專利名稱：與大豆油分含量相關(guān)的一個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中與大豆油分含量相關(guān)的一個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)。
背景技術(shù)：
大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量、品質(zhì)、熟期等均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，即受許多數(shù)量基因座位(或位點(diǎn))(Quantitative Trait Loci，QTLs)和環(huán)境因子的共同作用。長期以來，數(shù)量遺傳學(xué)是以統(tǒng)計(jì)推理為基礎(chǔ)的，即將控制數(shù)量性狀的多基因作為一個(gè)整體，通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)的一級和二級統(tǒng)計(jì)量來剖析描述QTLs的遺傳特征。但這無法確定控制數(shù)量性狀的QTLs的數(shù)目，更無法確定單個(gè)QTL的遺傳效應(yīng)以及它們在染色體上的位置。如果能將多基因性狀分解成若干個(gè)單一的遺傳組分，則可實(shí)現(xiàn)用研究單基因的方法去研究QTLs，并進(jìn)而定位乃至克隆QTLs。許多學(xué)者運(yùn)用傳統(tǒng)標(biāo)記在不同生物上進(jìn)行了類似的研究，但由于所用的常規(guī)標(biāo)記的局限性，難以實(shí)現(xiàn)對單個(gè)QTL的遺傳效應(yīng)的追蹤。DNA分子標(biāo)記技術(shù)及分子連鎖圖譜的迅猛發(fā)展，提供了這種可能。
微衛(wèi)星是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸為核心單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，是一種簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSR)，兩側(cè)一般是保守序列。由于它具有多態(tài)性高、共顯性、容易用PCR檢測和結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，因此是一種十分理想的分子標(biāo)記。
全球大豆總產(chǎn)量的85％用于榨油，油分含量是大豆的一種重要數(shù)量性狀。國內(nèi)外在這方面開展了一些研究。Mian等(1996)利用Young×PI416937的F4代120個(gè)株系對油分進(jìn)行分析，得到了3個(gè)QTL位點(diǎn)，位于A1和L連鎖群上。Qiu等(1999)利用Peking×Essex的F3代200個(gè)株系找到了1個(gè)與油分相關(guān)的QTL位點(diǎn)，位于H連鎖群。Specht等(2001)利用Minsoy×Noir的236株RIL群體找到了9個(gè)與油分相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別位于A1、D1a、D1b、F、G、I、J、L、O等連鎖群上。Chapman等(2003)利用Essex×Williams的F2代207個(gè)株系轉(zhuǎn)到了5個(gè)與油分相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別位于D2、B1等連鎖群上。國內(nèi)只有吳曉雷等(2001)利用科豐1號×南農(nóng)1138-2的RIL群體的201株系，找到了2個(gè)與油分相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別位于B2、M等連鎖群上。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供與大豆油分含量相關(guān)的一個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)。
本發(fā)明所提供的與大豆油分含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，名稱為Qsoil2，定位于大豆的GM7-D1a連鎖群，位于SSR引物位點(diǎn)Sat_001和Sat_114之間，與Sat_001的遺傳距離為0.0cM，與Sat_114的遺傳距離為7.3cM。
其中，Qsoil2的LR值為37.82(對應(yīng)LOD值為8.21)，可解釋18.10％的遺傳變異，加性效應(yīng)為0.52。
GM7-D1a連鎖群如圖1所示，包括Satt358、Sat_001、Sat_114、Satt226、Satt528、Satt342等28個(gè)SSR引物位點(diǎn)；位于“0cM”的SSR標(biāo)記是Satt358；Sat_001與Satt358的遺傳距離為43.0cM，Sat_114與Satt358的遺傳距離為50.6cM。
實(shí)驗(yàn)證明，以15個(gè)高油大豆品種品系的總DNA為模板，以Sat_001(序列表中的序列1和序列2)或Sat_114(序列表中的序列3和序列4)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明Sat_001擴(kuò)增的結(jié)果在15個(gè)高油大豆品種品系中，共有14個(gè)擴(kuò)增帶型與高油親本Charleston帶型一致，符合率為93.3％；Sat_114擴(kuò)增的結(jié)果在15個(gè)高油品種品系中，共有13個(gè)擴(kuò)增帶型與高油親本Charleston帶型一致，符合率為86.7％。說明Qsoil2位點(diǎn)與大豆油分含量關(guān)系密切，證明Qsoil2是與大豆油分含量相關(guān)的一個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)。
在實(shí)際應(yīng)用中，可以油分含量未知的大豆品種品系的總DNA為模板，以Sat_001(序列表中的序列1和序列2)或Sat_114(序列表中的序列3和序列4)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果擴(kuò)增得到的帶型與已知的高油大豆品種帶型一致，則該油分含量未知的大豆品種品系為高油品種品系。
本發(fā)明定位了一個(gè)與大豆油分含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)Qsoil2，可用該SSR引物位點(diǎn)進(jìn)行高油輔助育種，快速高效地選擇高油后代個(gè)體，選育高油品種。因此本發(fā)明的與大豆油分含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，將在高油大豆的育種和生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
圖1為大豆GM7-D1a連鎖群遺傳圖譜圖2為群體油分含量頻率分布3為GM7-D1a連鎖群油分QTL分析圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、Qsoil2的獲得1、準(zhǔn)備材料以美國半矮桿大豆品種Charleston(♀)為母本和以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所的東農(nóng)594(♂)為父本，按常規(guī)方法得到由154個(gè)株系構(gòu)成的F10代重組自交系(RIL)群體。
種植F10代RIL群體的154個(gè)株系，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，5m行長，三次重復(fù)。秋季株行收獲，利用Perten 8620測定油分含量，并去除不能正常成熟的11個(gè)單株(油分含量不準(zhǔn)確)。該群體的油分含量頻率分布結(jié)果如圖2所示，表明油分含量呈正態(tài)分布，符合重組自交系群體理論分布。
2、總DNA的提取采用改良的SDS法(Keim P，Olson TC，and Shoemaker RC.A rapid protocolfor isolating soybean DNA.Soybean Genetics Newsletter，1988，15150-152)提取步驟1中大豆各株系的總DNA。
3、SSR分析按照soybase網(wǎng)址(http//129.186.26.94/)上提供的大豆微衛(wèi)星序列合成共500對SSR引物，其名稱分別為Satt225、Satt300、Satt276、Satt409、Satt455、Satt470、Satt233、Satt119、Satt589、Satt453、Satt415、Satt298、Satt197、SattS09、Satt063、Satt020、Satt416、Satt126、Satt338、Satt565、Satt371、Satt316、Satt286、Satt305、Satt408、Satt436、Satt203、Satt603、Satt502、Satt271、Satt141、Satt290、Satt095、Satt186、Satt389、Satt154、Satt002、Satt231、Satt369、Satt045、Satt573、Satt144、Satt334、Satt516、Satt423、Satt146、Satt218、Satt554、Satt335、Satt510、Satt472、Satt288、Satt012、Satt303、Satt130、Satt309、Satt142、Satt302、Satt314、Satt192、Satt148、Satt330、Satt049、Satt239、Satt587、Satt431、Satt596、Satt285、Satt588、Satt381、Satt242、Satt373、Satt006、Satt182、Satt551、Satt323、Satt463、Satt590、Satt387、Satt530、Satt152、Satt479、Satt259、Satt487、Sat_001、Sat_003、Sat_009、Sat_020、Sat_022、Sat_033、Sat_036、Sat_038、Sat_039、Sat_040、Sat_042、Sat_043、Sat_044、Sat_062、Sat_064、Sat_069、Sat_071、Sat_074、Sat_076、Sat_077、Sat_083、Sat_084、Sat_085、Sat_086、Sat_087、Sat_088、Sat_089、Sat_090、Sat_091、Sat_092、Sat_093、Sat_094、Sat_095、Sat_096、Sat_097、Sat_099、Sat_103、Sat_104、Sat_105、Sat_106、Sat_107、Sat_108、Sat_109、Sat_110、Sat_111、Sat_112、Sat_113、Sat_114、Sat_115、Sat_116、Sat_117、Sat_118、Sat_119、Sat_120、Sat_121、Sat_122、Sat_123、Sat_124、Sat_125、Sat_126、Sat_127、Sat_128、Sat_129、Sat_130、Sat_131、Sat_132、Sat_133、Sat_134、Sat_135、Sat_136、Sct_001、Sct_010、Sct_026、Sct_028、Sct_033、Sct_034、Sct_046、Sct_064、Sct_065、Sct_067、Sct_094、Sct_137、Sct_147、Sct_186、Sct_187、Sct_188、Sct_189、、Scaa001、Scaa003、Satt385、Satt165、Satt538、Satt187、Satt359、Satt583、Satt474、Satt556、Satt294、Satt476、Satt307、Satt184、Satt368、Satt157、Satt537、Satt458、Satt543、Satt185、Satt355、Satt269、Satt394、Satt138、Satt253、Satt434、Satt440、Satt571、Satt380、Satt244、Satt167、Satt326、Satt398、Satt462、Satt540、Satt536、Satt584、Satt393、Satt473、Satt243、Satt042、Satt511、Satt236、Satt519、Satt430、Satt168、Satt070、Satt272、Satt390、Satt429、Satt597、Satt190、Satt524、Satt164、Satt422、Satt277、Satt482、Satt402、Satt198、Satt579、Satt600、Satt350、Satt528、Satt311、Satt256、Satt230、Satt452、Satt569、Satt030、Satt490、Satt324、Satt566、Satt505、Satt442、Satt279、Satt293、Satt419、Satt127、Satt270、Satt414、Satt287、Satt132、Satt247、Satt046、Satt260、Satt446、Satt523、Satt284、Satt567、Satt308、Satt245、Satt022、Satt159、Satt009、Satt477、Satt188、Satt358、Satt038、Satt050、Satt076、Satt079、Satt080、Satt082、Satt094、Satt117、Satt134、Satt139、Satt149、Satt150、Satt151、Satt153、Satt155、Satt160、Satt162、Satt163、Satt166、Satt169、Satt172、Satt173、Satt174、Satt175、Satt179、Satt180、Satt189、Satt191、Satt193、Satt195、Satt196、Satt199、Satt200、Satt201、Satt202、Satt204、Satt211、Satt216、Satt220、Satt226、Satt229、Satt237、Satt240、Satt248、Satt249、Satt251、Satt252、Satt254、Satt257、Satt258、Satt262、Satt263、Satt266、Satt267、Satt273、Satt274、Satt278、Satt289、Satt292、Satt301、Satt318、Satt320、Satt321、Satt325、Satt327、Satt329、Satt331、Satt336、Satt341、Satt342、Satt343、Satt349、Satt354、Satt365、Satt370、Satt372、Satt376、Satt382、Satt383、Satt413、Satt420、Satt421、Satt424、Satt426、Satt428、Satt435、Satt437、Satt439、Satt445、Satt449、Satt457、Satt459、Satt460、Satt468、Satt495、Satt504、Satt514、Satt515、Satt521、Satt522、Satt527、Satt539、Satt541、Satt545、Satt547、Satt555、Satt558、Satt570、Satt574、Satt576、Satt581、Satt586、Satt031、Satt041、Satt100、Satt123、Satt145、Satt156、Satt238、Satt241、Satt264、Satt282、Satt337、Satt345、Satt348、Satt353、Satt356、Satt375、Satt396、Satt405、Satt417、Satt467、Satt471、Satt520、Satt531、Satt549、Satt550、Satt552、Satt560、Satt564、Satt592、GMABAB、GMENOD2B、GMGLPSI2、GMRUBP、SOYHSP176、SOYGPATR、SOYLBC、SOYNOD26A、SOYPRP1、GMSC514、Sat_181、Sat_182、Sat_183、Sat_185、Sat_186、Sat_187、Sat_189、Sat_190、Sat_191、Sat_192、Sat_193、Sat_217、Sat_218、Sat_219、Sat_220、Sat_221、Sat_222、Sat_223、Sat_224、Sat_226、Sat_227、Sat_228、Sat_247、Sat_250、Sat_251、Sat_252、Sat_253、Sat_254、Sat_255、Sat_256、Sat_258、Sat_259、Sat_260、Sat_319、Sat_320、Sat_321、Sat_322、Sat_324、Sat_325、Sat_326、Sat_330、Sat_331、Sat_332、Sat_333、Sat_352、Sat_353、Sat_354、Sat_355、Sat_356、Sat_357、Sat_358、Sat_359、Sat_360、Sat_361、Sat_362、Satt613、Satt614、Satt615、Satt617、Satt618、Satt619、Satt620、Satt621、Satt622、Satt623、Satt633、Satt634、Satt635、Satt636、Satt637、Satt638、Satt640、Satt641、Satt643、Satt644、Satt646、Satt716、Satt717、Satt718、Satt720、Satt723。其中引物Satt358、Sat_001、Sat_114、Satt226、Satt528的序列分別如表1所示。
表1.部分SSR引物核苷酸組成
以步驟2中提取的總DNA為模板，利用上述SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中PCR反應(yīng)體系為采用20μl反應(yīng)體系，包括30ng大豆總DNA，各1.5μmol/L上游引物和下游引物，2.5μmol/L dNTP，1.5μl 10×緩沖液，1U Taq酶，用超純水補(bǔ)足20μl。循環(huán)擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)94℃變性30sec；47℃復(fù)性30sec；72℃延伸30sec；循環(huán)20次后在72℃延伸5min，置于4℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用銀染法顯示，照相，統(tǒng)計(jì)帶型。
4、數(shù)據(jù)處理將來源于親本Charleston(♀)帶型記為1，來源于東農(nóng)594(♂)帶型記為2，雙親雜合帶型為3，缺失或模糊帶型記為0。利用Mapmaker/EXP3.0作圖軟件，構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜。應(yīng)用Group命令進(jìn)行連鎖分析和分組(LOD＝5.0)，連鎖標(biāo)記少于8個(gè)的用Compare命令進(jìn)行優(yōu)化排序，多于8個(gè)的用Ripple命令排序，錯(cuò)誤檢測水平設(shè)為1％，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距(cM)。根據(jù)已由Cregan等定位的SSR標(biāo)記作為錨定標(biāo)記以確定相應(yīng)的連鎖群，構(gòu)建的大豆遺傳圖譜如圖1所示。
利用MapChart 2.1版本繪制連鎖圖譜。利用Windows QTL Cartographer V2.0進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖掃描農(nóng)藝性狀的QTLs，以似然比LR(Likehood Ratio)大于11.5，即對應(yīng)LOD值大于2.5作為QTLs存在的閾值，并分析確定由Sat 001與Sat 114兩個(gè)引物區(qū)間得到的Qsoil2為與大豆油分含量相關(guān)的一個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)。結(jié)果如圖3所示，表明Qsoil2定位于大豆的GM7-D1a連鎖群，位于SSR引物位點(diǎn)Sat_001和Sat_114之間，與Sat_001的遺傳距離為0.0cM，與Sat_114的遺傳距離為7.3cM。Qsoil2的LR值為37.82(對應(yīng)LOD值為8.21)，可解釋18.10％的遺傳變異，加性效應(yīng)為0.52。圖3中，連鎖群-7(D1a)，是代表大豆公共遺傳連鎖圖譜上的第七條連鎖群，代號為D1a。
實(shí)施例2、Qsoil2是與大豆油分含量相關(guān)的一個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)的證實(shí)實(shí)驗(yàn)材料包括高油親本Charleston和高油大豆品種品系紅豐9號、東農(nóng)46、東農(nóng)47、瑞士CH21507、綏農(nóng)10號、墾農(nóng)18、瑞士SIERA、東農(nóng)Q012、東農(nóng)Q028、東農(nóng)Q059、東農(nóng)Q072、東農(nóng)Q082、東農(nóng)Q114、東農(nóng)Q156、東農(nóng)32299。
按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行以下操作提取上述大豆品種的總DNA，以上述大豆品種的總DNA為模板，分別以Sat_001(序列表中的序列1和序列2)和Sat_114(序列表中的序列3和序列4)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明Sat_001擴(kuò)增的結(jié)果在15個(gè)高油品種品系中，共有14個(gè)擴(kuò)增帶型與高油親本Charleston帶型一致，符合率為93.3％；Sat_114擴(kuò)增的結(jié)果在15個(gè)高油品種品系中，共有13個(gè)擴(kuò)增帶型與高油親本Charleston帶型一致，符合率為86.7％。說明Qsoil2位點(diǎn)與大豆油分含量關(guān)系密切，證明Qsoil2是與大豆油分含量相關(guān)的一個(gè)數(shù)量性狀基因位點(diǎn)。
序列表<160>4<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcggatacga ccaaaaattg tt 22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcgaactgcg aagatactac cc 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3aactcaaatc caaactcact 20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4actcagtaaa taacaaaagt catt2權(quán)利要求
1.一個(gè)與大豆油分含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，定位于大豆的GM7-D1a連鎖群，位于SSR引物位點(diǎn)Sat_001和Sat_114之間，與Sat_001的遺傳距離為0.0cM，與Sat_114的遺傳距離為7.3cM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，其特征在于所述數(shù)量性狀基因位點(diǎn)的LR值為37.82，可解釋18.10％的遺傳變異，加性效應(yīng)為0.52。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，其特征在于所述GM7-D1a連鎖群包括Satt358、Sat_001、Sat_114、Satt226、Satt528、Satt342在內(nèi)的28個(gè)SSR引物位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)與大豆油分含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)。本發(fā)明所提供的與大豆油分含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，定位于大豆的GM7－D1a連鎖群，位于SSR引物位點(diǎn)Sat 001和Sat 114之間，與Sat 001的遺傳距離為0.0cM，與Sat 114的遺傳距離為7.3cM。所述數(shù)量性狀基因位點(diǎn)的LR值為37.82(對應(yīng)LOD值為8.21)，可解釋18.10％的遺傳變異，加性效應(yīng)為0.52?？捎迷撐稽c(diǎn)的DNA克隆制備轉(zhuǎn)基因大豆，分析油分含量，逐步縮小DNA范圍尋找主基因。本發(fā)明的與大豆油分含量相關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)，將在高油大豆的育種和生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/11GK1757729SQ20041008046
公開日2006年4月12日 申請日期2004年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月10日
發(fā)明者陳慶山, 李文濱, 張忠臣, 楊慶凱, 劉春燕, 張文慧, 張力軍, 陳立君, 藤偉麗 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)