專利名稱：一種利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法，特別涉及一種利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法。
背景技術(shù)：
雌激素(estrogen)是一類主要在動物的卵巢和睪丸內(nèi)合成的甾體類激素，對動物的生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和骨組織都起著重要作用。雌激素廣泛的生理作用必須通過其受體的中介才能發(fā)揮。雌激素受體(estrogenreceptor，ESR)是核受體(nuclear receptor)超家族的一員，是一種配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子。目前，國內(nèi)外許多研究已經(jīng)證明ESR基因是控制豬高產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一。Hewitt等人研究發(fā)現(xiàn)ESR敲除(estrogen receptor knockout)的小鼠發(fā)生不能排卵、LH調(diào)節(jié)紊亂、子宮對雌激素不敏感的現(xiàn)象，表明ESR在繁殖中起著重要作用(Hewitt S C，Korach K S.Oestrogen receptor knockout miceroles foroestrogen receptors αandβin reproductive tissues.Reproduction，2003，125(2)143-149)。
大量研究證明ESR基因存在廣泛的多態(tài)性。從Castagnoli等人首次報道了人ESR基因座PvuII的多態(tài)性(Castagnoli A，Maestri I，Bernardi F，Senno L D.PvuII RFLP inside the human estrogen receptor gene.Nucleic Acids Res，1987，15(2)866)開始，隨后Rothschild等人報道了豬ESR基因座PvuII的多態(tài)性(Rothschild M F，Larson R G，Jacobson C，Pearson P.PvuII polymorphisms atthe porcine oestrogen receptor locus(ESR).Anim Genet，1991，22(5)448)，接著Drogemuller等人也報道了豬ESR基因座Ava I和Msp I的多態(tài)性(DrogemullerV C，Thieven U，Harlizius B.An Ava I and Msp I polymorphism at the porcineESR gene.Animal Genetics，1997，28(1)59)。鑒于ESR對繁殖性狀的顯著作用，Rothschild等對含有50％中國梅山豬血緣的合成系進(jìn)行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)梅山豬中有一條特異的3.7kb的帶，命名為B基因，而相對應(yīng)的低產(chǎn)仔的品種含有的4.3kb的帶命名為A基因，并把B基因作為豬產(chǎn)仔數(shù)主效基因(ESR)的標(biāo)記。經(jīng)比較不同基因型發(fā)現(xiàn)具有3.7kb條帶的母豬(BB型)比具有4.3kb條帶的母豬(AA型)增加1.5頭總產(chǎn)仔數(shù)/胎和1.0頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎，其顯性度分別為1.31和0.43(Rothschild MF，Jacobson C，Vaske D，Tuggle C，Short T，Sasaki S，Eckardt G，McLaren D.A major gene for litter size in pigs.Proceedings of the 5thWorld Congresson Genetics Applied to Livestock Production.Guelph，Canada.1994，21225-228)。Southwood等證實了ESR基因在梅山豬合成系中的應(yīng)用。在梅山豬合成系中，BB型母豬第一胎總產(chǎn)仔數(shù)比AA型母豬要多1.41頭，產(chǎn)活仔數(shù)則多1.07頭；大白豬中，BB型母豬第一胎總產(chǎn)仔數(shù)比AA型母豬要多0.83頭，產(chǎn)活仔數(shù)則多0.8頭(Southwood O I，Short T H，Plastow G S.Genetic markers for litter sizein commercial lines of pig.InProceedings of the 6thWorld Congress onGenetics Applied to Livestock Production.Armidale，Australia，1998，26453-456)。陳克飛等采用PCR-RFLP方法，對5個不同品種262頭豬進(jìn)行了ESR基因多態(tài)性分析，研究表明ESR基因在這些豬群中對窩產(chǎn)仔數(shù)均有極顯著影響，BB基因型母豬平均比AA基因型母豬多1.40-3.37頭總產(chǎn)仔數(shù)/胎、0.63-3.58頭產(chǎn)活仔數(shù)/胎(陳克飛，黃路生，李寧，張勤，羅明，吳常信.豬雌激素受體(ESR)基因?qū)Ξa(chǎn)仔數(shù)性狀的影響.遺傳學(xué)報，2000，27(10)853-857)。
據(jù)《中國羊品種志》記載，山東小尾寒羊平均產(chǎn)活羔數(shù)為2.61，湖羊平均產(chǎn)活羔數(shù)為2.29(《中國羊品種志》編寫組.中國羊品種志.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1989，50-52，55-58)。儲明星等報道浙江省余杭湖羊場26只湖羊種公羊1990-1995年出生的115個女兒458窩平均產(chǎn)活羔數(shù)為2.11(儲明星，王秀利.湖羊出生類型與產(chǎn)活羔數(shù)表型及遺傳參數(shù)估計.遺傳學(xué)報，2001，28(5)418-423)。德國肉用美利奴成年母羊平均產(chǎn)活羔數(shù)為2.00(http://www.chinasheep.com)。Mohd-Yusuff等報道118只多賽特種公羊出生的1062個女兒4239窩平均產(chǎn)活羔數(shù)為1.40(Mohd-Yusuff M K，Dickerson G E.Young L D.Reproductive rate and genetic variation in compositeand parental populationsexperimental results in sheep.JAnim Sci，1992，70(3)673-688)。Abdulkhaliq等報道2082只薩?？四秆蚱骄a(chǎn)活羔數(shù)為1.41(Abdulkhaliq A M，Harvey W R，Parker C F.Genetic parameters for eweproductivity traits in the Columbia，Suffolk and Targhee breeds.J AnimSci，1989，67(12)3250-3257)。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。
SNP檢測方法常采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法。
本發(fā)明所提供的利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列組成的一對引物對待測綿羊的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測，確定自序列表中SEQ ID NO3的5′端第344位堿基為C還是G。
所述單核苷酸多態(tài)性檢測的方法可為DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)或等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等方法。
為得到更好的檢測結(jié)果，所述單核苷酸多態(tài)性檢測的方法優(yōu)選為先對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測，然后進(jìn)行DNA測序。
以序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2為引物得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為419bp，具有SEQ ID №3的核苷酸序列。如果自序列表中SEQ ID №3的5′端第344位堿基為C，其純合體的基因型為AA；自序列表中SEQ ID №3的5′端第344位堿基為G，其純合體的基因型為BB；雜合體的基因型為AB。
本發(fā)明以高繁殖力綿羊品種(如小尾寒羊、湖羊、德國肉用美利奴羊等)和低繁殖力綿羊品種(如多賽特羊、薩福克羊等)為實驗材料，對ESR基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測，比較ESR基因在不同綿羊品種中的多態(tài)性，并對其具有SSCP多態(tài)性的DNA片段進(jìn)行測序比較分析，結(jié)果表明自序列表中SEQ ID №3的5′端第344位堿基存在C→G的堿基突變。
本發(fā)明的研究結(jié)果表明ESR基因座AB基因型和BB基因型小尾寒羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)分別比AA基因型多0.51只(P＜0.05)和0.7只(P＜0.05)，ESR基因座B等位基因與小尾寒羊高產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。
本發(fā)明的研究結(jié)果表明ESR基因可能是控制綿羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖，為綿羊高繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供了理論和實踐基礎(chǔ)，能夠大大縮短育種周期，提高育種效率，并且將給綿羊生產(chǎn)者帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
圖1為ESR基因PCR產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2為ESR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP分析電泳圖譜圖3a和圖3b為小尾寒羊ESR基因第一外顯子的第344位AA和BB基因型的序列比較具體實施方式
實施例1、ESR基因的單核苷酸多態(tài)性檢測實驗材料具有第1胎和第2胎產(chǎn)羔數(shù)記錄的小尾寒羊146只母羊血樣采自山東省嘉祥種羊場；多賽特羊30只母羊、薩?？搜?1只母羊、德國肉用美利奴21只母羊血樣均采自北京高特牧業(yè)有限公司種羊場；湖羊29只母羊血樣采自浙江省余杭湖羊場。所采血樣均為10ml/只，用ACD抗凝，-20℃凍存。用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE，4℃保存。
主要試劑Taq DNA聚合酶、dNTP購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。
1、引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank發(fā)表的豬ESR基因(登錄號AH005677)的第一外顯子DNA序列設(shè)計引物，分別以小尾寒羊、湖羊、德國肉用美利奴羊、多賽特羊和薩?？搜虻幕蚪MDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為上游引物5′-TGCACCAGATCCAAGCCAACGA-3′(SEQ ID №1)；下游引物5′-CGGGTACCTGTAGAAGGCGGGAG-3′(SEQ ID №2)；PCR反應(yīng)總體積為25μL，其中基因組DNA 50ng，10×緩沖液2.5μL，dNTPs的終濃度為200μmol/L，Mg2+終濃度為1.2mmol/L，引物的終濃度為0.8μmol/L，Taq DNA聚合酶為1U。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性4min；94℃變性1mim，66℃復(fù)性1min30s，72℃延伸1min，34循環(huán)；最后72℃延伸7min，4℃保存。將小尾寒羊和湖羊的PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，表明特異性擴(kuò)增良好，片段長度(約為400bp)與預(yù)期的相符，可直接進(jìn)行SSCP分析。圖1中，M為SDOO2Marker，1-7為PCR產(chǎn)物。
2、SSCP分析取5μL PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加5μL上樣緩沖液(98％甲酰胺、0.025％溴酚藍(lán)、0.025％二甲苯氰、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)，離心混勻，98℃變性10min，迅速插入冰中，放置5min，使之保持變性狀態(tài)。樣品在8％非變性聚丙烯酰胺二丙烯酰胺(29∶1)凝膠中電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶。用美國Alpha Innotech公司的凝膠成像系統(tǒng)拍照。結(jié)果如圖2所示，表明該片段存在多態(tài)性。擴(kuò)增片段存在3種基因型，分別定義為AA、BB和AB。圖2中，2、3、8為AA(小尾寒羊)；4、7、9為AB(小尾寒羊)；1、5、6為BB(湖羊)。
3、不同基因型的純合子個體的直接測序為了確定點突變在序列中的位置，將AA、BB兩種純合基因型個體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。結(jié)果表明PCR產(chǎn)物長度為419bp，BB型和AA型相比，僅自序列表中序列3的5′端第344位堿基存在C→G的堿基突變(圖3a和圖3b)。參考GenBank中綿羊ESR基因第一外顯子序列，將AA型定為野生型，BB型定為突變型。該突變沒有導(dǎo)致氨基酸的改變，屬于沉默突變。
實施例2、檢測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)與ESR基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)系配合下列模型進(jìn)行最小二乘方差分析，比較小尾寒羊窩產(chǎn)羔數(shù)在標(biāo)記基因型之間的差異yijkl＝μ+HYSi+Pj+Gk+eijkl其中yijkl為窩產(chǎn)羔數(shù)的記錄值；μ為群體平均值；HYSi為第i個場年季的固定效應(yīng)；Pj為第j個胎次的固定效應(yīng)；Gk為第k種標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。用SAS(6.12版本)的GLM(General Linear Model)過程完成。
1、不同綿羊品種ESR基因型頻率和基因頻率按照實施例1的方法對小尾寒羊、多賽特羊、薩福克羊、湖羊和德國肉用美利奴羊進(jìn)行了ESR基因型檢測，計算了不同綿羊品種的基因型頻率和基因頻率，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示表1.ESR基因的PCR-SSCP在5個綿羊品種中的基因頻率和基因型頻率
注括號內(nèi)的數(shù)字表示不同基因型的個體數(shù)。
表1表明在5個綿羊品種的ESR基因外顯子1的第344位都檢測到了C→G的堿基突變，在小尾寒羊、湖羊、德國肉用美利奴羊中檢測到野生純合基因型(AA)、突變雜合基因型(AB)和突變純合基因型(BB)，而在多賽特和薩福克羊中沒有檢測到突變純合型(BB)，只檢測到2種基因型(AA、AB)。
表1還表明BB基因型只出現(xiàn)在高繁殖力綿羊品種(小尾寒羊、湖羊、德國肉用美利奴羊)中，而低繁殖力綿羊品種(多賽特羊、薩?？搜?則沒有BB基因型。湖羊、德國肉用美利奴羊、小尾寒羊、薩?？搜蚝投噘愄匮駻等位基因頻率分別為0.672、0.786、0.846、0.857和0.867，B等位基因頻率分別為0.328、0.214、0.154、0.143和0.133。說明ESR基因B等位基因與綿羊高產(chǎn)羔數(shù)呈正相關(guān)。
2、不同綿羊品種ESR基因型分布差異檢驗不同綿羊品種ESR基因型分布差異檢驗結(jié)果如表2所示，表明小尾寒羊和湖羊之間ESR基因型分布差異極顯著(P＜0.01)，湖羊和多賽特羊之間基因型分布差異顯著(P＜0.05)，其它各個綿羊品種之間基因型分布差異均不顯著。
表2.五個綿羊品種ESR基因型分布差異檢驗
注df＝(2-1)(3-1)＝2，x2(df＝2，0.05)＝5.99，x2(df＝2，0.01)＝9.21，*P＜0.05，**P＜0.013、ESR基因不同基因型的小尾寒羊窩產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤不同ESR基因型的小尾寒羊窩產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤如表3所示，表明BB基因型小尾寒羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)比AA基因型多0.7只(P＜0.05)，AB基因型小尾寒羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)比AA基因型多0.51只(P＜0.05)，B等位基因?qū)等位基因的顯性度為0.46。說明B等位基因與小尾寒羊高產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。推測ESR基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖。
表3.不同ESR基因型的小尾寒羊窩產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤
注同一性狀具有不同字母肩標(biāo)的平均值間差異顯著(P＜0.05)。
D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(BB+AA)/2
序列表<160>3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tgcaccagat ccaagccaac ga 22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2cgggtacctg tagaaggcgg gag 23<210>3<211>419<212>DNA<213>綿羊(Ovis aries)
<220>
<221>misc-feature<222>(344)<223>n＝c或g<400>3tgcaccagat ccaagccaac gagctggagc ccctgaaccg cccgcagctc aagatccccc 60tggagcggcc cctgggcgag atgtacgtgg acagcagcaa gcccgccgtg tacaactacc120ccgagggcgc cgcgtacgac ttcaacgccg cggccgccgc ctccgcgccc gtctacggcc180agtcgggcct cccctacggc cccgggtccg aggcggcggc gttcggggcc aacggcctgg240gggccttccc gccgctcacc agcgtgtctc cgagcccgct ggtgctgctg cacccgccgc300cgcagcccct ctcgcccttc ctgcaccccc acggccaaca ggtnccctat tacctggaga360atgagccgag cggctatgcg gtgcgcgagg ccggccctcc cgccttctac aggtacccg 419
權(quán)利要求
1.一種利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列組成的一對引物對待測綿羊的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測，確定自序列表中SEQ IDNO3的5′端第344位堿基為C還是G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性檢測的方法為DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性或等位基因特異的寡聚核苷酸雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述單核苷酸多態(tài)性檢測的方法為先對所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測，然后進(jìn)行DNA測序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述綿羊包括小尾寒羊、湖羊、德國肉用美利奴羊、多賽特羊和薩?？搜?。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法。本發(fā)明所提供的利用單核苷酸多態(tài)性預(yù)測綿羊窩平均產(chǎn)羔數(shù)的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2的核苷酸序列組成的一對引物對待測綿羊的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測，確定自序列表中SEQ ID NO3的5′端第344位堿基為C還是G。本發(fā)明的研究結(jié)果表明ESR基因可能是控制綿羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖，為綿羊高繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和育種提供了理論和實踐基礎(chǔ)，將給羊肉生產(chǎn)者帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12Q1/68GK1743461SQ20041007360
公開日2006年3月8日 申請日期2004年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月30日
發(fā)明者儲明星, 畢曉丹, 金海國 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所