專利名稱：植物病原真菌致病性的快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物病原真菌致病性的快速鑒定方法，具體的說(shuō)是一種快速篩選植物病害致病性的方法，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
真菌引起的植物病害已達(dá)3萬(wàn)種，占植物病害的70-80％，危害嚴(yán)重又具有毀滅性的的作物病害如馬鈴薯晚疫病，麥類銹病，稻瘟病，甘薯黑斑病等。要準(zhǔn)確診斷一種真菌是否是引起該病害的病原，必須經(jīng)過(guò)致病性接種驗(yàn)證。然而，對(duì)于一些病害從接種到出現(xiàn)癥狀時(shí)間則較長(zhǎng)，為了對(duì)病害快速診斷、鑒定，及時(shí)采取有效的防治措施，挽回因病害造成的經(jīng)濟(jì)損失，快速致病性鑒定顯得尤為重要。如由真菌致病疫霉(Phytophthrora infestance)引起的馬鈴薯晚疫病的致病性研究中，通常在溫室進(jìn)行，采用整株馬鈴薯植株接種，同時(shí)提供病害發(fā)生適宜的溫濕度環(huán)境條件。當(dāng)馬鈴薯離體葉片接種快速鑒定致病性的方法一經(jīng)問(wèn)世，就被廣泛采用。由細(xì)菌假單胞屬丁香假單胞致病變種(Pseudomonassyringae pv.syringae)侵染引起的梨細(xì)菌性疫病，在成熟的梨上驗(yàn)證致病性非常困難，只有非常幼嫩的組織才感病，通常采用未成熟的梨接種鑒定其致病性。然而，嫩梨每年只有很短的時(shí)間可獲得。梨樹離體葉片接種方法既方便，又快速，相對(duì)嫩梨10天發(fā)病，離體葉片接種只須2-3天即可發(fā)病，并可在梨樹整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)進(jìn)行大量菌株的致病性分析。但以上的致病性快速鑒定方法只適用于同一寄主上的單一病害。
中國(guó)新記錄病害——由真菌甘薯長(zhǎng)喙殼菌(Ceratocystis fimbriata)引起的石榴枯萎病，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，少則2周，多則一年余全株枯死，死亡率極高。該病菌寄主范圍廣泛，包括甘薯、芋頭、橡膠、咖啡、可可等30多種重要作物和經(jīng)濟(jì)林木。采用傳統(tǒng)的致病性對(duì)原寄主接種的方法，在石榴產(chǎn)地蒙自，用分離至石榴的甘薯長(zhǎng)喙殼菌對(duì)幼苗(一年生)和大樹接種到出現(xiàn)典型癥狀(全株枯死)5周-1年。由于從接種到癥狀顯現(xiàn)時(shí)間長(zhǎng)，只能在石榴產(chǎn)地，溫濕度利于發(fā)病和石榴生長(zhǎng)。要進(jìn)行大量菌株致病性、毒力測(cè)定，或異地大面積溫室種苗接種以監(jiān)測(cè)田間病害流行變化或品種抗性鑒定幾乎是不可能的。為此，我們進(jìn)行了一系列試驗(yàn)，以期找到該病菌致病性的快速鑒定方法，獲得了滿意的結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)技術(shù)中的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、效率高的植物病害致病性的快速鑒定方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1)將PSA上純培養(yǎng)的病原菌用滅菌水洗下，倍比稀釋在光學(xué)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出分生孢子濃度為104-106CFU/ml；2)選取中等大小的芋頭，用清水洗凈涼干，將芋頭切成2-3cm厚的圓片，放入0.1％的次氯酸鈉中浸泡10min，然后用滅菌水沖洗3次，每次3min，取出涼干；3)用移液槍在芋頭片中央加新鮮的孢子懸浮液5μL-10μL。每次均以等量滅菌水注入作為對(duì)照，重復(fù)三次；4)將接種后的芋頭片放入白瓷盤中，盤內(nèi)放入泡水棉花的小培養(yǎng)皿，盤外罩塑料薄膜；5)將罩好的白瓷盤置于22-30℃的恒溫箱中，隔天觀察，測(cè)量病菌的生長(zhǎng)直徑。
本發(fā)明的有益效果1效率高。本發(fā)明以病菌在芋頭片上的快速生長(zhǎng)代替對(duì)原寄主的致病性測(cè)定，結(jié)果快速，不但菌絲生長(zhǎng)快，且子囊殼產(chǎn)生的時(shí)間也快(2天)。可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量菌株進(jìn)行致病性鑒定。
2操作簡(jiǎn)單。本發(fā)明所采用的芋頭易于購(gòu)買，價(jià)格便宜，不易腐爛、變色。在病原菌致病性測(cè)定的方法中，代替對(duì)生長(zhǎng)條件要求高，接種到癥狀顯現(xiàn)時(shí)間長(zhǎng)的石榴苗，方法簡(jiǎn)單易行。
3結(jié)果可靠。經(jīng)對(duì)石榴苗接種發(fā)現(xiàn)病菌與在芋頭片上的生長(zhǎng)速度成正相關(guān)，效果直觀。
應(yīng)用芋頭片快速篩選石榴枯萎病菌的致病性，使異地操作簡(jiǎn)單易行，極大地提高了工作效率。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一接種石榴苗與接種芋頭片的發(fā)病比較孢子懸浮液的制備將PSA上純培養(yǎng)的病原菌用滅菌水洗下，倍比稀釋，在光學(xué)顯微鏡下數(shù)血球計(jì)數(shù)板小方格里的孢子數(shù)，計(jì)算出平均每格分生孢子含量，使終濃度為106CFU/ml。
石榴苗浸根接種將石榴苗浸入孢子懸浮液中，30min后取出種植于內(nèi)徑為22cm的塑料盆中，由并定期觀察，記載發(fā)病情況。結(jié)果見表(1)。
芋頭片接種1)將PSA上純培養(yǎng)的病原菌用滅菌水洗下，倍比稀釋在光學(xué)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出分生孢子濃度為104CFU/ml。
2)選取中等大小(100-250g)的芋頭，用清水洗凈涼干，將芋頭切成2-3cm厚的圓片，放入0.1％的次氯酸鈉中浸泡10min，然后用滅菌水沖洗3次，每次3min，取出涼干。
3)用移液槍在芋頭片中央加新鮮的孢子懸浮液5μL。每次試驗(yàn)均以5μL滅菌水注入作為對(duì)照，重復(fù)三次。
4)將接種后的芋頭片放入白瓷盤中，盤內(nèi)放入泡水棉花的小培養(yǎng)皿，盤外罩塑料薄膜。
5)將罩好的白瓷盤置于22℃的恒溫箱中，隔天觀察，測(cè)量病菌的生長(zhǎng)直徑。
結(jié)果見表(2)。由表(1)和表(2)可看出接種石榴苗發(fā)病最快需要5周，19周50％的植株發(fā)病，28周75％的植株發(fā)??；接種芋頭片2天菌絲生長(zhǎng)且產(chǎn)生子囊殼。
表(1)浸根接種石榴苗發(fā)病情況
表(2)接種芋頭片病菌生長(zhǎng)情況
注(P為子囊殼)
實(shí)施例二接種石榴塊與接種芋頭片的發(fā)病比較孢子懸浮液的制備同實(shí)施例1。
接種組織塊將石榴枝條用清水沖洗干凈后，用滅菌手術(shù)刀除掉樹皮，取維管束3×4mm2小塊組織，經(jīng)70％酒精溶液消毒10-30s，再用0.1％的升汞消毒3-6min，用滅菌水漂洗三次，每次3min，用滅過(guò)菌的濾紙吸干水移至PA培養(yǎng)基上，取10μL孢子懸浮液滴在組織上，置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)，并定期觀察。結(jié)果見表(3)。
芋頭片接種1)將PSA上純培養(yǎng)的病原菌用滅菌水洗下，倍比稀釋在光學(xué)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出分生孢子濃度為106CFU/ml。
2)同實(shí)施例一芋頭片接種2)。
3)用移液槍在芋頭片中央加新鮮的孢子懸浮液10μL。每次試驗(yàn)均以10μL滅菌水注入作為對(duì)照，重復(fù)三次。
4)同實(shí)施例一芋頭片接種4)。
5)將罩好的白瓷盤置于28℃的恒溫箱中，隔天觀察，測(cè)量病菌的生長(zhǎng)直徑。
由表(3)可看出接種石榴塊菌絲第4天開始生長(zhǎng)，子囊殼則在第8天以后，雖然大致可看出菌絲的長(zhǎng)勢(shì)，但由于石榴塊太小，因不能剪掉石榴的大枝條，且枝條也只有在石榴樹整枝打杈時(shí)易獲得。同時(shí)也由于菌絲生長(zhǎng)慢，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量菌絲生長(zhǎng)直徑。而接種芋頭片2天菌絲生長(zhǎng)且產(chǎn)生子囊殼，菌絲直徑1-1.2cm。
表(3)接種石榴塊病菌生長(zhǎng)情況
注(M為菌絲，P為子囊殼，+為少量菌絲，++為菌絲量中等，+++為菌絲量多)實(shí)施例三接種石榴塊與接種芋頭片的發(fā)病比較孢子懸浮液的制備同實(shí)施例一。
接種組織塊將石榴枝條用清水沖洗干凈后，用滅菌手術(shù)刀除掉樹皮，取維管束3×4mm2小塊組織，經(jīng)70％酒精溶液消毒10-30s，再用0.1％的升汞消毒3-6min，用滅菌水漂洗三次，每次3min，用滅過(guò)菌的濾紙吸干水移至PA培養(yǎng)基上，取8μL孢子懸浮液滴在組織上，置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，并定期觀察。結(jié)果見表(3)。
芋頭片接種1)將PSA上純培養(yǎng)的病原菌用滅菌水洗下，倍比稀釋在光學(xué)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出分生孢子濃度為105CFU/ml。
2)同實(shí)施例一芋頭片接種2)。
3)用移液槍在芋頭片中央加新鮮的孢子懸浮液8μL。每次試驗(yàn)均以10μL滅菌水注入作為對(duì)照，重復(fù)三次。
4)同實(shí)施例一芋頭片接種4)。
5)將罩好的白瓷盤置于25℃的恒溫箱中，隔天觀察，測(cè)量病菌的生長(zhǎng)直徑。
接種石榴塊菌絲第4天開始生長(zhǎng)，子囊殼則在第8天以后，菌絲的長(zhǎng)勢(shì)大致同實(shí)施例二，而接種芋頭片2天菌絲生長(zhǎng)且產(chǎn)生子囊殼，菌絲直徑0.9-1.1cm。
權(quán)利要求
1.一種植物病原真菌致病性的快速鑒定方法，其步驟是1)將PSA上純培養(yǎng)的病原菌用滅菌水洗下，倍比稀釋在光學(xué)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算出分生孢子濃度為104-106CFU/ml；2)選取中等大小的芋頭，用清水洗凈涼干，將芋頭切成2-3cm厚的圓片，放入0.1％的次氯酸鈉中浸泡10min，然后用滅菌水沖洗3次，每次3min，取出涼干；3)用移液槍在芋頭片中央加新鮮的孢子懸浮液5μL-10μL，每次均以等量滅菌水注入作為對(duì)照，重復(fù)三次；4)將接種后的芋頭片放入白瓷盤中，盤內(nèi)放入泡水棉花的小培養(yǎng)皿，盤外罩塑料薄膜；5)將罩好的白瓷盤置于22-30℃的恒溫箱中，隔天觀察，測(cè)量病菌的生長(zhǎng)直徑。
2.按照權(quán)利要求1所述的植物病原真菌致病性的快速鑒定方法，其特征在于用于致病性接種甘薯長(zhǎng)喙殼菌的濃度為104個(gè)/毫升。
3.按照權(quán)利要求1所述的植物病原真菌致病性的快速鑒定方法，其特征在于用于致病性接種甘薯長(zhǎng)喙殼菌的濃度為105個(gè)/毫升。
4.按照權(quán)利要求1所述的植物病原真菌致病性的快速鑒定方法，其特征在于芋頭片接種甘薯長(zhǎng)喙殼菌的培養(yǎng)溫度為22-24℃。
5.按照權(quán)利要求1所述的植物病原真菌致病性的快速鑒定方法，其特征在于芋頭片接種甘薯長(zhǎng)喙殼菌的培養(yǎng)溫度為28-30℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物病原真菌致病性的快速鑒定方法，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。以甘薯長(zhǎng)喙殼菌在芋頭片上的生長(zhǎng)代替對(duì)原寄主(石榴苗)的接種，快速鑒定病菌菌株的致病性。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)效率高，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量菌株進(jìn)行致病性鑒定。操作簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜。結(jié)果可靠，效果直觀，極大地提高了工作效率。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1824791SQ20051004876
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者黃瓊, 陳海如, 王云月, 焦玉霞, 邵思勝, 杜靜, 尹明權(quán), 趙瑩瑩 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)