專利名稱：一種植物轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因方法，尤其涉及一種將目的基因轉(zhuǎn)至受體植物的方法。
背景技術(shù)：
利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以沖破物種的界限，實(shí)現(xiàn)物種間的基因傳遞，并能改良現(xiàn)有物種的生物性狀，最大限度為人類服務(wù)。不僅如此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)還提供了科學(xué)的研究手段，使人類科技實(shí)現(xiàn)新的飛躍成為可能。但植物轉(zhuǎn)基因方法有很多種，在進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因時(shí)應(yīng)選擇什么方法才最有效，這是一個(gè)十分關(guān)鍵的問(wèn)題。目前用于外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法和技術(shù)很多，總的來(lái)說(shuō)可分為直接和間接法。
1.DNA直接導(dǎo)入法。DNA直接導(dǎo)入法可分為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、微注射法、基因槍法(微彈轟擊法)和花粉管通道法等等。DNA直接導(dǎo)入法用得最多的植物材料是原生質(zhì)體，另外可用植物材料包括器官分生組織、未成熟的胚、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、花粉、卵細(xì)胞等等。
1.1化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法現(xiàn)在用得最多的物質(zhì)是聚乙二醇，它能與原生質(zhì)體融合，影響原生質(zhì)體膜的通透性，致使原生質(zhì)體較好地吸收外源DNA。一般PEG濃度較低時(shí)，不會(huì)對(duì)原生質(zhì)體造成傷害，而獲得的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)自同1個(gè)細(xì)胞，避免了產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性和重復(fù)性好，但對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)和再生困難的植物難以利用，且轉(zhuǎn)化率低，一般在10-5～10-6。
1.2.電穿孔是植物細(xì)胞膜在外界高壓電脈沖下造成的非對(duì)稱穿孔，這種孔孔徑較小(8.4nm左右)，并可在很短時(shí)間內(nèi)(200ns)恢復(fù)到0.5nm，因此外源基因可以進(jìn)入細(xì)胞。電穿孔法對(duì)細(xì)胞沒(méi)有害處，但需要有特殊的設(shè)備，對(duì)不同的材料需要有嚴(yán)格的參數(shù)控制。由于對(duì)原生質(zhì)體再生的依賴，在應(yīng)用上也受到了很大的限制。
1.3.脂質(zhì)體法就是將包含外源基因的帶負(fù)電的脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)體融合，從而達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。
1.4.微注射法是使用毛細(xì)管(一般針尖的直徑為0.5nm)，在顯微鏡下將外源DNA注射入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的一種直接轉(zhuǎn)化方法。
1.5.基因槍法又稱高速微彈法或微彈轟擊法，即用鎢或金粒(直徑1～2μm)包裹外源DNA，而后以一定的方法加速這種微粒去穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使外源DNA能進(jìn)入到植物細(xì)胞中?；驑尫ㄔ谑褂眠^(guò)程中有它的局限性，如轉(zhuǎn)化效率不高，基因插入往往是多拷貝的，常造成轉(zhuǎn)基因的失活或沉默，轟擊過(guò)程中可能造成外源基因的斷裂，使插入的基因成為沒(méi)有活性的片段，出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化體或嵌合體的可能性較高，可能導(dǎo)致植物本身的某些基因非正常表達(dá)，還有可能發(fā)生共抑制現(xiàn)象。
2.載體介導(dǎo)法2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前雙子葉植物基因轉(zhuǎn)移的常用方法。它是利用根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上的一段T-DNA區(qū)在農(nóng)桿菌侵染植物形成腫瘤的過(guò)程中，T-DNA可以被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并插入到染色體基因組中。用Ti質(zhì)粒的這一天然的遺傳轉(zhuǎn)化特性，可將外源基因置換T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受體染色體而獲得穩(wěn)定的表達(dá)。根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒Ti轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前研究最多、技術(shù)方法相對(duì)成熟的轉(zhuǎn)化途徑。但長(zhǎng)期以來(lái)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移都局限在雙子葉植物范圍內(nèi)。直到近年來(lái)，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物才取得了重大突破。
2.2病毒介導(dǎo)法病毒載體是最近新出現(xiàn)的一種用于植物轉(zhuǎn)化的載體。植物病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)是將外源基因插入到病毒基因組中，通過(guò)病毒對(duì)植物細(xì)胞的感染而將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞。病毒載體比較小，便于在實(shí)驗(yàn)中操作，而且這類載體只要與植物細(xì)胞共培養(yǎng)就可以較高地感染植物細(xì)胞，外源基因能在植物細(xì)胞中快速?gòu)?fù)制和高水平表達(dá)。但是病毒載體的容量有限，不能包裝大片段的外源DNA基因，寄主范圍窄，復(fù)制穩(wěn)定性差，轉(zhuǎn)錄和復(fù)制機(jī)理復(fù)雜。故至今還沒(méi)有確定的證據(jù)表明，植物病毒是否可以整合進(jìn)植物細(xì)胞的基因組中。有人認(rèn)為轉(zhuǎn)入的外源基因穩(wěn)定遺傳的可能性不大。因此，目前植物病毒載體系統(tǒng)還未得到廣泛使用。
3.其他方法 除上述的一些主要方法外，還有離子束介導(dǎo)法、超聲波介導(dǎo)法、激光微束穿孔法、萌發(fā)種子的電泳法、花粉管通道和種子浸泡法等。它們各有其優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍，對(duì)于特定的植物或在一定的條件下被證明是有效的。
DNA直接導(dǎo)入法，對(duì)于穩(wěn)定的植物或在一定的條件下被證明是有效的，但它的一個(gè)主要不足之處是存在多變的DNA整合方式，DNA直接導(dǎo)入法導(dǎo)入外源基因的拷貝數(shù)較多，轉(zhuǎn)入頻率低。而多拷貝的外源基因在受體植物基因組上的排列方式大多是串聯(lián)，遺傳性狀的表現(xiàn)形式是單個(gè)基因，有時(shí)，多拷貝的外源基因可散布在受體植物基因組的不同位點(diǎn)，使整合方式非常復(fù)雜，也為確定有效的整合帶來(lái)困難。這些變化或修飾發(fā)生的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于土壤農(nóng)桿菌的載體介導(dǎo)法。自1993年以來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化在一些重要的禾谷類作物上相繼獲得成功，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法有著明顯的優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)入的外源基因多是單拷貝或低拷貝數(shù)插入，并且先插入活性區(qū)域，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)入的外源基因通常呈預(yù)期的孟德?tīng)栠z傳，轉(zhuǎn)化再生的植株通常是可育的，而且方法簡(jiǎn)單、有效。因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化愈來(lái)愈成為各種植物轉(zhuǎn)基因的主要方法，已得到廣泛應(yīng)用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的受體包括幼胚、幼胚產(chǎn)生的愈傷組織、莖、葉、莖尖分生組織、子葉節(jié)等。
上述的方法都依賴于組織培養(yǎng)，都需要建立一套植株高頻再生的體系，這樣，有很多種材料存在基因型依賴，很多種植物和品種無(wú)法成功建立這個(gè)體系，也就無(wú)法用這些技術(shù)做轉(zhuǎn)化。這些方法的很多工作要在試驗(yàn)室操作，需要一定條件支持。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種不依賴組織培養(yǎng)的新的植物轉(zhuǎn)基因方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的先在植株臨近受精后形成的合子胚的子房部位造成創(chuàng)傷；再用農(nóng)桿菌浸染傷口，讓農(nóng)桿菌內(nèi)的基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化活體植株上的合子期幼胚；轉(zhuǎn)化的幼胚在活體植株上長(zhǎng)大成種子；對(duì)種子進(jìn)行篩選，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。
具體可采用以下步驟進(jìn)行1、將欲轉(zhuǎn)化的受體植物培育至開(kāi)花；2、在轉(zhuǎn)化操作之前，將含有基因載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化用共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸至0.D600＝0.5-1.5濃度，作為轉(zhuǎn)化菌液；3、在受體植物受精后合子期使子房上端造成創(chuàng)傷；4、將轉(zhuǎn)化菌液與子房上傷口處接觸，與子房在植株上共培養(yǎng)；5、看護(hù)，培育至長(zhǎng)成種子；6、收獲種子，對(duì)種子進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明不用組織培養(yǎng)，不依賴基因型，不依賴實(shí)驗(yàn)室條件，適用于各種授粉結(jié)實(shí)、子房可以人為創(chuàng)傷的植物，包括禾本科的玉米、稻、麥；豆科的大豆、豌豆、豇豆、蠶豆、綠豆、小豆、菜豆；茄科的蕃茄、茄子、辣椒；葫蘆科的黃瓜、西瓜、南瓜、冬瓜；十字花科的蘿卜、油菜、白菜、甘藍(lán)、芥菜、蕪箐以及棉花可以對(duì)子房進(jìn)行人工創(chuàng)傷處理的植物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明在具體應(yīng)用時(shí)，根據(jù)受體植物的不同，采用不同方法使子房造成創(chuàng)傷，并根據(jù)花器特點(diǎn)用涂、抹、沾、滴等不同方法使轉(zhuǎn)化菌液與子房上傷口處接觸。對(duì)種子進(jìn)行篩選時(shí)，根據(jù)所用載體含有的篩選基因，對(duì)種子苗在培養(yǎng)基上或營(yíng)養(yǎng)缽中篩選，選擇劑初選后，用PCR、Southern blot篩選鑒定。下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明實(shí)施例1玉米轉(zhuǎn)化。材料自交系8902；基因及載體半夏凝集素(PTA)pCAMBIA3300PTA，菌種EHA101。于春季種植玉米自交系8902，待長(zhǎng)至受粉期，上午10:00授粉，第二天下午4:00進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。操作前一天準(zhǔn)備菌液，從平板劃取單菌落，培養(yǎng)一夜，第二天操作前，用植物轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸，濃度0.D600＝1.0-1.5，作為轉(zhuǎn)化液。轉(zhuǎn)化時(shí)，先對(duì)雌穗進(jìn)行處理，剝開(kāi)包葉，將花絲，即花的雌蕊垂直由上至下從根扯斷，由上至下是指雌穗尖端至穗底部，然后用細(xì)毛刷蘸取菌液刷涂。之后，合上包葉，用塑料袋罩好，外再套上紙袋，秋季收獲種子。共得2255粒種子，播于小營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，一缽一粒，再將其置入能盛水的盤(pán)中，使?fàn)I養(yǎng)土一次浸透，等待發(fā)芽。發(fā)芽長(zhǎng)出兩片葉時(shí)，用Basta除草劑(載體含Bar基因)100-200ppm均勻噴灑，幾天后再噴一次，未轉(zhuǎn)化的苗死亡，最終獲得109株活苗，移栽于田間。待緩苗后，取葉片做PCR進(jìn)行進(jìn)一步鑒定篩選，從中獲得轉(zhuǎn)化株。
實(shí)施例2大豆轉(zhuǎn)化。材料大豆品種吉育25號(hào)；基因及載體pBI121pta.待長(zhǎng)至受粉期，上午8:00--10:00自花受粉，下午4:00進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作。操作前一天準(zhǔn)備菌液，從平板劃取單菌落，培養(yǎng)一夜，第二天操作前，用植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸，濃度0.D.600＝0.5-1.0，作為轉(zhuǎn)化液。用移液槍吸取菌液滴在子房傷口處，用棉花球蘸菌液蓋在操作的花序上，等待收獲。共得112粒種子，播于小營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，一缽一粒，再將其置入能盛水的盤(pán)中，使?fàn)I養(yǎng)土一次浸透。待萌發(fā)兩片真葉平展時(shí)，用卡那霉素(載體含NPTII基因)500ppm均勻噴灑，幾天后再噴一次，未轉(zhuǎn)化的苗死亡，最終獲得5株活苗，移栽于花盆中。待緩苗后，取葉片做PCR進(jìn)行進(jìn)一步鑒定篩選。從中獲得轉(zhuǎn)化株，Southern blot結(jié)果證明是陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于先在植株臨近受精后形成的合子胚的子房部位造成創(chuàng)傷；再用農(nóng)桿菌浸染傷口，讓農(nóng)桿菌內(nèi)的基因載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化活體植株上的合子期幼胚；轉(zhuǎn)化的幼胚在活體植株上長(zhǎng)大成種子；對(duì)種子進(jìn)行篩選，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化液是將含有基因載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化用共培養(yǎng)培養(yǎng)基重懸至O.D600＝0.5-1.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于將欲轉(zhuǎn)化的植物培育至開(kāi)花，待受精后合子胚期處理花器官，將子房上端造成創(chuàng)傷，使轉(zhuǎn)化液與子房上切口處接觸，與子房在植株上共培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于對(duì)于玉米植株的方法為剝開(kāi)雌穗包葉，使其子房暴露在外，垂直向下扯下花絲，用細(xì)毛刷蘸取菌液從上至下刷至穗底部，合上包葉，套上塑料袋，再套一紙袋，共培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于對(duì)于大豆植株的方法為用移液槍吸取菌液滴于子房傷口上，用棉花蘸菌液扣在操作花上，共培養(yǎng)。
全文摘要
一種植物轉(zhuǎn)基因方法，涉及一種植物轉(zhuǎn)基因方法，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化剛受精完畢而形成的合子胚；轉(zhuǎn)化的合子胚在植株上成熟為種子；對(duì)種子進(jìn)行篩選；獲得轉(zhuǎn)化子，本技術(shù)適合玉米、大豆、水稻等可對(duì)子房進(jìn)行操作的受粉結(jié)實(shí)植物。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是，不用組織培養(yǎng)，不依賴基因型，不依賴實(shí)驗(yàn)室條件，效率高。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1687424SQ20051001678
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者劉德璞, 袁鷹, 郝文媛, 鄭培和, 譚化, 董英山 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院