專利名稱：一種用預(yù)培養(yǎng)方式提高乳酸菌凍干活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種用預(yù)培養(yǎng)方式提高乳酸菌凍干活性的方法，屬于酸奶凍干發(fā)酵劑、乳酸菌活菌制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于成本和工業(yè)化方面的問題，菌體收集最常用的方法是離心分離法，即借助離心機(jī)的離心力作用使菌體沉積，目的就是將菌體與培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物分開，且要盡可能減少對菌體的損傷，此類方法簡便、快速、處理量大，適合商業(yè)化生產(chǎn)。菌體經(jīng)過富集培養(yǎng)、離心收集和保護(hù)劑懸浮后，一般采取的措施就是迅速于低溫下預(yù)凍，預(yù)凍一定時(shí)間后就開始冷凍干燥。從保護(hù)劑懸浮菌體到預(yù)凍這一步，可以做的工作很多Broadbent等指出將乳酸乳球菌置于10℃冷激2h，能提高細(xì)胞凍融后的存活率。國內(nèi)關(guān)于這方面的研究才剛起步，東北農(nóng)大的張?zhí)m威等人發(fā)表過一篇綜述。國外有文獻(xiàn)報(bào)道的也僅限于對大腸桿菌和一些嗜溫乳酸菌關(guān)于冷激方面的研究。關(guān)于德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌這兩種常用于酸奶發(fā)酵劑菌種進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的研究還未見諸報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用預(yù)培養(yǎng)方式提高乳酸菌凍干活性的方法，在菌體經(jīng)過富集培養(yǎng)，離心收集和保護(hù)劑懸浮后，先不置于低溫下預(yù)凍，而是把懸浮菌體重新送回一定溫度培養(yǎng)一定時(shí)間，然后再冷凍干燥。本發(fā)明把這種處理方法稱為預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)對前面的離心收集過程使菌體造成的損傷有修復(fù)作用，所以能提高乳酸菌凍干活性。本發(fā)明根據(jù)微生物的生理代謝特點(diǎn)，引入了預(yù)培養(yǎng)的思路，最大限度的挖掘凍干酸奶發(fā)酵劑活性提高的關(guān)鍵控制點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案酸奶發(fā)酵劑主要由德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)兩種菌構(gòu)成。將這兩種菌分別或按照1∶1的配比以2％接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用常規(guī)方法經(jīng)過富集培養(yǎng)，離心后收集菌體，加入保護(hù)劑懸浮，保護(hù)劑的用量是菌體濕重量的10-15倍，加保護(hù)劑懸浮后的乳酸菌菌體于4℃放置平衡30min，在30-45℃溫度下，經(jīng)過30-120min時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)后，再進(jìn)行冷凍干燥。
本發(fā)明所用乳酸菌菌種為德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus)CTCC6047、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)CTCC6038或以上兩個(gè)菌種按質(zhì)量比1∶1混合菌種。
本發(fā)明所用保護(hù)劑為8g脫脂奶粉、2g甘油、0.5g酵母膏，加水100mL充分混合溶解。
本發(fā)明所用保護(hù)劑應(yīng)于115℃、15min條件下滅菌，滅菌后置于37℃下培養(yǎng)三天，確認(rèn)無菌后才能使用。
預(yù)培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為42℃，預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為60分鐘，本方法也適用于乳酸菌活菌制劑或酸奶發(fā)酵劑。
本發(fā)明的有益效果采用預(yù)培養(yǎng)方式可以修復(fù)離心過程中對菌體造成的損傷，所以能提高乳酸菌凍干活性。本發(fā)明對于用作酸奶發(fā)酵劑乳酸菌，可以縮短凝乳時(shí)間。菌體經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)過程，由冷凍干燥前的不活躍狀態(tài)又能回復(fù)到富集培養(yǎng)后的相對活躍狀態(tài)。所選菌株最適預(yù)培養(yǎng)溫度為42℃，最適預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為60min。將此種狀態(tài)的菌體凍干后，菌體活性顯著提高，凝乳時(shí)間比對照組縮短25min。
菌體用保護(hù)劑懸浮后不能馬上冷凍，保護(hù)劑與菌體細(xì)胞平衡需要一段時(shí)間。保護(hù)劑與菌體在4℃放置30min以上平衡完成。
經(jīng)過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞穩(wěn)定性比對照組要好。前者于4℃的條件下貯藏90天后，凝乳時(shí)間損失36％；而對照組損失62％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1菌種由德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)CTCC6047和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)CTCC6038兩種菌按照1∶1的配比以2％接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用常規(guī)方法經(jīng)過富集培養(yǎng)，離心后收集菌體，加入上述保護(hù)劑懸浮，于4℃放置平衡30min后進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)溫度分別選擇20℃，30℃，42℃，55℃，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間分別選擇1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，進(jìn)行初選，分別考察培養(yǎng)過程中pH和菌數(shù)的變化；考察預(yù)培養(yǎng)處理后的細(xì)胞經(jīng)凍干后的成活率和凝乳時(shí)間。結(jié)果表明菌體在20℃這個(gè)生長溫度，各項(xiàng)指標(biāo)很接近，pH和菌數(shù)都無變化，隨著時(shí)間的延長，pH會(huì)看出些變化，但很微弱，這證明20℃下菌體只有微弱的代謝。55℃為菌體生長的上限，也沒有代謝，而且菌體數(shù)量隨著時(shí)間的延長遞減，這證明該溫度對菌體產(chǎn)生嚴(yán)重的傷害；30℃作為嗜溫性乳酸菌的最適生長溫度，桿菌和球菌有一定程度的代謝比20℃強(qiáng)，但比42℃弱很多。在這些預(yù)培養(yǎng)溫度中，以42℃時(shí)的菌體變化最顯著，證明菌體在此溫度下開始變得活躍。但在該溫度下，菌體細(xì)胞生長不符合微生物在液體中發(fā)酵生長的一般規(guī)律，菌體數(shù)量從3h后開始下降，而在正常的液體發(fā)酵時(shí)，乳酸菌在這段時(shí)間正處于生長旺盛的對數(shù)期。分析原因可能是由于在如此一種體系中，細(xì)胞密度過大，營養(yǎng)成分的構(gòu)成、滲透壓等都不如10％的牛奶中好，隨著時(shí)間的延長，有害代謝產(chǎn)物積累增多，很快就到了不適合菌體生長的程度。
20℃時(shí)菌體處于休眠狀態(tài)，菌體沒有發(fā)生變化，存活率隨著時(shí)間的延長仍維持在初始狀態(tài)的值71％，但由于3h后菌體休眠時(shí)間過長，菌體趨于不活躍，所以凍干后的凝乳時(shí)間延長5min。
30℃預(yù)培養(yǎng)的結(jié)果在存活率方面表現(xiàn)得較好，預(yù)培養(yǎng)3h時(shí)的存活率達(dá)到83％，比任何對照組都高。這可能是菌體細(xì)胞在此低溫下產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)或細(xì)胞膜產(chǎn)生了抵御冷凍、干燥等損傷的脂肪酸、蛋白質(zhì)，這印證了國外大部分學(xué)者的報(bào)道，Mary等曾將這種應(yīng)激狀態(tài)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分離出來。在42℃(最適生長溫度)下，預(yù)培養(yǎng)1h左右的存活率僅次于30℃3h的值，達(dá)到81％。但預(yù)培養(yǎng)3h后的存活率較低，只有68％。這可能是由于42℃預(yù)培養(yǎng)菌體代謝旺盛，在如此一種高菌體濃度的環(huán)境下，環(huán)境很快變得不適應(yīng)菌體生長，代謝產(chǎn)物對菌體產(chǎn)生了損傷，所以2h后存活率開始下降。最重要的發(fā)現(xiàn)是42℃預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞凍干后，比其他組的凍干活性要大得多，預(yù)培養(yǎng)1h的凝乳時(shí)間只有185min，比對照組不經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞要快25min，這表明經(jīng)過42℃預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞的凍干活性得到了加強(qiáng)，印證了預(yù)培養(yǎng)設(shè)計(jì)的思路。
42℃被選擇作為最佳預(yù)培養(yǎng)溫度，再在此溫度下對預(yù)培養(yǎng)時(shí)間做一個(gè)優(yōu)化，選擇能使菌體細(xì)胞達(dá)到最大凍干活性的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。將懸浮菌體于42℃分別預(yù)培養(yǎng)0、30、60、90、120、150min后測培養(yǎng)過程中pH和菌數(shù)的變化。凍干后測活性和存活率。
表1 42℃預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對菌體凍干活性的影響
由上表可知，在42℃預(yù)培養(yǎng)過程中，菌體數(shù)量的變化很微小，從0min到120min菌體數(shù)量僅由2.6×109cfu/ml增加到3.0×109cfu/ml。繼續(xù)培養(yǎng)，則菌體數(shù)量會(huì)下降，150min后，菌體水平下降到初始濃度2.6×109cfu/ml。這可能是由于在此體系中，細(xì)胞密度過大，營養(yǎng)成分的構(gòu)成、滲透壓等都不如10％的牛奶中好，所以生長代謝相對微弱。至于pH為什么變化快，可能是能量代謝仍然可以順利進(jìn)行的緣故。在活性方面，預(yù)培養(yǎng)到60min凍干后的凝乳時(shí)間為185min，活性最強(qiáng)。隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體周圍的環(huán)境惡化，菌體受到損傷，所以90min以后的細(xì)胞凍干活性開始下降。
綜上所述，從存活率、凝乳時(shí)間等綜合考察，選擇預(yù)培養(yǎng)溫度范圍為30-45℃，優(yōu)選為42℃；預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為30-120分鐘，優(yōu)選為60分鐘。
權(quán)利要求
1.一種提高乳酸菌凍干活性的方法，其特征是經(jīng)過富集培養(yǎng)，離心收集乳酸菌菌體后用保護(hù)劑懸浮，保護(hù)劑的用量是菌體濕重量的10-15倍，加保護(hù)劑懸浮后的乳酸菌菌體在4℃放置30分鐘平衡，在30-45℃溫度下，經(jīng)過30-120分鐘的預(yù)培養(yǎng)后，再進(jìn)行冷凍干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用乳酸菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)CTCC6047、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)CTCC6038或以上兩個(gè)菌種按質(zhì)量比1∶1混合菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用保護(hù)劑為8g脫脂奶粉、2g甘油、0.5g酵母膏，加水100mL充分混合溶解。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是保護(hù)劑應(yīng)于115℃、15分鐘條件下滅菌，滅菌后置于37℃下培養(yǎng)三天，確認(rèn)無菌后才能使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是預(yù)培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為42℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為60分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是本方法適用于乳酸菌的活菌制劑或酸奶發(fā)酵劑。
全文摘要
一種用預(yù)培養(yǎng)方式提高乳酸菌凍干活性的方法，屬于酸奶凍干發(fā)酵劑、乳酸菌活菌制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將凍干前的乳酸菌菌體與保護(hù)劑混合，在4℃放置30分鐘平衡，再在一定溫度下，經(jīng)過一定時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，然后再冷凍干燥貯藏。與傳統(tǒng)的不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的凍干方法相比較，經(jīng)過富集培養(yǎng)，離心收集和保護(hù)劑懸浮后，先不置于低溫下預(yù)凍，而是把懸浮菌體重新送回一定溫度培養(yǎng)一定時(shí)間，然后再冷凍干燥。預(yù)培養(yǎng)對前面的離心收集過程使菌體造成的損傷有修復(fù)作用，所以能提高乳酸菌凍干活性。本發(fā)明引入了預(yù)培養(yǎng)的思路，用這種方法可以提高凍干酸奶發(fā)酵劑、乳酸菌活菌制劑的活性。
文檔編號C12R1/46GK1724648SQ20051004049
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月11日
發(fā)明者趙建新, 陳衛(wèi), 田豐偉, 張灝, 潘巧, 黃文利 申請人:江南大學(xué)