GFP的克隆細(xì)胞系的生成和測(cè)試結(jié)果基本上如實(shí)例5中所述，通過向BY-2細(xì)胞導(dǎo)入含有受TMV CP次基因組啟動(dòng)子控制的編碼GFP的開放閱讀框的基于TMV的病毒載體(D4C3GFP)來獲得克隆植物細(xì)胞系。使用熒光的目測(cè)篩選實(shí)施可表達(dá)GFP細(xì)胞的富集直至獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞群體(單個(gè)克隆細(xì)胞系或含有若干克隆細(xì)胞系的群體)。圖13C顯示含有其中導(dǎo)入了所述病毒載體的細(xì)胞的原生質(zhì)體懸浮液。圖13E顯示以單獨(dú)液滴鋪板于培養(yǎng)皿上的自所述懸浮液稀釋得到的樣品。圖13F顯示UV燈下的與圖13E相同的培養(yǎng)皿。很容易看到表達(dá)GFP的克隆植物細(xì)胞系。應(yīng)注意，所述液滴會(huì)包含單個(gè)克隆植物細(xì)胞系或多個(gè)克隆植物細(xì)胞系?？赏ㄟ^進(jìn)一步的限制稀釋使用用于單個(gè)細(xì)胞克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法生成單個(gè)克隆植物細(xì)胞系(即，源自單個(gè)祖細(xì)胞的群體)。
圖15顯示源自其中導(dǎo)入D4C3GFP的植物細(xì)胞的植物細(xì)胞系中的GFP產(chǎn)生。圖15A顯示對(duì)可表達(dá)GFP植物細(xì)胞系的富集。圖15B顯示由包含不編碼GFP的類似病毒載體的克隆植物細(xì)胞系獲得的愈傷組織。將載體導(dǎo)入圖15A中克隆源自于其的細(xì)胞后3個(gè)月拍攝的照片。兩個(gè)照片均在UV燈下拍攝。
實(shí)例7克隆植物的生成和測(cè)試如實(shí)例3中所述獲得表達(dá)hGH的克隆根系。通過酶促消化分離根細(xì)胞并如Peres等人，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 65，37-44，2001中所述對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)以生成克隆植物。圖16A顯示由克隆根系獲得的植株。為確定所述植株是否含有病毒載體，用小葉片樣品接種煙草品種，所述煙草品種是病毒感染時(shí)會(huì)形成局部損傷的敏感宿主。接種2天內(nèi)形成損傷(如圖16B中箭頭所示)，說明自所述克隆根系再生的克隆植物保持著活躍的病毒復(fù)制，強(qiáng)烈表明所述克隆植物也可表達(dá)hGH。額外實(shí)驗(yàn)顯示事實(shí)確實(shí)如此(數(shù)據(jù)未顯示)。
等效物所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可識(shí)別或能確定本文所述的本發(fā)明具體實(shí)施例的許多等效物。本發(fā)明的范圍并不意欲限于上述說明，而是如隨附權(quán)利要求書中所闡述。
權(quán)利要求
1.一種源自植物或其一部分的克隆實(shí)體，其中所述克隆實(shí)體的細(xì)胞包含含有感興趣多核苷酸的病毒載體。
2.如權(quán)利要求1所述的克隆實(shí)體，其中所述克隆實(shí)體是克隆根系。
3.如權(quán)利要求2所述的克隆根系，其中所述病毒載體源自TMV或A1MV。
4.如權(quán)利要求2所述的克隆根系，其中所述感興趣多核苷酸以可操作方式與CP啟動(dòng)子、MP啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或反式激活啟動(dòng)子連接。
5.如權(quán)利要求2所述的克隆根系，其中所述病毒載體能夠自我復(fù)制。
6.如權(quán)利要求1所述的克隆實(shí)體，其中所述克隆實(shí)體是克隆根細(xì)胞系。
7.如權(quán)利要求6所述的克隆根細(xì)胞系，其中所述病毒載體源自TMV或A1MV。
8.如權(quán)利要求6所述的克隆根細(xì)胞系，其中所述感興趣多核苷酸以可操作方式與CP啟動(dòng)子、MP啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或反式激活啟動(dòng)子連接。
9.如權(quán)利要求6所述的克隆根細(xì)胞系，其中所述病毒載體能夠自我復(fù)制。
10.如權(quán)利要求1所述的克隆實(shí)體，其中所述克隆實(shí)體是克隆植物細(xì)胞系。
11.如權(quán)利要求10所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述病毒載體源自TMV或A1MV。
12.如權(quán)利要求10所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述感興趣多核苷酸以可操作方式與CP啟動(dòng)子、MP啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或反式激活啟動(dòng)子連接。
13.如權(quán)利要求10所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述病毒載體能夠自我復(fù)制。
14.如權(quán)利要求1所述的克隆實(shí)體，其中所述克隆實(shí)體是克隆植物。
15.如權(quán)利要求14所述的克隆植物，其中所述病毒載體源自TMV或A1MV。
16.如權(quán)利要求14所述的克隆植物，其中所述感興趣多核苷酸以可操作方式與CP啟動(dòng)子、MP啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或反式激活啟動(dòng)子連接。
17.如權(quán)利要求14所述的克隆植物，其中所述病毒載體能夠自我復(fù)制。
18.一種獲得可表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆實(shí)體的方法，其包括以下步驟(i)將含有感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入植物或其一部分；和(ii)自所述植物生成克隆實(shí)體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述生成步驟包括將含有感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入植物或其一部分。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述生成步驟包括將足以形成發(fā)根的RiT-DNA或其一部分導(dǎo)入所述植物或其一部分。
21.一種產(chǎn)生多核苷酸或多肽的方法，其包括以下步驟(i)生成源自植物的克隆實(shí)體，所述克隆實(shí)體的細(xì)胞包含含有感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)如果所述克隆實(shí)體是克隆根系、克隆根細(xì)胞系或克隆植物細(xì)胞系，則將所述克隆實(shí)體保持培養(yǎng)；或如果所述克隆實(shí)體是克隆植物，則使所述克隆實(shí)體生長；(iii)如果所述克隆實(shí)體是克隆根系、克隆根細(xì)胞系或克隆植物細(xì)胞系，則收獲細(xì)胞或培養(yǎng)基；或如果所述克隆實(shí)體是克隆植物，則收獲植物組織；和(iv)自所述收獲到的細(xì)胞、培養(yǎng)基或植物組織中分離或純化所述多核苷酸或多肽。
22.一種獲得表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆根系的方法，其包括以下步驟(i)將含有感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入植物或其一部分；和(ii)自所述植物生成一或多個(gè)克隆根系。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述生成步驟包括使所述植物或其一部分與土壤桿菌接觸。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述土壤桿菌是發(fā)根病的病原體。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述土壤桿菌是發(fā)根土壤桿菌。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生成步驟包括將足以形成發(fā)根的RiT-DNA或其一部分導(dǎo)入所述植物或其一部分。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述生成步驟包括使所述植物或植物一部分暴露于激素刺激中。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述病毒載體源自TMV。
29.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述病毒載體源自A1MV。
30.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述病毒載體缺乏編碼功能性外被蛋白、功能性移動(dòng)蛋白或二者的序列。
31.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸以可操作方式與CP啟動(dòng)子連接。
32.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸以可操作方式與MP啟動(dòng)子連接。
33.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸以可操作方式與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子連接。
34.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述導(dǎo)入步驟是在所述生成步驟之前實(shí)施。
35.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述病毒載體或其一部分不會(huì)整合至宿主細(xì)胞DNA中。
36.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述病毒載體能夠自我復(fù)制。
37.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述病毒載體包含編碼可檢測(cè)物或可選擇標(biāo)記物的多核苷酸。
38.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟在導(dǎo)入所述病毒載體之后和生成所述克隆根系之前將所述植物保持一段時(shí)間以使所述病毒載體進(jìn)行復(fù)制。
39.如權(quán)利要求22所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟就所述感興趣多核苷酸的表達(dá)篩選一或多個(gè)源自所述植物的克隆根系。
40.一種克隆根系，其根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法獲得。
41.一種克隆根系，所述克隆根系的細(xì)胞包含含有感興趣多核苷酸的病毒載體。
42.如權(quán)利要求41所述的克隆根系，其中至少50％的所述細(xì)胞含有所述病毒載體。
43.如權(quán)利要求41所述的克隆根系，其中大體上所有根細(xì)胞含有所述病毒載體。
44.一種生成表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆根細(xì)胞系的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆根系，所述克隆根系的細(xì)胞包含其基因組含有感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)自所述克隆根釋放各個(gè)細(xì)胞；和(iii)在適于根細(xì)胞增殖的條件將所述細(xì)胞保持培養(yǎng)。
45.一種克隆根細(xì)胞系，其根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法獲得。
46.一種克隆根細(xì)胞系，所述克隆根細(xì)胞系的細(xì)胞包含含有感興趣多核苷酸的病毒載體。
47.如權(quán)利要求46所述的克隆根細(xì)胞系，其中至少50％的所述細(xì)胞含有所述病毒載體。
48.如權(quán)利要求46所述的克隆根細(xì)胞系，其中大體上所有根細(xì)胞含有所述病毒載體。
49.一種生成表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆根系，所述克隆根系的細(xì)胞包含其基因組含有感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)自所述克隆根釋放各個(gè)細(xì)胞；和(iii)在適于植物細(xì)胞增殖的條件下將所述細(xì)胞保持培養(yǎng)。
50.一種克隆植物細(xì)胞系，其根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法生成。
51.一種生成表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆植物的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆根系，所述克隆根系的細(xì)胞包含其基因組含有感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)自所述克隆根釋放各個(gè)細(xì)胞；和(iii)將所述細(xì)胞保持在適于形成植株的條件下。
52.一種克隆植物，其根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法生成。
53.一種克隆植物，所述克隆植物的細(xì)胞包含含有感興趣多核苷酸的病毒載體。
54.如權(quán)利要求53所述的克隆植物，其中所述病毒載體源自TMV。
55.如權(quán)利要求53所述的克隆植物，其中所述病毒載體源自A1MV。
56.如權(quán)利要求53所述的克隆植物，其中所述病毒載體缺乏編碼功能性外被蛋白、功能性移動(dòng)蛋白或二者的序列。
57.如權(quán)利要求53所述的克隆植物，其中所述多核苷酸以可操作方式與CP啟動(dòng)子連接。
58.如權(quán)利要求53所述的克隆植物，其中所述多核苷酸以可操作方式與MP啟動(dòng)子連接。
59.如權(quán)利要求53所述的克隆植物，其中所述多核苷酸以可操作方式與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子連接。
60.一種生成表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系的方法，其包括以下步驟(i)將含有感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入保持在培養(yǎng)中的植物細(xì)胞系的細(xì)胞中；和(ii)富集含有所述病毒載體的細(xì)胞。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述富集步驟包括(i)自所述培養(yǎng)物中取出一部分所述細(xì)胞；(ii)稀釋所述取出的細(xì)胞以降低細(xì)胞濃度；(iii)使經(jīng)稀釋的細(xì)胞進(jìn)行增殖；和(iv)篩選含有所述病毒載體的細(xì)胞。
62.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述富集步驟包括確定由所述培養(yǎng)物中取出的細(xì)胞是否表達(dá)所述感興趣多核苷酸。
63.一種克隆植物細(xì)胞系，其根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法生成。
64.一種克隆植物細(xì)胞系，所述克隆植物細(xì)胞系的細(xì)胞包含含有感興趣多核苷酸的病毒載體。
65.如權(quán)利要求64所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述病毒載體源自TMV。
66.如權(quán)利要求64所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述病毒載體源自A1MV。
67.如權(quán)利要求64所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述病毒載體缺乏編碼功能性外被蛋白、功能性移動(dòng)蛋白或二者的序列。
68.如權(quán)利要求64所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述多核苷酸以可操作方式與CP啟動(dòng)子連接。
69.如權(quán)利要求64所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述多核苷酸以可操作方式與MP啟動(dòng)子連接。
70.如權(quán)利要求64所述的克隆植物細(xì)胞系，其中所述多核苷酸以可操作方式與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子連接。
71.一種克隆植物，其根據(jù)權(quán)利要求64所述的克隆植物細(xì)胞系生成。
72.一種生成表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆植物的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆植物細(xì)胞系，所述克隆植物細(xì)胞系的細(xì)胞包含其基因組含有感興趣多核苷酸的病毒載體；和(ii)將所述細(xì)胞保持在適于形成植株的條件下。
73.一種克隆植物，其根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法生成。
74.一種產(chǎn)生感興趣多肽的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆根系，所述的克隆根系細(xì)胞包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的病毒載體；(ii)將所述克隆根系保持培養(yǎng)；(iii)自所述克隆根系收獲根組織或培養(yǎng)基；和(iv)自所述收獲到的根組織或培養(yǎng)基中分離或純化所述感興趣多肽。
75.一種產(chǎn)生感興趣多肽的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆根細(xì)胞系，所述克隆根細(xì)胞系的細(xì)胞包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的病毒載體；(ii)將所述克隆根細(xì)胞系保持培養(yǎng)；(iii)自所述克隆根系收獲細(xì)胞或培養(yǎng)基；和(iv)自所述收獲到的根細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離或純化所述感興趣多肽。
76.一種產(chǎn)生感興趣多肽的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆植物細(xì)胞系，所述克隆植物細(xì)胞系的細(xì)胞包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的病毒載體；(ii)將所述克隆植物細(xì)胞系保持培養(yǎng)；(iii)自所述克隆植物系收獲細(xì)胞或培養(yǎng)基；和(iv)自所述收獲到的植物細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離或純化所述感興趣多肽。
77.一種產(chǎn)生感興趣多肽的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆植物，所述克隆植物的細(xì)胞包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的病毒載體；(ii)使所述克隆植物生長；(iii)自所述克隆植物收獲植物組織；和(iv)自所述收獲到的植物組織中分離或純化所述感興趣多肽。
78.一種在根、根細(xì)胞、植物細(xì)胞系或植物中表達(dá)感興趣多核苷酸的方法，其包括以下步驟(i)生成克隆根、根細(xì)胞、植物細(xì)胞系或植物，所述克隆根、根細(xì)胞、植物細(xì)胞系或植物的細(xì)胞中包含含有感興趣多核苷酸的病毒載體；(ii)將所述克隆根、根細(xì)胞、植物細(xì)胞系或植物保持在適于表達(dá)所述感興趣多核苷酸的條件下。
全文摘要
本發(fā)明提供用于生成克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物與用于在這些細(xì)胞系和植物中表達(dá)基因產(chǎn)物的系統(tǒng)和方法。根據(jù)某些本發(fā)明方法，將含有一以可操作方式與一啟動(dòng)子連接的感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入一植物或其一部分。利用含有所述病毒載體的植物材料(例如，葉片部分)形成克隆根系，例如，通過使植物材料與發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)接觸以形成發(fā)根。所述發(fā)根源自單個(gè)祖細(xì)胞且因此為克隆的。這些克隆根系含有所述病毒載體且可表達(dá)所述感興趣多核苷酸?？寺「?xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物自克隆根獲得。根據(jù)本發(fā)明某些其它方法，將含有一以可操作方式與一啟動(dòng)子連接的感興趣多核苷酸的病毒載體導(dǎo)入保持在培養(yǎng)中的植物細(xì)胞系細(xì)胞(例如，預(yù)先存在或新近得到者)。通過(例如)連續(xù)多輪富集直至得到展現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞群體來獲得表達(dá)感興趣多核苷酸的克隆植物細(xì)胞系。使用標(biāo)準(zhǔn)方法自所述克隆植物細(xì)胞系獲得其細(xì)胞含有所述病毒載體的克隆植物。本發(fā)明提供利用本發(fā)明方法生成的克隆根系、克隆根細(xì)胞系、克隆植物細(xì)胞系和克隆植物。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1922306SQ200580005502
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2005年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月20日
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