細(xì)菌和用所述細(xì)菌生產(chǎn)化合物的方法

專利名稱：細(xì)菌和用所述細(xì)菌生產(chǎn)化合物的方法
現(xiàn)有技術(shù)化合物，特別是指L-氨基酸、維生素、核苷和核苷酸以及D-氨基酸，被用于人類藥物、藥品工業(yè)、化妝品、食品工業(yè)和動(dòng)物營養(yǎng)物中。
諸多的此類化合物是通過發(fā)酵棒桿菌菌株，尤其是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)來制備的。由于這些物質(zhì)非常重要，因此不斷地努力改進(jìn)這些制備方法。對此方法的改進(jìn)可以涉及發(fā)酵措施，例如攪拌和氧氣的供給，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成例如發(fā)酵過程中的糖濃度，或通過例如離子交換層析逐漸形成產(chǎn)物形式，或者微生物自身的固有輸出特性。
利用了誘變、選擇和突變體選擇方法來改進(jìn)這些微生物的輸出特性。用這種方式獲得了能產(chǎn)生特定化合物的，對于抗代謝物有抗性的菌株，或者是對于在調(diào)控上重要的代謝物為營養(yǎng)缺陷型的菌株。
多年來還利用了重組DNA技術(shù)方法，通過擴(kuò)增單個(gè)生物合成基因和調(diào)查生產(chǎn)效果，來改進(jìn)棒桿菌(Corynebacterium)菌株。
一種常用方法包括通過附加型復(fù)制質(zhì)粒在特定微生物中擴(kuò)增某些生物合成基因。該方法有一個(gè)缺點(diǎn)是，質(zhì)粒在發(fā)酵過程(在工業(yè)方法中發(fā)酵通常涉及許多代)中自然丟失(分離不穩(wěn)定性)。
另一種方法包括借助不在特定微生物中復(fù)制的質(zhì)粒來復(fù)制特定的生物合成基因。在這一方法中，包括了克隆的生物合成基因的質(zhì)粒被整合進(jìn)該微生物的染色體生物合成基因(Reinscheid等人，Appliedand Environmental Microbiology 60(1)，126-132(1994)；Jetten等人，Applied Microbiology and Biotechnology 43(1)76-82(1995))。該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，質(zhì)粒的核苷酸序列以及選擇所必需的抗生素抗性基因的核苷酸序列保留在微生物中。這對于例如生物質(zhì)的處理和利用是不利的。此外，專家預(yù)計(jì)，由于在相應(yīng)世代數(shù)(比如工業(yè)發(fā)酵中常用的)中通過“坎貝爾型交換(Campbell type crossover)”而去整合，這樣的菌株是不穩(wěn)定的。
發(fā)明目的本發(fā)明人的目的是，為利用棒桿菌細(xì)菌發(fā)酵制備化合物提供新的改進(jìn)措施。
發(fā)明概述本發(fā)明提供生產(chǎn)化合物的棒桿菌細(xì)菌，它除了在天然位點(diǎn)(座位)含有一個(gè)拷貝的一或多個(gè)編碼合成用于所述化合物合成的蛋白質(zhì)或RNA的可讀框(ORF)、基因或等位基因外，還在一或多個(gè)附加的位點(diǎn)處，優(yōu)選在第二個(gè)、以及可選地在第三或第四個(gè)位點(diǎn)處以整合入染色體的形式含有一個(gè)或多個(gè)，尤其是第二個(gè)、可選地第三或第四個(gè)拷貝的所述可讀框(ORF)、基因或等位基因，其中至少一個(gè)所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件或者編碼所述原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA。
在第二個(gè)、可選地在第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)不存在于微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，和不存在賦予其抗生素抗性的核苷酸序列，第二個(gè)、可選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)不涉及對于細(xì)菌的生長和所需化合物的產(chǎn)生必需的可讀框(ORF)、基因或等位基因。
本發(fā)明還提供制備一種或多種化合物的方法，其中采取以下步驟a)發(fā)酵棒桿菌細(xì)菌，該棒桿菌細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(座位)存在一或多個(gè)編碼用于合成所述化合物的蛋白質(zhì)或RNA的可讀框(ORF)、基因或等位基因外，b)還在某些位點(diǎn)將一或多個(gè)，尤其是第二個(gè)、可選地第三或第四個(gè)拷貝的所述可讀框(ORF)、基因或等位基因整合進(jìn)染色體，由此c)至少一個(gè)所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件或者編碼所述原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA，d)在所述位點(diǎn)不存在于微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，和不存在賦予其抗生素抗性的核苷酸序列，e)在所述可讀框(ORF)、基因或等位基因能夠表達(dá)的條件下進(jìn)行過表達(dá)，濃縮發(fā)酵液體培養(yǎng)基和/或細(xì)菌細(xì)胞中的化合物，f)分離該化合物，可選地g)連同來自發(fā)酵液體培養(yǎng)基和/或生物質(zhì)中的成分一起，直至＞(大于)0至100wt％。
相應(yīng)蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)活性或濃度與起始細(xì)菌(親本細(xì)菌或野生型)中的活性或濃度相比得到提高，尤其是編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列過表達(dá)時(shí)。一般這一提高至少為10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最大為1000％或2000％。
本發(fā)明還提供這樣的棒桿菌細(xì)胞，即其含有與存在于天然位點(diǎn)并編碼用于合成所述化合物(尤其是氨基酸)的蛋白質(zhì)或RNA的可讀框(ORF)、基因或等位基因優(yōu)選以串聯(lián)排列(tandem arrangement)直接相鄰的第三或第四個(gè)拷貝的所述可讀框(ORF)、基因或等位基因，如WO 03/014330中所述。
“串聯(lián)排列”意為，兩或多個(gè)ORF、基因或等位基因縱列彼此直接相鄰且方向相同的排列方式。兩或多個(gè)直接相鄰的ORF、基因或等位基因的另一種方向類型可以稱作反向。
這些棒桿菌細(xì)菌另外對于在選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的位點(diǎn)處的拷貝包括所述的“串聯(lián)排列”。
本發(fā)明還提供所述的發(fā)酵所述棒桿菌細(xì)菌的方法。
發(fā)明詳述化合物尤其是指氨基酸、維生素、核苷和核苷酸。這些化合物的生物合成途徑在現(xiàn)有技術(shù)中是已知且可利用的。
氨基酸優(yōu)選意指L-氨基酸，特別是蛋白質(zhì)源的L-氨基酸，選自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-谷胺酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸及其鹽，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸。L-賴氨酸是極為優(yōu)選的。
蛋白質(zhì)源的氨基酸意指出現(xiàn)在天然蛋白質(zhì)中的氨基酸，也就是說出現(xiàn)在微生物、植物、動(dòng)物和人的蛋白質(zhì)中。
維生素意指，尤其是維生素B1(硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B5(泛酸)、維生素B6(吡哆醇)、維生素B12(氰鈷胺素)、煙酸/煙酰胺、維生素M(葉酸)和維生素E(生育酚)及其鹽，泛酸為優(yōu)選的。
核苷和核苷酸意指，除其它之外，S-腺苷-甲硫氨酸、肌苷-5′-單磷酸和鳥苷-5′-單磷酸及其鹽。
棒桿菌細(xì)菌特別是棒桿菌屬(Corynebacterium)的細(xì)菌。在棒桿菌屬中，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)和Corynebacteriumthermoaminogenes為優(yōu)選。除其它之外，可以在K_mpfer和Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42，989-1005(1996))以及在US-A-5,250,434中找到該組細(xì)菌中菌株的分類學(xué)信息。
棒桿菌屬的適宜菌株(尤其)是已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)ATCC13868節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)ATCC243Brevibacterium chang-fua ATCC14017黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020
臺(tái)北短桿菌(Brevibacterium taipei)ATCC13744和嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC21645和突變體或菌株，比如現(xiàn)有技術(shù)已知的、從產(chǎn)生化合物的菌株衍生而來的突變體或菌株。
產(chǎn)氨棒桿菌物種中的適宜菌株(尤其)是已知的野生型菌株產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)ATCC6871產(chǎn)氨短桿菌ATCC15137和棒桿菌ATCC21084和突變體或菌株，比如現(xiàn)有技術(shù)已知的、從產(chǎn)生化合物的菌株衍生而來的突變體或菌株。
Corynebacterium thermoaminogenes物種中的適宜菌株(尤其)是已知的野生型菌株Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1540Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1541和Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1542和突變體或菌株，比如現(xiàn)有技術(shù)已知的、從產(chǎn)生化合物的菌株衍生而來的突變體或菌株。
帶有“ATCC”標(biāo)記的菌株可獲自美國模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanType Culture Collection)(Manassas，VA，USA)。帶有“FERM”標(biāo)記的菌株可獲自國家高級工業(yè)科技研究所(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)(AIST TsukubaCentral 6，1-1-1Higashi，Tsukuba Ibaraki，日本)。所提到的Corynebacterium thermoaminogenes的菌株(FERM BP-1539，F(xiàn)ERMBP-1540，F(xiàn)ERM BP-1541和FERM BP-1542)描述于US-A 5,250,434中。
可讀框(ORF)描述一段編碼或能夠編碼蛋白質(zhì)或多肽或核糖核酸的核苷酸序列，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)無法指出這段核苷酸序列的功能。
在為該核苷酸序列片段指出功能后，通常將其稱作基因。
等位基因通常理解為意指一個(gè)給定基因的替代形式。這些形式的區(qū)別在于核苷酸序列。
在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選使用內(nèi)源的(也即物種特異性的)可讀框、基因或等位基因。它們意指存在于某一物種群體，例如谷氨酸棒桿菌中的可讀框、基因或等位基因或其核苷酸序列。
本發(fā)明上下文中的“一個(gè)拷貝的位于天然位點(diǎn)(座位)的可讀框(ORF)、基因或等位基因”理解為意指，ORF或基因或等位基因相對于比如存在于相應(yīng)的野生型或相應(yīng)的親本生物或起始生物中的相鄰的ORF或基因或等位基因的位置。
因此，例如，編碼來自谷氨酸棒桿菌的“反饋”抗性天冬氨酸激酶的lysC基因或lysCFBR等位基因的天然位點(diǎn)是指，一側(cè)帶有直接相鄰的基因或可讀框orfX和leuA、另一側(cè)帶有直接相鄰的asd基因的lysC位點(diǎn)或lysC座位或1ysC基因位點(diǎn)。
“反饋”抗性天冬氨酸激酶理解為意指這樣的天冬氨酸激酶與野生型形式相比，它對于賴氨酸和蘇氨酸的混合物或AEC(氨基乙基半胱氨酸)和蘇氨酸的混合物或賴氨酸本身或AEC本身的抑制的敏感性降低(至少5至10％、10％至15％或10％至20％)。產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株通常包含這樣的“反饋”抗性的或脫敏的天冬氨酸激酶。
谷氨酸棒桿菌染色體的核苷酸序列是已知的，并且可以在專利申請EP-A-1108790以及歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，Germany和Cambridge，UK)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的登錄號(hào)(AccessionNo.)AX114121中找到。OrfX、leuA基因以及asd基因核苷酸序列的登錄號(hào)為AX120364(orfX)、AX123517(leuA)和AX123519(asd)。
還可以利用其它數(shù)據(jù)庫，例如國家醫(yī)學(xué)圖書館(Bethesda，MD，USA)的國家生物技術(shù)信息中心(National Centerfor BiotechnologyInformation，NCBI)。
也可以使用其它數(shù)據(jù)庫，比如國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的數(shù)據(jù)庫，或瑞士生物信息學(xué)研究所(SwissInstitute of Bioinformatics，Swissprot，日內(nèi)瓦，瑞士)的數(shù)據(jù)庫，或蛋白質(zhì)信息資源數(shù)據(jù)庫(Protein Information ResourceDatabase，PIR，華盛頓，美國)的數(shù)據(jù)庫。
“一或多個(gè)，特別是第二個(gè)、可選地第三或第四個(gè)位點(diǎn)”理解為意指不同于“天然位點(diǎn)”的位點(diǎn)。它在下文中也稱作“靶位點(diǎn)”或“靶序列”。它還可以叫做“整合位點(diǎn)”或“轉(zhuǎn)化位點(diǎn)”。這(些)位點(diǎn)或存在于相應(yīng)位點(diǎn)的核苷酸序列優(yōu)選位于染色體中，且通常并非是生長和所需化合物生產(chǎn)所必需的。
優(yōu)選以谷氨酸棒桿菌染色體的基因間區(qū)域，和通常包含在染色體中的原噬菌體及編碼缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA區(qū)域?yàn)榘形稽c(diǎn)。這樣的位點(diǎn)例子示于表12和13中。
為制備本發(fā)明的棒桿菌細(xì)菌，通過例如PCR或利用限制性內(nèi)切酶及之后的凝膠抽提，至少分離得到攜帶目的ORF、基因、等位基因或操縱子的DNA片段，可選地包括表達(dá)和/或調(diào)控信號(hào)(例如啟動(dòng)子、衰減子、調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、衰減子和終止子)。DNA片段長度隨特定ORF、基因、等位基因或操縱子的自然長度變化。一般，該長度介于0.25至10kb或0.5至10kb之間。之后為這(些)DNA片段在5’-和3’-末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列。然后，優(yōu)選借助在棒桿菌中不復(fù)制或僅發(fā)生有限復(fù)制的載體，將這些DNA片段轉(zhuǎn)化進(jìn)目的棒桿菌細(xì)菌；分離出那些在靶位點(diǎn)整合有目的ORF、基因或等位基因的細(xì)菌；靶位點(diǎn)處不保留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。當(dāng)然可以對該方法進(jìn)行修改，例如，使得首先將靶位點(diǎn)插入(克隆進(jìn))一個(gè)載體，并隨后在所述靶位點(diǎn)處插入目的ORF、基因、等位基因或操縱子。
本發(fā)明還相應(yīng)提供生產(chǎn)一或多種化合物的棒桿菌細(xì)菌的制備方法，包括a)分離至少一種目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可選地包括表達(dá)和/或調(diào)控信號(hào)，b)為ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件，c)優(yōu)選將帶有靶位點(diǎn)核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合進(jìn)在棒桿菌細(xì)菌中不復(fù)制或僅進(jìn)行有限復(fù)制的載體中，d)將b)或c)的核苷酸序列或載體轉(zhuǎn)移進(jìn)棒桿菌細(xì)菌中，和e)分離在靶位點(diǎn)整合了根據(jù)a)的核苷酸序列的棒桿菌細(xì)菌，靶位點(diǎn)處未存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。
還優(yōu)選，靶位點(diǎn)處不保留所用載體序列或物種異源DNA的殘基，比如限制性切割位點(diǎn)或者尤其是在轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中能夠或使得能夠發(fā)生復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，以及靶位點(diǎn)處不保留賦予抗生素抗性的核苷酸序列。這樣的位于所整合的ORF、基因或等位基因上游或下游的DNA的最多24個(gè)，優(yōu)選最多12個(gè)，尤其優(yōu)選最多6個(gè)核苷酸可選地保留在靶位點(diǎn)。
與編碼用于生產(chǎn)化合物的蛋白質(zhì)或RNA的ORF、基因、等位基因的5′-和3′-末端相附著的靶位點(diǎn)核苷酸序列的長度最小為至少100個(gè)堿基對。類似地可以使用核苷酸序列長度為至少200、300、400、500、600、800、1000、1200、1400、16000、18000或20000個(gè)堿基對的DNA。通常最大長度不超過3000、5000或10000個(gè)堿基對。優(yōu)選長度為至少300且最大為3000。
借助本發(fā)明的方法，制備化合物的棒桿菌細(xì)菌或發(fā)酵方法的生產(chǎn)率在選自濃度(所形成的化合物，基于單位體積)、產(chǎn)量(所形成的化合物，基于所消耗的碳源)以及產(chǎn)物形成速率(所形成的化合物，基于時(shí)間)的一個(gè)或多個(gè)特征方面提高至少0.5-1.0％或至少1.0至1.5％或至少1.5-2.0％。
有關(guān)比如染色體DNA、質(zhì)粒DNA的分離以及限制酶操作等這樣的常規(guī)遺傳工程方法的指導(dǎo)可以在Sambrook等人(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)中找到。關(guān)于棒桿菌的轉(zhuǎn)化及接合的指導(dǎo)除其它之外可以在Thierbach等人(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))、Sch_fer等人(Journal of Bacteriology 172，1663-1666(1990)和Gene 145，69-73(1994))以及Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991))中找到。
僅進(jìn)行有限復(fù)制的載體理解為意指，作為培養(yǎng)宿主或攜帶者的條件的函數(shù)而進(jìn)行復(fù)制或者不復(fù)制的質(zhì)粒載體。因此，Nakamura等人(US-A-6,303,383)已經(jīng)描述了棒桿菌細(xì)菌的一種溫度敏感型質(zhì)粒，它在溫度等于/低于31℃時(shí)只能進(jìn)行有限復(fù)制。
此外，為分離和鑒定本發(fā)明的棒桿菌細(xì)菌，可以利用常用的微生物學(xué)技術(shù)比如涂平板、選擇和篩選，以及常用的遺傳工程技術(shù)比如DNA雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和DNA測序，以及常用的生物化學(xué)方法比如酶活力測定。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌細(xì)菌，尤其是棒桿菌屬的細(xì)菌，它除了在天然位點(diǎn)(座位)含有至少一個(gè)拷貝的一或多個(gè)編碼產(chǎn)生賴氨酸的蛋白質(zhì)的可讀框(ORF)、基因或等位基因之外，還在第二個(gè)、可選地在第三或第四個(gè)整合在染色體內(nèi)的位點(diǎn)處含有一個(gè)或多個(gè)，尤其是第二個(gè)、可選地第三或第四個(gè)拷貝的所述可讀框(ORF)、基因或等位基因，其中至少一個(gè)所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件或者編碼所述原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA。
所述位點(diǎn)不帶有在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制或者能夠/使得能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)座或者賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明此外還提供制備L-賴氨酸的方法，包括a)發(fā)酵所述棒桿菌細(xì)菌，尤其是谷氨酸棒桿菌，在能夠允許所述可讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下，b)濃縮發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的L-賴氨酸，
c)從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離L-賴氨酸，可選地d)連同來自發(fā)酵液體培養(yǎng)基和/或生物質(zhì)中的成分一起，直至＞(大于)0至100％。
“生產(chǎn)賴氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”理解為意指，所有在增強(qiáng)/過表達(dá)后能夠具有提高賴氨酸生產(chǎn)這一效應(yīng)的，優(yōu)選內(nèi)源的可讀框、基因或等位基因。增強(qiáng)理解為意指，特定基因產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或酶的細(xì)胞內(nèi)濃度或活性相對于起始細(xì)菌中的蛋白質(zhì)或酶的活性或濃度的提高。
這些除其它之外包括以下可讀框、基因或等位基因accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、ddh、dps、eno、gap、gap2、gdh、gnd、lysC、lysCFBR、lysE、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwa1、zwf和zwf A213T。它們概述和解釋于表1中。
這些包括，尤其是編碼“反饋”抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。各種不同的lysCFBR等位基因在表2中給出了概括和說明。
以下lysCFBR等位基因是優(yōu)選的lysC A279T(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第279位的丙氨酸被蘇氨酸取代)、lysCA279V(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第279位的丙氨酸被纈氨酸取代)、lysC S301F(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第301位的絲氨酸被苯丙氨酸取代)、lysC T308I(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第308位的蘇氨酸被異亮氨酸取代)、lysC S301Y(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第308位的蘇氨酸被酪氨酸取代)、lysC G345D(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第345位的甘氨酸被天冬氨酸取代)、lysC R320G(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第320位的精氨酸被甘氨酸取代)、lysC T311I(根據(jù)SEQ IDNO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第311位的蘇氨酸被異亮氨酸取代)、lysC S381F(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第381位的絲氨酸被苯丙氨酸取代)。
LysCFBR等位基因lysC T311I(根據(jù)SEQ ID NO2所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)第311位的蘇氨酸被異亮氨酸取代)是特別優(yōu)選的，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
在第三或第四個(gè)位點(diǎn)，可以整合所述生產(chǎn)賴氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四個(gè)拷貝。除其它之外，以下可讀框、基因或核苷酸序列可用于此aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、fda、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、mqo、pck、pgi、poxB和zwa2，尤其是基因aecD，gluA，gluB，gluC，gluD和pck。這些在表3中給出了概括和說明。
所提到的位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所提到的可讀框或基因的編碼區(qū)域，還包括位于上游負(fù)責(zé)表達(dá)和調(diào)控的區(qū)域或核苷酸序列，比如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)控核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)和衰減子。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，位于下游的區(qū)域，比如轉(zhuǎn)錄終止子也包括在內(nèi)。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，也就是不具有編碼功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色體中的原噬菌體或缺陷噬菌體或噬菌體組件可用于此。
原噬菌體理解為意指與宿主基因組一起復(fù)制而且不形成感染性粒子的噬菌體，尤其是其基因組。缺陷噬菌體理解為意指由于各種突變而喪失了形成所謂的感染性粒子的能力的原噬菌體，尤其是其基因組。缺陷噬菌體也稱作隱蔽原噬菌體。原噬菌體和缺陷噬菌體常以整合在其宿主染色體中的形式出現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中有進(jìn)一步的描述，例如在由Edward A.Birge撰寫的教科書(Bacterial and BacteriophageGenetics，第三版，Springer-Verlag，紐約，美國，1994)或由S.Klaus等人撰寫的教科書(Bakterienviren，Gustav Fischer Verlag，Jena，德國，1992)中。
代表基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件或者編碼所述原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA的谷氨酸棒桿菌染色體區(qū)域的實(shí)例示于表12和13。DNA區(qū)域的位置參照EP-A-1108790或歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國和劍橋，英國)數(shù)據(jù)庫中所示的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基因組圖譜。
就表12的基因間區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有編碼功能即基因或等位基因的區(qū)域。
就選自表13的編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的區(qū)域。
表1生產(chǎn)賴氨酸的可讀框、基因和等位基因

表2編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因
表3用于整合生產(chǎn)賴氨酸的可讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
本發(fā)明相應(yīng)地還提供制備生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌細(xì)菌的方法，包括a)分離至少一種生產(chǎn)賴氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可選地包括表達(dá)和/或調(diào)控信號(hào)，b)為生產(chǎn)賴氨酸的ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件，c)優(yōu)選將帶有靶位點(diǎn)核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合進(jìn)在棒桿菌細(xì)菌中不復(fù)制或僅進(jìn)行有限復(fù)制的載體中，d)將b)或c)的所述核苷酸序列或載體轉(zhuǎn)移進(jìn)棒桿菌細(xì)菌中，和e)分離靶位點(diǎn)整合有根據(jù)a)的核苷酸序列的棒桿菌細(xì)菌。靶位點(diǎn)處未存留在所述微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制，或能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座，或賦予其抗生素抗性的核苷酸序列，例如帶有載體原點(diǎn)的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的棒桿菌細(xì)菌，尤其是棒桿菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明還提供根據(jù)權(quán)利要求20的制備L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的方法。
“生產(chǎn)甲硫氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”理解為意指，所有在增強(qiáng)/過表達(dá)后具有提高甲硫氨酸生產(chǎn)這一效應(yīng)的，優(yōu)選內(nèi)源的可讀框、基因或等位基因。
這些除其它之外包括以下可讀框、基因或等位基因accBC、accDA、aecD、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dps、eno、fda、gap、gap2、gdh、gnd、glyA、hom、homFBR、lysC、lysCFBR、metA、metB、metE、metH、metY、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwa1、zwf和zwf A213T。這些概括和解釋在表4中。它們包括，尤其是編碼“反饋”抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(參見表2)和編碼“反饋”抗性高絲氨酸脫氫酶homFBR等位基因。
“反饋”抗性高絲氨酸脫氫酶理解為意指，與野生型形式相比，對由蘇氨酸或AHV(α-氨基-β-羥基戊酸)引起的抑制具有較低(至少5％至10％、10％至15％或10％至20％)敏感度的高絲氨酸脫氫酶。生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株通常含有這樣的“反饋”抗性的或脫敏的高絲氨酸脫氫酶(亦參見Eikmanns等人的第153至156頁(Antonie vanLeuwenhoek 64145-163，1993))。
在第三或第四個(gè)位點(diǎn)，可以整合生產(chǎn)甲硫氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四個(gè)拷貝。除其它之外，以下可讀框、基因或核苷酸序列可用于此brnE、brnF、brnQ、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、ddh、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、metD、metK、pck、pgi、poxB和zwa2。這些概括和說明在表5中。
所提到的位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所提到的可讀框或基因的編碼區(qū)域，還包括位于上游負(fù)責(zé)表達(dá)和調(diào)控的區(qū)域或核苷酸序列，比如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)控核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)和衰減子。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，位于下游的區(qū)域，比如轉(zhuǎn)錄終止子也包括在內(nèi)。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，也就是不具有編碼功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色體中的原噬菌體或缺陷噬菌體或噬菌體組件也可用于此。
代表基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的谷氨酸棒桿菌染色體區(qū)域的實(shí)例示于表12和13。DNA區(qū)域的位置參照EP-A-1108790或歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國和劍橋，英國)數(shù)據(jù)庫中所示的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組圖譜。
就表12的基因間區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有編碼功能即基因或等位基因的區(qū)域。
就選自表13的編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的區(qū)域。
表4生產(chǎn)甲硫氨酸的可讀框、基因和等位基因
表5用于整合生產(chǎn)甲硫氨酸的可讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
“生產(chǎn)蘇氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”理解為意指，所有在增強(qiáng)/過表達(dá)后具有提高賴氨酸生產(chǎn)這一效應(yīng)的，優(yōu)選內(nèi)源的可讀框、基因或等位基因。
這些除其它之外包括以下可讀框、基因或等位基因accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysI、cysN、cysQ、dps、eno、fda、gap、gap2、gdh、gnd、hom、homFBR、lysC、lysCFBR、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、thrB、thrC、thrE、zwa1、zwf和zwfA213T。這些概括和解釋在表6中。它們包括，尤其是編碼“反饋”抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(參見表2)和編碼“反饋”抗性高絲氨酸脫氫酶homFBR等位基因。
“反饋”抗性高絲氨酸脫氫酶理解為意指，與野生型形式相比，對由蘇氨酸或AHV(α-氨基-β-羥基戊酸)引起的抑制具有較低(至少5％至10％、10％至15％或10％至20％)敏感度的高絲氨酸脫氫酶。生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株通常含有這樣的“反饋”抗性的或脫敏的高絲氨酸脫氫酶(亦參見Eikmanns等人的第153至156頁(Antonie vanLeuwenhoek 64145-163，1993))。
在第三或第四個(gè)位點(diǎn)，可以整合生產(chǎn)蘇氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四個(gè)拷貝。除其它之外，以下可讀框、基因或核苷酸序列可用作整合位點(diǎn)ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、ddh、gluA、gluB、gluC、gluD、glyA、ilvA、ilvBN、ilvC、ilvD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、mdh、menE、metA、metD、pck、poxB、sigB和zwa2。這些概括和說明在表7中。
所提到的位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所提到的可讀框或基因的編碼區(qū)域，還包括位于上游負(fù)責(zé)表達(dá)和調(diào)控的區(qū)域或核苷酸序列，比如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)控核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)和衰減子。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，位于下游的區(qū)域，比如轉(zhuǎn)錄終止子也包括在內(nèi)。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，也就是不具有編碼功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色體中的原噬菌體或缺陷噬菌體或噬菌體組件也可用于此。
代表基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的谷氨酸棒桿菌染色體區(qū)域的實(shí)例示于表12和13。DNA區(qū)域的位置參照EP-A-1108790或歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國和劍橋，英國)數(shù)據(jù)庫中所示的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組圖譜。
就表12的基因間區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有編碼功能即基因或等位基因的區(qū)域。
就選自表13的編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的區(qū)域。
表6生產(chǎn)蘇氨酸的可讀框、基因和等位基因
表7用于整合生產(chǎn)蘇氨酸的可讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
本發(fā)明相應(yīng)地還提供制備生產(chǎn)L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的棒桿菌細(xì)菌的方法，包括a)分離至少一種生產(chǎn)甲硫氨酸或蘇氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可選地包括表達(dá)和/或調(diào)控信號(hào)，b)為ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件，c)優(yōu)選將所述帶有靶位點(diǎn)核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合進(jìn)在棒桿菌細(xì)菌中不復(fù)制或僅進(jìn)行有限復(fù)制的載體中，
d)將b)或c)的所述核苷酸序列或載體轉(zhuǎn)移進(jìn)棒桿菌細(xì)菌中，和f)分離靶位點(diǎn)整合有根據(jù)a)的核苷酸序列的棒桿菌細(xì)菌。
優(yōu)選靶位點(diǎn)處未存留在所述微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列和賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)L-纈氨酸的棒桿菌細(xì)菌，尤其是棒桿菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明還提供根據(jù)權(quán)利要求20的制備L-纈氨酸的方法。
“生產(chǎn)纈氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”理解為意指，所有在增強(qiáng)/過表達(dá)后具有提高纈氨酸生產(chǎn)這一效應(yīng)的可讀框、基因或等位基因。
這些除其它之外包括以下可讀框、基因或等位基因brnE、brnF、brnEF、cstA、cysD、dps、eno、fda、gap、gap2、gdh、ilvB、ilvN、ilvBN、ilvC、ilvD、ilvE、msiK、pgk、ptsH、ptsI、ptsM、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tpi、zwa1。這些概括和解釋在表8中。它們尤其包括編碼纈氨酸-抗性乙酰乳酸合酶的ilvBN等位基因。
“反饋”抗性乙酰乳酸合酶(＝乙酰羥酸合成酶)理解為意指，與野生型形式相比，對至少由纈氨酸或纈氨酸類似物2-噻唑丙氨酸(EPappln.No.03014640.1)引起的抑制具有較低(至少10％至15％或10％至20％)敏感度的乙酰乳酸合酶。
在第三或第四個(gè)位點(diǎn)，可以整合生產(chǎn)纈氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四個(gè)拷貝。除其它之外，以下可讀框、基因或核苷酸序列可用于此aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、ddh、gluA、gluB、gluC、gluD、glyA、ilvA、luxR、lySR1、lySR2、lysR3、panB、panC、poxB和zwa2。這些概括和說明在表9中。
所提到的位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所提到的可讀框或基因的編碼區(qū)域，還包括位于上游負(fù)責(zé)表達(dá)和調(diào)控的區(qū)域或核苷酸序列，比如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)控核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)和衰減子。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，位于下游的區(qū)域，比如轉(zhuǎn)錄終止子也包括在內(nèi)。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，也就是不具有編碼功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色體中的原噬菌體或缺陷噬菌體或噬菌體組件可用于此。
代表基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的谷氨酸棒桿菌染色體區(qū)域的實(shí)例示于表12和13。DNA區(qū)域的位置參照EP-A-1108790或歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國和劍橋，英國)數(shù)據(jù)庫中所示的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組圖譜。
就表12的基因間區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表12所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且不具有編碼功能即基因或等位基因的區(qū)域。
就選自表13的編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA區(qū)域而言，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，由于野生型與野生型菌株之間相互不同以及根據(jù)所接受的突變處理，根據(jù)本發(fā)明可以使用含有與表13所述核苷酸序列具有至少70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的核苷酸序列且編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的區(qū)域。
表8生產(chǎn)纈氨酸的可讀框、基因和等位基因
表9用于整合生產(chǎn)纈氨酸的可讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
本發(fā)明相應(yīng)地還提供制備生產(chǎn)L-纈氨酸的棒桿菌細(xì)菌的方法，包括a)分離至少一種生產(chǎn)纈氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可選地包括表達(dá)和/或調(diào)控信號(hào)，b)為ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件，c)優(yōu)選將帶有靶位點(diǎn)核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合進(jìn)在棒桿菌細(xì)菌中不復(fù)制或僅進(jìn)行有限復(fù)制的載體中，d)將b)或c)的所述核苷酸序列或載體轉(zhuǎn)移進(jìn)棒桿菌細(xì)菌中，和
e)分離靶位點(diǎn)整合有根據(jù)a)的核苷酸序列的棒桿菌細(xì)菌。靶位點(diǎn)處未存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制，或能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座，或賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供制備L-色氨酸的方法，其包括以下步驟a)發(fā)酵棒桿菌細(xì)菌，尤其是根據(jù)權(quán)利要求1的谷氨酸棒桿菌。
“生產(chǎn)色氨酸的可讀框、基因或等位基因的拷貝”理解為意指，所有在增強(qiáng)/過表達(dá)后具有提高色氨酸生產(chǎn)這一效應(yīng)的可讀框、基因或等位基因。
這些除其它之外包括以下可讀框、基因或等位基因aroA，aroB，aroC，aroD，aroE，aroG，aroK，cstA，eno，gap，gap2，gnd，ppsA，rpe，serA，serB，serC，tal，thyA，tkt，tpi，trpA，trpB，trpC，可選地包括至少一種選自A215T(215位的丙氨酸替換為蘇氨酸)、D138A(138位的天冬氨酸替換為丙氨酸)、S149F(149位的絲氨酸替換為苯丙氨酸)和A162E(162位的丙氨酸替換為谷氨酸)的氨基酸替換的trpD，trpE，包括例如氨基酸替換S38R(38位的絲氨酸替換為精氨酸)的trpEFBR，trpG，可選地包括突變W14*的trpL，zwa1，可選地包括氨基酸替換A213T(213位的丙氨酸替換為蘇氨酸)的zwf。這些概括和解釋在表10中。這些尤其包括包含trpE、trpG、trpD、trpC和trpA以及可選地trpL的色氨酸操縱子。此外，這些還特別包括編碼色氨酸抗性鄰氨基苯甲酸合酶的trpEFBR等位基因。
“反饋”抗性鄰氨基苯甲酸合酶理解為意指，與野生型形式相比，對由色氨酸或5-氟色氨酸(Matsui等人，Journal of Bacteriology169(11)5330-5332(1987))或類似物引起的抑制具有較低(至少5％至10％、10％至15％或10％至20％)敏感度的鄰氨基苯甲酸合酶。生產(chǎn)L-色氨酸的菌株通常包含這樣的“反饋”抗性的或脫敏的鄰氨基苯甲酸合酶(參見例如US 6180373和EP0338474)。
在第三或第四個(gè)位點(diǎn)，可以整合生產(chǎn)色氨酸的可讀框(ORF)、基因或等位基因的第三或第四個(gè)拷貝。除其它之外，以下可讀框、基因或核苷酸序列可用作整合位點(diǎn)ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、cysE、gluA、gluB、gluC、gluD、glyA、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、pgi、pheA、poxB和zwa2。這些概括和說明在表11中。
所提到的位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所提到的可讀框或基因的編碼區(qū)域，還包括位于上游負(fù)責(zé)表達(dá)和調(diào)控的區(qū)域或核苷酸序列，比如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、啟動(dòng)子、調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)控核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)和衰減子。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域上游1-800、1-600、1-400、1-200、1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，位于下游的區(qū)域，比如轉(zhuǎn)錄終止子也包括在內(nèi)。這些區(qū)域通常位于編碼區(qū)域下游1-400、1-200、1-100、1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，也就是不具有編碼功能的核苷酸序列。最后，通常包含在染色體中的原噬菌體或缺陷噬菌體或噬菌體組件也可用于此。
代表基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的谷氨酸棒桿菌染色體區(qū)域的實(shí)例示于表12和13。DNA區(qū)域的位置參照EP-A-1108790或歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國和劍橋，英國)數(shù)據(jù)庫中所示的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組圖譜。
表10生產(chǎn)色氨酸的可讀框、基因和等位基因
表11用于整合生產(chǎn)色氨酸的可讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
本發(fā)明相應(yīng)地還提供制備生產(chǎn)L-色氨酸的棒桿菌細(xì)菌的方法，包括a)分離至少一種生產(chǎn)色氨酸的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可選地包括表達(dá)和/或調(diào)控信號(hào)，b)為ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件，c)優(yōu)選將帶有靶位點(diǎn)核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合進(jìn)在棒桿菌細(xì)菌中不復(fù)制或僅進(jìn)行有限復(fù)制的載體中，d)將b)或c)的所述核苷酸序列或載體轉(zhuǎn)移進(jìn)棒桿菌細(xì)菌中，和e)分離靶位點(diǎn)整合有根據(jù)a)的核苷酸序列的棒桿菌細(xì)菌。靶位點(diǎn)處未存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制，或能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座，或賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。
表12作為整合可讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)的基因間區(qū)域
表13適于整合可讀框、基因和等位基因的并且編碼噬菌體或噬菌體組件的靶位點(diǎn)
在本發(fā)明的研究工作中，將lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝整合進(jìn)谷氨酸棒桿菌的gluB基因，這樣，在gluB基因位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為DSM13994glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶lysCFBR等位基因lysC T311I，和在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即gluB基因處，攜帶第二個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因lysC T311I。可以幫助實(shí)現(xiàn)將lysCFBR等位基因整合進(jìn)gluB基因的質(zhì)粒示于附

圖1。它稱作pK18mobsacBglu1_1。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因整合進(jìn)作為靶位點(diǎn)的谷氨酸棒桿菌gluB基因，這樣，在gluB基因位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為DSM12866glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶野生型的lysC基因，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即gluB基因處，攜帶形式為lysCFBR等位基因lysC T311I的第二個(gè)拷貝lysC基因。其已保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM15039?？梢詭椭鷮?shí)現(xiàn)將lysCFBR等位基因整合進(jìn)gluB基因的質(zhì)粒示于附圖1。它稱作pK18mobsacBglu1_1。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因整合進(jìn)作為靶位點(diǎn)的谷氨酸棒桿菌aecD基因，這樣，在aecD基因位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為DSM12866aecD∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶野生型的lysC基因，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即aecD基因處，攜帶形式為lysCFBR等位基因lysC T311I的第二個(gè)拷貝lysC基因。可以幫助實(shí)現(xiàn)將lysCFBR等位基因整合進(jìn)aecD基因的質(zhì)粒示于附圖2。它稱作pK18mobsacBaecD1_1。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因整合進(jìn)作為靶位點(diǎn)的谷氨酸棒桿菌pck基因，這樣，在pck基因位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為DSM12866pck∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶野生型的lysC基因，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即pck基因處，攜帶形式為lysCFBR等位基因lysC T311I的第二個(gè)拷貝lysC基因?？梢詭椭鷮?shí)現(xiàn)將lysCFBR等位基因整合進(jìn)pck基因的質(zhì)粒示于附圖3。它稱作pK18mobsacBpck1_1。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的ddh基因整合進(jìn)作為靶位點(diǎn)的谷氨酸棒桿菌gluB基因，這樣，在gluB基因位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為DSM12866glu∷ddh的菌株，在其天然ddh位點(diǎn)攜帶一個(gè)拷貝的ddh基因，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即gluB基因處，攜帶第二個(gè)拷貝的ddh基因。可以幫助實(shí)現(xiàn)將ddh基因整合進(jìn)gluB基因的質(zhì)粒示于附圖4。它稱作pK18mobsacBgluB2_1。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的dapA基因整合進(jìn)作為靶位點(diǎn)的谷氨酸棒桿菌aecD基因，這樣，在aecD基因位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為DSM12866aecD∷dapA的菌株，在其天然dapA位點(diǎn)攜帶一個(gè)拷貝的dapA基因，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即aecD基因處，攜帶第二個(gè)拷貝的dapA基因。可以幫助實(shí)現(xiàn)將dapA基因整合進(jìn)aecD基因的質(zhì)粒示于附圖5。它稱作pK18mobsacBaecD2_1。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的pyc等位基因整合進(jìn)作為靶位點(diǎn)的谷氨酸棒桿菌pck基因，這樣，在pck基因位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為DSM12866pck∷pyc的菌株，在其天然pyc位點(diǎn)攜帶野生型的pyc基因，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即pck基因處，攜帶形式為pyc等位基因pyc P458S的第二個(gè)拷貝pyc基因?？梢詭椭鷮?shí)現(xiàn)將pyc等位基因整合進(jìn)pck基因的質(zhì)粒示于附圖6。它稱作pK18mobsacBpck1_3。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的色氨酸操縱子整合進(jìn)選自表12的谷氨酸棒桿菌基因間區(qū)域(靶位點(diǎn))，這樣，在靶位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為ATCC21850nc∷trp的菌株，在其天然色氨酸操縱子位點(diǎn)攜帶一個(gè)拷貝的色氨酸操縱子，即菌株ATCC 21850的色氨酸操縱子，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即根據(jù)表12位置為27398至28707的基因間區(qū)域處，攜帶第二個(gè)拷貝的所述色氨酸操縱子?？梢詭椭鷮?shí)現(xiàn)將所述色氨酸操縱子整合進(jìn)所述靶位點(diǎn)的質(zhì)粒示于附圖9。它稱作pK18mobsacBnc∷trp。
在本發(fā)明的研究工作中，將一個(gè)拷貝的色氨酸操縱子整合進(jìn)選自表12的編碼原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的谷氨酸棒桿菌區(qū)域(靶位點(diǎn))，這樣，在靶位點(diǎn)就不存留在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加型復(fù)制的核苷酸序列、能夠/使得能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列以及賦予其抗生素抗性的核苷酸序列。這一稱為ATCC21850pha1∷trp菌株，在其天然色氨酸操縱子位點(diǎn)攜帶一個(gè)拷貝的色氨酸操縱子，即菌株ATCC 21850的色氨酸操縱子，并在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))，也即根據(jù)表13位置為88231至89445的區(qū)域處，攜帶第二個(gè)拷貝的所述色氨酸操縱子?？梢詭椭鷮?shí)現(xiàn)將所述色氨酸操縱子整合進(jìn)所述靶位點(diǎn)的質(zhì)粒示于附圖10。它稱作pK18mobsacBpha1∷trp。
為生產(chǎn)化合物，根據(jù)本發(fā)明制備的棒桿菌細(xì)菌可以連續(xù)培養(yǎng)或者以分批法(分批培養(yǎng))或補(bǔ)料分批(補(bǔ)料法)或重復(fù)補(bǔ)料分批法(重復(fù)補(bǔ)料法)進(jìn)行不連續(xù)培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法的概述描述在Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科書中。
所使用的培養(yǎng)基必須以適宜的方式符合特定菌株的要求。有關(guān)不同微生物培養(yǎng)基的說明在美國細(xì)菌學(xué)會(huì)的手冊“Manual of Methodsfor Genera Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)中有。
比如像葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素這樣的糖類和碳水化合物，比如像大豆油、葵花子油、花生油和椰子油這樣的油類和脂肪，比如像棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸這樣的脂肪酸，比如像丙三醇和乙醇這樣的醇類，以及比如像乙酸或乳酸這樣的有機(jī)酸，可用作碳源。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或混合使用。
有機(jī)含氮化合物，比如蛋白胨、酵母提取物、肉類提取物、麥芽提取物、玉米浸漬液、大豆粉和尿素，或者無機(jī)化合物，比如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨，可用作氮源。氮源可以單獨(dú)或混合使用。
磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的鈉鹽可用作磷源。培養(yǎng)基還必須包括比如硫酸鎂或硫酸鐵這樣的生長所必需的金屬鹽。最后，除上述物質(zhì)之外還可以使用比如氨基酸和維生素這樣的必需生長物質(zhì)。此外，還可以在培養(yǎng)基中添加適宜的前體物質(zhì)。所提到的起始物質(zhì)可以單次加到培養(yǎng)基中，或者可以在培養(yǎng)過程中以適宜方式補(bǔ)料加入。
堿性化合物，比如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物，比如磷酸或硫酸，可以適宜的方式用于控制培養(yǎng)物的pH?？梢杂帽热缰舅峋垡叶减ミ@樣的防沫劑來控制泡沫形成?？梢韵蚺囵B(yǎng)基中添加具有選擇活性的適宜物質(zhì)比如抗生素，以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為維持有氧狀況，向培養(yǎng)基中導(dǎo)入氧氣和含氧氣體混合物，比如空氣。培養(yǎng)溫度通常為20℃至45℃，且優(yōu)選25℃至40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至形成最大量的目的化合物。通常在10至160小時(shí)內(nèi)達(dá)到這一目標(biāo)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的棒桿菌細(xì)菌，尤其是生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌細(xì)菌，具有預(yù)料不到的高穩(wěn)定性。它們保持穩(wěn)定至少10-20、20-30、30-40、40-50、優(yōu)選至少50-60、60-70、70-80和80-90個(gè)世代或細(xì)胞分裂周期。
以下微生物已經(jīng)保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約，菌株谷氨酸棒桿菌DSM12866glu∷lysC以純培養(yǎng)物形式于2002年6月5日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，Germany)，保藏編號(hào)為DSM15039。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的純培養(yǎng)物形式于2001年4月20日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM14243。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的純培養(yǎng)物形式于2002年6月5日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM15040。
實(shí)施例1將lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝整合進(jìn)菌株DSM13994和菌株DSM12866的染色體中通過多次非直接誘變、選擇和突變體選擇從谷氨酸棒桿菌ATCC13032制得谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994。該菌株對賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并具有對由賴氨酸和蘇氨酸混合物(各為25mM)引起的抑制不敏感的反饋抗性天冬氨酸激酶。該菌株的lysCFBR等位基因核苷酸序列示作SEQ ID NO3。它在下文中也稱作lysC T311I。所編碼的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列示作SEQID NO4。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該菌株的純培養(yǎng)物于2001年1月16日保藏于德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)。
通過非直接誘變和選擇L-賴氨酸累積最好的突變體，從谷氨酸棒桿菌ATCC13032制得了菌株DSM12866。它是甲硫氨酸敏感型的。通過添加蘇氨酸可以在含有L-甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基上重新生長。該菌株具有如SEQ ID NO1所示的野生型lysC基因。相應(yīng)的野生型天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列示作SEQ ID NO2。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該菌株的純培養(yǎng)物于1999年6月10日保藏于德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)。
1.1分離菌株DSM13994的lysC等位基因DNA并測序用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株DSM13994分離出染色體DNA。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出帶有l(wèi)ysC基因或等位基因的DNA區(qū)段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌lysC基因序列(Kalinowski等人，Molecular Microbiology，5(5)，1197-1204(1991)；登錄號(hào)X57226)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRlysC1beg(SEQ ID No5)5′TA(G GAT CC)T CCG GTG TCT GAC CAC GGT G 3′lysC2end(SEQ ID NO6)5′AC(G GAT CC)G CTG GGA AAT TGC GCT CTT CC 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出攜帶有l(wèi)ysC基因或等位基因、長約1.7kb的DNA區(qū)段。此外這些引物還包含限制性內(nèi)切酶BamHI的切割位點(diǎn)序列，其在如上所示核苷酸序列中用圓括號(hào)標(biāo)記。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約1.7kb并攜帶有菌株DSM13994的lysC等位基因的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
然后用Topo TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目錄編號(hào)K4600-01)將片段連接進(jìn)載體pCRII-TOPO。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)。通過將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有卡那霉素(50mg/l)、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷，64mg/l)的LB瓊脂上涂板來選擇攜帶有質(zhì)粒的細(xì)胞。
分離DNA后，通過限制性切割檢查所獲得的質(zhì)粒，并在瓊脂糖凝膠中鑒定。所得質(zhì)粒稱作pCRIITOPOlysC。
用PE Applied Biosystems(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序裝置并根據(jù)Sanger等人的雙脫氧鏈終止法(Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA，745463-5467(1977))確定所擴(kuò)增的DNA片段或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列。PCR產(chǎn)物的編碼區(qū)序列示于SEQ ID No3。與之相關(guān)的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。
在菌株DSM13994的lysCFBR等位基因的編碼區(qū)域核苷酸序列(SEQID NO3)第932位發(fā)現(xiàn)了堿基胸腺嘧啶。在野生型基因(SEQ ID NO1)的相應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)了堿基胞嘧啶。
在菌株DSM13994的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ IDNo4)第311位發(fā)現(xiàn)了氨基酸異亮氨酸。在野生型蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)的相應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)了氨基酸蘇氨酸。
在編碼區(qū)域第932位含有堿基胸腺嘧啶、并由此編碼在氨基酸序列第311位含有氨基酸異亮氨酸的天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的LysC等位基因，在下文中稱作lysCFBR等位基因或lysC T311I。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，攜帶lysCFBR等位基因lysC T311I的質(zhì)粒pCRIITOPOlysC以大腸桿菌菌株TOP10/pCRIITOPOlysC的純培養(yǎng)物形式于2001年4月20日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM14242。
1.2構(gòu)建取代載體pK18mobsacBglu1_1用谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032作染色體DNA供體。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株ATCC13032分離出染色體DNA。借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出帶有g(shù)luB基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌gluABCD基因簇的序列(Kronemeyer等人，Journal of Bacteriology，1771152-1158(1995))(登錄號(hào)X81191)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRgluBgl1(SEQ ID NO7)5′TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G 3′gluBgl2(SEQ ID NO8)5′AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G 3′
所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出攜帶有g(shù)luB基因及其周邊區(qū)域、大小約1.7kb的DNA片段。周邊區(qū)域是位于gluB上游、代表gluA基因3′末端、長約0.33kb的序列區(qū)段，以及位于gluB下游、代表gluC基因的5′末端、長約0.44kb的序列區(qū)段。此外這些引物還包含限制性內(nèi)切酶BglII的切割位點(diǎn)序列，其在如上所示核苷酸序列中用圓括號(hào)標(biāo)記。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約1.7kb并攜帶有菌株gluB基因及其周邊區(qū)域的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
然后用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目錄編號(hào)K4600-01)將片段連接進(jìn)載體pCRII-TOPO。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)。通過將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有卡那霉素(50mg/l)、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷，64mg/l)的LB瓊脂上涂板來選擇攜帶有質(zhì)粒的細(xì)胞。
分離DNA后，用限制性切割檢查所獲得的質(zhì)粒，并在瓊脂糖凝膠中鑒定。所得質(zhì)粒稱作pCRII-TOPOglu。
用限制性酶BglII(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割質(zhì)粒pCRII-TOPOglu，并在用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出長約1.7kb的gluB片段，將之與Sch_fer等人所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB(Gene 1469-73(1994))連接。該克隆載體事先用限制性酶BamHI切割并用堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，與長約1.7kb的gluB片段混合，用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBglu1。
從攜帶質(zhì)粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242(參見實(shí)施例1.1)分離出質(zhì)粒DNA，并用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割，用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出了長約1.7kb、含有l(wèi)ysCFBR的DNA片段，并將其與上述載體pK18mobsacBglu1相連。該克隆載體事先用限制性酶BamHI切割并用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，與長約1.7kb的lysCFBR片段混合，用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，InDNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBglu1_1。該質(zhì)粒圖譜示于附圖1。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的純培養(yǎng)物形式于2001年4月20日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM14243。
1.3利用取代載體pK18mobsacBglu1_1將lysCFBR等位基因lysCT311I的第二個(gè)拷貝整合進(jìn)菌株DSM13994的染色體(靶位點(diǎn)gluB基因)根據(jù)Sch_fer等人(Journal of Microbiology 1721663-1666(1990))的操作程序?qū)?shí)施例1.2中描述的載體pK18mobsacBglu1_1通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994。該載體不能在DSM13994中獨(dú)立復(fù)制，并且只有在整合進(jìn)染色體后才能保留在細(xì)胞中。將接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold SpringHarbor，紐約，1989)上涂板，選擇出帶有整合態(tài)pK18mobsacBglu1_1的克隆或轉(zhuǎn)接合子。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上涂板，并在33℃下培養(yǎng)48小時(shí)。
為了選擇由于發(fā)生第二次重組事件而使得其中質(zhì)粒被切除的突變體，將克隆在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)，然后在含有10％蔗糖的LB瓊脂上涂板，培養(yǎng)48小時(shí)。
質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1，如同起始質(zhì)粒pK18mobsacB一樣，除包含卡那霉素抗性基因外，還包含一個(gè)拷貝的編碼枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶的sacB基因。這一可被蔗糖誘導(dǎo)的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致形成果聚糖蔗糖酶，該酶催化合成對谷氨酸棒桿菌有毒性的產(chǎn)物果聚糖。因此只有那些由于第二次重組事件而切除了其中所整合的pK18mobsacBglu1_1的克隆才會(huì)在LB瓊脂上生長。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝出現(xiàn)在染色體中的gluB座位，或者保留宿主的原始gluB座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了大約20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。在此，從這些克隆的染色體DNA擴(kuò)增出了一個(gè)攜帶有g(shù)luB基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。選擇了與實(shí)施例1.2所述用于構(gòu)建整合質(zhì)粒的相同的引物寡核苷酸進(jìn)行PCR。
gluBgl1(SEQ ID NO7)5′TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G 3′gluBgl2(SEQ ID NO8)5′AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G 3′這些引物可以在帶有原始gluB座位的對照克隆中擴(kuò)增出大小約為1.7kb的DNA片段。從那些在染色體gluB座位帶有第二個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因的那些克隆中，擴(kuò)增出了大小約為3.4kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用同樣的方式鑒定到了一個(gè)克隆，它除了在lysC座位含有的一個(gè)拷貝外，還在染色體gluB座位含有第二個(gè)拷貝的lysCFRB等位基因lysCT311I。該克隆稱作菌株DSM13994glu∷lysC。
1.4利用取代載體pK18mobsacBglu1_1將lysCFBR等位基因lysCT311I這一形式的第二拷貝lysC基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)gluB基因)如實(shí)施例1.3中所述，將質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866。以實(shí)施例1.3中所述的方式鑒定到了一個(gè)克隆，它除了在lysC座位含有一個(gè)拷貝的野生型基因外，還在染色體gluB座位含有l(wèi)ysCFBR等位基因lysC T311I這一形式的第二拷貝lysC基因。該克隆稱作菌株DSM12866glu∷lysC。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，在gluB基因處含有第二個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因的本發(fā)明谷氨酸棒桿菌菌株以谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866glu∷lysC的純培養(yǎng)物形式于2002年6月5日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM15039。
1.5構(gòu)建取代載體pK18mobsacBpck1_1用谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032作染色體DNA供體。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株ATCC13032分離出染色體DNA。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出帶有pck基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌pck基因序列(EP1094111，和Riedel等人，Journal of Molecular andMicrobiological Biotechnology 3573-583(2001))(登錄號(hào)AJ269506)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRpck_beg(SEQ ID NO9)5′TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3′pck_end(SEQ ID NO10)5′AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guideto Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出攜帶有pck基因及其鄰近區(qū)域、大小約2.9kb的DNA片段。這些引物還包含限制性內(nèi)切酶BglII的切割位點(diǎn)序列，在如上所示核苷酸序列中用圓括號(hào)標(biāo)記。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約2.9kb并攜帶有pck基因及其周邊區(qū)域的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
然后用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目錄編號(hào)K4600-01)將片段連接進(jìn)載體pCRII-TOPO。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有卡那霉素(50mg/l)、X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上涂板來選擇攜帶有質(zhì)粒的細(xì)胞。
分離DNA后，用限制性切割檢查所獲得的質(zhì)粒，并在瓊脂糖凝膠中鑒定。所得質(zhì)粒稱作pCRII-TOPOpck。
用限制性酶BglII(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割質(zhì)粒pCRII-TOPOpck，并在用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出長約2.9kb的pck片段，將之與Sch_fer等人所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB(Gene 1469-73(1994))連接。該克隆載體事先用限制性酶BamHI切割并用堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，與長約2.9kb的pck片段混合，用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBpck1。
從攜帶質(zhì)粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242(參見實(shí)施例1.1)分離出質(zhì)粒DNA，并用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割，用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出了長約1.7kb、含有l(wèi)ysCFBR的DNA片段，并將其與上述載體pK18mobsacBpck1相連。該克隆載體事先用限制性酶BamHI切割并用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，與長約1.7kb的lysCFBR片段混合，用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，InDNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobdsacBpck1_1。該質(zhì)粒圖譜示于附圖3。
1.6利用取代載體pK18mobsacBpck1_1將lysCFBR等位基因lysCT311I這一形式的第二拷貝lysC基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)pck基因)如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例1.5中所述的質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_1接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866。如實(shí)施例1.3所述，選擇谷氨酸棒桿菌DSM12866染色體中的靶向重組事件。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝出現(xiàn)在染色體中的pck座位，或者保留宿主的原始pck座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了大約20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。在此，從這些克隆的染色體DNA擴(kuò)增出了一個(gè)攜帶有pck基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。選擇了與實(shí)施例1.5所述用于構(gòu)建整合質(zhì)粒的相同的引物寡核苷酸進(jìn)行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO9)5′TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3′pck_end(SEQ ID NO10)5′AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT 3′這些引物可以在帶有原始pck座位的對照克隆中擴(kuò)增出大小約為2.9kb的DNA片段。從那些在染色體pck座位帶有第二個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因的那些克隆中，擴(kuò)增出了大小約為4.6kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方式鑒定到了一個(gè)克隆，它除了在lysC座位帶有野生型基因拷貝外，還在染色體pck座位帶有l(wèi)ysCFBR等位基因lysC T311I這一形式的第二拷貝lysC基因。該克隆稱作菌株DSM12866pcklysC。
1.7構(gòu)建取代載體pK18mobsacBaecD1_1用谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032作染色體DNA供體。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株ATCC13032分離出染色體DNA。借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出帶有aceD基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌aecD基因序列(Rossol等人，Journal of Bacteriology 1742968-2977(1992))(登錄號(hào)M89931)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRaecD_beg(SEQ ID NO11)5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′aecD_end(SEQ ID NO12)5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出攜帶有aecD基因及其周邊區(qū)域、大小約2.1kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約2.1kb的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
用限制性酶BamHI和EcoRV(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割純化的DNA片段。之后將該片段連接進(jìn)載體pUC18(Norrander等人，Gene 26101-106(1983))。該載體事先用限制性酶BglII和SmaI切割，去磷酸化，與長約1.5kb、攜帶有aecD的片段混合，用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，The Netherlands)。將轉(zhuǎn)化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
分離DNA后，所獲質(zhì)粒通過限制性酶切割來檢查，在瓊脂糖凝膠中鑒定。所得質(zhì)粒稱作pUC18aecD。
從攜帶質(zhì)粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242(參見實(shí)施例1.1)分離出質(zhì)粒DNA，并用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割以及之后用Klenow聚合酶處理。用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出長約1.7kb、含lysCFBR的DNA片段，并將之與上述載體pUC18aecD連接。該載體事先用限制性酶StuI切割并用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，德國)去磷酸化，與長約1.7kb的lysCFBR片段混合，用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，InDNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pUC18aeCD1。
質(zhì)粒pUC18aecD1用限制性酶KpnI切割，之后用Klenow聚合酶處理。然后用限制性酶SalI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割該質(zhì)粒，借助QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出攜帶有aecD和lysC、約為3.2kb的片段，并將之與Sch_fer等人(Gene1469-73(1994))所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB連接。該載體事先用限制性酶SmaI和SalI切割，并用堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，與長約3.2kb、帶有aecD和lysC的片段混合，并用T4 DNA連接酶(Amer sham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBaecDl_1。該質(zhì)粒圖譜示于附圖2。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的純培養(yǎng)物形式于2002年6月5日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為DSM15040。
1.8利用取代載體pK18mobsacBaecD1-1將作為lysCFBR等位基因的第二拷貝lysC基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)aecD基因)如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例1.4中所述的質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866。如實(shí)施例1.3所述，選擇谷氨酸棒桿菌DSM12866染色體中的靶向重組事件。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝出現(xiàn)在染色體中的aecD座位，或者保留宿主的原始aecD座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了大約20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。在此，從這些克隆的染色體DNA中擴(kuò)增出了一個(gè)攜帶有aecD基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。選擇了與實(shí)施例1.7所述用于構(gòu)建整合質(zhì)粒的相同的引物寡核苷酸進(jìn)行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO11)5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′aecD_end(SEQ ID NO12)5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′這些引物可以在帶有原始aecD座位的對照克隆中擴(kuò)增出大小約為2.1kb的DNA片段。從那些在染色體aecD座位帶有第二拷貝lysCFBR等位基因的克隆中，擴(kuò)增出大小約為3.8kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方式鑒定到了一個(gè)克隆，它除了在lysC座位帶有野生型基因拷貝外，還在染色體aecD座位帶有l(wèi)ysCFBR等位基因lysC T311I這一形式的第二拷貝lysC基因。該克隆稱作菌株DSM12866aecD∷lysC。
實(shí)施例2將第二拷貝的ddh基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)gluB基因)2.1構(gòu)建取代載體pK18mobsacBglu2_1用谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032作染色體DNA供體。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株ATCC13032分離出染色體DNA。借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出帶有g(shù)luB基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌gluABCD基因簇序列(Kronemeyer等人，Journal of Bacteriology，1771152-1158(1995)；EP1108790)(登錄號(hào)X81191和AX127149)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRgluA_beg(SEQ ID NO13)5′CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC 3′gluD_end(SEQ ID NO14)5′CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出大小約為4.4kb、攜帶有g(shù)luB基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，目錄編號(hào)K4600-01)將該片段連接進(jìn)載體pCRII-TOPO。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)。將轉(zhuǎn)化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
分離DNA后，所獲質(zhì)粒通過限制性酶切割來檢查，在瓊脂糖凝膠中鑒定。所得質(zhì)粒稱作pCRII-TOPOglu2。
質(zhì)粒pCRII-TOPOglu2用限制性酶EcoRI和SalI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割，用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出長約3.7kb的gluB片段，并將之與Sch_fer等人(Gene 14，69-73(1994))所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB相連。該載體事先用限制性酶EcoRI和SalI切割并用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，與長約3.7kb的gluB片段混合，并用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBglu2。
如實(shí)施例2.1中所述，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)還擴(kuò)增出一段攜帶ddh基因的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌ddh基因簇序列(Ishino等人，Nucleic Acids Research 15，3917(1987))(登錄號(hào)Y00151)，
選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRddh_beg(SEQ ID NO15)5′CTG AAT CAA AGG CGG ACA TG 3′ddh_end(SEQ ID NO16)5′TCG AGC TAA ATT AGA CGT CG 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出大小約為1.6kb、帶有ddh基因的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約1.6kb并攜帶有ddh基因的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
純化后，將攜帶有ddh基因的片段與上述載體pK18mobsacBglu2連接。該載體事先用限制性酶BamHI做了部分切割。通過用Klenow聚合酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理載體，切割末端的突出被補(bǔ)平為鈍端，然后將該載體與長約1.6kb、帶有ddh基因的DNA片段混合，并用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理混合物。通過將Vent聚合酶(New England Biolabs，F(xiàn)rankfurt，德國)用于PCR反應(yīng)，產(chǎn)生了具有鈍端且適于連接進(jìn)經(jīng)過預(yù)處理的載體pK18mobsacBglu2中的、帶ddh的DNA片段。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，InDNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBglu2_1。該質(zhì)粒圖譜示于附圖4。
2.2利用取代載體pK18mobsacBglu2_1將第二拷貝的ddh基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)gluB基因)如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例2.1中所述的質(zhì)粒pK18mobsacBglu2_1接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866。如實(shí)施例1.3所述，選擇谷氨酸棒桿菌DSM12866染色體中的靶向重組事件。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，第二拷貝的ddh基因出現(xiàn)在染色體中的gluB座位，或者保留宿主的原始gluB座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了大約20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。在此，從這些克隆的染色體DNA擴(kuò)增出了一個(gè)攜帶有所述glu區(qū)域的DNA片段。選擇了與實(shí)施例2.1中所述用于構(gòu)建取代質(zhì)粒的相同的引物寡核苷酸進(jìn)行PCR。
gluA_beg(SEQ ID NO13)5′CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC 3′gluD_end(SEQ ID NO14)5′CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT 3′這些引物可以在帶有原始glu座位的對照克隆中擴(kuò)增出大小約為4.4kb的DNA片段。從在染色體glu座位帶有第二拷貝ddh基因的克隆中，擴(kuò)增出大小約為6kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方式鑒定到了一個(gè)克隆，它除了在ddh座位帶有一個(gè)拷貝外，還在染色體gluB座位帶有第二拷貝ddh基因。該克隆稱作菌株DSM12866glu∷ddh。
實(shí)施例3將第二拷貝的dapA基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)aecD基因)3.1構(gòu)建取代載體pK18mobsacBaecD2_1
用谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032作染色體DNA供體。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株ATCC13032分離出染色體DNA。借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出帶有aecD基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌aecD基因序列(Rossol等人，Journal of Bacteriology 1742968-2977(1992))(登錄號(hào)M89931)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRaecD_beg(SEQ ID NO11)5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′aecD_end(SEQ ID NO12)5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出攜帶有aecD基因及其鄰近區(qū)域、大小約2.1kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約2.1kb的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
用限制性酶BglII和EcoRV(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)切割純化的DNA片段。之后將該片段連接進(jìn)載體pUC18(Norrander等人，Gene 26101-106(1983))。該載體事先用限制性酶BamHI和SmaI切割，去磷酸化，與長約1.5kb、攜帶有aecD的片段混合，用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，The Netherlands)。將轉(zhuǎn)化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
分離DNA后，所獲質(zhì)粒通過限制性酶切割來檢查，在瓊脂糖凝膠中鑒定。所得質(zhì)粒稱作pUC18aecD。
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出另一個(gè)帶有dapA基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌dapA基因序列(Bonassi等人，Nucleic Acids Research 185421(1990))(登錄號(hào)X53993和AX127149)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRdapA_beg(SEQ ID NO17)5′CGA GCC AGT GAA CAT GCA GA 3′dapA_end(SEQ ID NO18)5′CTT GAG CAC CTT GCG CAG CA 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出攜帶有dapA基因及其鄰近區(qū)域、大小約1.4kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約1.4kb的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
純化后，將長約1.4kb、攜帶有dapA的DNA片段與上述載體pUC18aecD連接。該載體事先用限制性酶StuI切割，與長約1.4kb的DNA片段混合，并用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，InDNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pUC18aecD2。
質(zhì)粒pUC18aecD2用限制性酶SalI切割以及用EcoRI部分切割(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)，利用QIAquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離開后，從瓊脂糖凝膠中分離出長約2.7kb、帶有aecD和dapA的片段，并將之與Sch_fer等人(Gene 1469-73(1994))所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB連接。該克隆載體事先用限制性酶EcoRI和SalI切割并用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，BoehringerMannheim)去磷酸化，與帶有aecD和dapA、長約2.7kb的片段混合，用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBaecD2_1。質(zhì)粒圖譜示于附圖5。
3.2用取代載體pK18mobsacBaecD2_1將第二拷貝的dapA基因整合進(jìn)菌株DSM12866染色體中(靶位點(diǎn)aecD基因)如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例3.1中所述的質(zhì)粒pK18mobsacBaecD2_1接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866。如實(shí)施例1.3所述，選擇谷氨酸棒桿菌DSM12866染色體中的靶向重組事件。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，第二個(gè)拷貝的dapA基因出現(xiàn)在染色體中的aecD座位，或者保留宿主的原始aecD座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了大約20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。在此，從這些克隆的染色體DNA中擴(kuò)增出了一個(gè)攜帶有aecD基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。選擇了與實(shí)施例3.1中所述用于構(gòu)建整合質(zhì)粒的相同的引物寡核苷酸進(jìn)行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO11)5′GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC 3′aecD_end(SEQ ID NO12)5′AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3′這些引物可以在帶有原始aecD座位的對照克隆中擴(kuò)增出大小約為2.1kb的DNA片段。從那些在染色體aecD座位帶有第二拷貝dapA基因的克隆中，擴(kuò)增出大小約為3.6kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方式鑒定了一個(gè)克隆，它除了在dapA座位有一個(gè)拷貝之外，還在染色體的aecD座位具有第二拷貝的dapA基因。該克隆稱作菌株DSM12866aecD∷dapA。
實(shí)施例4將pyc等位基因pycP458S這一形式的第二拷貝pyc基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)pck基因)4.1構(gòu)建取代載體pK18mobsacBpck1_3將實(shí)施例1.5中所述的取代載體pK18mobsacBpck1作為插pyc等位基因的基礎(chǔ)載體。
如實(shí)施例2.1所述，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)還擴(kuò)增出帶有pyc基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌pyc基因簇序列(Peters-Wendisch等人，Journal of Microbiology 144915-927(1998))(登錄號(hào)Y 09548)，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRpyc_beg(SEQ ID NO19)5′TC(A CGC GT)C TTG AAG TCG TGC AGG TCA G 3′pyc_end(SEQ ID NO20)5′TC(A CGC GT)C GCC TCC TCC ATG AGG AAG A 3′所示引物由MWG Biotech合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增出大小約為3.6kb、帶有pyc基因的DNA片段。這些引物還包含限制性內(nèi)切酶MluI的切割位點(diǎn)序列，它在如上所示的核苷酸序列中用圓括號(hào)標(biāo)記。
用限制性內(nèi)切酶MluI切割所擴(kuò)增出的長約3.6kb、帶有pyc基因的DNA片段，通過在0.8％瓊脂糖凝膠中的電泳進(jìn)行鑒定，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
純化后，將帶有pyc基因的片段連入所述的載體pK18mobsacBpckl。該載體事先用限制性酶BssHII切割，用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，德國)去磷酸化，與帶有pyc基因、約3.6kb的DNA片段混合，并用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理混合物。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，InDNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBpck1_2。
4.2通過對野生型pyc基因進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變來構(gòu)建pyc等位基因pyc P458S用QuikChange位點(diǎn)定向誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，USA)完成位點(diǎn)定向誘變。EP-A-1108790描述了谷氨酸棒桿菌pyc基因中可以提高L-賴氨酸生產(chǎn)的點(diǎn)突變。基于pyc基因核苷酸序列第1372位胞嘧啶變成胸腺嘧啶的點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致在由該核苷酸序列衍生的氨基酸序列中第458位的脯氨酸被絲氨酸取代。該等位基因稱作pyc P458S。為形成所述突變，選擇以下引物寡核苷酸用于線性擴(kuò)增P458S-1(SEQ ID NO21)5′GGATTCATTGCCGATCAC(TCG) CACCTCCTTCAGGCTCCA 3′P458S-2(SEQ ID NO22)5′GTGGAGGAAGTCCGAGGT(CGA) GTGATCGGCAATGAATCC 3′所示引物由MWG Biotech合成。用于取代458位脯氨酸的絲氨酸的密碼子在如上所示的核苷酸序列中用圓括號(hào)標(biāo)記。將實(shí)施例4.1中所述的質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_2和兩個(gè)各自互補(bǔ)于該質(zhì)粒一條鏈的引物用于利用Pfu Turbo DNA聚合酶的線性擴(kuò)增。通過這一引物延長，形成了呈斷開環(huán)鏈的突變質(zhì)粒。用DpnI(該內(nèi)切酶特異性切割甲基化和半甲基化的模板DNA)處理線性擴(kuò)增產(chǎn)物。將這一新合成的、斷開的、突變的載體DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株XL1 Blue(Bullock，F(xiàn)ernandez和Short，BioTechniques(5)376-379(1987))。轉(zhuǎn)化后，XLl Blue細(xì)胞修復(fù)該突變質(zhì)粒中的斷裂(break)。在含有卡那霉素50mg/l的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。分離DNA后，利用限制性切割來檢查所獲得的質(zhì)粒，在瓊脂糖凝膠中鑒定。通過測序來檢查突變DNA片段的DNA序列。PCR產(chǎn)物的序列與Ohnishi等人(2002)所述的序列一致。所得質(zhì)粒稱作pK18mobsacBpck1_3。該質(zhì)粒圖譜示于附圖6。
4.3用取代載體pkl8mobsacBpck1_3將pyc等位基因pycP458S這一形式的第二拷貝pyc基因整合進(jìn)菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)pck基因)如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例4.2中所述的質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_3接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866。如實(shí)施例1.3所述，選擇谷氨酸棒桿菌DSM12866染色體中的靶向重組事件。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，第二拷貝的pyc等位基因出現(xiàn)在染色體中的pck座位，或者保留宿主的原始pck座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了大約20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。在此，從這些克隆的染色體DNA中擴(kuò)增出了一個(gè)攜帶有pck基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。選擇了與實(shí)施例1.5中所述用于構(gòu)建取代質(zhì)粒的相同的引物寡核苷酸進(jìn)行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO9)5′TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT 3′pck_end(SEQ ID NO10)5′AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTT ATT 3′這些引物可以在帶有原始pck座位的對照克隆中擴(kuò)增出大小約為2.9kb的DNA片段。從在染色體pck座位帶有第二拷貝pyc等位基因的克隆中，擴(kuò)增出大小約6.5kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方式鑒定到了一個(gè)克隆，它除了在pyc座位帶有一個(gè)拷貝的野生型基因外，還在染色體pck座位帶有pyc等位基因pycP458S這一形式的第二拷貝pyc基因。該克隆稱作菌株DSM12866pck∷pyc。
實(shí)施例5制備賴氨酸將實(shí)施例1、2、3和4中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994glu∷lysC、DSM12866glu∷lysC、DSM12866pck∷lysC、DSM12866aecD∷lysC、DSM12866glu∷ddh、DSM12866aecD∷dapA和DSM12866pck∷pyc培養(yǎng)在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并測定培養(yǎng)物上清液中的賴氨酸含量。
為此，首先在33℃將培養(yǎng)物在腦-心瓊脂平板(Merck，Darmstadt，德國)上培養(yǎng)24小時(shí)。從該瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(100ml錐形瓶中含10ml培養(yǎng)基)。用MM培養(yǎng)基作為預(yù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。在240rpm的搖床上于33℃培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)物24小時(shí)。從該預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，使主培養(yǎng)物的起始OD(660nm)為0.1OD。還將MM培養(yǎng)基用于主培養(yǎng)物。
MM培養(yǎng)基CSL5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓加熱滅菌) 50g/l鹽類(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4*7H2O 1.0g/lCaCl2*2H2O 10mg/lFeSO4*7H2O 10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l生物素(無菌過濾) 0.3mg/l硫胺素*HCl(無菌過濾) 0.2mg/lCaCO325g/l用氨水將CSL(玉米浸漬液)、MOPS(嗎啉代丙烷磺酸)和鹽溶液調(diào)至pH7，并高壓加熱滅菌。然后添加無菌基質(zhì)和維生素溶液，以及以干燥狀態(tài)高壓加熱滅菌的CaCO3。
在含10ml體積培養(yǎng)基的100ml帶擋板錐形瓶中完成培養(yǎng)。于33℃和80％大氣濕度中進(jìn)行培養(yǎng)。
48小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長處測定OD。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德國)的氨基酸分析儀通過離子交換層析和柱后衍生茚三酮檢測法測定所形成的賴氨酸量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表14。
表14
實(shí)施例6將一個(gè)拷貝的lysC_T3111I-等位基因整合進(jìn)菌株DSM13992染色體的基因間區(qū)域ncode16.1構(gòu)建交換載體pK18mobsacBnc1∷lysC用谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994(參見實(shí)施例1)作染色體DNA供體。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從菌株DSM13994分離出染色體DNA。借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴(kuò)增出具有標(biāo)記作“ncode1”的染色體基因間區(qū)域的DNA片段(SEQ ID NO23)。該區(qū)域位于谷氨酸棒桿菌基因組序列第27398至28707位，它可以從登錄代碼AX127149(參見表12)獲得。根據(jù)該區(qū)域的已知序列，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCR引物ncode 1(SEQ ID NO24)5′GA(A GAT CT)A AGC TCT ATT GTC CCC TAC G 3′引物ncode 2(SEQ ID NO25)5′GAT CCT TTT AAA AGC CAG TAA CAA G 3′引物ncode 3(SEQ ID NO26)5′CTT GTT ACT GGC TTT TAA AAGGAT CCT_ATT AAA GAA CAC TCC CCTAT 3′所示引物由MWG Biotech公司合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR protocols.A guide to methods and applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR，其中首先用引物組合ncode 1和ncode 2或者ncode 3和ncode 4擴(kuò)增出兩種產(chǎn)物，然后以這兩種產(chǎn)物為模板與引物組合ncode 1和ncode 4一起用于第二次PCR。在這種方式中，所選擇的引物可以擴(kuò)增出大小約1.2kb的DNA片段，該片段在基因間區(qū)域具有一個(gè)人造的限制性內(nèi)切酶BarnHI的接口(用下劃線強(qiáng)調(diào)(SEQID NO28))。此外，這些引物還包含限制性內(nèi)切酶Bglll的接口序列，它在上述核苷酸系列中用括號(hào)標(biāo)示。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的長約1.2kb、具有基因間區(qū)域ncode1的DNA片段，并用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化(QIAquick凝膠抽提試劑盒，Qiagen，Hilden)。
接下來，用Topo TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，Netherlands，目錄編號(hào)K4600-01)將該片段連接進(jìn)載體pCRII-TOPO。將連接物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，Netherlands)。將轉(zhuǎn)化物在含有卡那霉素(50mg/l)和X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上涂板，由此選擇出攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
分離DNA后，所得質(zhì)粒通過限制性斷裂來加以證實(shí)，和在瓊脂糖凝膠中鑒定。所得質(zhì)粒稱作pCRII-TOPOnc。
用限制性酶BglII(Amersham-Pharmarcia，F(xiàn)reiburg，德國)切割質(zhì)粒pCRII-TOPOnc，并隨后在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離，用Qiagenquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)從瓊脂糖凝膠中分離出長約1.2kb的片段，將該片段與Sch_fer等人(Gene 1469-73(1994))所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB連接。該載體首先用限制性酶BarnHI斷開并用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim)去磷酸化，與長約1.2kb的片段混合，并用T4-DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該培養(yǎng)物。
之后，用連接培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedings of the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA cloning.A practical approach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物在添加有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold SpringHarbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過用酶Xbal進(jìn)行限制性切割及隨后瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBnc。
用限制性酶BamHI(Amersham-Pharmarcia，F(xiàn)reiburg，德國)切割實(shí)施例1中所述的質(zhì)粒pCRIITOPOlysC。用Qiagenquick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離之后，從瓊脂糖凝膠中分離出長約1.7kb、包含lysCT311I的DNA片段，并將其與上述載體pK18mobsacBnc連接。該載體首先用限制性酶BamHI斷開并用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Boehringer Mannheim，德國)去磷酸化，與長約1.7kb的片段混合，并用T4-DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該培養(yǎng)物。
之后，用連接培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5omcr(LifeTechnologies GmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，In.DNA cloning.A practical approach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物在添加有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA laboratory manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過用酶HindIII和Xbal進(jìn)行限制性切割以及隨后的瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBnc∷lysC。附圖7顯示了該質(zhì)粒的圖譜。
6.2利用交換載體pK18mobsacBnc∷lysC將IYSCFBM等位基因lysCT311I這一形式的第二拷貝lysC基因整合進(jìn)菌株DSM13992的染色體(靶位點(diǎn)基因間區(qū)域ncode1)根據(jù)Sch_fer等人的改良方案(1990Journal of Microbiology1721663-1666)將實(shí)施例6.1中命名的載體pK18mobsacBnc∷lysC轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM13992。
通過重復(fù)的非定向誘變、選擇和突變體選擇從谷氨酸棒桿菌ATCC13032制備出谷氨酸棒桿菌菌株DSM13992。該菌株對抗生素鏈霉素有抗性，和對賴氨酸類似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸在表型上有抗性。然而，該菌株具有對由賴氨酸和蘇氨酸(各25mM)的混合物引起的抑制敏感的野生型天冬氨酸激酶。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該菌株的純培養(yǎng)物于2001年1月16日在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國)登記。
載體pK18mobsacBnc∷lysC不能在DSM13992中獨(dú)立復(fù)制，并且只有在通過重組而整合進(jìn)染色體后才能保留在細(xì)胞中。
將接合培養(yǎng)物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrock等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇出那些帶有整合的pK18mobsacBnc∷lysC的克隆。將已經(jīng)開始生長的克隆在含有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂板上涂板，于33℃培養(yǎng)16小時(shí)。為了實(shí)現(xiàn)通過第二次重組事件切除質(zhì)粒，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后用10％蔗糖起始這些克隆。質(zhì)粒pK18mobsacB包含一個(gè)拷貝的sacB基因，該基因可以將蔗糖轉(zhuǎn)化為對谷氨酸棒桿菌有毒性的果聚糖。
因此，只有整合的pK18mobsacBnc∷lysC已經(jīng)被再次切除的克隆才能在含有蔗糖的LB瓊脂上生長。依據(jù)切除時(shí)第二次重組事件發(fā)生的位置，或者一個(gè)拷貝的lysC及其周邊基因間區(qū)域ncode1與該質(zhì)粒一同被切除，或者僅僅是基因間區(qū)域ncode1被切除。
為了證明lysC拷貝保留在染色體的基因間區(qū)域ncode1中，根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)研究了大約20個(gè)表現(xiàn)“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。在此，從這些克隆的染色體DNA擴(kuò)增出了一個(gè)攜帶有l(wèi)ysC基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCR
3371V(SEQ ID NO29)5′TAT CAT GCG GTG AGC TGT GA 3′3372N(SEQ ID NO30)5′TAG GGG TGA TGT GCT ACT GT 3′這些引物可以在具有原始ncode1位點(diǎn)的對照克隆中擴(kuò)增出大小約為1.3kb的DNA片段。從那些在染色體的基因間區(qū)域ncode1中具有一個(gè)拷貝的lysC基因的克隆中，可以擴(kuò)增出大小約3.0kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方式鑒定到了一個(gè)克隆，它除了在lysC位點(diǎn)具有一個(gè)拷貝外，還在染色體的基因間區(qū)域ncode1中具有第二個(gè)拷貝的lysCFBR等位基因lysC T311I。該克隆名為菌株DSM13992nc∷lysC。
實(shí)施例7將第二拷貝的ilvD基因整合進(jìn)乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)菌株FERM BP-1763的染色體(靶位點(diǎn)ddh基因)將第二拷貝的編碼二羥酸脫水酶的基因ilvD，導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌菌株FERM BP-1763的編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因，以提高該菌株的纈氨酸生產(chǎn)。
乳發(fā)酵短桿菌菌株FERM BP-1763是對霉酚酸有抗性的纈氨酸生產(chǎn)者(US-A-5,188,948)。它是L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型的。
7.1.分離菌株FERM BP-1763的ilvD基因的DNA用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從乳發(fā)酵短桿菌菌株FERM BP-1763分離出染色體DNA。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出包含ilvD基因的DNA區(qū)段。谷氨酸棒桿菌的ilvD基因序列是已知的(Genbank登錄號(hào)AJ012293；DE19907567的SEQ.ID.No.1，登錄號(hào)AX034412，和EP1108790的SEQ.ID.No.7063和1399，登錄號(hào)AX127147和AX121483)。現(xiàn)存大量資料表明乳發(fā)酵短桿菌和谷氨酸棒桿菌即使不相同也是極為相關(guān)的(Abe等人，Journal of General and Applied Microbiology 13279-301(1967)；Suzuki等人，International Journal of SystematicBacteriology 31131-138(1981))。因此，根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌ilvD基因序列，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRilvD-A1(SEQ ID NO31)5′ATC GTCTCT AGACTT GGA GCG CCA AAA GGC AC 3′ilvD-E1(SEQ ID NO32)5′GTC ATCTCT AGATCG AGG CAG AGT TCG CTG GT 3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。這些引物可以擴(kuò)增長約2970bp、帶有ilvD基因及其周邊區(qū)域的DNA片段。這些周邊區(qū)域包含ilvD基因編碼區(qū)域約284bp的上游區(qū)域和約819bp的下游區(qū)域。這些引物還包含限制性內(nèi)切酶XbaI的切割位點(diǎn)序列，它在上述核苷酸序列中用下劃線標(biāo)記。
用限制性內(nèi)切酶XbaI切割所擴(kuò)增出的攜帶ilvD基因及其上游和下游區(qū)域的DNA片段，并在0.8％瓊脂糖凝膠中通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化出長約2.95kb的DNA片段(High Pure PCR Product Purification Kit，Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德國)。
7.2構(gòu)建取代載體pK18mobsacBddh∷ilvD以實(shí)施例7.1中從菌株FERM BP-1763分離的染色體DNA為模板，構(gòu)建ddh整合盒。術(shù)語“ddh整合盒”表示主要由ddh基因序列組成的DNA區(qū)段，它包括一個(gè)人造的限制酶位點(diǎn)，在這個(gè)位點(diǎn)中可以插入其它基因或序列。該最終結(jié)構(gòu)可用于將基因或其它DNA序列整合進(jìn)染色體ddh基因中。
根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌ddh基因序列(Ishino等人，NucleicAcids Research 15(9)，319及以下(1987)，Genbank登錄號(hào)Y00151，以及EP1108790的SEQ ID No.7068和Nr.3494，登錄號(hào)AX127152和AX123578)，選擇以下引物寡核苷酸，利用基因SOEing法(GeneSplicing by Overlap Extension，Horton，MolecularBiotechnology 393-98(1995))，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來產(chǎn)生ddh整合盒ddh_del1(SEQ ID NO33)5′ATC GTCGCT AGCCCA ACG AAT CTC CAC GAG ACG 3′ddh_del2(SEQ ID NO34)5′GAC ATC CGC ACC ATG CCT GA 3′ddh_del3(SEQ ID NO35)5′TCA GGC ATG GTG CGG ATGTCT AGAGTC GGC AAC CAC GAA GCA TT3′ddh_del4(SEQ ID NO36)5′ATG CTCGCT AGCATG ACC AAC ATC CGC GTA GC 3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。引物ddh_del1和ddh_del4各包含限制性內(nèi)切酶NheI的切割位點(diǎn)序列(在上述核苷酸序列中用下劃線表示的序列)。引物ddh_del3由兩個(gè)核苷酸序列區(qū)域構(gòu)成，其中一個(gè)與ddh基因編碼區(qū)域第653至634位核苷酸結(jié)合，另一個(gè)與第606至587位核苷酸結(jié)合。在這兩個(gè)區(qū)域之間，刪除了ddh基因編碼區(qū)域的27個(gè)堿基對，并在引物ddh_del3的這兩個(gè)區(qū)域之間插入了四個(gè)堿基“TAGA”以形成一個(gè)限制性內(nèi)切酶XbaI的人造切割位點(diǎn)。這四個(gè)堿基用斜體字母標(biāo)出，該XbaI位點(diǎn)在上述序列中用下劃線標(biāo)注。引物ddh_del3的5′-末端區(qū)域反向互補(bǔ)于引物ddh_del2。
通過PCR，引物ddh_del1和ddh_del2可以擴(kuò)增出長約0.75kb的DNA片段，它包含ddh基因的3′-末端區(qū)域和下游區(qū)域，引物ddh_del3和ddh_del4可以擴(kuò)增出長約0.64kb的DNA片段，它包含ddh基因的5′-末端區(qū)域。之后在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，用常規(guī)方法(High Pure PCR ProductPurification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國)將其從凝膠中分離和純化。這兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物可以一起用作另一使用引物ddh_del1和ddh_del4的PCR反應(yīng)的模板。這產(chǎn)生大小約1.38kb、包含ddh基因的ddh整合盒，它包括31bp的缺失和一個(gè)人造的限制性酶XbaI切割位點(diǎn)，和ddh基因下游412bp的區(qū)域。
用限制性內(nèi)切酶NheI切割這一ddh整合盒，并通過在0.8％瓊脂糖凝膠中的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用常規(guī)方法(High Pure PCR ProductPurification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國)從凝膠中分離和純化出長約1.36kb的DNA片段，并將之與Sch_fer等人(Gene14569-73(1994))所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB連接。該載體pK18mobsacB事先用限制性內(nèi)切酶XbaI切割并用堿性磷酸酶(Boehringer，Mannheim)去磷酸化，之后與ddh整合盒混合，并用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理。限制性切割酶NheI和XbaI的粘性末端是互補(bǔ)的，這樣的連接產(chǎn)物不再能被這兩種酶中的任何一種切割。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBddh_Xba。
用限制性酶XbaI切割載體pK18mobsacBddh_Xba，該酶只在ddh整合盒內(nèi)部的人造XbaI-位點(diǎn)處切割一次。然后用堿性磷酸酶使(Boehringer Mannheim，德國)該載體去磷酸化，并將之與獲自實(shí)施例7.1、長約2.95kb、已經(jīng)用限制性酶XbaI切割過的ilvD片段混合。用T4DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
然后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，In.DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold SpringHarbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割以及隨后的瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobs acBddh∷ilvD。附圖8顯示了該質(zhì)粒的圖譜。
7.3將第二拷貝的ilvD基因整合進(jìn)染色體(靶位點(diǎn)ddh基因)根據(jù)Sch_fer等人的方案(Journal of Microbiology 1721663-1666(1990))將實(shí)施例7.2中所述的載體pK18mobsacBddh∷ilvD接合轉(zhuǎn)移進(jìn)乳發(fā)酵短桿菌菌株FERM BP-1763。該載體不能在FERMBP-1763中獨(dú)立復(fù)制，并且只有在整合進(jìn)染色體后才能保留在細(xì)胞中，要么如同此處所必需的整合進(jìn)ddh區(qū)域，要么整合進(jìn)ilvD區(qū)域。首先，將接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，選擇出在染色體內(nèi)整合了pK18mobsacBddh∷ilvD的克隆或轉(zhuǎn)接合子。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上涂板，并在33℃下培養(yǎng)48小時(shí)。之后就質(zhì)粒在ddh座位的整合篩選所得轉(zhuǎn)接合子。
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，檢測了20個(gè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子的質(zhì)粒pK18mobsacBddh∷ilvD在ddh座位的整合。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))分離這些克隆的染色體DNA。選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRddh-int1(SEQ ID NO37)
5′-attcttccgcgaccgcgata-3′ddh-A1(SEQ ID NO38)5′-ccggataaaccaccatgaac-3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成。它們位于ddh整合盒外，可以從在ilvD座位整合有載體pK18mobsacBddh∷ilvD的克隆的DNA擴(kuò)增出約1.45kb的PCR片段。如果將這一大小約為10kb的載體整合進(jìn)ddh座位，則不能得到可見的擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。
利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定所擴(kuò)增的DNA片段。
利用兩個(gè)不顯示可見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆來選擇其中由于第二次重組事件的發(fā)生而使得質(zhì)粒被切除的克隆。將克隆在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)，之后在含有10％蔗糖的LB瓊脂上涂板，并培養(yǎng)48小時(shí)。
如同起始質(zhì)粒pK18mobsacB，質(zhì)粒pK18mobsacBddh∷ilvD除包含卡那霉素抗性基因外，還包含一個(gè)拷貝的編碼枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。這一可被蔗糖誘導(dǎo)的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致形成果聚糖蔗糖酶，該酶催化合成對谷氨酸棒桿菌有毒性的產(chǎn)物果聚糖。因此只有那些由于第二次重組事件而切除了其中整合的pK18mobsacBddh∷ilvD的克隆才會(huì)在添加了蔗糖的LB瓊脂上生長。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，第二個(gè)拷貝的ilvD基因出現(xiàn)在ddh座位，或者保留宿主的原始ddh座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology1401817-1828(1994))從這些克隆分離出染色體DNA。
選擇已在本實(shí)施例中描述過的引物寡核苷酸ddh-int1和ddh-A1(SEQ ID NO38和SEQ ID NO39)并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)完成PCR。這些引物可以擴(kuò)增出包含ddh基因的DNA片段。在帶有原始ddh座位的對照克隆中可以擴(kuò)增出大小約1.65kb的DNA片段。從在染色體ddh座位整合有第二拷貝ilvD基因的克隆中，可以擴(kuò)增出大小約4.6kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方法鑒定到了一個(gè)克隆，它在染色體ddh座位整合有一個(gè)拷貝的ilvD基因。該克隆稱作菌株FERM BP-1763ddh∷ilvD。
實(shí)施例8L-纈氨酸的生產(chǎn)在適于生產(chǎn)纈氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)實(shí)施例7.3中獲得的乳發(fā)酵短桿菌菌株FERM BP-1763ddh∷ilvD并檢測培養(yǎng)物上清液中的纈氨酸含量。
為此，首先于33℃在瓊脂平板(腦/心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。從這個(gè)瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(100ml錐形瓶中含10ml培養(yǎng)基)。用完全培養(yǎng)基CgIII(2.5g/l NaCl，10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，pH7.4，20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓加熱滅菌)作為此預(yù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。于33℃將預(yù)培養(yǎng)物在240rpm的搖床上培養(yǎng)48小時(shí)。從這一預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，使主培養(yǎng)物的起始光密度(OD，660nm)為0.1OD。主培養(yǎng)物使用MM培養(yǎng)基。
MM培養(yǎng)基CSL(玉米浸漬液) 5g/lMOPS(嗎啉代丙烷磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓加熱滅菌) 50g/l鹽類(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/l
MgSO4*7H2O1.0g/lCaCl2*2H2O10mg/lFeSO4*7H2O10mg/lMnSO4*H2O 5.0mg/l異亮氨酸(無菌過濾) 0.1g/l甲硫氨酸(無菌過濾) 0.1g/l硫胺素*HCl(無菌過濾) 0.2mg/l亮氨酸(無菌過濾) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL、MOPS和鹽溶液調(diào)至pH7，并高壓加熱滅菌。然后添加無菌基質(zhì)和維生素溶液，以及以干燥狀態(tài)高壓加熱滅菌的CaCO3。
在含10ml體積培養(yǎng)基的100ml帶擾流器(flow spoilers)的錐形瓶中完成培養(yǎng)。于33℃和80％大氣濕度中進(jìn)行培養(yǎng)。
48小時(shí)后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長處測定OD。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德國)的氨基酸分析儀通過離子交換層析和柱后衍生茚三酮檢測法測定所形成的纈氨酸量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表15。
表15
實(shí)施例9將第二拷貝的色氨酸操縱子整合進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21850染色體(靶位點(diǎn)基因間區(qū)域ncode1)(US 3,849,251)將第二拷貝的色氨酸操縱子導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21850的基因間區(qū)域ncode1(區(qū)域ncode1對應(yīng)于谷氨酸棒桿菌基因組第27398和28707位間的序列，參見表12、實(shí)施例6.1和SEQ ID NO23)以提高該菌株的L-色氨酸生產(chǎn)。
谷氨酸棒桿菌的色氨酸操縱子含有基因trpL，它編碼對于衰減控制很重要的色氨酸操縱子引導(dǎo)肽，基因trpE，它編碼鄰氨基苯甲酸合酶成分I，基因trpG，它編碼鄰氨基苯甲酸合酶成分II，基因trpD，它編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，基因trpC，它編碼磷酸核糖基鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶，基因trpB，它編碼色氨酸合酶(β鏈)，和基因trpA，它編碼色氨酸合酶(α鏈)。
谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21850(US 3,849,251)是對L-色氨酸和其它芳香族氨基酸的化學(xué)類似物具有多重抗性的色氨酸生產(chǎn)者。它是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸營養(yǎng)缺陷型的。
來自ATCC21850的基因trpL的核苷酸序列在第42位由腺嘌呤代替鳥嘌呤。這導(dǎo)致編碼引導(dǎo)肽第14位氨基酸色氨酸的密碼子tgg變成終止密碼子tga。該無義突變的位置防止終止結(jié)構(gòu)的形成并導(dǎo)致組成型抗終止應(yīng)答(Heery和Dunican，Applied and EnvironmentalMicrobiology 59(3)791-799(1993))。
9.1.分離包含菌株ATCC21850的色氨酸操縱子的DNA用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21850分離染色體DNA。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出帶有色氨酸操縱子的DNA區(qū)段。谷氨酸棒桿菌的染色體核苷酸序列是已知的，可以在專利申請EP-A-1108790和歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國和Cambridge，UK)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫的登錄號(hào)AX114121中找到。還可以在國家醫(yī)學(xué)圖書館(Bethesda，MD，USA)的國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫中找到它。色氨酸操縱子中的基因核苷酸序列的登錄號(hào)為AX123436(trpE)、AX123438(trpG)、AX123439(trpD)、AX123440(trpC)、AX123442(trpB)和AX123443(trpA)。可以在登錄號(hào)M17892下找到trpL的核苷酸序列。
根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌色氨酸操縱子序列，選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRtrp-A1(SEQ ID NO39)5′GTACGGA TCCCAA GGA CAG CTC GTG TAG AC 3′trp-E1(SEQ ID NO40)5′AGCTGGA TCCCAC CGG CTC GAA GCT AAG AT 3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，用Eppendorf(Hamburg，德國)的TripleMaster PCR系統(tǒng)完成PCR反應(yīng)。這些引物可以擴(kuò)增出長約7.95kb、帶有色氨酸操縱子及其周邊區(qū)域的DNA片段。這些引物還包含限制性內(nèi)切酶BamHI的切割位點(diǎn)序列，它在上述核苷酸序列中用下劃線標(biāo)記。
用限制性內(nèi)切酶BamHI切割所擴(kuò)增出的帶有色氨酸操縱子及其上游和下游區(qū)域的DNA片段，并通過在0.8％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。用常規(guī)方法從凝膠中分離和純化長約7.93kb的DNA片段(高純度PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國)。
9.2構(gòu)建取代載體pK18mobsacBnc∷trp在實(shí)施例6.1中獲得的質(zhì)粒pK18mobsacBnc包含基因間區(qū)域ncodel(SEQ ID NO23)。該質(zhì)粒用限制性酶BamHI切割，然后用堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim，德國)去磷酸化，與獲自實(shí)施例9.1包含色氨酸操縱子、已用限制性酶BamHI切割并純化的DNA片段混合。用T4DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
然后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，In.DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷.ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，ColdSpring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割以及隨后的瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBnc∷trp。該質(zhì)粒的圖譜示于附圖9。
9.3將第二拷貝的色氨酸操縱子整合進(jìn)染色體基因間區(qū)域ncode1用Sch_fer等人的方案(Journal of Microbiology 1721663-1666(1990))將實(shí)施例9.2中所述的載體pK18mobsacBnc∷trp接合轉(zhuǎn)移進(jìn)菌株ATCC21850。該載體不能在ATCC21850中獨(dú)立復(fù)制，并且只有在整合進(jìn)染色體后才能保留在細(xì)胞中，要么如同此處所必需的整合進(jìn)ncode1區(qū)域，要么整合進(jìn)色氨酸操縱子區(qū)域。首先，將接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual.第二版，Cold SpringHarbor，紐約，1989)上涂板，選擇出在染色體內(nèi)整合了pK18mobsacBnc∷trp的克隆或轉(zhuǎn)接合子。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上涂板，并在33℃下培養(yǎng)48小時(shí)。然后就發(fā)生在ncode1區(qū)域內(nèi)的整合事件篩選所得的轉(zhuǎn)接合子。
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，檢測了20個(gè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子的質(zhì)粒pK18mobsacBnc∷trp在ncode1座位的整合。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))分離這些克隆的染色體DNA。選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRncode1-A1(SEQ ID NO41)5′-ACT ATC ATG CGG TGA GCT GT-3′ncodel-E1(SEQ ID NO42)5′-GGC AGC TCT GTA GCC ATA TT-3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成。它們位于染色體內(nèi)ncodel區(qū)域的克隆部分之外，可以從具有整合進(jìn)色氨酸操縱子的載體pK18mobsacBnc∷trp的克隆的DNA擴(kuò)增出約1.47kb的PCR片段。如果這一大小為14.9kb的載體整合進(jìn)ncode1區(qū)域，將不會(huì)出現(xiàn)可見擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。
利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定所擴(kuò)增的DNA片段。
利用兩個(gè)不顯示可見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆來選擇其中由于第二次重組事件的發(fā)生而使得質(zhì)粒被切除的克隆。將克隆在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)，之后在含有10％蔗糖的LB瓊脂上涂板，并培養(yǎng)48小時(shí)。
如同起始質(zhì)粒pK18mobsacB，質(zhì)粒pK18mobsacBnc∷trp除包含卡那霉素抗性基因外，還包含一個(gè)拷貝的編碼枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。這一可被蔗糖誘導(dǎo)的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致形成果聚糖蔗糖酶，該酶催化合成對谷氨酸棒桿菌有毒性的產(chǎn)物果聚糖。因此只有那些由于第二次重組事件而切除了其中整合的pK18mobsacBnc∷trp的克隆才會(huì)在添加了蔗糖的LB瓊脂上生長。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，第二個(gè)拷貝的色氨酸操縱子出現(xiàn)在ncode1座位，或者保留宿主的原始ncode1座位。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從這些克隆分離出染色體DNA。
選擇已在本實(shí)施例中描述的引物寡核苷酸ncode1-A1(SEQ IDNO41)，和另一個(gè)引物trp-test進(jìn)行PCRtrp-test(SEQ ID NO43)5′-CCA ACC ACG ATG AGA AGG AC -3′根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，1990，Academic Press)完成PCR。這些引物只可以從在染色體ncode1區(qū)域內(nèi)整合有第二個(gè)拷貝的trp操縱子的克隆中擴(kuò)增大小約為0.92kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方式鑒定了一個(gè)在染色體基因間區(qū)域ncode1內(nèi)整合有一個(gè)拷貝色氨酸操縱子的克隆。該克隆稱作菌株ATCC21850nc∷trp。
實(shí)施例10將色氨酸操縱子的第二拷貝整合進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21850染色體(靶位點(diǎn)噬菌體組件pha1)(US 3,849,251)在本實(shí)施例中，將第二個(gè)拷貝的色氨酸操縱子導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌ATCC21850的噬菌體組件phal(Genebank登錄號(hào)AX127149第88231-89445位核苷酸，參見表13)以提高菌株的色氨酸生產(chǎn)。
10.1構(gòu)建取代載體pK18mobsacBpha1∷trp以實(shí)施例9.1中分離的菌株ATCC21850染色體DNA作為擴(kuò)增噬菌體組件pha1整合盒的模板。術(shù)語“噬菌體組件pha1整合盒”表示主要由噬菌體組件pha1序列組成的DNA區(qū)段，包括一個(gè)可以插入其它基因或序列的人工構(gòu)建的限制性酶BamHI位點(diǎn)。該最終結(jié)構(gòu)可用于將基因或其它DNA序列整合進(jìn)染色體噬菌體組件pha1。
通過SOEing法(Gene Splicing by Overlap Extension，Horton，Molecular Biotechnology 393-98(1995))利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增噬菌體組件phal整合盒。表13中提到了谷氨酸棒桿菌的噬菌體組件phal的核苷酸序列，它可以在Genebank登錄號(hào)AX127149下的核苷酸序列第88231-89445位找到。選擇以下引物進(jìn)行PCRpha1-int1(SEQ ID NO44)5′A GTCGTC GACGCT ATC AAC GCT TCG ATC AC 3′pha1-int2(SEQ ID NO45)5′CTG TCT CGT ACG GAT GAC AG 3′pha1-int3(SEQ ID NO46)5′CTG TCA TCC GTA CGA GAC AGG GAT CCA TAC CTT GCC AGT CAA ATCT 3′pha1-int4(SEQ ID NO47)5′G TCAGAA TTCGCA GCA TGT AAC GGA TAG GT 3′
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成，并根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。引物pha1-int1和pha1-int 4包含限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRI的切割位點(diǎn)序列，它們在上述核苷酸序列中用下劃線標(biāo)示。引物pha1-int3由噬菌體組件pha1核苷酸序列的兩個(gè)區(qū)域組成，在這兩個(gè)區(qū)域之間刪除了該核苷酸序列的17個(gè)堿基并整合了五個(gè)堿基“GATCC”以形成一個(gè)人造的限制性內(nèi)切酶BamHI切割位點(diǎn)。在上述序列中這五個(gè)堿基用斜體字母標(biāo)示，BamHI位點(diǎn)用下劃線標(biāo)示。引物pha1-int3的5′-末端區(qū)域反向互補(bǔ)于引物pha1-int2。
借助PCR，引物pha1-int1和pha1-int2可以擴(kuò)增出長約0.59kb的DNA片段，引物pha1-int3和pha1-int4可以擴(kuò)增出長約0.9kb的DNA片段。之后在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，用常規(guī)方法(High Pure PCR Product Purification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國)將其從凝膠中分離和純化。這兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物可以一起用作另一使用引物pha1-int1和pha1-int4的PCR反應(yīng)的模板。這產(chǎn)生大小約1.48kb、包含噬菌體組件pha1及其周邊區(qū)域的噬菌體組件pha1整合盒，它包括17bp的缺失和一個(gè)人造的限制性酶BamHI切割位點(diǎn)。
用限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRI切割噬菌體組件pha1整合盒，并在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。用常規(guī)方法(HighPure PCR Product Purification Kit，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國)從凝膠中分離和純化出長約1.47kb的DNA片段，并將之與Sch_fer等人(Gene 14569-73(1994))所述的可移動(dòng)的克隆載體pK18mobsacB連接。該載體pK18mobsacB事先用限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRI切割，之后與噬菌體組件pha1整合盒混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理。
之后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人；Proceedingsof the National Academy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)(Hanahan，In.DNA Cloning.A Practical Approach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen的QIAprep SpinMiniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳來檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBphal。
用限制性酶BamHI切割載體pK18mobsacBpha1，該酶只在噬菌體組件pha1整合盒內(nèi)部的人造BamHI-位點(diǎn)處切割一次。然后用堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim，德國)使該載體去磷酸化，并將之與獲自實(shí)施例9.1、包含色氨酸操縱子、已經(jīng)用限制性酶BamHI切割并純化過的DNA片段混合。用T4DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國)處理該混合物。
然后用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life TechnologiesGmbH，Karlsruhe，德國)(Hanahan，In.DNA Cloning.A PracticalApproach.第1卷，ILR-Press，Cold Spring Harbor，紐約，1989)。將轉(zhuǎn)化物在添加有50mg/l卡那霉素的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual。第二版，Cold SpringHarbor，紐約，1989)上涂板，由此選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
用Qiagen公司的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性切割以及隨后的瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行檢查。該質(zhì)粒稱作pK18mobsacBpha1∷trp。附圖10顯示了該質(zhì)粒的圖譜。
10.3將色氨酸操縱子的第二個(gè)拷貝整合進(jìn)染色體(靶位點(diǎn)噬菌體組件pha1)用Sch_fer等人的方案(Journal of Microbiology 1721663-1666(1990))將實(shí)施例10.2中所述的載體pK18mobsacBpha1∷trp接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌ATCC21850。該載體在ATCC21850中不能獨(dú)立復(fù)制，并且只有在整合進(jìn)染色體后才能保留在細(xì)胞中，要么如同此處所必需的整合進(jìn)噬菌體組件pha1，要么整合進(jìn)色氨酸操縱子。首先，將接合物在添加了15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB瓊脂(Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual.第二版，Cold Spring Harbor，紐約，1989)上涂板，選擇出在染色體內(nèi)整合了pK18mobsacpha1∷trp的克隆或轉(zhuǎn)接合子。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子在含有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上涂板，并在33℃下培養(yǎng)48小時(shí)。之后質(zhì)粒在噬菌體組件pha1中的整合篩選所得轉(zhuǎn)接合子。
利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，檢測了20個(gè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子的質(zhì)粒pK18mobsacBpha1∷trp在噬菌體組件pha1的整合。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))分離這些克隆的染色體DNA。選擇以下引物寡核苷酸進(jìn)行PCRpha1-test1(SEQ ID NO48)5′-GCG CTC CAT CAC TAG AGT TC-3′pha1-test2(SEQ ID NO49)5′-GGT CAG AGT GAG CAC CTA AG-3′所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成。它們位于噬菌體組件pha1整合盒外，可以從在色氨酸操縱子整合有載體pK18mobsacBphal∷trp的克隆的DNA擴(kuò)增出約1.56kb的PCR片段。如果將這一大小約為15kb的載體整合進(jìn)噬菌體組件pha1，則不能得到可見的擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)進(jìn)行PCR。
利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定所擴(kuò)增的DNA片段。
利用兩個(gè)不顯示可見PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆來選擇其中由于第二次重組事件的發(fā)生而使得質(zhì)粒被切除的克隆。將克隆在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20個(gè)小時(shí)，之后在含有10％蔗糖的LB瓊脂上涂板，并培養(yǎng)48小時(shí)。
如同起始質(zhì)粒pK18mobsacB，質(zhì)粒pK18mobsacBpha1∷trp除包含卡那霉素抗性基因外，還包含一個(gè)拷貝的編碼枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。這一可被蔗糖誘導(dǎo)的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致形成果聚糖蔗糖酶，該酶催化合成對谷氨酸棒桿菌有毒性的產(chǎn)物果聚糖。因此只有那些由于第二次重組事件而切除了其中所整合的pK18mobsacBpha1∷trp的克隆才會(huì)在添加了蔗糖的LB瓊脂上生長。根據(jù)第二次重組事件發(fā)生的位置，在切除之后，第二個(gè)拷貝的色氨酸操縱子出現(xiàn)在噬菌體組件phal中，或者保留宿主的原始噬菌體組件pha1。
大約檢測了40至50個(gè)克隆的“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)調(diào)查了20個(gè)顯示“在蔗糖存在下生長”和“在卡那霉素存在下不生長”的表型的克隆。用常規(guī)方法(Eikmanns等人，Microbiology 1401817-1828(1994))從這些克隆分離出染色體DNA。
選擇已在本實(shí)施例中描述過的引物寡核苷酸pha1-test1(SEQ IDNO48)，和另一個(gè)引物pha1-test3進(jìn)行PCRpha1-test3(SEQ ID NO50)5′-CTG CGA GCT TCA TTC GAT CC -3′用Innis等人的標(biāo)準(zhǔn)PCR方法(PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，1990，Academic Press)完成PCR。這些引物只可以從在染色體噬菌體組件pha1處整合有第二拷貝的色氨酸操縱子的克隆中擴(kuò)增出大小約1.6kb的DNA片段。
在0.8％瓊脂糖凝膠電泳中鑒定所擴(kuò)增出的DNA片段。
用這種方法鑒定到了一個(gè)克隆，它在染色體噬菌體區(qū)域pha1處整合有一個(gè)拷貝的色氨酸操縱子。該克隆稱作菌株ATCC21850pha1∷trp。
實(shí)施例11L-色氨酸的生產(chǎn)在適于生產(chǎn)色氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲自實(shí)施例9.3的谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21850nc∷trp和獲自實(shí)施例10.2的谷氨酸棒桿菌菌株ATCC21850phal∷trp，并檢測培養(yǎng)物上清液中的色氨酸含量。
為此，首先于33℃在瓊脂平板(腦/心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時(shí)。從這個(gè)瓊脂平板培養(yǎng)物開始，接種預(yù)培養(yǎng)物(100ml錐形瓶中含10ml培養(yǎng)基)。用完全培養(yǎng)基CgIII(2.5g/l NaCl，10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，pH7.4，20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓加熱滅菌)作為這些預(yù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。于33℃將預(yù)培養(yǎng)物在240rpm的搖床上培養(yǎng)16小時(shí)。
主培養(yǎng)物使用添加了L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的色氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基。
色氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基摩礫層 100g/lCSL(玉米浸漬液) 10g/l鹽類(NH4)2SO420g/lKH2PO40.5g/lMgSO4*7H2O 0.25g/lK2HPO40.5mg/lL-苯丙氨酸(無菌過濾)0.3g/lL-酪氨酸(無菌過濾) 0.15g/l用氨水將摩礫層、CSL和鹽溶液調(diào)至pH7，并高壓加熱滅菌。然后添加無菌基質(zhì)。
為了對在帶擾流器(flow spoilers)的500ml錐形瓶中的50ml色氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基接種，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長處測定光密度(OD)。之后離心預(yù)培養(yǎng)物，去除上清液，將各個(gè)沉淀重懸于5ml色氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中。從該懸液接種主培養(yǎng)物，使主培養(yǎng)物的起始光密度(OD，660nm)為0.1OD。將該培養(yǎng)物在150rpm的搖床上于33℃培養(yǎng)5天。
5天后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測定波長處測定各培養(yǎng)物的光密度(OD)。用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德國)的氨基酸分析儀通過離子交換層析和柱后衍生茚三酮檢測法測定所形成的色氨酸量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表16。
表16
附圖簡述所述的堿基對編號(hào)是在重復(fù)測量的情況下獲得的近似值。
附圖1質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1的圖譜所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因HindIII 限制性酶HindIII的切割位點(diǎn)BamHI 限制性酶BamHI的切割位點(diǎn)lysClysCFBR等位基因，lysC T311I′gluA gluA基因的3′末端片段gluB′ gluB基因的5′末端片段′gluB gluB基因的3′末端片段gluC′ gluC基因的5′末端片段sacBsacB基因RP4mob 帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制原點(diǎn)V
附圖2質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1的圖譜所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KanR 卡那霉素抗性基因SalI 限制性酶SalI的切割位點(diǎn)lysC lysCFBR等位基因，lysC T311IaecD′aecD基因的5′末端片段′aecDaecD基因的3′末端片段sacB sacB基因RP4mob帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV 復(fù)制原點(diǎn)V附圖3質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_1的圖譜所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KanR 卡那霉素抗性基因BamHI 限制性酶BamHI的切割位點(diǎn)lysC lysCFBR等位基因，lysC T311Ipck′ pck基因的5′末端片段′pck pck基因的3′末端片段sacB sacB基因RP4mob帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV 復(fù)制原點(diǎn)V附圖4質(zhì)粒pK18mobsacBgluB2_1的圖譜.
所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KanR 卡那霉素抗性基因SalI限制性酶SalI的切割位點(diǎn)EcoRI 限制性酶EcoRI的切割位點(diǎn)BamHI 限制性酶BamHI的切割位點(diǎn)ddh ddh基因
gluA gluA基因gluB′ gluB基因的5′末端片段′gluB gluB基因的3′末端片段gluC gluC基因gluD′ gluD基因的5′末端片段sacB sacB基因RP4mob 帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV 復(fù)制原點(diǎn)V附圖5質(zhì)粒pK18mobsacBaecD2_1的圖譜.
所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KanR 卡那霉素抗性基因EooRI限制性酶EooRI的切割位點(diǎn)SalI 限制性酶SalI的切割位點(diǎn)dapA dapA基因aecD′ aecD基因的5′末端片段′aecD aecD基因的3′末端片段sacB sacB基因RP4mob 帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV 復(fù)制原點(diǎn)V附圖6質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_3的圖譜.
所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KanR 卡那霉素抗性基因pycpyc等位基因，pyc P458Spck′ pck基因的5′末端片段′pck pck基因的3′末端片段sacB sacB基因RP4mob 帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域
oriV復(fù)制原點(diǎn)V附圖7質(zhì)粒pK18mobsacBnc∷lysC的圖譜所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因BamHI 限制性酶BamHI的切割位點(diǎn)HindIII 限制性酶HindIII的切割位點(diǎn)XbaI 限制性酶XbaI的切割位點(diǎn)lysClysCFBR等位基因，lysC T311IsacBsacB基因RP4mob 帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制原點(diǎn)V附圖8質(zhì)粒pK18mobsacBddh∷ilvD的圖譜所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義Kan 卡那霉素抗性基因XbaI限制性酶XbaI的切割位點(diǎn)NheI限制性酶NheI的切割位點(diǎn)ddh int′ ddh基因的5′末端片段′ddh int ddh基因的3′末端片段ilvD ilvD基因sacBsacB基因RP4mob 帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制原點(diǎn)V附圖9質(zhì)粒pK18mobsacBnc∷trp的圖譜所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KmR卡那霉素抗性基因BamHI 限制性酶BamHI的切割位點(diǎn)
HindIII 性酶HindIII的切割位點(diǎn)nc′ncode1區(qū)域的5′末端片段′ncncode1區(qū)域的3′末端片段trpLtrpL基因trpEtrpE基因trpGtrpG基因trpDtrpD基因trpCtrpC基因trpBtrpB基因trpAtrpA基因sacB sacB基因RP4mob帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV 復(fù)制原點(diǎn)V附圖9質(zhì)粒pK18mobsacBph1∷trp的圖譜所使用的縮寫和標(biāo)記具有以下含義KmR 卡那霉素抗性基因BamHI 限制性酶BamHI的切割位點(diǎn)EcoRI 限制性酶EcoRI的切割位點(diǎn)SalI 限制性酶SalI的切割位點(diǎn)phage′ 噬菌體區(qū)域phal的5′末端片段′phage 噬菌體區(qū)域phal的3′末端片段trpLtrpL基因trpEtrpE基因trpGtrpG基因trpDtrpD基因trpCtrpC基因trpBtrpB基因trpAtrpA基因sacB sacB基因RP4mob帶有轉(zhuǎn)移復(fù)制原點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV 復(fù)制原點(diǎn)V
用于專利程序目的的國際承認(rèn)的在微生物保藏方面的布達(dá)佩斯特條約 INTERNATIONALFORMDegussa AGKantstr.233790Halle(Westf.) RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSITissued pursuant to Rule 7.1 by theINTERNATILONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottom of this page 1Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.Form USMZ-BP/4(sole page)12/2001
用于專利程序目的的國際承認(rèn)的在微生物保藏方面的布達(dá)佩斯特條約 INTERNATIONAL FORMDegussa AGKantstr.233790 Halle(Wesff.)VIABILITY STATEMENTissued pursuant to Rule 10.2by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottom of this page 1Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevanl date(date of the new deposit or dateof the transfer).
2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent viability test.
3Mark with a cross the applicable box.
4Fill in if the information has been requested and ifthe results of the test were negative.Form DSMZ-BP/9(sole page)12/2001
用于專利程序目的的國際承認(rèn)的在微生物保藏方面的布達(dá)佩斯特條約INTERNATIONAL FORMDegussa AGKantstr.233790Halle/KünsebeckRECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSITissued pursuant to Rule 7.1 by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentifled at the bottom of this page 1Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was acquiredForm DSMZ-BP/4(sole page)00196
用于專利程序目的的國際承認(rèn)的在微生物保藏方面的布達(dá)佩斯特條約INTERNATIONAL FORMDegussa AGKantstr.233790 Halle/KünsebeckVIABILITY STATEMENTissued pursuant to Rule 10.2 by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottom of this page 1Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit ordate of the transfer).
2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent viabillty test.
3Mark with a cross the applicable box.
4Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.Form DSMZ-BP/9(sole page)0196
用于專利程序目的的國際承認(rèn)的在微生物保藏方面的布達(dá)佩斯特條約 INTERNATIONAL FORMDegussa AGKantstr.233790Halle(Westf.) RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSITissred pursuant to Rule 7.1 by theINTERNATJONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottorm of this page 1Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was acquired.Form DSMZ-BP/4(sole page)12/2001
用于專利程序目的的國際承認(rèn)的在微生物保藏方面的布達(dá)佩斯特條約 INTERNATIONAL FORMDegussa AGKantstr. 233790 Halle(Westf.)VIABILTTY STATEMENTissred pursuant to Rule 10.2 by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottom of this page 1Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit or dateof the transfer).
2In the cases referred to in Rulc 10.2(e)(ii)and(iii)，refer to the most recent viability test.
3Mark with a cross the applicable box.
4Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.Form DSMZ-BP/9(sole page)12/2001
序列表<110>Degussa AG<120>細(xì)菌和用所述細(xì)菌I生產(chǎn)化合物的方法<130>010301 BT<160>50<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1263<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1263)<223>lysC野生型基因<400>1gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct96Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat144Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt192Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc240Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg288Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc336Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc384Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125aag atc tgc att gtt get ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc432Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg480Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt528Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190ctg gaa aag ctc age ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc624Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat672Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg720Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc768Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att816Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat864Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa912Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc960Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc1008Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct1056Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg1104Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt1152Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca1200Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat1248Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415gca ggc acc gga cgc1263Ala Gly Thr Gly Arg420<210>2<211>421<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>2Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn2l0 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420<210>3<211>1263<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1263)<223>lysC-fbr allele lysC T311I<400>3gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg48Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct96Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat144Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt192Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc240Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg288Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Glv Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc336Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc384Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc432Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg480Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt528Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag576Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc624Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu MetLeu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200205tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat672Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg720Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc768Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att816Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat864Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa912Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc960Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc1008Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct1056Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg1104Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt1152Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca1200Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415gca ggc acc gga cgc1263Ala Gly Thr Gly Arg420<210>4<211>421<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>4Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys G1u I1e Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420<210>5<211>28
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物lysC1beg<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物lysC1beg<400>5taggatcctc cggtgtctga ccacggtg 28<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物lysC2end<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)
<223>引物lysC2end<400>6acggatccgc tgggaaattg cgctcttcc 29<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物gluBgl1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物gluBgl1<400>7taagatctgt gttggacgtc atggcaag 28<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物gluBgl2<400>8acagatcttg aagccaagta cggccaag 28<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pck_beg<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>引物pck_anf<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)<223>引物pck_beg<400>9taagatctgc cggcatgact tcagttt27<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pck_end<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物pck_end<400>10acagatctgg tgggagcctt tcttgttatt 30<210>11<211>20<212>DNA
<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物aecD_beg<400>11gaacttacgc caagctgttc 20<210>12<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物aecD_end<400>12agcaccacaa tcaacgtgag 20<210>13
<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物gluA_beg<400>13cacggttgct cattgtatcc20<210>14<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物gluD_end<400>14cgaggcgaat cagacttctt20
<210>15<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ddh_beg<400>15ctgaatcaaa ggcggacatg20<210>16<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ddh_end
<400>16tcgagctaaa ttagacgtcg20<210>17<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物dapA_beg<400>17cgagccagtg aacatgcaga20<210>18<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)<223>引物dapA_end<400>18cttgagcacc ttgcgcagca20<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyc_beg<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物pyc_anf<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物pyc_beg
<400>19tcacgcgtct tgaagtcgtg caggtcag28<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pyc_end<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物pyc_end<400>20tcacgcgtcg cctcctccat gaggaaga28<210>21<211>39<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(39)<223>引物P458S-1<400>21ggattcattg ccgatcactc gcacctcctt caggctcca39<210>22<211>39<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(39)<223>引物P458S-2<400>22gtggaggaag tccgaggtcg agtgatcggc aatgaatcc39<210>23<211>1310<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1310)<223>基因間區(qū)域ncode1<400>23aagctctatt gtcccctacg tgctcgtttc tggcctttta gtaagcacca ggaataagcg60ccgatgaaga cacaatcata ccgacaatta atcgtgccga tatgagctct taaaagacag120cataaaacga gtttttcaaa agcctattaa gtgtcaatta cgacgtgcat taatagatac180tcaatcacct taaattgttg acacactcca ctaaaacagg tctattaaaa gacaattgaa240ttacgcccta gtagtacttg tttcaggcca ccacttagaa ggcttttaag tatccactat300gtatcaatta tctagaacct ttagtgactt tgaaacggca gtactctatt ggctcttaat360ggtcaattac ataacaatta tattgagcct ttgaaacaac tcactctgct gcatattaaa420aggtcgatta actaacgatt gaattgatcc ttaaaaagcc tttatctatc gcattatgaa480taaatattta atcgaccttt aatagtgacc taaaagcctt ttaaaagcca acgcattcag540tgacttttaa aaggctatta agtgtcaatt gaattgcctt gttactggct tttaaaaggc600tattaaagaa cactccccta ttgtctttta atcgtcactt aatcgacctc taaaaggtaa660ctaattgact cttgagtgac acatatttaa ttgaccttta agtaacgatt ataaggcaat720taatgtgacc aaataaagac acgtaactga ctaatcttta tctgactatt acaaggcttt780aaaagagcac ttatgtgtcg attaagtgtc tacgcaataa ctgtgcttta agaggcttta840aaaactacaa ttgaatcgac cactaatcgt tacttaaatg actattaaca aaagtcactt900ttagagcacc gcaaaagcct tttaatggtc acgcaataag cctttaagta acaattaaat960
aagtggcttt aaaatcacta ctgcagcacg attgaaaggt aattagcggt cgattaagtg1020tcaattaatt aatagtgatt caaaatctca ttaaagcgca attcaattga cagctaataa1080gcccttaagt aacaaatact ttatccgtac tttaagggca cgctaaaagc cttttaatcg1140acatctaatt gtcataacgc ttcgatgcgc ccatgggaat acacttagcg gtcgattaaa1200tggatactaa gtagcaatta gccagagtcg cgtgacagag ttgtggcgca cagtagcaca1260tcacccctac ccccgtgcat ctcttaatta gcactaaaac aacatttatc 1310<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物ncode 1<400>24gaagatctaa gctctattgt cccctacg 28<210>25
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>引物ncode 2<400>25gatcctttta aaagccagta acaag25<210>26<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(47)<223>引物ncode 3<400>26cttgttactg gcttttaaaa ggatcctatt aaagaacact cccctat 47<210>27<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物ncode 4<400>27gaagatctcg actctggcta attgctac 28<210>28<211>1249<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>PCR-Produkt<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1249)<223>PCR之后的基因間區(qū)域ncode1<400>28gaagatctaa gctctattgt cccctacgtg ctcgtttctg gccttttagt aagcaccagg60aataagcgcc gatgaagaca caatcatacc gacaattaat cgtgccgata tgagctctta120aaagacagca taaaacgagt ttttcaaaag cctattaagt gtcaattacg acgtgcatta180atagatactc aatcacctta aattgttgac acactccact aaaacaggtc tattaaaaga240caattgaatt acgccctagt agtacttgtt tcaggccacc acttagaagg cttttaagta300tccactatgt atcaattatc tagaaccttt agtgactttg aaacggcagt actctattgg360ctcttaatgg tcaattacat aacaattata ttgagccttt gaaacaactc actctgctgc420atattaaaag gtcgattaac taacgattga attgatcctt aaaaagcctt tatctatcgc480attatgaata aatatttaat cgacctttaa tagtgaccta aaagcctttt aaaagccaac540gcattcagtg acttttaaaa ggctattaag tgtcaattga attgccttgt tactggcttt600taaaaggatc ctattaaaga acactcccct attgtctttt aatcgtcact taatcgacct660ctaaaaggta actaattgac tcttgagtga cacatattta attgaccttt aagtaacgat720tataaggcaa ttaatgtgac caaataaaga cacgtaactg actaatcttt atctgactat780
tacaaggctt taaaagagca cttatgtgtc gattaagtgt ctacgcaata actgtgcttt840aagaggcttt aaaaactaca attgaatcga ccactaatcg ttacttaaat gactattaac900aaaagtcact tttagagcac cgcaaaagcc ttttaatggt cacgcaataa gcctttaagt960aacaattaaa taagtggctt taaaatcact actgcagcac gattgaaagg taattagcgg1020tcgattaagt gtcaattaat taatagtgat tcaaaatctc attaaagcgc aattcaattg1080acagctaata agcccttaag taacaaatac tttatccgta ctttaagggc acgctaaaag1140ccttttaatc gacatctaat tgtcataacg cttcgatgcg cccatgggaa tacacttagc1200ggtcgattaa atggatacta agtagcaatt agccagagtc gagatctag1249<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物3371V<400>29tatcatgcgg tgagctgtga 20
<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物3372N<400>30taggggtgat gtgctactgt20<210>31<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ilvD-A1
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物ilvD-A1<400>31atcgtctcta gacttggagc gccaaaaggc ac32<210>32<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ilvD-E1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物ilvD-E1<400>32gtcatctcta gatcgaggca gagttcgctg gt32<210>33
<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ddh_del1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(33)<223>引物ddh_del1<400>33atcgtcgcta gcccaacgaa tctccacgag acg33<210>34<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ddh_del2
<400>34gacatccgca ccatgcctga20<210>35<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物ddh_del3<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(44)<223>引物ddh_del3<400>35tcaggcatgg tgcggatgtc tagagtcggc aaccacgaag catt44<210>36<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物ddh_del4<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物ddh_del4<400>36atgctcgcta gcatgaccaa catccgcgta gc32<210>37<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ddh-int1<400>37attcttccgc gaccgcgata 20<210>38
<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ddh_A1<400>38ccggataaac caccatgaac20<210>39<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物trp-A1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)
<223>引物trp-A1<400>39gtacggatcc caaggacagc tcgtgtagac30<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物trp-E1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物trp-E1<400>40agctggatcc caccggctcg aagctaagat30<210>41<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ncode1-A1<400>41actatcatgc ggtgagctgt20<210>42<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ncode1-E1<400>42ggeagctctg tagccatatt20<210>43<211>20
<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物trp-test<400>43ccaaccacga tgagaaggac20<210>44<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pha1-int1<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物pha1-int1
<400>44agtcgtcgac gctatcaacg cttcgatcac30<210>45<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物phal-int2<400>45ctgtctcgta cggatgacag 20<210>46<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pha1-int3<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>引物pha1-int3<400>46ctgtcatccg tacgagacag ggatccatac cttgccagtc aaatc 45<210>47<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物pha1-int4<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物pha1-int4<400>47gtcagaattc gcagcatgta acggataggt 30<210>48<211>20
<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物pha1-test1<400>48gcgctccatc actagagttc20<210>49<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物pha1-test2<400>49ggtcagagtg agcacctaag20
<210>50<211>20<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物pha1-test3<400>50ctgcgagctt cattcgatcc20
權(quán)利要求
1.棒桿菌細(xì)菌，它除了在天然位點(diǎn)(座位)含有一個(gè)拷貝的一或多個(gè)編碼用于合成化合物的蛋白質(zhì)或RNA的可讀框(ORF)、基因或等位基因外，a)還在整合進(jìn)染色體的位點(diǎn)處含有一或多個(gè)拷貝的所述可讀框(ORF)、基因或等位基因，由此b)不含有在微生物中能夠/使得能夠發(fā)生復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，和c)在所述位點(diǎn)不含有賦予抗生素抗性的核苷酸，和d)所述位點(diǎn)與對所述細(xì)菌的生長以及目的化合物的生產(chǎn)而言至關(guān)重要的可讀框(ORF)、基因或等位基因無關(guān)，e)至少一個(gè)所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體和缺陷噬菌體或噬菌體組件或者編碼所述原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的棒桿菌細(xì)菌，其中基因間區(qū)域與選自下表的多核苷酸至少70％相同
。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的棒桿菌細(xì)菌，其中包含在染色體內(nèi)的原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件與選擇下表的多核苷酸至少70％相同
。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的棒桿菌細(xì)菌，其中所述棒桿菌細(xì)菌屬于棒桿菌屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的棒桿菌屬的棒桿菌細(xì)菌，它們屬于谷氨酸棒桿菌物種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的棒桿菌細(xì)菌，其中所述化合物選自L-氨基酸、維生素、核苷和核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的棒桿菌細(xì)菌，其中化合物是一或多種選自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸的L-氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的棒桿菌細(xì)菌，其中L-氨基酸是L-賴氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的棒桿菌細(xì)菌，其中編碼用于生產(chǎn)賴氨酸的蛋白質(zhì)的一或多個(gè)所述可讀框(ORF)、基因或等位基因選自accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、ddh、dps、eno、gap、gap2、gdh、gnd、lysC、lysCFBR、lysE、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pyc P458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwal、zwf和zwf A213T。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的棒桿菌細(xì)菌，其中編碼用于生產(chǎn)賴氨酸的蛋白質(zhì)的一或多個(gè)所述可讀框、基因或等位基因選自dapA、ddh、lysCFBR和pyc P458S。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的棒桿菌細(xì)菌，其中含有編碼反饋抗性形式的天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的棒桿菌細(xì)菌，其中含有由lysCFBR等位基因編碼、具有包含一或多個(gè)選自A279T、A279V、S301F、T308I、S301Y、G345D、R320G、T311I和S381F的氨基酸取代的根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列的反饋抗性天冬氨酸激酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的棒桿菌細(xì)菌，其中由lysCFBR等位基因編碼的反饋抗性天冬氨酸激酶包括根據(jù)SEQ ID NO4的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的棒桿菌細(xì)菌，其中l(wèi)ysCFBR等位基因編碼區(qū)域包括SEQ ID NO3的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求8的棒桿菌細(xì)菌，其中所述基因或等位基因的第三或第四個(gè)拷貝整合在選自aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、fda、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menE、mqo、pck、pgi和poxB的位點(diǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的棒桿菌細(xì)菌，其中位點(diǎn)是aecD基因位點(diǎn)。
17.根據(jù)權(quán)利要求151的生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌細(xì)菌，其中位點(diǎn)是gluB基因位點(diǎn)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的生產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌細(xì)菌，其中位點(diǎn)是pck基因位點(diǎn)。
19.制備化合物的方法，包括在適宜培養(yǎng)基中對權(quán)利要求1至18的棒桿菌細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵。
20.通過發(fā)酵棒桿菌細(xì)菌制備化合物的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵棒桿菌細(xì)菌，該棒桿菌細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(座位)存在至少一個(gè)拷貝的一或多個(gè)編碼用于合成所述化合物的蛋白質(zhì)或RNA的可讀框(ORF)、基因或等位基因外，b)還在整合進(jìn)染色體的位點(diǎn)含有一或多個(gè)，尤其是第二個(gè)、可選地第三或第四個(gè)拷貝的所述可讀框(ORF)、基因或等位基因，發(fā)酵在可以使所述可讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下進(jìn)行，由此c)不帶有在微生物中能夠/使得能夠進(jìn)行附加體型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列和d)在所述位點(diǎn)不帶有賦予其抗生素抗性的核苷酸序列，由此e)至少一個(gè)所述位點(diǎn)選自所有包含在染色體內(nèi)的基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件或者編碼所述原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件的DNA，f)濃縮發(fā)酵液體培養(yǎng)基和/或細(xì)菌細(xì)胞中的化合物，g)分離該化合物，可選地h)連同來自發(fā)酵液體培養(yǎng)基和/或生物質(zhì)中的成分一起，直至＞(大于)0至100wt％。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中基因間區(qū)域選自權(quán)利要求2的表格。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件選自權(quán)利要求3的表格。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中使用了這樣的棒桿菌細(xì)菌，這些細(xì)菌中由所述可讀框、基因或等位基因編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)活性被提高，尤其是編碼這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列過表達(dá)。
24.根據(jù)權(quán)利要求20至29的方法，其中所述細(xì)菌屬于棒桿菌屬。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)菌屬于谷氨酸棒桿菌物種。
26.根據(jù)權(quán)利要求20至25的方法，其中化合物選自L-氨基酸、維生素、核苷和核苷酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中化合物是一或多種選自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸的L-氨基酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中化合物是L-賴氨酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求20至26的制備L-賴氨酸的方法，其中使用了這樣的棒桿菌細(xì)菌，這些細(xì)菌中一或多個(gè)可讀框、基因或等位基因選自accBC、accDA、cstA、cysD、cysE、cysH、cysK、cysN、cysQ、dapA、dapB、dapC、dapD、dapE、dapF、ddh、dps、eno、gap、gap2、gdh、gnd、lysC、lysCFBR、lysE、msiK、opcA、oxyR、ppc、ppcFBR、pgk、pknA、pknB、pknD、pknG、ppsA、ptsH、ptsI、ptsM、pyc、pycP458S、sigC、sigD、sigE、sigH、sigM、tal、thyA、tkt、tpi、zwal、zwf和zwf A213T。
30.根據(jù)權(quán)利要求20至26的制備L-賴氨酸的方法，其中發(fā)酵一或多個(gè)可讀框、基因或等位基因選自基因或等位基因dapA、ddh、lysCFBR和pyc P458S的棒桿菌細(xì)菌。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的制備L-賴氨酸的方法，其中等位基因是編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的制備L-賴氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因編碼的反饋抗性天冬氨酸激酶包含含有一或多個(gè)選自A279T、A279V、S301F、T308I、S301Y、G345D、R320G、T311I和S381F的氨基酸取代的根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的制備L-賴氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因編碼的反饋抗性天冬氨酸激酶包括根據(jù)SEQ ID NO4的氨基酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求31的制備L-賴氨酸的方法，其中l(wèi)ysCFBR等位基因編碼區(qū)域包括SEQ ID NO3的核苷酸序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求20至26的制備L-賴氨酸的方法、其中對第三或第四個(gè)位點(diǎn)選自aecD、ccpA1、ccpA2、citA、citB、citE、fda、gluA、gluB、gluC、gluD、luxR、luxS、lysR1、lysR2、lysR3、menB、mqo、pck、pgi和poxB的棒桿菌細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵。
36.生產(chǎn)棒桿菌細(xì)菌的方法，包括a)優(yōu)選地從棒桿菌細(xì)菌中分離至少一種編碼用于生產(chǎn)化合物的蛋白質(zhì)或RNA的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，可選地包括表達(dá)和/或調(diào)控信號(hào)，b)為所述ORF、基因或等位基因的5′和3′末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列，c)其中所述位點(diǎn)選自基因間區(qū)域、原噬菌體、缺陷噬菌體或噬菌體組件，d)優(yōu)選將帶有靶位點(diǎn)核苷酸序列的目的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列整合進(jìn)在棒桿菌細(xì)菌中不復(fù)制或僅進(jìn)行有限復(fù)制的合適載體中，e)將b)或c)的所述核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒桿菌細(xì)菌中，和f)分離在靶位點(diǎn)整合了根據(jù)a)的核苷酸序列的棒桿菌細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及棒桿菌細(xì)菌，所述細(xì)菌除在其天然位點(diǎn)(座位)具有至少一個(gè)拷貝的編碼蛋白質(zhì)或RNA合成的可讀框(ORF)、基因或等位基因外，一定還在第二個(gè)、可選地在第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)以整合入染色體的形式具有第二個(gè)、可選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝的該可讀框(ORF)、基因或等位基因；本發(fā)明還涉及用所述細(xì)菌發(fā)酵制備化合物的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1748031SQ200480003529
公開日2006年3月15日 申請日期2004年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月5日
發(fā)明者B·巴特, C·賴嫩, B·黑德里希, G·蒂爾巴赫 申請人:底古薩股份公司