專利名稱：用igfbp2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法
(一)、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于動物分子遺傳學領(lǐng)域，特別是涉及一種用分子標記檢測雞體脂性狀的方法。
(二)、背景技術(shù)經(jīng)過多年對肉雞的科學選育，現(xiàn)代肉雞的生產(chǎn)性能有了顯著提高。但是，在肉雞早期生長速度得以明顯提高的同時，伴隨著出現(xiàn)的突出問題是腹脂沉積過多，肉仔雞體內(nèi)沉積過多的脂肪有諸多不利(1)明顯降低飼料轉(zhuǎn)化效率，因為沉積單位重量的脂肪組織比沉積單位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴體瘦肉對脂肪組織的比例，因而降低了分割肉產(chǎn)量；(3)加工者和消費者將肉仔雞體內(nèi)沉積的這些脂肪的很大一部分(腹脂墊、肌胃周圍脂肪、嗉囔脂肪及腸系膜脂肪等)丟棄，這不僅增加了加工者和消費者的負擔，而且增加了廢物及處理水中的脂肪含量，從而污染環(huán)境。由此看來，肉仔雞體內(nèi)沉積過多的脂肪將會給生產(chǎn)者、加工者和消費者造成顯而易見的經(jīng)濟損失。肉種雞過肥將會嚴重影響產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率，并且會誘導(dǎo)脂肪肝綜合癥的發(fā)生，從而加大了產(chǎn)蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在雞體內(nèi)的過多蓄積，進一步提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率和胴體質(zhì)量是我國急需研究解決的重大問題。
類胰島素生長因子結(jié)合蛋白II(Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2，IGFBP2)是循環(huán)系統(tǒng)中含量第二大的IGFBPs(Rajaram等，1997)，分子量大約在31-32KDa(Vivian等，1999)，具有廣泛的生物學功能，它能調(diào)節(jié)IGFs、TGFβ等生長因子的生物活性，還可能擁有自己的特異性受體直接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(Slootweg等，1995)。試驗表明，在生物體內(nèi)IGFBP2具有影響脂類代謝、調(diào)節(jié)體重等重要生理功能(Hoeflich等，1998；Brockmann等，2001)。
IGFBP2被多種細胞所分泌，存在于細胞外、細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)。完整的IGFBP2能與IGFs結(jié)合，但被蛋白酶水解之后，與IGFs的親和力會隨之降低(Hoeflich個人主頁)。IGFBP2對IGFs活性有抑制作用，由于與IGF2的親和力遠大于IGF1(Rajaram等，1997)，所以對IGF2的抑制作用更強一些。IGFs和TGFβ是刺激脂肪前體細胞增殖分化的調(diào)節(jié)因子(Butterwith等，1991)，IGFBP2可以調(diào)節(jié)IGFs(Rajaram等，1997)和TGF β(Richardson等，1998)在脂肪組織的活性，間接影響脂肪細胞的增殖。據(jù)報道，人的IGFBP2血漿含量與體重、腹脂重呈負相關(guān)(P＜0.05)(Brockmann等，2001)。同時發(fā)現(xiàn)，IGFBP2血漿含量與瘦素(Leptin)血漿含量呈負相關(guān)(P＜0.05)，Leptin是脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)因子，影響脂肪沉積，可見IGFBP2對脂肪代謝有影響，但IGFBP2與Leptin之間的具體作用機制還不清楚。在生長激素超量表達的小鼠中，通過轉(zhuǎn)基因的方法使IGFBP2超量表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的腹脂降低(P＝0.08)(Hoeflich等，2001)；對小鼠IGFBP2的血漿含量研究發(fā)現(xiàn)，低脂小鼠血漿IGFBP2的相對含量明顯高于肥胖小鼠，IGFBP2相對含量與脂肪重呈負相關(guān)(Brockmann等，2001)，這一結(jié)果與在人上的研究結(jié)果相似。
雞IGFBP2的cDNA是從胚胎的視網(wǎng)膜中克隆得到的(Schoen等，1995)，其前體蛋白包含311個氨基酸殘基組成，除去36個殘基的信號肽，成熟蛋白為275個氨基酸殘基，與鼠、牛、綿羊和人的cDNA同源性分別為71％、68％、68％、66％。雞IGFBP2有4個外顯子，也具有哺乳動物的IGFBP2擁有的RGD和ATTTA結(jié)構(gòu)域，其mRNA比人、鼠、綿羊的mRNA都長，約2.3kb，因為雞的IGFBP2有一個較長的3’調(diào)控區(qū)(Schoen等，1995)。與哺乳動物相似，雞胚胎期IGFBP2基因就有豐富表達，表達部位有眼睛、腦、骨骼肌、心臟、小腸和肝臟(Schoen等，1995)。
李志輝等(2003)對雞IGFBP2基因研究發(fā)現(xiàn)，在該基因的中發(fā)現(xiàn)一個多態(tài)位點，該位點是由序列中1196處一個C→A的點突變造成的(GenBank Accession NoU15086)。
(三)、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種分子生物學技術(shù)，即采用PCR和SSCP方法，用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測雞腹脂含量，從而預(yù)示和鑒定雞體脂性狀的分子標記方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1、根據(jù)雞IGFBP2基因序列設(shè)計一對引物IGFBP2F5’-GGG ACT GCT TTC CAA TAG-3’IGFBP2R5’-TTA CAG TCT TTG GTC TCG G-3’2、利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增。
3、使用聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳分離，檢測出IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)的C1196A的單堿基變異。
4、將PCR產(chǎn)物進行SSCP分析發(fā)現(xiàn)3種譜帶分別命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。取兩個純合基因型的片斷進行回收，并克隆到載體，測序結(jié)果表明，AA型的基因序列和GenBank(Accession NoU15086)中的一致，定義為野生型；BB型發(fā)生了1196處發(fā)生堿基突變，為C1196A，定義為突變型。
本發(fā)明還可以包括1、其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測單堿基變異而分類的基因型。
2、其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是3’調(diào)控區(qū)。
3、其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是由IGFBP2F和IGFBP2R表示的引物擴增的3’調(diào)控區(qū)。
4、其中用于分析多態(tài)性的位點選自在GenBank(Accession NoU15086)登錄的雞IGFBP2基因序列中第1196位的1個C→A堿基的變異。
5、其中雞體脂性狀是雞的腹脂重，腹脂率。
6、其中SSCP分析中的聚丙烯酰胺凝膠濃度為16％。
實驗證明AA基因型雞只的腹脂重、腹脂率均顯著(P＜0.05或極顯著P＜0.01)低于BB基因型雞只的腹脂重、腹脂率。
本發(fā)明巧妙地采用PCR擴增和SSCP的方法檢測了雞IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)的C1196A的單堿基變異，操作簡單、費用低、精確度高，可進行自動化檢測。使用本發(fā)明的標記基因型對雞的體脂進行選擇時，7周齡的腹脂重和腹脂率最高可以分別取得17.62％和15.14％的遺傳進展，可以加速低脂雞的育種進程。
附圖1是IGFBP2基因C1196A單堿基變異多態(tài)位點分析。
(五)、具體實施方案下面舉例對本發(fā)明做更詳細地描述一、實驗材料1.實驗動物和性狀測定①AA肉雞、海蘭蛋雞和地方品種北京油雞、白耳雞、石歧雜共5個隨機群體。
②東北農(nóng)業(yè)大學高低脂系第六世代、第七世代資源群體，分別選取了227和435只雞。7周齡時翅靜脈采血，草酸鹽抗凝；稱量活重之后屠宰，稱量屠體重、腹脂重等性狀。
③東北農(nóng)業(yè)大學建立的以高脂肉雞和白耳雞為親本雜交產(chǎn)生的F2資源群體(NEAUF2)，本研究共計選取540只雞。12周齡時翅靜脈采血，草酸鹽抗凝；稱量活重之后屠宰，稱量屠體重、腹脂重等性狀。
2.藥品和酶三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris飽和酚，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL 2000、dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶，大連寶生物公司；瓊脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，原平皓公司。
3.主要儀器PTC-200PCR儀(PERKIN ELMER)、Biometra梯度PCR儀、UVP多功能成像系統(tǒng)、Ultrospec 1000紫外分光光度計、BECKMAN冷凍離心機、Milli-Q超純水儀、DYY-III2穩(wěn)壓電泳儀及配套電泳槽。
二、實驗方法1.緩沖液與常用試劑的配制
1M Tris Cl121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
TE緩沖液10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高壓滅菌。
20×SET緩沖液3MNaCl，1M Tris Cl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH 8.0)，高壓滅菌。
5×TBE緩沖液54g Tris堿，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。
50×TAE緩沖液242g Tris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。
1M Tris Cl121.14g Tris堿溶于800ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
0.5M EDTA186.1g EDTA溶于800ml雙蒸水中，用NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1000ml，高壓滅菌。
3M NaAc(pH5.2)408.1g NaAc 3H2O溶于800ml雙蒸水中，用冰乙酸調(diào)pH至7.0，定容至1000ml。
200ml銀染液NH3H2O 2ml；3.6％NaOH 4.2ml；20％AgNO33.6ml，加去離子水至200ml。
200ml顯色液1％檸檬酸鈉1ml；甲醛100ul；加去離子水至200ml。
禽血裂解液10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。
2.引物的設(shè)計與合成以下引物由上海博亞生物公司合成IGFBP2F5’-GGG ACT GCT TTC CAA TAG-3’IGFBP2R5’-TTA CAG TCT TTG GTC TCG G-3’3.雞基因組DNA的小量提取方法一(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為100-200μg/ml，混勻55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的團塊。
(2)將溶液冷卻至室溫，加入5M NaCl至終濃度1.5M，混勻10min。加入等體積酚/氯仿，反復(fù)顛倒離心管混勻10min?！?3)12,000rpm，室溫離心10min。取上清，加等體積氯仿混勻10min?！?4)12,000rpm，室溫離心10min。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA?！?5)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次?！?6)7,500rpm，室溫離心5min，棄上清。
(7)將DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。
方法二
(1)將20μl全血加入裝有700μl 1×SET的1.5ml離心管中，輕輕混勻。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度100-200μg/μl和10％的SDS至終濃度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來回顛倒，使其混勻(4)12,000rpm離心10min，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個離心管中，棄去有機相。重復(fù)第三和第四步驟一次。
(5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，離心10min，移出水相到另一個離心管。
(6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(23∶1)，來回顛倒混合10min，12,000rpm，離心10min，移出水相到另一個離心管。
(7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M，pH5.2)和2倍體積的無水乙醇，來回顛倒，沉淀DNA。
(8)將DNA挑出放到1.5ml離心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于空氣中干燥。
(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br>
4.PCR反應(yīng)(1)以雞DNA為模板進行PCR擴增，25ul反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑10×PCR reaction buffer 2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 2.0μl引物1(10μM)0.5μl引物2(10μM)0.5μlEX-Taq(5U/μl) 0.25μl去離子水18.25l基因組DNA(50ng/μl) 1.0μl(2)將上述溶液混合并按以下條件進行PCR反應(yīng)。
94℃變性5min；94℃30sec，48.5℃30sec，72℃40sec，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5～10μl)進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物。
5.SSCP分析以濃度為16％、體積為25ml，厚度為0.1cm的膠為例。
(1)清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，烘干后，用0.8％瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙。
(2)在100ml燒杯內(nèi)加入30％丙烯酰胺11.7ml，50％甘油2.5ml，5×TBE 5ml，10％過硫酸銨0.175ml，TEMED8μl，去離子水5.617ml，混勻后迅速灌膠。
(3)當澆灌至離玻璃板上沿0.1cm時停止灌膠，插入梳子，室溫聚和半小時，多余的丙烯酰胺4℃保存。隨時觀察凝膠聚合情況，并補加丙烯酰胺。
(4)凝膠聚合好后，向電泳槽加入1×TBE，用注射器沖洗加樣孔。
(5)預(yù)電泳10min，同時準備點樣。
(6)取1μl PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加5-6μl變性上樣Buffer混勻，置于100度沸水中變性10分鐘，然后迅速放置冰水中冷卻10分鐘，用微量注射器點樣。
(7)100伏，電泳14-16h。
6.硝酸銀染色方法(1)電泳結(jié)束后關(guān)上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于70％乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10-15min。(乙醇用完可以回收)。
(2)雙蒸水洗膠2遍，每次2min，去除殘留乙醇。
(3)用200ml染色液染色30min。
(4)雙蒸水洗膠3遍，每次2min。
(5)用200ml顯色液顯色，約10-30min，當DNA帶的強度合適時，倒掉顯色液。
(6)去離子水洗掉多余的顯色液，保鮮膜封好，掃描照相或保存。
7.統(tǒng)計模型建立根據(jù)資源群體的特點構(gòu)建合適統(tǒng)計模型□Y＝μ+G+L+G*L+BW7+e□Y＝μ+G+L+H+G*L+BW7+e③Y＝μ+G+S+H+F+D(F)+G*S+BW12+e其中Y為性狀觀察值，μ為群體均值，G為基因型固定效應(yīng)，S為性別固定效應(yīng)，H為孵化批次固定效應(yīng)，F(xiàn)為家系隨機效應(yīng)，D(F)為母雞(家系內(nèi))的隨機效應(yīng)，G*S為基因型與性別的互作效應(yīng)，G*L為基因型與品系的互作效應(yīng)，BW12為12周齡體重，BW7為7周齡體重，e為剩余值。
模型□應(yīng)用于東北農(nóng)業(yè)大學高低脂系第六世代資源群體，模型□應(yīng)用于東北農(nóng)業(yè)大學高低脂系第七世代資源群體，模型③應(yīng)用于東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群體。使用SAS 6.12版本進行卡方檢驗。使用統(tǒng)計軟件JMP 4.0(SAS Institute Inc.，Cary，NC)檢驗基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計性狀的最小二乘均值。使用統(tǒng)計軟件MTDFREML估計基因型對性狀的遺傳和表型貢獻率。
實施例1、在不同品種基因型和基因頻率統(tǒng)計結(jié)果利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對AA肉雞、海蘭蛋雞和地方品種北京油雞、白耳雞、石歧雜，共5個隨機群體個體的基因組DNA進行PCR擴增，然后進行SSCP分析。共檢測到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
計算了不同雞種該基因的基因型頻率和基因頻率并進行卡方檢驗?；蛐秃突蝾l率統(tǒng)計結(jié)果見表1。獨立性檢驗(X2)總體結(jié)果表明，品種間基因型頻率差異極顯著(P＜0.01)。進行一步分析發(fā)現(xiàn)，在其它任意兩個雞種間差異都達到顯著的水平(P＜0.05)。北京油雞和白耳雞A基因頻率和AA基因型頻率明顯高于其它品種，而AA肉雞中A基因頻率和AA基因型頻率是5個品種中最低的。白耳雞是一種體形較小的蛋用地方品種，成年體重1.0-1.2千克(中國家禽品種志)，脂肪沉積較少，北京油雞是一種體形較小的蛋肉兼用型地方品種，成年體重1.6-1.7千克(中國家禽品種志)，肌間脂肪分布良好，肉質(zhì)細致，肉味鮮美，腹脂沉積較少；而肉雞由于多年的人工選擇，伴隨著早期生長速度的提高，有著極強脂肪沉積能力，因此，等位基因A可能與降低脂肪沉積有關(guān)。
表1 基因型和基因頻率在不同品種間比較
*括號內(nèi)是檢測個體數(shù)實施例2、雞IGFBP2基因的多態(tài)性與肉雞高低脂雙向選擇品系第六世代腹脂性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對肉雞高低脂雙向選擇品系第六世代的基因組DNA進行PCR擴增，然后進行SSCP分析。共檢測到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
對IGFBP2基因C1196A位點的3種基因型與第六世代227個個體的腹脂重和腹脂率進行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對第六世代個體的腹脂重、腹脂率有顯著影響(P＜0.05)(表2)。
表2 第六世代腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對3種基因型間第六世代雞只腹脂性狀的最小二乘均值進行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個體的腹脂重和腹脂率顯著低于AB型個體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；AA基因型個體的腹脂重和腹脂率比AB基因型個體的腹脂重和腹脂率分別低6.6克和0.28％(表3)。
表3 IGFBP2基因不同基因型對第六世代雞只腹脂性狀的影響
均值比較時同一列無相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)表4列出基因型對第六世代肉雞腹脂性狀的遺傳貢獻率和表型貢獻率。IGFBP2基因的變異位點對第六世代肉雞的腹脂重和腹脂率的遺傳貢獻率都較大，分別為12.43％和10.09％。因此推測用該基因?qū)Ω怪誀钸M行標記輔助選擇，會獲得較大的遺傳進展。
表4 IGFBP2基因?qū)Φ诹来怆u腹脂性狀的遺傳和表型貢獻率
1A為剩余多基因效應(yīng)方差；E為殘差的方差；G為檢測的基因效應(yīng)方差實施例3、雞IGFBP2基因的多態(tài)性與肉雞高低脂雙向選擇品系第七世代腹脂性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對肉雞高低脂雙向選擇品系第七世代的基因組DNA進行PCR擴增，然后進行SSCP分析。共檢測到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
對IGFBP2基因C1196A位點的3種基因型與第七世代435個個體的腹脂重和腹脂率進行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對第七世代個體的腹脂重、腹脂率有顯著影響(P＜0.05)(表5)。
表5 第七世代腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對3種基因型間第七世代雞只腹脂性狀的最小二乘均值進行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個體的腹脂重和腹脂率顯著低于BB型個體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有AA基因型個體的腹脂重和腹脂率比BB基因型個體的腹脂重和腹脂率分別低4.73克和0.19％(表6)。
表6 IGFBP2基因不同基因型對第七世代雞只腹脂性狀的影響
均值比較時同一列無相同字母者差異顯著(a-bp＜0.05)表7列出基因型對第七世代雞只腹脂性狀的遺傳貢獻率和表型貢獻率。IGFBP2基因的變異位點對第七世代肉雞的腹脂重和腹脂率的遺傳貢獻率都較大，分別為17.62％和15.14％。因此推測用該基因?qū)Ω怪誀钸M行標記輔助選擇，會獲得較大的遺傳進展。
表7 IGFBP2基因?qū)Φ谄呤来怆u腹脂性狀的遺傳和表型貢獻率
1A為剩余多基因效應(yīng)方差；E為殘差的方差；G為檢測的基因效應(yīng)方差實施例4、雞IGFBP2基因的多態(tài)性與東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群體體脂性狀的相關(guān)分析利用本發(fā)明的引物(IGFBP2F和IGFB2R)對東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群的基因組DNA進行PCR擴增，然后進行SSCP分析。共檢測到3種基因型，分別將其命名為AA、AB、BB基因型(圖1)。
對IGFBP2基因C1196A位點的3種基因型與東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群540個個體的腹脂重和腹脂率進行最小二乘分析，結(jié)果表明基因型對東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群個體的腹脂重、腹脂率有極顯著影響(P＜0.01)(表8)。
表8 東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群腹脂性狀的最小二乘分析結(jié)果(P值)
對3種基因型間東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群雞只腹脂性狀的最小二乘均值進行多重比較，結(jié)果表明AA基因型個體的腹脂重和腹脂率顯著低于BB型個體的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有AA基因型個體的腹脂重和腹脂率比BB基因型個體的腹脂重和腹脂率分別低10.29克和0.5％(表9)。
表9 IGFBP2基因不同基因型對東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群雞只腹脂性狀的影響
均值比較時同一列無相同字母者差異顯著(a-bP＜0.05)表10列出基因型對東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群雞只腹脂性狀的遺傳貢獻率和表型貢獻率。IGFBP2基因的變異位點對東北農(nóng)業(yè)大學F2資源群肉雞的腹脂重和腹脂率的遺傳貢獻率分別為2.95％和3.02％。
表10 IGFBP2基因?qū)|北農(nóng)業(yè)大學F2資源群肉雞腹脂性狀的遺傳和表型貢獻率
1A為剩余多基因效應(yīng)方差；E為殘差的方差；G為檢測的基因效應(yīng)方差
權(quán)利要求
1.一種用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是(1)、根據(jù)雞IGFBP2基因序列設(shè)計一對引物IGFBP2F5’-GGG ACT GCT TTC CAA TAG-3’IGFBP2R5’-TTA CAG TCT TTG GTC TCG G-3’(2)、利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增；(3)、使用16％聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進行SSCP分析，檢測出IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)中的1個單堿基突異位點；(4)、多態(tài)性分析經(jīng)SSCP分析分別發(fā)現(xiàn)3種基因型，分別命名為AA、AB和BB型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中分析基因多態(tài)性的方法是通過檢測單堿基變異而確定基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是3’調(diào)控區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于分析基因多態(tài)性的區(qū)域是由IGFBP2F和IGFBP2R表示的引物擴增的3’調(diào)控區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于分析多態(tài)性的位點位于雞IGFBP2基因(GenBank AccessionNoU15086)序列中第1196位的1個C→A堿基突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中雞體脂性狀是雞的腹脂重和腹脂率。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于SSCP分析的聚丙烯酰胺凝膠濃度為16％。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法，其特征是其中用于SSCP分析的聚丙烯酰胺凝膠濃度為16％。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種用IGFBP2基因預(yù)示和鑒定雞腹脂量的分子標記方法。根據(jù)雞IGFBP2基因序列設(shè)計一對引物IGFBP2F和IGFBP2R；利用該引物對雞的基因組DNA進行PCR擴增，然后應(yīng)用SSCP的方法，使用聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳分離，檢測出IGFBP2基因3’調(diào)控區(qū)中的1個單堿基變異位點；分別對雞IGFBP2基因該位點兩種純合型及雜合型進行命名。利用本發(fā)明的分子標記方法對雞體脂性狀進行選擇，不僅為雞育種工作中標記輔助選擇提供了一個更為有效、簡便易行的分子標記方法，同時也為雞的體脂性狀改良提供了一種有效的分子標記育種手段，從而可以加速低脂肉雞的育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK1769487SQ200510010450
公開日2006年5月10日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者李輝, 李志輝 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學