專利名稱：小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1及其應(yīng)用。
二.
背景技術(shù)：
植物轉(zhuǎn)基因研究始于20世紀(jì)80年代初期，1983年Zambryski獲得了世界上第一例轉(zhuǎn)基因植株，1985年Horch創(chuàng)造了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的葉盤法，自此以后，分別建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、病毒介導(dǎo)法、PEG介導(dǎo)法、電激穿孔法、顯微注射法、花粉管通道法、超聲波法、基因槍法等，轉(zhuǎn)基因成功的物種不斷擴(kuò)大，涉及50多個(gè)物種共110多種植物，其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因植物占轉(zhuǎn)基因植物總數(shù)的85％以上，基因槍法獲得的轉(zhuǎn)基因植物占10％左右，雙子葉植物是農(nóng)桿菌的天然寄主，利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法已經(jīng)建立了多種雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)移體系，并將一些優(yōu)良外源基因轉(zhuǎn)入了雙子葉植物，育成了轉(zhuǎn)基因品種，但是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)單子葉植物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的工作進(jìn)展相對(duì)較慢。
小麥?zhǔn)亲钪饕募Z食作物之，但其基因工程的研究進(jìn)程已落后于其它作物，小麥轉(zhuǎn)基因研究開始于80年代初期。1992年Vasil等利用基因槍介導(dǎo)法獲得了世界上第一例小麥轉(zhuǎn)基因植株，1994年曾君祉、成卓敏等利用花粉管通道法分別獲得了小麥轉(zhuǎn)基因植株。在以后的幾年內(nèi)，小麥轉(zhuǎn)基因研究基本上借助于基因槍介導(dǎo)法。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到目前為止獲得小麥轉(zhuǎn)基因的報(bào)道中，基因槍法占90％左右，其它方法僅占10％上下，原因在于基因槍介導(dǎo)法的方法比較成熟，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法還比較困難。但是，與基因槍介導(dǎo)法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、可以導(dǎo)入大片段DNA等優(yōu)點(diǎn)，且導(dǎo)入的基因一般為單拷貝整合，不至于發(fā)生基因沉默現(xiàn)象，然而，小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移一直是世界上的一道難題，雖然Hess、Mooney等曾先后做過(guò)嘗試，但未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。隨著基因分離技術(shù)和克隆手段的提高，今后將有更多與小麥改良有關(guān)的重要基因被克隆出來(lái)，同時(shí)小麥生產(chǎn)中的一些實(shí)際問(wèn)題，如蚜蟲、赤霉病、白粉病、銹病、全蝕病、紋枯病、土傳病毒病、干旱、鹽堿等問(wèn)題相繼出來(lái)，而基因工程育種可能是最好的解決途徑。
植物在生長(zhǎng)的過(guò)程中，受到許多病原物的侵害，植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果1.病原物成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；2.寄主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。病害是小麥生產(chǎn)的主要障礙，小麥的大多數(shù)病害屬于真菌性病害，將外源抗真菌基因?qū)胄←準(zhǔn)欠乐涡←湶『Φ耐緩街?，一般常用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)小麥進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。專利申請(qǐng)?zhí)枮?3109435.X，發(fā)明名稱為《一種用農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)小麥進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法》中公開了一種用農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)小麥進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法，它是將小麥愈傷組織與含有Ti質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，將質(zhì)粒載體上的外源基因轉(zhuǎn)移到受體基因組中，但在轉(zhuǎn)化前要用含有乙磺酸、賴氨酸、章魚堿、谷氨酰胺、乙酰丁香酮、葡萄糖、麥芽糖等的培養(yǎng)液進(jìn)行重懸。目前在世界范圍內(nèi)，對(duì)小麥抗病基因以及小麥抗病相關(guān)基因的分離、克隆以及抗病反應(yīng)的研究相對(duì)來(lái)說(shuō)比較少。
三.
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服目前小麥抗病相關(guān)基因研究過(guò)程中存在的不足，提供一種新的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1及其應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1，其特征是TaEDR1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其核苷酸序列的堿基組成896a 630c 758g 766t1 cgccaaactg aaataaccaa gagaggaaat attttcgaaa cccaaaccct aggtgctcgt61 ggggagcgcc atgaagatcc cgtttgtgac caagtggtcg caccgatcca gcgagcccgc121 ggggccgtcg aattcggctg cagcgcagca gcagcagcag cagcaggcgc cgtctcctcc181 tcctcccgtg gcgtcgacag aggcggcagg ggatgagttc attctgcagg aggaagagta241 ccagatgcaa ctggcgttgg cgctatcagc gtcggcgtcg ggcgccgagg gcgctgggga301 tcccgacggg gagcagatca gaaaggcgaa gctgatgagc ctcgggaagg gccacccggt361 caccaacagc gatcgtggcg ggggagacac cccggagtcg ctctcccgcc gttacaggga421 ctataacttt cttgattaca atgagaaagt aattgatgga ttctacgacg tatttggcct
481 ctctgcggga tcatctgggc agggcaaaat accttcactg gcagagcttc agatgagcat541 tggggatctt ggatatgaag taattgtggt tgactataaa tttgataatg ctctgcagga601 gatgaaggaa gtagcagaat gctgcctgtt gggctgtcct gacattacag tattggtgcg661 acgaatagct gaagttgttg cagatcacat gggtggtcca gtgatcgatg caaatgaaat721 gatcactagg tggttgagca aaagcattga gcagaggaca tcacaccaga caagccttct781 gcatattggc agtatagaga taggcttgtc tcgccatcgt gccttacttt tcaagattct841 tgctgatatt gttggtatcc cttgcaagct ggttaaaggg agtcattaca ctggtgttga901 agatgacgct attaacataa taaagatgga tgacaaaagg gagtttttgg tggatgttat961 ggctgctcca gggactctca ttccagcaga tgtctttaat tcaaagggta ctccattcaa1021 cttcagtcaa acattgggtc agaatcaggt ggtggagtca gcaagtaaca tcgaagatga1081 cccagttgca ttacagtcag agcataaacg taaccaaggg catatgtttg ccaataataa1141 tcggatctca gtcaatctat caagctatga gaatacaatg accgctggaa gtagtgctag1201 tgaacctggg acattggacc ctaggatgca attaggtaaa acatcaactt tgcctagtgc1261 tccttccaag cagaagaaga atctgcaatt gattacagac tctcatgaaa ctgaagagtc1321 ccgaaaacta tttgtggagt tagatccttt caatgctatt gaatctggga aaagctcatt1381 ggcattcaag ggattaaata atagaaacaa tgaattccaa aggcgtagag agaatgtagt1441 cccaccatct gtaagatctc aacagccatt ggtgatgaaa aactggtctg cttgcaatga1501 catttccaac aacaagcaat acaatgttgc tgatgggtca gttcctcgga gaaatgccac1561 tgacaatgca tcgtcatctc agttggcgtt gtcaactgca aagcattaca attccaatgt1621 tagagagcta aacgatagag tgtatgcagc acctgctcgt aattatgaca acaagatagt1681 tggtacctcg gctatggcca aagcattgac tggagagtgc cctgacagat cacaggtgc1741 acctggtctt tattatgaca agatgcttgg tacctcttct atgaatgcag cttctacatc1801 cggaatcggg aaagttgcag aaaaggaccc tcataatgat ccgggaaaag gtcccatcta1861 ttctagattt gatggtgaac tttctaaaaa tgctcaagga tttactcccg aaagggatga1921 gcacaaggaa aattgtggca gtcatgacca caaaatgtta tatcctgatc caagaaagtc1981 ccctcttgac agattcatgg acaggccaag gcagagcata gaatgtgttt ttccatccca2041 agttggatca aataaggctg acatggtgtt ggatgaagtg tctgaatgtg aaatcctttg2101 ggaagatctt gtaatcgatg aaagaattgg cataggttca tatggagaag tctaccatgc
2161 tgattggaat ggaactgaag tagctgtaaa gaagttcttg gatcaagagt tctatggtga2221 tgctttagag gaatttcgtt gtgaagtgag gattatgcgt cggctccgtc atccaaatat2281 tgttctcttt atgggtgcag taacacggcc tccacactta tctattgtat cagaatatct2341 tccaagggga agcttatata agatcattca tcgccctaat tgccaaatcg acgagaagcg2401 taggattaaa atggcccttg atgtggccag aggcatgaat tgtcttcata ccagtgtacc2461 aacaattgtt caccgggatc taaaatcacc aaacttgctg gttgacgata attggactgt2521 gaaggtctgt gatttcggac tttcacgtct gaagcacagt acatttttgt catcaaaatc2581 cactgccggg actcctgagt ggatggcacc agaggttttg cggaatgagc aatccaatga2641 gaagtgtgat atttacagct ttggtgttat cctgtgggag ctagcaacac taagaaagcc2701 atggcatggg atgaaccaaa tgcaagttgt gggcgcagtt ggcttccagg accgacggct2761 tgacattcca aaagaagtag atcctatagt tgcatcaatt atacgtgatt gctggcagaa2821 ggatccaaac ttgcgtcctt ctttcatcca attaactagc tacctgaaga cattgcaaag2881 gcttgtaatc ccttcacatc aggagacagc gagcaaccat gtaccctatg aaatatcttt2941 atatcggtga accgcacatc tctaccccgg ggttgtcacc caccaagtgt gaataagcag3001 taattatgat tttgtcatcg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa所述的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼的蛋白，其氨基酸序列為1 MKIPFVTKWS HRSSEPAGPS NSAAAQQQQQ QQAPSPPPPV ASTEAAGDEF ILQEEEYQMQ61 LALALSASAS GAEGAGDPDG EQIRKAKLMS LGKGHPVTNS DRGGGDTPES LSRRYRDYNF121 LDYNEKVIDG FYDVFGLSAG SGQGKIPSL AELQMSIGDL GYEVIVVDYK FDNALQEMKE181 VAECCLLGCP DITVLVRRIA EVVADHMGGP VIDANEMITR WLSKSIEQRT SHQTSLLHIG241 SIEIGLSRHR ALLFKILADI VGIPCKLVKG SHYTGVEDDA INIIKMDDKR EFLVDVMAAP301 GTLIPADVFN SKGTPFNFSQ TLGQNQVVES ASNIEDDPVA LQSEHKRNQG HMFANNNRIS361 VNLSSYENTM TAGSSASEPG TLDPRMQLGK TSTLPSAPSK QKKNLQLITD SHETEESRKL421 FVELDPFNAI ESGKSSLAFK GLNNRNNEFQ RRRENVVPPS VRSQQPLVMK NWSACNDISN481 NKQYNVADGS VPRRNATDNA SSSQLALSTA KHYNSNVREL NDRVYAAPAR NYDNKIVGTS541 AMAKALTGEC PDRSQVPPGL YYDKMLGTSS MNAASTSGIG KVAEKDPHND PGKGPIYSRF601 DGELSKNAQG FTPERDEHKE NCGSHDHKML YPDPRKSPLD RFMDRPRQSI ECVFPSQVGS661 NKADMVLDEV SECEILWEDL VIDERIGIGS YGEVYHADWN GTEVAVKKFL DQEFYGDALE
721 EFRCEVRIMR RLRHPNIVLF MGAVTRPPHL SIVSEYLPRG SLYKIIHRPN CQIDEKRRIK781 MALDVARGMN CLHTSVPTIV HRDLKSPNLL VDDNWTVKVC DFGLSRLKHS TFLSSKSTAG841 TPEWMAPEVL RNEQSNEKCD IYSFGVILWE LATLRKPWHG MNQMQVVGAV GFQDRRLDIP901 KEVDPIVASI IRDCWQKDPN LRPSFIQLTS YLKTLQRLVI PSHQETASNH VPYEISLYR所述的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼的蛋白，其基因編碼的是一個(gè)促分裂原蛋白激酶激酶激酶，包括N-端序列和C-端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域2大部分。
小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在植物抗病改良中的應(yīng)用。
小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在合成新的抗病相關(guān)基因中的應(yīng)用。
小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在小麥基因芯片制作中的應(yīng)用。
本發(fā)明的積極有益效果是1.本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1可以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗病育種。該基因可以插入到不同類型的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成植物表達(dá)載體，通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行植物抗病改良，啟動(dòng)子可以是組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、玉米泛素啟動(dòng)子Ubi等，連接在組成型表達(dá)啟動(dòng)子下游的基因?qū)⒃谵D(zhuǎn)基因植物的任何組織和任何發(fā)育時(shí)期表達(dá)；啟動(dòng)子也可以是病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子、或組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，連接在這些啟動(dòng)子下的基因僅在病原菌存在時(shí)、或在特定組織中表達(dá)，使該基因的表達(dá)受到更精確的控制。
2.本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1可以設(shè)計(jì)合成新的抗病相關(guān)基因。將TaEDR1與EDR1、HvEDR1等抗病相關(guān)促分裂原蛋白激酶激酶激酶比較可知，這些蛋白的羧基端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能域高度保守，而在氨基端的結(jié)構(gòu)有較大差異，因此，氨基端的結(jié)構(gòu)變化決定EDR1類似蛋白與其他蛋白的互作特異性，通過(guò)定點(diǎn)突變、或基因序列重組等技術(shù)，可以人工合成很多具有新的特性的基因，通過(guò)基因工程技術(shù)應(yīng)用于植物抗病改良中。另外，本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1是具有抗病負(fù)調(diào)控作用的基因，通過(guò)定點(diǎn)突變使其蛋白激酶功能域失活，或構(gòu)建反義RNA、RNA干擾植物表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于植物抗病改良中。
3.本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1可以進(jìn)行基因芯片的制作?？蓪⒃摶虻目寺∮糜谛←溁蛐酒谱鳎瑧?yīng)用于小麥抗病等研究中，根據(jù)TaEDR1基因cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，在含本基因的克隆中擴(kuò)增TaEDR1基因的全長(zhǎng)cDNA，或擴(kuò)增編碼N-端結(jié)構(gòu)域的基因特異性強(qiáng)的區(qū)段，進(jìn)行基因芯片的制作。
4.本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在小麥抗白粉病反應(yīng)中起著重要作用。小麥在受到小麥白粉病菌的攻擊時(shí)，小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在小麥葉片中的表達(dá)增強(qiáng)，增強(qiáng)幅度可達(dá)3-5倍(參見(jiàn)圖1)；小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在小麥葉片中表達(dá)量較高，在幼莖和幼穗中表達(dá)中等，在根部表達(dá)量較低(參見(jiàn)圖2)，小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1的表達(dá)譜變化證明了其在小麥抗白粉病反應(yīng)中起著重要的作用。
5.本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1的途徑是小麥抗病的重要途徑之一。本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼的蛋白是一個(gè)促分裂原蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)，包括N-端序列和C-端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域2大部分，在受到小麥白粉病菌的攻擊時(shí)，TaEDR1基因在小麥葉片中的表達(dá)增強(qiáng)，增強(qiáng)幅度可達(dá)3-5倍(參見(jiàn)圖1)，TaEDR1基因在小麥葉片中表達(dá)量較高，在幼莖和幼穗中表達(dá)中等，在根部表達(dá)量較低(參見(jiàn)圖2)，TaEDR1的表達(dá)譜變化證明了其在小麥抗白粉病反應(yīng)中起重要作用，小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼蛋白的氨基酸序列與已經(jīng)克隆的大麥HvEDR1(GanBank查詢號(hào)gi11127922)有92％的相同，從比較結(jié)果可以看出本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1的途徑是小麥抗病的重要途徑之一。
四.
圖1為通過(guò)半定量RT-PCR技術(shù)分析TaEDR1基因在小麥抗白粉病反應(yīng)中的表達(dá)變化，圖上M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，0、1、12、24等數(shù)字為小麥白粉病菌接種誘導(dǎo)時(shí)間；Actin為小麥肌動(dòng)蛋白基因，為穩(wěn)定表達(dá)基因，作為基因表達(dá)變化的對(duì)照，TaMlo是小麥的一個(gè)抗病相關(guān)基因，表達(dá)受白粉病菌的誘導(dǎo)略有增強(qiáng)，作為基因表達(dá)分析的對(duì)照，結(jié)果可見(jiàn)，TaEDR1基因在白粉病菌接種后表達(dá)增強(qiáng)，白粉病菌接種后24小時(shí)基因的表達(dá)量達(dá)到未接種時(shí)的大約3-5倍；圖2為通過(guò)半定量RT-PCR技術(shù)分析TaEDR1基因在小麥不同組織中的表達(dá)變化，圖上M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1、2、3、4、5、6、7分別為幼葉、中部葉、旗葉、幼穗、幼莖、根、白粉病菌誘導(dǎo)的根，Actin為小麥肌動(dòng)蛋白基因，為穩(wěn)定表達(dá)基因，作為基因表達(dá)變化的對(duì)照。
五.
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1的克隆過(guò)程小麥TaEDR1基因是從對(duì)白粉病抗性程度很高的小麥抗病新品系“99-2439”中分離的。以白粉病菌誘導(dǎo)后22小時(shí)的葉片為材料提取總RNA(核糖核酸)，再進(jìn)一步分離mRNA(信使核糖核酸)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核酸)，用該cDNA為模板進(jìn)行基因克隆。
根據(jù)擬南芥EDR1基因及其同源物設(shè)計(jì)的一對(duì)兼并性引物(序列為5′-GCIGTIAAIAAITTI(T/C)TIGA(T/C)CA(G/A)GA-3′和5′-GCIAAIGAIGGIC(G/T)IAI(G/A)TTIGG(G/A)TC-3′)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)獲得了代表小麥TaEDR1基因的627bp長(zhǎng)的cDNA片段。在這個(gè)序列的基礎(chǔ)上又設(shè)計(jì)了一個(gè)5′-RACE基因特異性引物(序列為5′-CGGAGCCGACGCATAATCCTCACTT-3′)，通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)獲得了2268bp長(zhǎng)的基因5′-端序列。隨后，再在5′-端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)基因特異性引物(序列為5′-TAGGTGCTCGTGGGGAGCG-3′)，通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)獲得了小麥TaEDR1基因的全長(zhǎng)cDNA序列克隆。
具體克隆技術(shù)cDNA的合成用TRIzol試劑提取總RNA。用Poly(A)TractmRNA分離系統(tǒng)III分離出mRNA。用SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒合成cDNA。
反轉(zhuǎn)錄PCR用高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)橄仍?4℃變性2分鐘；接30個(gè)循環(huán)的94℃變性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后在72℃延伸7分鐘。
快速擴(kuò)增cDNA末端使用專門的試劑盒(SMARTTMRACE cDNA AmplificationKit)進(jìn)行擴(kuò)增，溶液配制按說(shuō)明書進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的94℃變性15秒，72℃退火和延伸3分鐘；25個(gè)循環(huán)的94℃變性15秒，68℃退火30秒，72℃延伸3分鐘；最后在72℃延伸7分鐘。
產(chǎn)物回收和測(cè)序分析擴(kuò)增產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切割下來(lái)，用液氮反復(fù)凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉淀。回收的DNA片段用超純水溶解后，用T4-DNA連接酶將其與pGEM-T Easy載體連接，4℃連接過(guò)夜。用CaCl2熱擊法，在42℃熱擊90秒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B菌株中。用質(zhì)粒小量提取法提取質(zhì)粒DNA。在大連寶生物公司用ABI377自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLASTt和BLASTp計(jì)算機(jī)輔助程序(Altschul等1997)在美國(guó)國(guó)家生物信息中心網(wǎng)站NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)和相關(guān)的連網(wǎng)站點(diǎn)進(jìn)行同源序列查詢比較。在NCBI網(wǎng)站用Marchler-Bauer等(2003)的方法進(jìn)行保守功能域數(shù)據(jù)分析。
在GenBank中進(jìn)行相似性查詢比較，證明所克隆的全長(zhǎng)cDNA為新的小麥基因，命名為TaEDR1基因，該基因的部分序列已經(jīng)作為小麥新基因在GenBank中登錄，編號(hào)為AY743662。
小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼蛋白的氨基酸序列與已經(jīng)克隆的大麥HvEDR1(GanBank查詢號(hào)gi11127922)有92％的相同，其比較結(jié)果如下TaEDR11 MKIPFVTKWSHRSSEPAGPSNSAAAQQQQ----QQQAPSPPPPVASTEAAGDEFILQEEEYQMQLALALSASASGAEGAGDPDGEQIRKA86MKIPFVTKWSHRSSEPAGPSNSAAAQQQQ APS PPVASTEAAGDEFILQEEEYQMQLALALSASASGAEGAGDPDGEQIRKAHvEDR11 MKIPFVTKWSHRSSEPAGPSNSAAAQQQQPPPLSPSAPSRSPPVASTEAAGDEFILQEEEYQMQLALALSASASGAEGAGDPDGEQIRKA 90TaEDR187 KLMSLGKGHPVTNSDRGGGDTPESLSRRYRDYNFLDYNEKVIDGFYDVFGLSAGSSGQGKIPSLAELQMSIGDLGYEVIVVDYKFDNALQ176KLMSLGKG PVTNSD GGG T ESLSRRYRDYNFLDYNEKVIDGFYD+FG SA SSG GKIPSLAEL MSIGDLGYEVIVVDYKFDNALQHvEDR191 KLMSLGKGDPVTNSDLGGGYTAESLSRRYRDYNFLDYNEKVIDGFYDIFGPSAESSGHGKIPSLAELHMSIGDLGYEVIVVDYKFDNALQ180TaEDR1177 EMKEVAECCLLGCPDITVLVRRIAEVVADHMGGPVIDANEMITRWLSKSIEQRTSHQTSLLHIGSIEIGLSRHRALLFKILADIVGIPCK265EMKEVAECCLLGCPDITVLVRRIAEVVADHMGGPVIDANEMITRWLSKSIEQRTSHQTSLLHIGSIEIGLSRHRALLFKILAD+VGIPCKHvEDR1181 EMKEVAECCLLGCPDITVLVRRIAEVVADHMGGPVIDANEMITRWLSKSIEQRTSHQTSLLHIGSIEIGLSRHRALLFKILADMVGIPCK 270TaEDR1267 LVKGSHYTGVEDDAINIIKMDDKREFLVDVMAAPGTLIPADVFNSKGTPFNFSQTLGQNQVVESASNIEDDPVALQSEHKRNQGHMFANN356LVKGSHYTGV DDAINIIKMD+KREFLVDVMAAPGTLIPADVFNSKGTPFNFSQTLGQNQVVESASNIEDDPVALQSEH+ QGHMFANNHvEDR1271 LVKGSHYTGVVDDAINIIKMDNKREFLVDVMAAPGTLIPADVFNSKGTPFNFSQTLGQNQVVESASNIEDDPVALQSEHEHYQGHMFANN 360TaEDR1357 NRISVNLSSYENTMTAGSSASEPGTLDPRMQLGKTSTLPSAPSKQKKNLQLITDSHETEESRKLFVELDPFNAIESGKSSLAFKGLNNRN446+R+S NLSSYENTMTAGSSASEPGTL GK STL APSKQKKNLQLI DSHE +ESR LF E DPFNA ESGKSSLAFKGLNNRNHvEDR1361DRVSDNLSSYENTMTAGSSASEPGTL------GKASTLAGAPSKQKKNLQLIPDSHEIDESRNLFAEFDPFNATESGKSSLAFKGLNNRN 444TaEDR1447 NEFQRRRENVVPPSVRSQQPLVMKNWSACNDISNNKQYNVADGSVPRRNATDNASSSQLALSTAKHYNSNVRELNDRVYAAPARNYDNKI536++F+RRRENVVPPS RSQQPLV KNWSACNDISNNKQYNVADGSVPRRNATDNASSSQLALSTAKHYN NVRELNDR+YAAPARNYDN+IHvEDR1445 KNWSACNDISNNKQYNVADGSVPRRNATDNASSSQLALSTAKHYNPNVRELNDRMYAAPARNYDNRI534
TaEDR1537 VGTSAMAKALTGECPDRSQVPPGLYYDKMLGTSSMNAASTSGIGKVAEKDPHNDPGKGPIYSRFDGELSKNAQGFTPERDEHKENCGSHD 626+GTSAMAKA TG+C DRSQVPPGLYYDKMLGTSSMN AS+SGIGKVAEKD ND KGPIYSRFDGELSKNAQGFTPERDEHKENCGS+DHvEDR1535IGTSAMAKASTGDCLDRSQVpPGLYYDKMLGTSSMNTASSSGIGKVAEKDLQNDLEKGPIYSRFDGELSKNAQGFTPERDEHKENCGSYD624TaEDR1627 HKMLYPDPRKSPLDRFMDRPRQSIECVFPSQVGSNKADMVLDEVSECEILWEDLVIDERIGIGSYGEVYHADWNGTEVAVKKFLDQEFYG 716H+ML+PDPRKSPLDRFMDRPRQ+IECV PSQVGS+K D+VLDEVSECEILWEDLVIDERIGIGSYGEVYHADWNGTEVAVKKFLDQEFYGHvEDR1625HRMLHPDPRKSPLDRFMDRPRQNIECVSPSQVGSSKVDLVLDEVSECEILWEDLVIDERIGIGSYGEVYHADWNGTEVAVKKFLDQEFYG714TaEDR1717 DALEEFRCEVRIMRRLRHPNIVLFMGAVTRPPHLSIVSEYLPRGSLYKIIHRPNCQIDEKRRIKMALDVARGMNCLHTSVPTIVHRDLKS 806DALEEFRCEVRIMRRLRHPNIVLFMGAVTRPPHLSIVSEYLPRGSLYKIIHRPNCQIDEKRRIKMALDVARGMNCLHTSVPTIVHRDLKSHvEDR1715 DALEEFRCEVRIMRRLRHPNIVLFMGAVTRPPHLSIVSEYLPRGSLYKIIHRPNCQIDEKRRIKMALDVARGMNCLHTSVPTIVHRDLKS 804TaEDR1807 PNLLVDDNWTVKVCDFGLSRLKHSTFLSSKSTAGTPEWMAPEVLRNEQSNEKCDIYSFGVILWELATLRKPWHGMNQMQVVGAVGFQDRR 896PNLLVDDNWTVKVCDFGLSRLKHSTFLSSKSTAGTPEWMAPEVLRNEQSNEKCDIYSFGVILWELATLRKPWHGMNQMQVVGAVGFQDRRHvEDR1805 PNLLVDDNWTVKVCDFGLSRLKHSTFLSSKSTAGTPEWMAPEVLRNEQSNEKCDIYSFGVILWELATLRKPWHGMNQMQVVGAVGFQDRR 894TaEDR1897 LDIPKEVDPIVASIIRDCWQKDPNLRPSFIQLTSYLKTLQRLVIPSHQETASNHVPYEISLYR 959LDIPKEVDPIVASIIRDCWQKDPNLRPSFIQLTSYLKTLQRLVIPSHQETASNHVPYEISLYRHvEDR1895 LDIPKEVDPIVASIIRDCWQKDPNLRPSFIQLTSYLKTLQRLVIPSHQETASNHVPYEISLYR 957小麥TaEDR1蛋白與大麥HvEDR1蛋白的比較，有差異的部分用下劃線標(biāo)出， 表示一個(gè)不確定的氨基酸殘基，從比較結(jié)果可以看出本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1的途徑是小麥抗病的重要途徑之一。
實(shí)施例二本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在轉(zhuǎn)基因抗病育種上的應(yīng)用。
將TaEDR1基因從pGEM-T easy載體上酶切下來(lái)，或用高保真Taq-DNA聚合酶和基因特異性引物擴(kuò)增下來(lái)，用T4-DNA連接酶將TaEDR1連接在玉米泛素高效啟動(dòng)子Ubi(Ubiquitin-1)的下游，再插入到pCAMBIA-Bar植物表達(dá)載體中，從而構(gòu)建成pCAMBIA-Ubi-TaEDR1表達(dá)載體質(zhì)粒。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B菌株中繁殖，提取該載體的質(zhì)粒，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗病育種。通過(guò)基因槍(如伯樂(lè)公司的高壓氦氣基因槍，PDS-1000/He)將pCAMBIA-Ubi-TaEDR1表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，但抗病性差的小麥品種的幼胚愈傷組織中。利用表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記基因——抗除草劑基因Bar，在加有除草劑PPT的MS固體培養(yǎng)基中篩選，獲得抗PPT的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。再將篩選獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)到新的誘導(dǎo)組織分化的分化培養(yǎng)基(含3mg/L的PPT；1mg/L的Zeatin，和1mg/L的IAA，1/2的MS固體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生新的再生植株，這樣就獲得了轉(zhuǎn)基因小麥，用基因特異性引物通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的后代進(jìn)行檢測(cè)，選擇基因純合，抗病性好的理想轉(zhuǎn)基因品系，即可進(jìn)行大田種植、推廣。
實(shí)施例三小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在設(shè)計(jì)合成新抗病相關(guān)基因上的應(yīng)用。
現(xiàn)代DNA合成技術(shù)已經(jīng)可以合成全長(zhǎng)基因，因此，根據(jù)TaEDR1基因和HvEDR1基因的差異，將HvEDR1基因編碼45位氨基酸殘基以前的cDNA合成后與TaEDR1基因編碼41位氨基酸殘基到基因cDNA末端部分相連接，這樣就合成了全新的基因。然后，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證合成基因的編碼框(ORF)是否正確。通過(guò)驗(yàn)證的基因即可進(jìn)一步構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)合成基因的抗病性進(jìn)行檢測(cè)，具有良好抗病性的合成基因可以用于轉(zhuǎn)基因抗病小麥新品種的培育，其植物表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因的具體操作同實(shí)施例二所述的相同。
實(shí)施例四小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在基因芯片制作上的應(yīng)用。
以TaEDR1基因cDNA克隆為模板，用基因特異性引物或pGEM-T easy載體上的M13通用引物通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得DNA產(chǎn)物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，溶解后，按照基因芯片制作程序制作小麥基因芯片，用于抗病等相關(guān)研究，如可以用英國(guó)的BioRobotics自動(dòng)點(diǎn)膜儀將標(biāo)本點(diǎn)在8×12厘米的尼龍膜上，每個(gè)樣品點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)的DNA量為幾納克，同時(shí)點(diǎn)上看家基因(如18sRNA和Actin基因)作為穩(wěn)定表達(dá)基因?qū)φ?，試?yàn)研究材料的mRNA提取后用同位素(如33p)標(biāo)記作為探針，與基因芯片進(jìn)行雜交，用記錄儀分析雜交信號(hào)，根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱分析不同實(shí)驗(yàn)條件下TaEDR1基因的表達(dá)變化，研究TaEDR1基因與抗病等反應(yīng)的關(guān)系。
實(shí)施例五小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在抗白粉病反應(yīng)中的表達(dá)分析方法表達(dá)分析的具體方法(1)穩(wěn)定表達(dá)對(duì)照基因——小麥肌動(dòng)蛋白基因(Actin)的擴(kuò)增根據(jù)GenBank中的Actin基因cDNA片段的序列(GenBank查詢號(hào)gi48927617)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，WAC-F5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′和WAC-R5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′，反轉(zhuǎn)錄PCR在Perkin-Elmer 9600基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)液為25μL體系，包括3μL的經(jīng)過(guò)定量的等量cDNA，0.4μmol/L的每種基因特異性引物，200μmol/L的dNTP，1倍的PCR緩沖液，1.5mmol/L的MgCl2，1-2個(gè)單位的Taq- DNA聚合酶；擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性3分鐘；18個(gè)循環(huán)的94℃變性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分鐘；最后在72℃延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化釔錠染色，紫外燈下觀察、照相，小麥肌動(dòng)蛋白基因的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物為422bp長(zhǎng)。(2)小麥TaEDR1基因的擴(kuò)增方法與上述方法相同，只是擴(kuò)增的退火溫度不同，為50℃，基因特異性引物為p15′-TTTCGTTGTGAAGTGAGG-3′；p25′-ATGGCTTTCTTAGTGTTGC-3′，TaEDR1基因的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物為469bp長(zhǎng)。
序列表<110>河南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>3050<212>DNA<213>普通小麥(Triticum aestivum L.)<400>1cgccaaactg aaataaccaa gagaggaaat attttcgaaa cccaaaccct aggtgctcgt60ggggagcgcc atgaagatcc cgtttgtgac caagtggtcg caccgatcca gcgagcccgc120ggggccgtcg aattcggctg cagcgcagca gcagcagcag cagcaggcgc cgtctcctcc180tcctcccgtg gcgtcgacag aggcggcagg ggatgagttc attctgcagg aggaagagta240ccagatgcaa ctggcgttgg cgctatcagc gtcggcgtcg ggcgccgagg gcgctgggga300tcccgacggg gagcagatca gaaaggcgaa gctgatgagc ctcgggaagg gccacccggt360caccaacagc gatcgtggcg ggggagacac cccggagtcg ctctcccgcc gttacaggga420ctataacttt cttgattaca atgagaaagt aattgatgga ttctacgacg tatttggcct480ctctgcggga tcatctgggc agggcaaaat accttcactg gcagagcttc agatgagcat540tggggatctt ggatatgaag taattgtggt tgactataaa tttgataatg ctctgcagga600gatgaaggaa gtagcagaat gctgcctgtt gggctgtcct gacattacag tattggtgcg660acgaatagct gaagttgttg cagatcacat gggtggtcca gtgatcgatg caaatgaaat720gatcactagg tggttgagca aaagcattga gcagaggaca tcacaccaga caagccttct780gcatattggc agtatagaga taggcttgtc tcgccatcgt gccttacttt tcaagattct840tgctgatatt gttggtatcc cttgcaagct ggttaaaggg agtcattaca ctggtgttga900agatgacgct attaacataa taaagatgga tgacaaaagg gagtttttgg tggatgttat960ggctgctcca gggactctca ttccagcaga tgtctttaat tcaaagggta ctccattcaa1020cttcagtcaa acattgggtc agaatcaggt ggtggagtca gcaagtaaca tcgaagatga1080cccagttgca ttacagtcag agcataaacg taaccaaggg catatgtttg ccaataataa1140tcggatctca gtcaatctat caagctatga gaatacaatg accgctggaa gtagtgctag1200tgaacctggg acattggacc ctaggatgca attaggtaaa acatcaactt tgcctagtgc1280
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<210>2<211>959<212>PRT<213>普通小麥(Triticum aestivum L.)<400>2Met Lys lle Pro Phe Val The Lys Trp Ser His Arg Ser Ser Glu15 10 15Pro Ala Gly Pro Ser Asn Ser Ala Ala Ala Gln Gln Gln Gln Gln20 25 30Gln Gln Ala Pro Ser Pro Pro Pro Pro Val Ala Ser The Glu Ala35 40 45Ala Gly Asp Glu Phe lle Leu Gln Glu Glu Glu Tyr Gln Met Gln50 55 60Leu Ala Leu Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ser Gly Ala Glu Gly Ala65 70 75Gly Asp Pro Asp Gly Glu Gln lle Arg Lys Ala Lys Leu Met Ser80 85 90Leu Gly Lys Gly His Pro Val The Asn Ser Asp Arg Gly Gly Gly95 100 105Asp The Pro Glu Ser Leu Ser Arg Arg Tyr Arg Asp Tyr Asn Phe110 115 120Leu Asp Tyr Asn Glu Lys Val lle Asp Gly Phe Tyr Asp Val Phe125 130 135Gly Leu Ser Ala Gly Ser Ser Gly Gln Gly Lys lle Pro Ser Leu140 145 150Ala Glu Leu Gln Met Ser lle Gly Asp Leu Gly Tyr Glu Val lle155 160 165Val Val Asp Tyr Lys Phe Asp Asn Ala Leu Gln Glu Met Lys Glu170 175 180Val Ala Glu Cys Cys Leu Leu Gly Cys Pro Asp lle The Val Leu185 190 195Val Arg Arg lle Ala Glu Val Val Ala Asp His Met Gly Gly Pro200 205 210Val lle Asp Ala Asn Glu Met lle The Arg Trp Leu Ser Lys Ser215 220 225lle Glu Gln Arg The Ser His Gln The Ser Leu Leu His lle Gly230 235 240Ser lle Glu lle Gly Leu Ser Arg His Arg Ala Leu Leu Phe Lys245 250 255lle Leu Ala Asp lle Val Gly lle Pro Cys Lys Leu Val Lys Gly260 265 270Ser His Tyr The Gly Val Glu Asp Asp Ala lle Asn lle lle Lys275 280 285
Met Asp Asp Lys Arg Glu Phe Leu Val Asp Val Met Ala Ala Pro290 295 300Gly The Leu lle Pro Ala Asp Val Phe Asn Ser Lys Gly The Pro305 310 315Phe Asn Phe Ser Gln The Leu Gly Gln Asn Gln Val Val Glu Ser320 325 330Ala Ser Asn lle Glu Asp Asp Pro Val Ala Leu Gln Ser Glu His335 340 345Lys Arg Asn Gln Gly His Met Phe Ala Asn Asn Asn Arg lle Ser350 355 360Val Asn Leu Ser Ser Tyr Glu Asn The Met The Ala Gly Ser Ser365 370 375Ala Ser Glu Pro Gly The Leu Asp Pro Arg Met Gln Leu Gly Lys380 385 390The Ser The Leu Pro Ser Ala Pro Ser Lys Gln Lys Lys Asn Leu395 400 405Gln Leu lle The Asp Ser His Glu The Glu Glu Ser Arg Lys Leu410 415 420Phe Val Glu Leu Asp Pro Phe Asn Ala lle Glu Ser Gly Lys Ser425 430 435Ser Leu Ala Phe Lys Gly Leu Asn Asn Arg Asn Asn Glu Phe Gln440 445 450Arg Arg Arg Glu Asn Val Val Pro Pro Ser Val Arg Ser Gln Gln455 460 465Pro Leu Val Met Lys Asn Trp Ser Ala Cys Asn Asp lle Ser Asn470 475 480Asn Lys Gln Tyr Asn Val Ala Asp Gly Ser Val Pro Arg Arg Asn485 490 495Ala The Asp Asn Ala Ser Ser Ser Gln Leu Ala Leu Ser The Ala500 505 510Lys His Tyr Asn Ser Asn Val Arg Glu Leu Asn Asp Arg Val Tyr515 520 525Ala Ala Pro Ala Arg Asn Tyr Asp Asn Lys lle Val Gly The Ser530 535 540Ala Met Ala Lys Ala Leu The Gly Glu Cys Pro Asp Arg Ser Gln545 550 555Val Pro Pro Gly Leu Tyr Tyr Asp Lys Met Leu Gly The Ser Ser560 565 570Met Asn Ala Ala Ser The Ser Gly lle Gly Lys Val Ala Glu Lys575 580 585Asp Pro His Asn Asp Pro Gly Lys Gly Pro lle Tyr Ser Arg Phe590 595 600Asp Gly Glu Leu Ser Lys Asn Ala Gln Gly Phe The Pro Glu Arg605 610 615
Asp Glu His Lys Glu Asn Cys Gly Ser His Asp His Lys Met Leu620 625 630Tyr Pro Asp Pro Arg Lys Ser Pro Leu Asp Arg Phe Met Asp Arg635 640 645Pro Arg Gln Ser lle Glu Cys Val Phe Pro Ser Gln Val Gly Ser650 655 660Asn Lys Ala Asp Met Val Leu Asp Glu Val Ser Glu Cys Glu lle665 670 675Leu Trp Glu Asp Leu Val lle Asp Glu Arg lle Gly lle Gly Ser680 685 690Tyr Gly Glu Val Tyr His Ala Asp Trp Asn Gly The Glu Val Ala695 700 705Val Lys Lys Phe Leu Asp Gln Glu Phe Tyr Gly Asp Ala Leu Glu710 715 720Glu Phe Arg Cys Glu Val Arg lle Met Arg Arg Leu Arg His Pro725 730 735Asn lle Val Leu Phe Met Gly Ala Val The Arg Pro Pro His Leu740 745 750Ser lle Val Ser Glu Tyr Leu Pro Arg Gly Ser Leu Tyr Lys lle755 760 765lle His Arg Pro Asn Cys Gln lle Asp Glu Lys Arg Arg lle Lys770 775 780Met Ala Leu Asp Val Ala Arg Gly Met Asn Cys Leu His The Ser785 790 795Val Pro The lle Val His Arg Asp Leu Lys Ser Pro Asn Leu Leu800 805 810Val Asp Asp Asn Trp The Val Lys Val Cys Asp Phe Gly Leu Ser815 820 825Arg Leu Lys His Ser The Phe Leu Ser Ser Lys Ser The Ala Gly830 835 840The Pro Glu Trp Met Ala Pro Glu Val Leu Arg Asn Glu Gln Ser845 850 855Asn Glu Lys Cys Asp lle Tyr Ser Phe Gly Val lle Leu Trp Glu860 865 870Leu Ala The Leu Arg Lys Pro Trp His Gly Met Asn Gln Met Gln875 880 885Val Val Gly Ala Val Gly Phe Gln Asp Arg Arg Leu Asp lle Pro890 895 900Lys Glu Val Asp Pro lle Val Ala Ser lle lle Arg Asp Cys Trp905 910 915Gln Lys Asp Pro Asn Leu Arg Pro Ser Phe lle Gln Leu The Ser920 925 930Tyr Leu Lys The Leu Gln Arg Leu Val lle Pro Ser His Gln Glu935 940 945The Ala Ser Asn His Val Pro Tyr Glu lle Ser Leu Tyr Arg950 955 959
權(quán)利要求
1.一種小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1，其特征是TaEDR1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其核苷酸序列的堿基組成896 a630 c758 g766 t1cgccaaactg aaataaccaa gagaggaaat attttcgaaa cccaaaccct aggtgctcgt61 ggggagcgcc atgaagatcc cgtttgtgac caagtggtcg caccgatcca gcgagcccgc121 ggggccgtcg aattcggctg cagcgcagca gcagcagcag cagcaggcgc cgtctcctcc181 tcctcccgtg gcgtcgacag aggcggcagg ggatgagttc attctgcagg aggaagagta241 ccagatgcaa ctggcgttgg cgctatcagc gtcggcgtcg ggcgccgagg gcgctgggga301 tcccgacggg gagcagatca gaaaggcgaa gctgatgagc ctcgggaagg gccacccggt361 caccaacagc gatcgtggcg ggggagacac cccggagtcg ctctcccgcc gttacaggga421 ctataacttt cttgattaca atgagaaagt aattgatgga ttctacgacg tatttggcct481 ctctgcggga tcatctgggc agggcaaaat accttcactg gcagagcttc agatgagcat541 tggggatctt ggatatgaag taattgtggt tgactataaa tttgataatg ctctgcagga601 gatgaaggaa gtagcagaat gctgcctgtt gggctgtcct gacattacag tattggtgcg661 acgaatagct gaagttgttg cagatcacat gggtggtcca gtgatcgatg caaatgaaat721 gatcactagg tggttgagca aaagcattga gcagaggaca tcacaccaga caagccttct781 gcatattggc agtatagaga taggcttgtc tcgccatcgt gccttacttt tcaagattct841 tgctgatatt gttggtatcc cttgcaagct ggttaaaggg agtcattaca ctggtgttga901 agatgacgct attaacataa taaagatgga tgacaaaagg gagtttttgg tggatgttat961 ggctgctcca gggactctca ttccagcaga tgtctttaat tcaaagggta ctccattcaa1021 cttcagtcaa acattgggtc agaatcaggt ggtggagtca gcaagtaaca tcgaagatga1081 cccagttgca ttacagtcag agcataaacg taaccaaggg catatgtttg ccaataataa1141 tcggatctca gtcaatctat caagctatga gaatacaatg accgctggaa gtagtgctag1201 tgaacctggg acattggacc ctaggatgca attaggtaaa acatcaactt tgcctagtgc1261 tccttccaag cagaagaaga atctgcaatt gattacagac tctcatgaaa ctgaagagtc1321 ccgaaaacta tttgtggagt tagatccttt caatgctatt gaatctggga aaagctcatt1381 ggcattcaag ggattaaata atagaaacaa tgaattccaa aggcgtagag agaatgtagt1441 cccaccatct gtaagatctc aacagccatt ggtgatgaaa aactggtctg cttgcaatga1501 catttccaac aacaagcaat acaatgttgc tgatgggtca gttcctcgga gaaatgccac1561 tgacaatgca tcgtcatctc agttggcgtt gtcaactgca aagcattaca attccaatgt1621 tagagagcta aacgatagag tgtatgcagc acctgctcgt aattatgaca acaagatagt1681 tggtacctcg gctatggcca aagcattgac tggagagtgc cctgacagat cacaggtgcc1741 acctggtctt tattatgaca agatgcttgg tacctcttct atgaatgcag cttctacatc1801 cggaatcggg aaagttgcag aaaaggaccc tcataatgat ccgggaaaag gtcccatcta1861 ttctagattt gatggtgaac tttctaaaaa tgctcaagga tttactcccg aaagggatga1921 gcacaaggaa aattgtggca gtcatgacca caaaatgtta tatcctgatc caagaaagtc1981 ccctcttgac agattcatgg acaggccaag gcagagcata gaatgtgttt ttccatccca2041 agttggatca aataaggctg acatggtgtt ggatgaagtg tctgaatgtg aaatcctttg2101 ggaagatctt gtaatcgatg aaagaattgg cataggttca tatggagaag tctaccatgc2161 tgattggaat ggaactgaag tagctgtaaa gaagttcttg gatcaagagt tctatggtga2221 tgctttagag gaatttcgtt gtgaagtgag gattatgcgt cggctccgtc atccaaatat2281 tgttctcttt atgggtgcag taacacggcc tccacactta tctattgtat cagaatatct2341 tccaagggga agcttatata agatcattca tcgccctaat tgccaaatcg acgagaagcg2401 taggattaaa atggcccttg atgtggccag aggcatgaat tgtcttcata ccagtgtacc2461 aacaattgtt caccgggatc taaaatcacc aaacttgctg gttgacgata attggactgt2521 gaaggtctgt gatttcggac tttcacgtct gaagcacagt acatttttgt catcaaaatc2581 cactgccggg actcctgagt ggatggcacc agaggttttg cggaatgagc aatccaatga2641 gaagtgtgat atttacagct ttggtgttat cctgtgggag ctagcaacac taagaaagcc2701 atggcatggg atgaaccaaa tgcaagttgt gggcgcagtt ggcttccagg accgacggct2761 tgacattcca aaagaagtag atcctatagt tgcatcaatt atacgtgatt gctggcagaa2821 ggatccaaac ttgcgtcctt ctttcatcca attaactagc tacctgaaga cattgcaaag2881 gcttgtaatc ccttcacatc aggagacagc gagcaaccat gtaccctatg aaatatcttt2941 atatcggtga accgcacatc tctaccccgg ggttgtcacc caccaagtgt gaataagcag3001 taattatgat tttgtcatcg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
2.一種權(quán)利要求1所述的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼的蛋白，其氨基酸序列為1 MKIPFVTKWS HRSSEPAGPS NSAAAQQQQQ QQAPSPPPPV ASTEAAGDEF ILQEEEYQMQ61 LALALSASAS GAEGAGDPDG EQIRKAKLMS LGKGHPVTNS DRGGGDTPES LSRRYRDYNF121 LDYNEKVIDG FYDVFGLSAG SSGQGKIPSL AELQMSIGDL GYEVIVVDYK FDNALQEMKE181 VAECCLLGCP DITVLVRRIA EVVADHMGGP VIDANEMITR WLSKSIEQRT SHQTSLLHIG241 SIEIGLSRHR ALLFKILADI VGIPCKLVKG SHYTGVEDDA INIIKMDDKR EFLVDVMAAP301 GTLIPADVFN SKGTPFNFSQ TLGQNQVVES ASNIEDDPVA LQSEHKRNQG HMFANNNRIS361 VNLSSYENTM TAGSSASEPG TLDPRMQLGK TSTLPSAPSK QKKNLQLITD SHETEESRKL421 FVELDPFNAI ESGKSSLAFK GLNNRNNEFQ RRRENVVPPS VRSQQPLVMK NWSACNDISN481 NKQYNVADGS VPRRNATDNA SSSQLALSTA KHYNSNVREL NDRVYAAPAR NYDNKIVGTS541 AMAKALTGEC PDRSQVPPGL YYDKMLGTSS MNAASTSGIG KVAEKDPHND PGKGPIYSRF601 DGELSKNAQG FTPERDEHKE NCGSHDHKML YPDPRKSPLD RFMDRPRQSI ECVFPSQVGS661 NKADMVLDEV SECEILWEDL VIDERIGIGS YGEVYHADWN GTEVAVKKFL DQEFYGDALE721 EFRCEVRIMR RLRHPNIVLF MGAVTRPPHL SIVSEYLPRG SLYKIIHRPN CQIDEKRRIK781 MALDVARGMN CLHTSVPTIV HRDLKSPNLL VDDNWTVKVC DFGLSRLKHS TFLSSKSTAG841 TPEWMAPEVL RNEQSNEKCD IYSFGVILWE LATLRKPWHG MNQMQVVGAV GFQDRRLDIP901 KEVDPIVASI IRDCWQKDPN LRPSFIQLTS YLKTLQRLVI PSHQETASNH VPYEISLYR
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼的蛋白，其特征是小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1所編碼的蛋白，其基因編碼的是一個(gè)促分裂原蛋白激酶激酶激酶，包括N-端序列和C-端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域2大部分。
4.小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在植物抗病改良中的應(yīng)用。
5.小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在合成新的抗病相關(guān)基因中的應(yīng)用。
6.小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1在小麥基因芯片制作中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1及其應(yīng)用。本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1是從對(duì)白粉病抗性程度很高的小麥抗病新品系“99－2439”中分離的，該基因全長(zhǎng)cDNA為3050bp，包括70bp的5′－非編碼區(qū)，70bp的3′－非編碼區(qū)，2877bp的編碼區(qū)，終止子，和30bp的多聚腺苷酸尾，3′－非編碼區(qū)包含1個(gè)典型的加尾信號(hào)序列，該基因所編碼的蛋白是一個(gè)全長(zhǎng)由959個(gè)氨基酸組成的促分裂原蛋白激酶激酶激酶。本發(fā)明的小麥抗病相關(guān)基因TaEDR1可以應(yīng)用在植物抗病改良上、合成新的抗病相關(guān)基因上以及小麥基因芯片制作上，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1757730SQ20051001780
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月20日
發(fā)明者牛吉山, 郭天財(cái), 張麗娜, 王映紅, 洪德峰 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)