專利名稱：中國(guó)對(duì)蝦c－型凝集素基因及其編碼的c－型凝集素多肽與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凝集素基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用，尤其涉及一種中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因及其編碼的C-型凝集素多肽與應(yīng)用；屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
無脊椎動(dòng)物遭受病原感染后可激活多種細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，從微生物侵襲到最終清除病原一般要經(jīng)過下列幾個(gè)步驟首先這些無脊椎動(dòng)物必須能夠識(shí)別外來異物，稱為感染的非己識(shí)別(Recognition of infectious non-self)；隨后，引發(fā)了激活絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞外級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而將受到感染的信號(hào)放大為更強(qiáng)的“危險(xiǎn)”信號(hào)或解除錯(cuò)誤警報(bào)，這個(gè)過程稱為信號(hào)的調(diào)整和放大(Signal modulationand amplification)；然后引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Signal transduction pathway)，而導(dǎo)致目的基因的轉(zhuǎn)錄活性；最后，激活了效應(yīng)物反應(yīng)系統(tǒng)。
雖然有很多效應(yīng)物基因的功能還不為人們所知，但有3大類效應(yīng)物系統(tǒng)是很清楚的即抗菌肽、酚氧化酶依賴性黑化系統(tǒng)和凋亡相關(guān)基因系統(tǒng)。
下面主要闡述先天免疫的起始步驟——免疫識(shí)別受體研究方面的進(jìn)展。
以前對(duì)無脊椎動(dòng)物識(shí)別侵染微生物的機(jī)制了解的很少，近幾年來這方面的研究進(jìn)展很快?，F(xiàn)在基本證實(shí)這種“非己”識(shí)別是因?yàn)榇嬖谀承┨禺愋缘?、可溶的或與細(xì)胞膜結(jié)合的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，也稱為模式識(shí)別蛋白或模式識(shí)別分子。雖然它們沒有高等動(dòng)物B細(xì)胞和T細(xì)胞系統(tǒng)顯著的特異性，但可以識(shí)別或結(jié)合那些微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相關(guān)分子模式，如脂多糖(LPS)、肽聚糖(peptidoglycans)和甘露聚糖(mannans)等。識(shí)別后，這些受體通過激活存在于血淋巴的蛋白酶和利用免疫反應(yīng)組織的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而引起免疫反應(yīng)。免疫識(shí)別受體還可以作為促進(jìn)吞噬的調(diào)理素，也可以是凝集、黑化或其他蛋白質(zhì)修飾級(jí)聯(lián)反應(yīng)等免疫過程的起始因子。關(guān)于這些免疫識(shí)別受體的分類，不同的作者意見不一，有人將高等動(dòng)物包括人類中發(fā)現(xiàn)的PRR分為7個(gè)家族，即C型凝集素、富亮氨酸蛋白、清除受體、五聚體蛋白、脂類轉(zhuǎn)移酶、整合素和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白。最近有的學(xué)者將在果蠅和按蚊中發(fā)現(xiàn)的模式識(shí)別受體分為6種類型肽聚糖識(shí)別蛋白，含硫酯鍵蛋白，革蘭陰性菌結(jié)合蛋白，清除受體，C-型凝集素和硫依賴型凝集素。
模式識(shí)別受體的研究，實(shí)際上是研究先天免疫系統(tǒng)識(shí)別“自己”與“非己“的本質(zhì)，這對(duì)深入了解無脊椎動(dòng)物的先天免疫的功能與調(diào)節(jié)機(jī)制、對(duì)免疫學(xué)研究的完整性和學(xué)科發(fā)展具有重要的理論意義，同時(shí)可為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物免疫防治策略的制定提供指導(dǎo)。因此進(jìn)行該方面的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從對(duì)蝦中克隆的模式識(shí)別受體——中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因序列，并提供其克隆方法與載體。
本發(fā)明的中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長(zhǎng)度557堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源對(duì)蝦(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc 120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc 180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg 240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa 300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta 360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat 420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa 480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc 540taaaaaaaaa aaaaaaa557本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因編碼的C-型凝集素多肽，它具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長(zhǎng)度159氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val
35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His Gly50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser Gln Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr155其中，還包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的變異體，它編碼具有少于8個(gè)氨基酸改變的同源變異蛋白，而且氨基酸改變是保守性氨基酸改變。
本發(fā)明的中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素cDNA的克隆方法是采用一步法或RNA kit從對(duì)蝦中提取總RNA，或者用mRNA kit分離提取mRNA。然后利用總RNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；其中根據(jù)對(duì)蝦C-型凝集素的保守序列設(shè)計(jì)的引物為正向引物5’GGT GCA TTT TCT TGG ACG CCT-3’反向引物5’ATG GGA GTG AGT CTG TTG TTT-3’PCR反應(yīng)條件為首先94℃變性2分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃ 45秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
純化通過鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得DNA片段；取上述純化產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega公司產(chǎn)品)或pMD 18-T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞(常用載體宿主細(xì)胞)，平板培養(yǎng)；提取并純化質(zhì)粒，擴(kuò)增質(zhì)粒并測(cè)序；再經(jīng)過3’和5’末端快速擴(kuò)增，將3’和5’端序列拼接，即得SEQ ID NO.1所示中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因全長(zhǎng)核苷酸序列。
本發(fā)明的中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用。
其中，上述應(yīng)用的方法是通過基因重組技術(shù)使所述基因在大腸桿菌、酵母和昆蟲核型多角體病毒中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。
例如將獲得的中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因克隆到pET-30a(Novagen公司)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 DE3細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化；并利用獲得重組蛋白進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。
其抗菌譜和最小抑菌濃度(以菌體不生長(zhǎng)的濃度為最小抑菌濃度)見表1。
表1中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素最小抑菌濃度
利用本發(fā)明的中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因通過基因工程方法將其轉(zhuǎn)入作物，可以獲得具有抗菌能力的作物。
利用本發(fā)明的方法通過現(xiàn)有基因工程方法修飾中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因，還可用于其他研究和生產(chǎn)。
利用本發(fā)明獲得的重組的C-型凝集素可用于抗菌的飼料添加劑、食品保存、動(dòng)植物基因轉(zhuǎn)化和藥物開發(fā)。
圖1中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素的重組表達(dá)其中1誘導(dǎo)前菌株，2誘導(dǎo)后菌株，3細(xì)胞破碎后的上清液，4細(xì)胞破碎后的沉淀，5純化的C-型凝集素，M標(biāo)準(zhǔn)Marker。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素cDNA的克隆1)總RNA的提取采用現(xiàn)有技術(shù)一步法提取總RNA。
2)cDNA第一鏈合成6微克總RNA，加反應(yīng)液20微升，反應(yīng)液是50毫摩爾氯化鉀和3毫摩爾氯化鎂混合液，10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩爾二硫蘇糖醇(DTT)，5微摩爾寡聚脫氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩爾脫氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25單位RNA酶抑制劑，8單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃反應(yīng)90分鐘，70℃ 10分鐘終止反應(yīng)。
3)PCR反應(yīng)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)試劑與條件首先將下列試劑混在一起
·10xTaq DNA聚合酶緩沖液5微升(μl)·模板cDNA 1μl·正向引物(1.25μg/μl)1μl·反向引物(1.25μg/μl)1μl·脫氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl·Taq DNA聚合酶0.25μl·滅菌水 37.75μl·總體積 50μl根據(jù)對(duì)蝦C-型凝集素的保守序列設(shè)計(jì)的引物為正向引物5’GGT GCA TTT TCT TGG ACG CCT-3’反向引物5’ATG GGA GTG AGT CTG TTG TTT-3’PCR反應(yīng)條件為首先94℃變性2分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94℃ 30秒，53℃ 45秒，72℃ 45秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
4)反應(yīng)產(chǎn)物純化利用德國(guó)奎因(QIAGEN)公司產(chǎn)品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
5)對(duì)蝦C-型凝集素cDNA克隆取純化產(chǎn)物3微升，連接于pGEM-T Easy載體(Promega公司產(chǎn)品)。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株，在含有氨芐青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG0.1摩爾/毫升)的平板生長(zhǎng)過夜，挑取3個(gè)白斑，在LB液體培養(yǎng)基(5毫升，含100微克/毫升安芐青霉素)中培養(yǎng)過夜。
6)質(zhì)粒純化收取過夜培養(yǎng)菌液2毫升，離心(10000轉(zhuǎn)/分，1分鐘)收集細(xì)胞。用微量DNA純化試劑盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美國(guó)普洛麥格Promega公司)純化質(zhì)粒，純化步驟按說明書進(jìn)行。
7)序列測(cè)定與同源檢索取純化質(zhì)粒4微升，用載體引物T7進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)序(本工作在上海生工公司完成)。將所得序列與基因庫(kù)序列比較。
8)對(duì)蝦C-型凝集素cDNA 3’端快速擴(kuò)增根據(jù)得到抗菌肽基因片段后，又設(shè)計(jì)一條特異性正向引物F35’-GTT TAC AAA TTTCCA AGT CCC TTC-3’，進(jìn)行cDNA 3’端快速擴(kuò)增，操作步驟按寶生物3’RACE試劑盒說明書進(jìn)行。
取血細(xì)胞總RNA約20μg，其他試劑的調(diào)制和反應(yīng)條件按說明書進(jìn)行。用特異性引物F3與3’接頭進(jìn)行3’端PCR擴(kuò)增，采用55℃退火，其余與上述的PCR擴(kuò)增程序相同，對(duì)所得產(chǎn)物按前述方法進(jìn)行克隆、驗(yàn)證和測(cè)序。
9)對(duì)蝦C-型凝集素cDNA 5’端克隆按CLONTECH公司(美國(guó))SMARTTMPCR cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒說明書進(jìn)行，包括下列步驟第一鏈cDNA合成1.0μl RNA樣品(0.05-1.0μg總RNA)
1.0μl SMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)1μlCDS/3’PCR引物2.0μl 水將上述試劑在0.5ml離心管內(nèi)混勻，72℃孵育2分鐘。再冰浴2分鐘，然后加入下列試劑2.0μl 5x第一鏈緩沖液1.0μl DTT(20mM)1.0μl dNTP(10mM)1.0μl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶10μl 總體積混勻，42℃孵育1小時(shí)，冰浴終止反應(yīng)。
以上述cDNA為模板，以試劑盒提供的5’PCR引物和反向引物5’TGT CCT TAC CCCTAC GAG CCC CTG 3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得對(duì)蝦C-型凝集素cDNA的5’序列。
將3’和5’端序列拼接，即獲得SEQ ID NO.1所示中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因全長(zhǎng)核苷酸序列。
實(shí)施例2重組表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)與抑菌功能測(cè)定(1)根據(jù)中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素的序列和表達(dá)載體pPET30a(Novagen公司)的克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物L(fēng)EC-pet F5’AAT ATTGAA TTCATG AAG TTC CTG GCG CCG GTT 3’(EcoR1)LEC-pet R5’GCC CGACTC GAGTTA ATA ATT CTT GAG ACA AAT G 3’(Xhol)本發(fā)明選擇了pET30a克隆位點(diǎn)的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)引物時(shí)在上游引物引入了EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物上引入了Xho I酶切位點(diǎn)。
(2)基因擴(kuò)增、克隆與重組質(zhì)粒篩選以pMD-18T-Lec為模板，用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為94℃，2min預(yù)變性；94℃，30s，56℃，45s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
2％的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物檢測(cè)。
將PCR產(chǎn)物作制備電泳，用UNIQ-5 Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工產(chǎn)品)回收、純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)過EcoR I和Xho I內(nèi)切酶酶切，切下兩端帶有Xho I和EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn)的家蠅防御素成熟肽cDNA片段，同樣表達(dá)載體pET30a經(jīng)過EcoR I和Xho I內(nèi)切酶酶切，暴露出多克隆位點(diǎn)兩端的Xho I和EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后，將酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB+Amp平板PCR篩選陽性克隆。挑取PCR篩到的菌落，37℃振蕩擴(kuò)增培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，EcoR I和Xho I雙酶切與測(cè)序驗(yàn)證后，即為重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-Lec。接轉(zhuǎn)化E.coli表達(dá)菌株BL21 DE3感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Amp平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)。
(3)篩選表達(dá)菌株從上述LB+Amp平板上挑取8個(gè)單克隆菌落，2ml LB+Amp液體培養(yǎng)基37℃振蕩過夜培養(yǎng)，次日，取20μl過夜培養(yǎng)液加入到2ml LB+Amp液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)3h，至OD600在0.5～0.7之間，然后加入IPTG至終濃度為1mmol，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)4h。誘導(dǎo)前，隨機(jī)從一個(gè)樣品中取出0.5ml菌液，電泳檢測(cè)時(shí)作未誘導(dǎo)對(duì)照。
表達(dá)完后，各取0.5ml菌液，5000r/min離心5min收集細(xì)胞，包括未誘導(dǎo)的樣品，重懸于100μl去離子水中，以此為電泳樣品作12.5％的SDS-PGAE。根據(jù)電泳結(jié)果，鑒定表達(dá)菌株。
(5)重組C-型凝集素表達(dá)與純化挑取表達(dá)菌株單克隆在LB+Amp液體培養(yǎng)基中37℃過夜振蕩培養(yǎng)，次日，按照體積比1∶100加入到100ml LB+Amp培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)3h后，再加入IPTG至終濃度為1mmol，再37℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。誘導(dǎo)前取出0.5ml的菌液，作為誘導(dǎo)前對(duì)照樣品。誘導(dǎo)培養(yǎng)完后，菌液在合適的離心管中7000r/min離心10min收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸于5ml預(yù)冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混勻后冰浴30min。超聲波破碎細(xì)胞，超聲循環(huán)為超聲1s；間隔1s；全程40s。重復(fù)4次，每次間隙時(shí)將菌液在冰浴中混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質(zhì)變性。最后，將破碎后的菌液10000r/min離心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分別留樣、備用。
重組蛋白以包含體的形式存在，以常規(guī)方法經(jīng)過包含體純化、復(fù)性和親和層析，即獲得到了重組蛋白——重組C-型凝集素(見圖1)。
(6)重組蛋白活性測(cè)定活性鑒定采用液體生長(zhǎng)抑制方法。
分別取測(cè)試菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌等單菌落(見表1)LB過夜培養(yǎng)液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋到OD600＝0.01(約106左右)為測(cè)試菌液。取100μl測(cè)試菌液分別與10倍稀釋的重組C-型凝集素樣品混勻，于96孔培養(yǎng)板30℃振蕩培養(yǎng)，每隔1h用酶標(biāo)儀測(cè)A630吸收值，用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)，繪制生長(zhǎng)曲線圖，以氨芐青霉素和Elution Buffer為對(duì)照。
抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果其抗菌譜和最小抑菌濃度(以菌體不生長(zhǎng)的濃度為最小抑菌濃度)見表1。
表1中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素最小抑菌濃度
序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學(xué)<120>中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因及其編碼的C-型凝集素多肽與應(yīng)用<141>2005-9-1<160>2<210>1<211>557<212>cDNA<213>對(duì)蝦(Fenneropenaeius chinensis)<221>中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因<222>(1)…(557)<400>1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc540taaaaaaaaa aaaaaaa 557SEQ ID NO.2<210>2<211>159<212>PRT<221>中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因編碼的C-型凝集素多肽<222>(1)…(159)<400>2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15
Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His Gly50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser Gln Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET Gly Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr15權(quán)利要求
1.一種中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長(zhǎng)度557堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源對(duì)蝦(Fenneropenaeius chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgaagttcc tggcgccggt tattcttact acgttgatct ccgtcgctgc gtcagccagt 60gtccgtgcga ccgagtgccc ctccccctac gagcccctgg acgaaacgag gtgcattttc120ttggacgcct tcgtcagcta cacttggcaa gagacggttg acttgtgcaa gagccacggc180ggagaaatcc tgacaatcga ggactgcgag acgttcgccc ttgtctatga ctacatcagg240agccaggatg tcacgaaagg aaaacactac tggttaggag caaccgatga agtagaagaa300ggcacatgga aatttgtaaa caacagactc actcccatgg gcattcctta ctggggtgta360aacgagccta acaatgggaa tacctacaac tgcgctatga tgcatgctag ttataaccat420tattggtacg atgccgcgtg cggaagcaag tataacccca tttgtctcaa gaattattaa480aaagtgcatg ggcaagggag cactgtgata aaaggtacga cttggaaatg aagagacagc540taaaaaaaaa aaaaaaa 557
2.權(quán)利要求1所述中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因編碼的C-型凝集素多肽，它具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列；其所示信息為(a)序列特征*長(zhǎng)度159氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ ID NO.2Met Lys Phe Leu Ala Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Ile Ser Val5 10 15Ala Ala Ser Ala Ser Val Arg Ala Thr Glu Cys Pro Ser Pro Tyr20 25 30Glu Pro Leu Asp Glu Thr Arg Cys Ile Phe Leu Asp Ala Phe Val35 40 45Ser Tyr Thr Trp Gln Glu Thr Val Asp Leu Cys Lys Ser His G1y50 55 60Gly Glu Ile Leu Thr Ile Glu Asp Cys Glu Thr Phe Ala Leu Val65 70 75Tyr Asp Tyr Ile Arg Ser G1n Asp Val Thr Lys Gly Lys His Tyr80 85 90Trp Leu Gly Ala Thr Asp Glu Val Glu Glu Gly Thr Trp Lys Phe95 100 105Val Asn Asn Arg Leu Thr Pro MET G1y Ile Pro Tyr Trp Gly Val110 115 120Asn Glu Pro Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Cys Ala Met Met His125 130 135Ala Ser Tyr Asn His Tyr Trp Tyr Asp Ala Ala Cys Gly Ser Lys140 145 150Tyr Asn Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr155
3.權(quán)利要求2所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的變異體，它編碼具有少于8個(gè)氨基酸改變的同源變異蛋白，而且氨基酸改變是保守性氨基酸改變。
4.權(quán)利要求l所述中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述中國(guó)對(duì)蝦C-型凝集素基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用，其方法是通過基因重組技術(shù)使所述基因在大腸桿菌、酵母和昆蟲核型多角體病毒中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中國(guó)對(duì)蝦C－型凝集素基因及其編碼的C－型凝集素多肽，還公開了所述中國(guó)對(duì)蝦C－型凝集素基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用。利用本發(fā)明獲得的重組的C－型凝集素可用于抗菌的飼料添加劑、食品保存、動(dòng)植物基因轉(zhuǎn)化和藥物開發(fā)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1766109SQ20051004458
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者王金星, 趙小凡 申請(qǐng)人:山東大學(xué)