專利名稱：精神分裂癥關(guān)聯(lián)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個與精神分裂癥有顯著關(guān)聯(lián)的易感基因。
背景技術(shù)：
精神分裂癥是最嚴重的精神疾病之一。在我國，精神分裂癥的終身患病率高達0.7％。這樣大的患病群體，不僅給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔，而且還嚴重威脅社會的安全與穩(wěn)定。因此，確定精神分裂癥的病因，建立有效地防治方法，已成為醫(yī)學界乃至整個社會需迫切解決的問題。精神分裂癥與遺傳因素有密切關(guān)系，且歸類于多基因遺傳病。人類基因組系統(tǒng)掃描發(fā)現(xiàn)，除19號、21號和Y染色體外，其余染色體上都可能含有精神分裂癥易感基因。利用連鎖和關(guān)聯(lián)方法定位精神分裂癥的易感基因已成為分子遺傳學研究的熱點。StraubRE等最早報道6p區(qū)域可能存在精神分裂癥易感基因(Straub RE，et al.NatGenet，1995，11287-293)。Schwab SG等人亦發(fā)現(xiàn)在10號和6號染色體存在精神分裂癥易感基因(Schwab SG，et al.Mol Psychiatry，2000，5638-649)。但至今在該染色體區(qū)域內(nèi)未發(fā)現(xiàn)確定特異的與精神分裂癥有關(guān)的易感基因。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是在第6號染色體區(qū)域內(nèi)揭示精神分裂癥關(guān)聯(lián)基因；目的之二是通過該易感基因遺傳特性提出一種判定精神分裂癥的易感人群的方法，以利于指導(dǎo)精神分裂癥的預(yù)防和治療。
本研究結(jié)果表明PPARD是精神分裂癥的易感基因，序列長度為85569bp。由于該位點的單核苷酸多態(tài)性rs2076169堿基T突變?yōu)镃，從而與精神分裂癥的易感性相關(guān)聯(lián)。PPARD基因位于6p21.1染色體區(qū)域，由這個基因所編碼的蛋白是過氧化物酶激活型增殖體受體(PPAR)家族的一個成員。PPARs是核激素受體，結(jié)合過氧化物酶增殖體通過細胞控制過氧化物酶體的大小和數(shù)量。PPARs介導(dǎo)多種生物反應(yīng)過程，并且可能參與幾種慢性疾病的發(fā)生，包括糖尿病、肥胖、動脈硬化以及癌癥。這個蛋白是PPAR-δ和PPAR-γ配體介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性的有效抑制劑，它的功能可能是作為轉(zhuǎn)錄抑制和核受體信號的綜合體。在結(jié)腸癌細胞中發(fā)現(xiàn)PPARD基因表達升高，這種表達升高可以被APC(adenomatosis polyposis coli)所抑制，APC是一種腫瘤抑制蛋白與APC/beta信號通路有關(guān)。小鼠的基因敲除實驗表明，PPARs對胼胝體的髓鞘形成、脂質(zhì)代謝和表皮細胞的增殖均起重要作用。
本發(fā)明在6p21區(qū)通過連鎖不平衡分析方法進行單個核苷酸多態(tài)性(SNP)連鎖不平衡制圖分析，通過NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)數(shù)據(jù)庫，獲得6p21內(nèi)所有侯選基因，并獲得PPARD基因序列。通過http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http//snp.cshl.org/數(shù)據(jù)庫，在PPARD基因上選擇含有限制性酶切位點的單核苷酸多態(tài)性rs2076169。下列所示為這個單核苷酸多態(tài)性的核苷酸序列。加黑部分分別為引物序列，方框內(nèi)是發(fā)生互換的堿基，劃線處則是Hinf I限制性內(nèi)切酶識別的酶切位點，箭頭所示內(nèi)切酶的切割部位。具體信息如下。SNPrs2076169 Gene bank accession numberAY442342，Base changeC/TGGTAACATAAGATTGTCTCACGGCTAACTTGATTTCTTCATAAATGTATCTGGTTCTGTGTATTTGTGAGGTGGTGATTCAATAAAATAATCTGTGA TGATGGGTGTGAAGTTAGGAAGGACCCACAAATATCACTGGAAAAACAAATGTCTGTCCTTTTTTCTCAGAGCCCGCTTTGAGCCTTGAGAAACAAGAAACCCAGACCTCAGGTAAGACGATGGCTCAGCC以中國東北地區(qū)255個漢族精神分裂癥患者和他們健康父母雙親組成的核心家系(Trios)為研究對象?；颊呔?000-2004年間入院，按國際疾病分類標準第10版(ICD-10)被診斷為精神分裂癥。這種基于家系的研究，系以父母雙親傳遞給患病子女的等位基因為“病例”，以未傳遞的等位基因為“對照”。因病例與對照等位基因均來自同樣的基因池，可避免人群層化問題。
家系成員均由外周靜脈抽取抗凝血5ml，用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl，加入到1.5ml離心管中，然后加入100ul的1×TE緩沖液，搖勻；②一邊振蕩，一邊加入200μl的B1試劑，充分混勻；③在振蕩中加入200μl的B2試劑，充分混勻；④將混合溶液移入旋轉(zhuǎn)離心柱中離心(14000rpm，分鐘)；⑤向旋轉(zhuǎn)離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm，1分鐘)；⑥重復(fù)上述步驟；⑦空柱離心(14000rpm，2分鐘)，將旋轉(zhuǎn)離心柱移入干凈的1.5ml離心管中，加入100μl的B4試劑離心(14000rpm，1分鐘)；此時離心管中的溶液體積為100μl，含有已經(jīng)提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產(chǎn)的型號為Du640紫外分光光度儀，分別取波長260nm、280nm兩個波段，測得其相應(yīng)DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通過公式，計算出DNA含量，公式為DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數(shù)，另外通過公式計算出DNA純度，公式為DNA純度＝OD260nm/OD280nm。
依據(jù)相應(yīng)的堿基序列合成引物。rs2076169為GGTAACATAAGATTGTCTCACGG和GGCTGAGCCATCGTCTTACCTG。PCR反應(yīng)體系為20μl，其中含10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of each dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR擴增條件為①94℃5min②96℃45s，60℃60s，72℃60s 3個循環(huán)；③95℃45s，58℃60s，72℃60s 5個循環(huán)；④94℃45s，56℃60s，72℃60s 32個循環(huán)；⑤72℃10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，以DNAmarker DL2000為分子量標準品。所擴增的片段長度為233bp。
在PCR擴增后的反應(yīng)體系中，加入適量相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶及其酶切緩沖液，置37℃溫箱5小時。經(jīng)3.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型，其中有完全切開的純合基因型，未切開的純合基因型，既有切開又有未切開的雜合基因型。
建立Pedigree和SPSS SNP基因分型數(shù)據(jù)庫(參見表1和表2)，應(yīng)用擬合優(yōu)度卡方檢驗和傳遞不平衡檢驗，應(yīng)用UNPHASED分析軟件進行單倍體傳遞卡方檢驗，利用SPSS軟件管理數(shù)據(jù)。
表1 Pedigree數(shù)據(jù)庫格式
表2 SPSS數(shù)據(jù)庫格式
傳遞不平衡檢驗(Transmitted disequi1ibrium test，TDT)顯示SNP rs2076169與精神分裂癥顯著關(guān)聯(lián)(x2＝14.961，P＝0.00011)。在233個家系466個父母中，154個為雜合子，而這些雜合父母分別將101個C等位基因和53個T等位基因傳遞給患病子女(參見表3)。由于C等位基因傳遞過多，說明含C等位基因的單倍體或染色體可能攜帶決定精神分裂癥易感性的突變位點。
表3 PPARD基因與精神分裂癥的關(guān)系
注傳遞等位基因指雜合父母傳遞給患病子女的等位基因數(shù)目根據(jù)本發(fā)明由PPARD基因堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法，可對未表現(xiàn)精神分裂癥臨床癥狀的人群進行如下所示方法的篩查，rs2076169堿基為C的個體為精神分裂癥的易感人群。Rs2076169堿基為T的個體不易發(fā)生精神分裂癥。對精神分裂癥易感人群在日常生活中應(yīng)盡量減少誘發(fā)因素，如環(huán)境因素的刺激，可降低精神分裂癥的發(fā)病率。這是本發(fā)明的一個重要用途。
根據(jù)本發(fā)明，對精神分裂癥的患者可采用如基因敲除等基因工程方法針對性進行基因治療。另外，疾病基因的存在有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能的缺損或改變，阻礙或干擾特定生化通路中生物大分子的相互作用。正因為PPARD基因的堿基突變，可能造成蛋白質(zhì)表達及功能異常。本發(fā)明為進一步檢測蛋白功能，開發(fā)新型治療藥物，開展基于遺傳學背景的個體化藥物治療奠定了十分重要的基礎(chǔ)，并將帶來十分可觀的社會與經(jīng)濟效益。
具體實施例方式
通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態(tài)性rs2076169的基因型分析，其rs2076169堿基為C的個體為精神分裂癥的易感人群。
1.基因組DNA提取受試者均由外周靜脈抽取抗凝血5ml，用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl，加入到1.5ml離心管中，然后加入100ul的1×TE緩沖液，搖勻；②一邊振蕩，一邊加入200μl的B1試劑，充分混勻；③在振蕩中加入200μl的B2試劑，充分混勻；④將混合溶液移入旋轉(zhuǎn)離心柱中離心(14000rpm，分鐘)；⑤向旋轉(zhuǎn)離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm，1分鐘)；⑥重復(fù)上述步驟；⑦空柱離心(14000rpm，2分鐘)，將旋轉(zhuǎn)離心柱移入干凈的1.5ml離心管中，加入100μl的B4試劑離心(14000rpm，1分鐘)；此時離心管中的溶液體積為100μl，含有已經(jīng)提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產(chǎn)的型號為Du640紫外分光光度儀，分別取波長260nm、280nm兩個波段，測得其相應(yīng)DNA的OD260nm及OD280nm值，然后再通過公式，計算出DNA含量，公式為DNA含量＝50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數(shù)，另外通過公式計算出DNA純度，公式為DNA純度＝OD260nm/OD280nm。
2.PCR擴增目的片段應(yīng)用以下引物序列GGTAACATAAGATTGTCTCACGG和GGCTGAGCCATCGTCTTACCTG進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為20μl，其中含10mMTris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mMMgCl2，0.001％(w/v)gelatin，200μM of dNTP，上下游引物各0.4μM，Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U，DNA模板30-50ng。PCR擴增條件為①94℃5min②96℃45s，60℃60s，72℃60s 3個循環(huán)；③95℃45s，58℃60s，72℃60s 5個循環(huán)；④94℃45s，56℃60s，72℃60s 32個循環(huán)；⑤72℃10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，以DNAmarker DL2000為分子量標準品。所擴增的片段長度為233bp。
3.限制性內(nèi)切酶酶切鑒定基因型酶切的反應(yīng)體系為20μl，其中，10μl PCR產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶Hinf I 0.7μl，酶切緩沖液2μl，BSA 0.2μl。置37℃溫箱5小時。經(jīng)3.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型，其中有完全切開的純合基因型(C/C)，未切開的純合基因型(T/T)，既有切開又有未切開的雜合基因型(C/T)。
4.結(jié)果判定rs2076169堿基為C的個體為精神分裂癥的易感人群。Rs2076169堿基為T的個體不易發(fā)生精神分裂癥。
權(quán)利要求
1.一個精神分裂癥關(guān)聯(lián)基因，是序列長度為85569bp的PPARD基因，由于該基因的單核苷酸多態(tài)性rs2076169堿基T突變?yōu)镃，從而與精神分裂癥的易感性相關(guān)聯(lián)。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的PPARD基因堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法，其特征是通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態(tài)性rs2076169的基因型分析，其rs2076169堿基為C的個體為精神分裂癥的易感人群，具體作法是(1)基因組DNA提取，用微量DNA提取試劑盒提取基因組DNA；(2)PCR擴增目的片段，引物序列為GGTAACATAAGATTGTCTCACGG和GGCTGAGCCATCGTCTTACCTG；(3)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定基因型，酶切的反應(yīng)體系為20μl，其中，10μl PCR產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶HinfI 0.7μl，酶切緩沖液2μl，BSA 0.2μl，置37℃溫箱5小時，經(jīng)3.5％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型；(4)結(jié)果判定，rs2076169堿基為C的個體為精神分裂癥的易感人群，rs2076169堿基為T的個體不易發(fā)生精神分裂癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一個與精神分裂癥的發(fā)生密切相關(guān)的精神分裂癥關(guān)聯(lián)基因，即序列長度為85569bp的PPARD基因。由于該基因的單核苷酸多態(tài)性rs2076169堿基T突變?yōu)镃，從而與精神分裂癥的易感性相關(guān)聯(lián)。rs2076169堿基為C的個體為精神分裂癥的易感人群，rs2076169堿基為T的個體不易發(fā)生精神分裂癥。PPARD基因及其編碼蛋白對闡明精神分裂癥遺傳學機制及建立基因診斷方法，指導(dǎo)精神分裂癥預(yù)防、開發(fā)新型治療藥物具有重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1727478SQ20051001688
公開日2006年2月1日 申請日期2005年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月16日
發(fā)明者鞠桂芝, 尉軍, 孫世龍, 劉樹錚, 于雅琴, 史杰萍, 謝林, 張萱, 郭英君, 許琪 申請人:吉林大學