肽聚糖免疫增強劑及其生產(chǎn)方法

專利名稱：肽聚糖免疫增強劑及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)養(yǎng)殖魚蝦飼料添加劑技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種肽聚糖免疫增強劑及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明利用微生物發(fā)酵技術(shù)，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)魚蝦飼料用多糖類免疫增強劑。
背景技術(shù)：
在當(dāng)前的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，普遍存在過度追求產(chǎn)量、忽視質(zhì)量的現(xiàn)象。結(jié)果導(dǎo)致養(yǎng)殖密度過大，水質(zhì)污染加重，從而造成病害時常發(fā)生，特別是近幾年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中病毒病大規(guī)模暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。因此，控制疾病的發(fā)生對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。在水產(chǎn)病害防治領(lǐng)域中，傳統(tǒng)上是采用抗生素來預(yù)防和控制病害的發(fā)生。這樣的傳統(tǒng)做法存在諸多弊端，如濫用抗生素而造成抗生素污染，進(jìn)而使病害生物產(chǎn)生抗藥性，或者由于濫用藥物，而造成藥物殘留超標(biāo)等負(fù)面效應(yīng)。單純靠抗生素藥物對防治病毒病是根本沒有效果的。再眾所周知，接種疫苗是水產(chǎn)養(yǎng)殖中預(yù)防疾病的有效措施，可是由于免疫反應(yīng)具有特異性，一種疫苗只能特異性地預(yù)防相應(yīng)的某種疾病，而且由于現(xiàn)階段疫苗的制備及其在實際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用仍存在著困難。
有一種肽聚糖廣泛存在于部分革蘭氏陰性菌和大部分革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中，其是由聚糖鏈、肽亞單位和間肽橋組成的大分子聚合物。例如，雙歧桿菌細(xì)胞壁肽聚糖含量約為細(xì)胞壁干重的50-80％，這種肽聚糖能對魚類和對蝦免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。低劑量肽聚糖的多種有益的生物學(xué)功能越來越引起人們的重視，特別是其免疫調(diào)節(jié)功能逐漸被人們所利用。由于自然界中菌種的多樣性，組成其細(xì)胞壁的肽聚糖的結(jié)構(gòu)也不盡相同，也決定了提取的肽聚糖的活性的差異較大，同樣，不同的菌種單位發(fā)酵液中細(xì)菌產(chǎn)量高低也不盡相同。魚蝦用肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)目前僅限于實驗室小規(guī)模生產(chǎn)，其成本高，產(chǎn)品批次之間質(zhì)量相差較大，而且整體質(zhì)量不穩(wěn)定。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，有關(guān)免疫激活劑的研究與應(yīng)用，在國際上目前都還處在初始階段，許多技術(shù)不成熟，且缺乏有效的技術(shù)指標(biāo)來評價其應(yīng)用的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要應(yīng)用發(fā)酵工藝、酶工程等生物技術(shù)，進(jìn)行魚蝦肽聚糖免疫增強的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，可以實現(xiàn)減少污染、提高效率、降低成本、提高質(zhì)量，利于肽聚糖制劑進(jìn)一步在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的廣泛利用，提供一種成本更低的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)魚蝦用肽聚糖免疫增強劑的技術(shù)。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，研制了一種肽聚糖免疫增強劑。所述的免疫增強劑具有如下的物化參數(shù)，色澤為淡褐色的液體，粘度3.2-5.0，比重1.021-1.042；該免疫增強劑按W/V比含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，總固形物含量8-10％；其余為水。
一種所述肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)方法，所述的生產(chǎn)方法按如下步驟進(jìn)行經(jīng)培養(yǎng)菌種接種一級種子培養(yǎng)——二級種子罐厭氧培養(yǎng)；當(dāng)種子液OD450＝1.2時，即每毫升種子液的細(xì)菌數(shù)量在1.1-1.4×108個時，即可接種于初始發(fā)酵罐，并在發(fā)酵過程中每間隔2小時通入適量氮氣；在菌體生長至以756UV-VIS分光光度計于450nm處測量菌液OD值在1.0-1.4時終止發(fā)酵；以此發(fā)酵液為種子液接種于n個發(fā)酵罐，其每罐接種量為5-12.5％；繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)以756UV-VIS分光光度計于450nm處測量發(fā)酵液OD值在1.0-1.4時終止發(fā)酵，此發(fā)酵液為目的發(fā)酵液；再經(jīng)離心分離取菌體，再轉(zhuǎn)至后處理罐中，加入消化緩沖液進(jìn)行菌體后處理將該后處理罐中的后處理液加熱加壓至0.07KPa/106℃滅菌20min，再加入溶菌酶在37℃下消化24小時；當(dāng)溶菌酶消化完成后，向該后處理罐內(nèi)加入半胱氨酸至終濃度為5.5mmol/L，并補充EDTA至其終濃度為1.1mmol/L，之后加入木瓜蛋白酶，并在65℃下消化24小時；最終獲得主要含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，總固形物含量為8-10％的液體肽聚糖制劑。
所述的消化緩沖液，其為含有0.1mmol/L EDTA、pH6.2的磷酸鹽緩沖液；該消化緩沖液的投料比是以其體積與分離收集的濕菌重量的比為2——3∶1加入到分離收集的濕菌體中的。
所述的溶菌酶，其是以每升后處理液加入1-5克的投料比加入溶菌酶。
所述的木瓜蛋白酶，其是以每升該處理液加入5-10克的投料比加入木瓜蛋白酶。
所述的培養(yǎng)菌種，其是雙歧桿菌選自嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacteriumthermophilum)，或分叉雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)，或青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolesentis)，或嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)，或長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。
本發(fā)明的優(yōu)點，比照現(xiàn)有技術(shù)其是可以連續(xù)發(fā)酵。在第1個發(fā)酵罐發(fā)酵完成后，向罐內(nèi)通入氮氣將發(fā)酵液壓至其它n個已注入發(fā)酵液并滅菌處理的發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵，用于提高發(fā)酵產(chǎn)量。根據(jù)實際生產(chǎn)需要確定雙歧桿菌的產(chǎn)量，通常以雙歧桿菌濕菌重量為添加量參照指標(biāo)。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到需要量時，終止發(fā)酵。將發(fā)酵液逐步注入儲液罐，連續(xù)流離心機分離菌體。在本發(fā)明的技術(shù)中，在雙歧桿菌發(fā)酵完成后，直接進(jìn)行菌體后處理。首先將與發(fā)酵液分離的菌體移入發(fā)酵罐，加入消化緩沖液，菌體與消化緩沖液的比值是1∶2-3(W/V)，消化緩沖液為包含EDTA的pH6.2的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明中菌體的處理分為兩步進(jìn)行，一是溶菌酶消化，二是蛋白酶消化，最終獲得主要含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，總固形物含量為8-10％的液體肽聚糖制劑。就魚蝦用肽聚糖免疫增強劑的通常用途而言，液體制劑具有效果好、使用方便的優(yōu)點。
本發(fā)明與現(xiàn)有實驗室小型發(fā)酵技術(shù)相比，本發(fā)明的魚蝦用肽聚糖免疫增強劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)具有連續(xù)生產(chǎn)、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。如果采用小型發(fā)酵罐實驗室發(fā)酵，酸沉降和離心相結(jié)合收集菌體，多步酶消化法制備肽聚糖粗制物，每1升發(fā)酵液平均可獲得4g肽聚糖制劑。使用本技術(shù)每噸發(fā)酵液的平均發(fā)酵產(chǎn)量為8kg，即每1升發(fā)酵液可獲得8g肽聚糖制劑。這不僅是體現(xiàn)在單位產(chǎn)量和單位物質(zhì)成本的差別，而且最大的差別還是體現(xiàn)在生產(chǎn)量上的差別和由于菌體細(xì)胞壁中脂磷壁酸，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰胞壁酸等其它成分，如分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，也可對對蝦和貝類免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定的免疫調(diào)節(jié)作用和魚類，對蝦和貝類的營養(yǎng)成分。以生產(chǎn)200噸對蝦肽聚糖飼料為例，200噸免疫飼料需肽聚糖制劑40公斤(以濕菌重量計)。采用本發(fā)明技術(shù)，從種子液培養(yǎng)到最終菌體處理完成需要一周的時間既可生產(chǎn)40公斤肽聚糖制劑。如果在實驗室發(fā)酵以17升PVC發(fā)酵罐生產(chǎn)，以日生產(chǎn)量2罐計算，不間斷生產(chǎn)需要將近一年的時間！使用本發(fā)明肽聚糖制劑的免疫增強劑可以彌補化學(xué)藥物和疫苗的不足，它比化學(xué)藥物安全性高，比疫苗應(yīng)用范圍廣，另外本發(fā)明肽聚糖制劑的免疫增強劑和疫苗的混合使用也能增強疫苗的療效。本發(fā)明肽聚糖制劑的免疫增強劑的功能是多方面的，在甲殼動物中，可活化血淋巴中的吞噬細(xì)胞，提高吞噬病原菌能力；刺激血淋巴中抗菌、溶菌活力的產(chǎn)生或升高；激活酚氧酶原系統(tǒng)產(chǎn)生識別信號及介導(dǎo)吞噬等；在魚類中，可激活嗜中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的吞噬作用；激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或分泌淋巴因子以協(xié)調(diào)體液免疫和細(xì)胞免疫；刺激抗體的產(chǎn)生和補體的生成等。使用免疫增強劑不但可以提高養(yǎng)殖魚蝦生產(chǎn)性能和防治疾病的作用，而且具有無污染，無抗藥性和無殘留等優(yōu)點。
具體實施例方式
在本發(fā)明的技術(shù)中，使用的發(fā)酵裝置為通用型發(fā)酵設(shè)備，主要設(shè)備條件包括蒸汽鍋爐，0.25-6噸發(fā)酵罐n+1個，及其鍋爐與發(fā)酵連接的管道，壓力表，溫度表，連續(xù)流離心機等。補充氮氣罐，用來平衡發(fā)酵罐內(nèi)外壓力并維持厭氧條件。
在本發(fā)明的技術(shù)中，發(fā)酵罐和管道的清洗和滅菌后，首先經(jīng)培養(yǎng)菌種接種一級種子培養(yǎng)——二級種子罐厭氧培養(yǎng)；當(dāng)種子液OD450＝1.2時，即每毫升種子液的細(xì)菌數(shù)量在1.1-1.4×108個時，即可接種于初始發(fā)酵罐。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)壓力降至0.02KPa開始向罐內(nèi)通氮氣，以維持正壓；發(fā)酵罐內(nèi)溫度降至37℃時，開始接種種子液，接種量控制在5-12.5％；發(fā)酵溫度為35-37℃，發(fā)酵過程中每2-4小時攪拌1次，并通適量氮氣。并在發(fā)酵過程中每間隔2小時通入適量氮氣；在向第1個發(fā)酵罐(0.25噸)內(nèi)注入混勻的發(fā)酵液，并盡量增加發(fā)酵液體積，僅留少許空間；之后發(fā)酵液加熱加壓滅菌，并關(guān)閉所有空氣開關(guān)，在空氣過濾器的進(jìn)氣端直接接入氮氣管；在菌體生長至以756UV-VIS分光光度計于450nm處測量菌液OD值在1.0-1.4時終止發(fā)酵；此發(fā)酵液為目的發(fā)酵液；再經(jīng)離心分離取菌體，再轉(zhuǎn)至后處理罐中，加入消化緩沖液進(jìn)行菌體后處理將該后處理罐中的后處理液加熱加壓至0.07KPa/106℃滅菌20min，再加入溶菌酶在37℃下消化24小時；當(dāng)溶菌酶消化完成后，向該后處理罐內(nèi)加入半胱氨酸至終濃度為5.5mmol/L，并補充EDTA至其終濃度為1.1mmol/L，之后加入木瓜蛋白酶，并在65℃下消化24小時，最終獲得具有優(yōu)良物化參數(shù)的免疫增強劑。本發(fā)明的免疫增強劑的物化參數(shù)所采用的相對分子量的測定方法為高效凝膠滲透色譜法，脂肪的測定方法參照GB/T5009.6-2003，核糖核酸的測定方法為蛋白酶消化、CTAB孵育、酚/氯仿/異戊醇抽提法，總固形物含量的測定方法參照GB/T5009.3-2003。
具體實施例如下實施例1對蝦苗種培育用肽聚糖制劑的生產(chǎn)及使用效果
在本發(fā)明實施例中，采用的主要設(shè)備條件是250升發(fā)酵罐，總體積250升，工作體積240升。所用的發(fā)酵液成分包含1％葡萄糖，1％乳糖，1％胰蛋白胨，0.6％酵母膏，0.6％牛肉膏，0.1％吐溫-80，1％Na2HPO4，0.6％KH2PO4和0.05％MgSO4，pH 6.5。
取-70℃低溫保存的嗜熱雙歧桿菌凍干粉1支，其是雙歧桿菌選自嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)，或分叉雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)，或青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolesentis)，或嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)，或長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，挑選單菌落接種于液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)形成種子液，當(dāng)種子液細(xì)菌濃度達(dá)到1×108個細(xì)菌/ml(OD590＝1.2)即可接種于發(fā)酵罐。在發(fā)酵過程中定時取樣，使用756UV-VIS分光光度計于450nm處測量培養(yǎng)菌液OD值，獲得雙歧桿菌生長曲線。測定結(jié)果顯示雙歧桿菌于接種后15h開始進(jìn)入指數(shù)生長期，并于21h后進(jìn)入平臺期。發(fā)酵24小時后，停止發(fā)酵，將發(fā)酵液逐步注入儲液罐，連續(xù)流離心機分離菌體，離心速度16000rpm，流速100L/H。將與發(fā)酵液分離的菌體移入發(fā)酵罐，加入消化緩沖液，菌體與消化緩沖液的比值是1∶2或1∶3(W/V)，消化緩沖液為包含0.1mmol/L EDTA的pH6.2的磷酸鹽緩沖液；加熱加壓至0.07KPa/106℃滅菌20min；每升加入溶菌酶5g，37℃消化24小時。溶菌酶消化完成后，向罐內(nèi)加入半胱氨酸至終濃度為5.5mmol/L，并補充EDTA至終濃度為1.1mmol/L，加入木瓜蛋白酶至每升5g，65℃消化24小時。獲得具有如下物化參數(shù)的免疫增強劑色澤為淡褐色的液體，粘度3.2，比重1.042；該免疫增強劑按W/V比含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖2.0％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5％，脂肪0.3％，核糖核酸0.01％，總固形物含量10％；其余為水；約2000g(以濕菌重量計算)，-20℃凍存。
凡納對蝦苗種培育池3個，育苗有效水體50立方米，同天布卵，密度為每立方米20萬粒。自蚤狀幼體I期1#池每日投喂的幼體餌料中添加了0.01％的上述肽聚糖制劑，2#池按每立方米0.2g在水體中潑灑上述肽聚糖制劑，3#池每日投喂普通餌料。日常管理見對蝦育苗操作規(guī)程。分別在Z1期、M1期及PL1期計數(shù)幼體存活尾數(shù)，計算Z1-M1期、Z1-PL1期及M1-PL1期幼體成活率。結(jié)果顯示與對照池相比，在幼體的兩個發(fā)育階段(Z1-M1期和M1-PL1期)及整個幼體發(fā)育階段(Z1-PL1)，肽聚糖制劑經(jīng)浸浴和口服兩種作用方式均能提高幼體的成活率。生產(chǎn)統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表1。
表1肽聚糖制劑應(yīng)用于凡納對蝦育苗生產(chǎn)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)(成活率％)

實施例2大菱鲆室內(nèi)水泥池養(yǎng)殖用肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)和應(yīng)用效果采用與實施例1基本相同的步驟進(jìn)行本實施例，不同的是發(fā)酵24小時后終止發(fā)酵，向罐內(nèi)通入氮氣，將發(fā)酵液壓至2個體積為1000升的二級發(fā)酵罐，每罐接種量為12.5％，進(jìn)行二次發(fā)酵。最終獲得具有如下物化參數(shù)的免疫增強劑色澤為淡褐色的液體，粘度4.2，比重1.030；該免疫增強劑按W/V比含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.8％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)6％，脂肪0.4％，核糖核酸0.015％，總固形物含量9％；其余為水；約16kg(以濕菌重量計算)，-20℃凍存。
選用黃海水產(chǎn)研究所生產(chǎn)的“海力”牌海水養(yǎng)殖魚用配合飼料(粉料)為原料，新鮮小雜魚制成魚糜作為粘合劑(魚糜添加量為40％)。將上述肽聚糖制劑加入原料及魚糜的混合物中充分混勻，濃度為0.1％，用小型制粒機制成直徑為7mm的濕顆粒餌料，于-18℃凍存，飼喂前將其解凍。
大菱鲆工廠化養(yǎng)殖池4個，養(yǎng)殖有效水體30立方米，放苗時單位體重45克，密度300尾/立方米。2個魚池每日投喂添加了0.1％上述肽聚糖制劑的免疫飼料，2個魚池每日投喂普通飼料。日常管理見大菱鲆養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范。分別在使用免疫飼料的1個月、2個月和3個月測定其血液的白細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞吞噬率，測定其血清的溶菌酶活性和補體活性，測量增重率，統(tǒng)計成活率。結(jié)果顯示與對照池相比，肽聚糖制劑經(jīng)口服可提高大菱鲆免疫能力、增重率和成活率(表2)。
表2飼料中添加肽聚糖制劑大菱鲆血液免疫指標(biāo)及生長的變化

實施例3凡納對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)用肽聚糖制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用效果采用與實施例1基本相同的步驟進(jìn)行本實施例，不同的是第1個發(fā)酵罐發(fā)酵的同時，向另外1個5噸發(fā)酵罐內(nèi)注入混勻的發(fā)酵液，加熱加壓至0.07KPa/106℃滅菌20min；關(guān)閉所有空氣開關(guān)，在空氣過濾器的進(jìn)氣端直接接入氮氣管；當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)壓力降至0.02KPa開始向罐內(nèi)通氮氣，以維持正壓；發(fā)酵罐內(nèi)溫度降至37℃時即可接入第1個發(fā)酵罐內(nèi)已發(fā)酵完成的發(fā)酵液；接種后的培養(yǎng)條件，菌體分離和消化同實施例1，最終獲得具有如下物化參數(shù)色澤為淡褐色的液體，粘度5.0，比重1.042；該免疫增強劑按W/V比含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5％，脂肪0.3％，核糖核酸0.02％，總固形物含量8％；其余為水的液態(tài)免疫增強劑。該免疫增強劑消化結(jié)束后，向發(fā)酵罐內(nèi)注入20％(w/w)已滅菌處理的大豆渣為載體，一并注入干燥機，噴霧干燥前濃度25％，進(jìn)風(fēng)與出風(fēng)溫度分別在195℃和85℃，烘干后收集獲得以小分子蛋白和低聚肽聚糖為主要活性成分的固體肽聚糖制劑約40kg(以濕菌重量計算)，4℃保存。
在對蝦基礎(chǔ)飼料中添加0.02％上述肽聚糖制劑，粉碎混勻后制成顆粒免疫飼料。
凡納對蝦高位養(yǎng)殖池22個，養(yǎng)殖面積0.33-0.67公頃不等，放苗40-80萬尾不等，養(yǎng)殖周期80-120d，養(yǎng)殖蝦達(dá)到上市規(guī)格(100-130尾/Kg)開始捕大留小分批上市。從放苗開始投喂免疫飼料，7天一個循環(huán)，其中4天連續(xù)投喂免疫飼料，3天投喂基礎(chǔ)飼料。(表3，表4)。
表3全程使用免疫飼料養(yǎng)殖池的統(tǒng)計數(shù)據(jù) 表4未使用免疫飼料養(yǎng)殖池的統(tǒng)計數(shù)據(jù)
結(jié)果到養(yǎng)殖期術(shù)，對蝦平均成活率為78.32％，1/15公頃產(chǎn)量為509Kg。比其它全程投喂基礎(chǔ)飼料的養(yǎng)殖池對蝦平均成活率57.44，提高20.88％，產(chǎn)量提高19.25％，經(jīng)濟(jì)效益顯著。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對于上述實施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種肽聚糖免疫增強劑，其特征在于所述的免疫增強劑具有如下的物化參數(shù)，色澤為淡褐色的液體，粘度3.2-5.0，比重1.021-1.042；該免疫增強劑按W/V比含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，總固形物含量8-10％；其余為水。
2.一種按照權(quán)利要求1所述肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)方法，所述的生產(chǎn)方法按如下步驟進(jìn)行經(jīng)培養(yǎng)菌種接種一級種子培養(yǎng)——二級種子罐厭氧培養(yǎng)；其特征在于當(dāng)種子液OD450＝1.2時，即每毫升種子液的細(xì)菌數(shù)量在1.1-1.4×108個時，即可接種于初始發(fā)酵罐，并在發(fā)酵過程中每間隔2小時通入適量氮氣；在菌體生長至以756UV-VIS分光光度計于450nm處測量菌液OD值在1.0-1.4時終止發(fā)酵；以此發(fā)酵液為種子液接種于n個發(fā)酵罐，其每罐接種量為5-12.5％；繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)以756UV-VIS分光光度計于450nm處測量發(fā)酵液OD值在1.0-1.4時終止發(fā)酵，此發(fā)酵液為目的發(fā)酵液；再經(jīng)離心分離取菌體，再轉(zhuǎn)至后處理罐中，加入消化緩沖液進(jìn)行菌體后處理將該后處理罐中的后處理液加熱加壓至0.07KPa/106℃滅菌20min，再加入溶菌酶在37℃下消化24小時；當(dāng)溶菌酶消化完成后，向該后處理罐內(nèi)加入半胱氨酸至終濃度為5.5mmol/L，并補充EDTA至其終濃度為1.1mmol/L，之后加入木瓜蛋白酶，并在65℃下消化24小時；最終獲得主要含有相對分子量小于20KD的活性成分的肽聚糖1.5-2.0％，分子量小于20KD的蛋白質(zhì)5-8％，脂肪0.3-0.5％，核糖核酸0.01-0.02％，總固形物含量為8-10％的液體肽聚糖制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的消化緩沖液，其為含有0.1mmol/L EDTA、pH6.2的磷酸鹽緩沖液；該消化緩沖液的投料比是以其體積與分離收集的濕菌重量的比為2-3∶1加入到分離收集的濕菌體中的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的溶菌酶，其是以每升后處理液加入1-5克的投料比加入溶菌酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的木瓜蛋白酶，其是以每升該處理液加入5-10克的投料比加入木瓜蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述肽聚糖免疫增強劑的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)菌種，其是雙歧桿菌選自嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)，或分叉雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)，或青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolesentis)，或嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)，或長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。
全文摘要
本發(fā)明是一種肽聚糖免疫增強劑。其色澤為淡褐色，粘度3.2－5.0，比重1.021－1.042；其含1.5－2.0％的活性成分肽聚糖，5－8％的蛋白質(zhì)，0.3－0.5％的脂肪，0.01－0.02％的核糖核酸，8－10％的總固形物，其余為水。該免疫增強劑的生產(chǎn)方法如下經(jīng)培養(yǎng)菌種接種一級種子培養(yǎng)—二級種子罐厭氧培養(yǎng)；即可接種于初始發(fā)酵罐，并在發(fā)酵過程中每間隔2小時通入適量氮氣；在菌液OD值1.0－1.4時終止發(fā)酵；再接種于n個發(fā)酵罐，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液OD值在1.0－1.4時，以此發(fā)酵液為目的發(fā)酵液；再經(jīng)分離取菌體，再轉(zhuǎn)至后處理罐，加入消化緩沖液行菌體后處理，再加入溶菌酶消化處理，再加入半胱氨酸并補充EDTA處理，之后加入木瓜蛋白酶消化處理；最終獲得上述組分的液體肽聚糖制劑。
文檔編號C12P1/00GK1739790SQ20051004464
公開日2006年3月1日 申請日期2005年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月31日
發(fā)明者宋曉玲, 王秀華, 黃倢 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所