專利名稱：一種堿性低溫蛋白酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌和從細(xì)菌得到的蛋白酶，尤其是涉及一種從海桿菌屬(Marinobactersp.)R2菌株和從該細(xì)菌得到的堿性低溫蛋白酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
已有的堿性蛋白酶可從多種途徑獲得，其中由微生物獲得堿性蛋白酶以及堿性蛋白酶在洗滌劑等行業(yè)的應(yīng)用已有一些報(bào)道，例如1913年Rohm首先將胰島蛋白酶用于洗滌浸泡劑，1945年Dr.Jaag(瑞士)等發(fā)現(xiàn)了微生物堿性蛋白酶。而用于洗滌劑的堿性蛋白酶商品也越來越多，例如美國(guó)GENENCOR國(guó)際公司的Properase CT，丹麥NOVO公司的Savinase 4.OT堿性低溫蛋白酶等。公告號(hào)為CN1109750C的專利提供一種新型堿性低溫蛋白酶、制造方法、應(yīng)用和產(chǎn)生該蛋白酶的微生物，涉及一種新的黃桿菌屬未知種菌株YS9412-130，由該菌株或其突變體產(chǎn)生的新型堿性低溫蛋白酶，該蛋白酶在低溫條件下具有低活化能和高活性比，能有效降解蛋白類；酶基因編碼由792個(gè)核苷酸組成，與絲氨酸蛋白酶有不同程度的同源性，但不同于已有絲氨酸蛋白酶家族，屬一種新生型絲氨酸蛋白酶家族。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種從南極深海泥樣獲得并經(jīng)分離成為純培養(yǎng)物的菌株海桿菌屬(Marinobacter sp.)R2。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種從海桿菌屬R2菌株得到的堿性低溫蛋白酶及其制備方法。
本發(fā)明所說的菌株海桿菌屬(Marinobacter sp.)R2于2005年1月5日保藏于中國(guó)武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM205002。樣品的來源為南極深海900米深處的泥樣。菌株的篩選分離和培養(yǎng)方法為將泥樣用滅菌海水按10、100、1000的稀釋倍數(shù)稀釋后，涂布于篩選培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)一周，挑選出具有透明圈的單菌落，進(jìn)一步劃線分離，取單菌落鏡檢為純種后于-70℃超低溫冰箱中保藏。所說的培養(yǎng)基如下1、改良的2216E培養(yǎng)基蛋白胨0.5％，酵母膏0.1％，自然陳海水，pH7～8。
2、MM培養(yǎng)基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5％～2.0％，蒸餾水配制。
3、酪蛋白培養(yǎng)基KH2PO40.04％，Na2HPO40.1％，NaCl 0.01％，ZnSO40.002％，CaCl20.0002％，酪素0.4％，酪素水解氨基酸0.005％，瓊脂1.5％～2.0％，蒸餾水，pH7.0～7.2。
4、篩選培養(yǎng)基脫脂奶粉1％，酵母膏0.2％，瓊脂粉1.5％，自然陳海水，pH7～8。
5、發(fā)酵培養(yǎng)基酪蛋白1％，酵母膏0.2％，KH2PO40.04％，Na2HPO40.1％，ZnSO40.002％，CaCl20.0002％，自然陳海水，pH7～8。
菌株海桿菌屬R2經(jīng)下列方法鑒定后屬于海桿菌屬(Marinobacter sp.)的一個(gè)新種。
1、16S rDNA序列分析結(jié)果表明R2菌株屬于海桿菌屬(Marinobacter sp.)。
2、DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株R2的基因組DNA與Marinobacterhydrocarbonoclasticus同源性僅為70％。
3、形態(tài)學(xué)特征及抗性試驗(yàn)油鏡下觀察，R2細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)排列。革蘭氏染色為陰性，菌體大小為10～15μm×2～3μm。菌落呈圓形，表面粗糙無(wú)光澤，邊緣隆起，有明顯的皺褶，顏色為乳白色，不透明。在酪蛋白培養(yǎng)基平皿上可產(chǎn)生明顯的透明圈?？股乜剐詫?shí)驗(yàn)表明R2菌株對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素和鏈霉素均具有抗性。
本發(fā)明所說的菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶具有以下酶學(xué)性質(zhì)1、菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為20℃，在15～25℃范圍內(nèi)酶活力高，表現(xiàn)出明顯的低溫蛋白酶特性。菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶在0～20℃內(nèi)活力較為穩(wěn)定，30℃下保溫24h后酶活降為8.3％，40℃保溫1h后酶活剩余7.6％，50℃以上10min基本喪失全部活力，符合低溫蛋白酶對(duì)熱敏感的特性。Ca2+在一定程度上提高了酶的穩(wěn)定性。
2、菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶的最適pH為9～10，屬于堿性蛋白酶。
3、菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶能夠降解胰凝乳蛋白酶的特異性底物N-Succ-(Ala)2-Pro-Phe-pNA和N-Succ-(Ala)2-Pro-Leu-pNA，具有類胰凝乳蛋白酶活性。
4、螯合劑EDTA和絲氨酸蛋白酶專一抑制劑Phenylmethylsufonyl fluoride(PMSF)、4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride(AEBSF)對(duì)菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶顯示出較強(qiáng)的抑制作用，而半胱氨酸蛋白酶專一抑制劑E-64和天冬氨酸蛋白酶專一抑制劑pepstatinA對(duì)此酶均無(wú)抑制作用。表明菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶。
5、高濃度的變性劑，包括十二烷基硫酸鈉(SDS)，尿素，鹽酸胍，二巰基丁二醇(DTT)，巰基乙醇對(duì)菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶均有較為明顯的抑制作用。
6、Ca2+、Mn2+、Cu2+對(duì)菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶有較為明顯的激活作用，而Cd2+、Co2+則能抑制酶活。
本發(fā)明所說的菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶的制備方法步驟為1)粗酶液制備將菌株R2用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體酪蛋白培養(yǎng)基中，在5～30℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素，在5～25℃溫度下振蕩培養(yǎng)，1～4天后加入天冬酰胺，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基中的固體酪蛋白顆粒消失且培養(yǎng)液呈淡乳黃色即為產(chǎn)酶高峰期，將發(fā)酵液離心，取上清，得粗酶液；2)粗酶液加硫酸銨至30％～40％飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至70％～80％飽和度，離心取沉淀，在Tris-HCl緩沖液中透析過夜；3)將透析過后的酶液離心，上清液用冷凍干燥進(jìn)行濃縮，再上樣于已用Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡過的DEAE-52柱，洗脫，收集酶活性部分冷凍干燥；4)把冷凍干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，然后上樣于用同一緩沖液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的緩沖液洗脫，合并活性部分，冷凍干燥；5)將凍干后的樣品溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，再分離純化，收集有活力部分冷凍干燥，即為純酶。
在步驟1)中，活化菌種時(shí)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基選自MM培養(yǎng)基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5％～2.0％，蒸餾水配制。發(fā)酵時(shí)加入氨芐青霉素終濃度為0.05％，天冬酰胺的終濃度為0.005％。
在步驟3)中，所說的洗脫采用含0～2mol/LNaCl線性梯度的Tris-HCl緩沖液洗脫。
在步驟5)中，所說的分離純化時(shí)所用的緩沖液采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0～9.0。所說的分離純化采用電泳純化，電泳純化的條件為分離膠濃度14％，柱高5cm，電壓300V；濃縮膠濃度為4％，柱高1cm，電壓240V。
蛋白酶活力測(cè)定采用Folin酚試劑顯色法進(jìn)行。
菌株海桿菌屬R2所產(chǎn)堿性低溫蛋白酶的特性及優(yōu)點(diǎn)是1、R2菌株所產(chǎn)生的蛋白酶屬于堿性低溫蛋白酶，其最適反應(yīng)溫度為20℃，是現(xiàn)有低溫蛋白酶中最低的，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
2、大多數(shù)的蛋白酶能被Cu2+、Ag+、Pb2+抑制，而菌株R2所產(chǎn)的蛋白酶不但對(duì)Ag+、Pb2+不敏感，反而能被Cu2+激活，表明該酶具有特殊的機(jī)制。
3、R2菌株對(duì)多種抗生素具有抗性，這一點(diǎn)在應(yīng)用中尤其具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵诎l(fā)酵中加入抗生素可以抑制其他菌的污染，從而簡(jiǎn)化步驟，節(jié)約成本。
4、R2菌株可以在常溫下直接發(fā)酵產(chǎn)生低溫蛋白酶，但低溫下發(fā)酵的活力更高。這一特性在實(shí)際應(yīng)用中也可以節(jié)約能源、設(shè)備等成本投入。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
制備粗酶液，將保藏的菌株R2用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體酪蛋白培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基選自MM培養(yǎng)基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂2.0％，蒸餾水配制。在20℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且加入氨芐青霉素，終濃度為0.05％，在15℃溫度下振蕩培養(yǎng)，2天后加入天冬酰胺，天冬酰胺的終濃度為0.005％，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基中的固體酪蛋白顆粒降解情況，顆粒消失且培養(yǎng)液呈淡乳黃色即為產(chǎn)酶高峰期。將發(fā)酵液離心，取上清，得粗酶液。在粗酶液中加硫酸銨至32％飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至75％飽和度，離心取沉淀，在Tris-HCl緩沖液中透析過夜。將透析過后的酶液離心，上清液用冷凍干燥進(jìn)行濃縮，然后上樣于已用Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡過的DEAE-52柱，用含0～2mol/LNaCl線性梯度的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集酶活性部分冷凍干燥。把冷凍干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，然后上樣于用同一緩沖液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的緩沖液洗脫，合并活性部分，冷凍干燥。將凍干后的樣品溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，分離純化時(shí)所用的緩沖液采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0。利用SDS-PAGE制備電泳儀進(jìn)行分離純化。電泳純化的條件為分離膠濃度14％，柱高5cm，電壓300V；濃縮膠濃度為4％，柱高1cm，電壓240V。洗脫液為Tris-HCl緩沖液。收集有活力部分冷凍干燥，即為純酶。蛋白酶活力的測(cè)定采用Folin酚試劑顯色法進(jìn)行。
實(shí)施例2與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于制備粗酶液時(shí)，培養(yǎng)基選自MM培養(yǎng)基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5％，蒸餾水配制。在15℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入氨芐青霉素，在25℃溫度下振蕩培養(yǎng)，3天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸銨至35％飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至72％飽和度，離心取沉淀，在Tris-HCl緩沖液中透析過夜。將凍干后的樣品溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，分離純化時(shí)所用的緩沖液采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.5。
實(shí)施例3與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于制備粗酶液時(shí)，培養(yǎng)基選自MM培養(yǎng)基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.8％，蒸餾水配制。在5℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入氨芐青霉素，在20℃溫度下振蕩培養(yǎng)，1天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸銨至30％飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至80％飽和度，離心取沉淀，在Tris-HCl緩沖液中透析過夜。將凍干后的樣品溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，分離純化時(shí)所用的緩沖液采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，pH9。
實(shí)施例4與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于制備粗酶液時(shí)，培養(yǎng)基選自MM培養(yǎng)基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5％，蒸餾水配制。在25℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入氨芐青霉素，在30℃溫度下振蕩培養(yǎng)，4天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸銨至36％飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至77％飽和度，離心取沉淀，在Tris-HCl緩沖液中透析過夜。將凍干后的樣品溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，分離純化時(shí)所用的緩沖液采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8。
實(shí)施例5與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于制備粗酶液時(shí)，培養(yǎng)基選自MM培養(yǎng)基(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.7％，KH2PO40.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO40.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.7％，蒸餾水配制。在30℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入氨芐青霉素，在5℃溫度下振蕩培養(yǎng)，3天后加入天冬酰胺，在粗酶液中加硫酸銨至40％飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至70％飽和度，離心取沉淀，在Tris-HCl緩沖液中透析過夜。將凍干后的樣品溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，分離純化時(shí)所用的緩沖液采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.5。
權(quán)利要求
1.一種菌株海桿菌屬(Marinobacter sp.)R2，2005年1月5日保藏于中國(guó)武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM205002。
2.一種從海桿菌屬R2得到的堿性低溫蛋白酶。
3.如權(quán)利要求2所述的一種從海桿菌屬R2得到的堿性低溫蛋白酶，其酶學(xué)性質(zhì)為1)最適反應(yīng)溫度為20℃，在15～25℃范圍內(nèi)酶活力高，表現(xiàn)出明顯的低溫蛋白酶特性，在0～20℃內(nèi)活力穩(wěn)定，30℃下保溫24h后酶活降為8.3％，40℃保溫1h后酶活剩余7.6％，50℃以上10min基本喪失全部活力，符合低溫蛋白酶對(duì)熱敏感的特性；2)最適pH為9～10，屬于堿性蛋白酶；3)能夠降解胰凝乳蛋白酶的特異性底物N-Succ-(Ala)2-Pro-Phe-pNA和N-Succ-(Ala)2-Pro-Leu-pNA，具有類胰凝乳蛋白酶活性；4)螯合劑EDTA和絲氨酸蛋白酶專一抑制劑Phenylmethylsufonyl fluoride、4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride對(duì)菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶顯示出較強(qiáng)的抑制作用，而半胱氨酸蛋白酶專一抑制劑E-64和天冬氨酸蛋白酶專一抑制劑pepstatir A對(duì)此酶均無(wú)抑制作用，表明菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶；5)高濃度的變性劑，包括十二烷基硫酸鈉，尿素，鹽酸胍，二巰基丁二醇，硫基乙醇對(duì)菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶均有較為明顯的抑制作用；6)Ca2+、Mn2+、Cu2+對(duì)菌株海桿菌屬R2堿性低溫蛋白酶有明顯的激活作用，而Cd2+、Co2+則能抑制酶活。
4.如權(quán)利要求2所述的一種從海桿菌屬R2得到的堿性低溫蛋白酶的制備方法，其步驟為1)粗酶液制備將菌株R2用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行活化后轉(zhuǎn)接于液體酪蛋白培養(yǎng)基中，在5～30℃的條件下振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液轉(zhuǎn)接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入氨芐青霉素，在5～25℃溫度下振蕩培養(yǎng)，1～4天后加入天冬酰胺，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基中的固體酪蛋白顆粒消失且培養(yǎng)液呈淡乳黃色即為產(chǎn)酶高峰期，將發(fā)酵液離心，取上清，得粗酶液；2)粗酶液加硫酸銨至30％～40％飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸銨至70％～80％飽和度，離心取沉淀，在Tris-HCl緩沖液中透析過夜；3)將透析過后的酶液離心，上清液用冷凍干燥進(jìn)行濃縮，再上樣于已用Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡過的DEAE-52柱，洗脫，收集酶活性部分冷凍干燥；4)把冷凍干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，然后上樣于用同一緩沖液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的緩沖液洗脫，合并活性部分，冷凍干燥；5)將凍干后的樣品溶于Tris-HCl緩沖液中并透析過夜，再分離純化，收集有活力部分冷凍干燥，即為純酶。
5.如權(quán)利要求4所述的一種從海桿菌屬R2得到的堿性低溫蛋白酶的制備方法，其特征在于在步驟1)中，活化菌種時(shí)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基選自MM培養(yǎng)基(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO40.7％，KH2PO4 0.3％，檸檬酸鈉0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，瓊脂1.5％～2.0％，蒸餾水配制。發(fā)酵時(shí)加入的氨芐青霉素，終濃度為0.05％，天冬酰胺的終濃度為0.005％。
6.如權(quán)利要求4所述的一種從海桿菌屬R2得到的堿性低溫蛋白酶的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所說的洗脫采用含0～2mol/L NaCl線性梯度的Tris-HCl緩沖液洗脫。
7.如權(quán)利要求4所述的一種從菌株海桿菌屬R2得到的堿性低溫蛋白酶的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所說的分離純化時(shí)所用的緩沖液采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0～9.0。
8.如權(quán)利要求4所述的一種從海桿菌屬R2得到的堿性低溫蛋白酶的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所說的分離純化采用電泳純化，電泳純化的條件為分離膠濃度14％，柱高5cm，電壓300V；濃縮膠濃度為4％，柱高1cm，電壓240V。
全文摘要
一種堿性低溫蛋白酶及其制備方法，涉及一種細(xì)菌和從細(xì)菌得到的蛋白酶。提供一種從南極深海泥樣獲得并經(jīng)分離成為純培養(yǎng)物的菌株海桿菌屬R2、從R2菌株得到的堿性低溫蛋白酶及其制備方法。保藏編號(hào)為CCTCCNOM205002。其步驟為粗酶液制備將菌株R2活化后接于培養(yǎng)基，培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，再轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基中，加氨芐青霉素和天冬酰胺，培養(yǎng)，發(fā)酵，離心；粗酶液加硫酸銨離心取上清，離心取沉淀，在緩沖液中透析；酶液離心，冷凍干燥，再上樣洗脫，收集酶活性部分冷凍干燥；重溶于緩沖液中并透析，上樣洗脫，合并活性部分，冷凍干燥；樣品溶于緩沖液中并透析分離純化，收集有活力部分冷凍干燥，即為純酶。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1670187SQ200510062600
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2005年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月28日
發(fā)明者曾潤(rùn)穎, 林念煒 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所