專利名稱：幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因多態(tài)性檢測(cè)芯片及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因多態(tài)性檢測(cè)芯片及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)的研究一直是胃腸病工作者的熱門課題，目前有關(guān)Hp耐藥問(wèn)題受到消化界和微生物學(xué)家的極大關(guān)注。許多資料顯示Hp不僅可引起慢性胃炎、消化性潰瘍，而且與胃癌、胃MALT淋巴瘤和一些心血管疾病、血液病、自身免疫性疾病、皮膚病等有關(guān)[1，2]。Hp感染者合并潰瘍患者必須接受根除治療[3]，臨床常規(guī)應(yīng)用三聯(lián)或四聯(lián)療法根除Hp即質(zhì)子泵抑制劑或/和鉍劑聯(lián)合克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑/替硝唑等兩種抗生素。而耐藥菌株的出現(xiàn)給Hp的根除帶來(lái)很大的困難，克拉霉素治療其耐藥菌株常預(yù)示著根除失敗的可能性很大[4]。因此，在根除治療前了解細(xì)菌的耐藥性至關(guān)重要。而且由于抗生素濫用及應(yīng)用不規(guī)范，耐藥菌株的出現(xiàn)日益增多，導(dǎo)致Hp耐藥率日益升高。研究表明Hp克拉霉素耐藥與23S rRNA基因A2142G、A2143G[5]和C2182T[6]點(diǎn)突變相關(guān)。
用于SNPs做基因分析是特指檢測(cè)人類基因組中大量存在的單核苷酸變異，這與疾病易感性和毒物易感性有關(guān)[7]。SNPs不僅是人類種族和個(gè)體差異的標(biāo)記，亦是決定不同人群種族和個(gè)體差異的標(biāo)記，可以成為尋找疾病相關(guān)基因，進(jìn)行疾病診斷、預(yù)防和藥物篩選的基礎(chǔ)。用于SNPs檢測(cè)的常規(guī)方法有等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交，限制性內(nèi)切酶法(RFLP)，位點(diǎn)特異性引物PCR(PCR-SSP)和直接測(cè)序等?；蛐酒夹g(shù)的發(fā)展為新的SNPs的檢測(cè)方法提供了可能性[8]。寡核苷酸芯片技術(shù)是新近發(fā)展起來(lái)的一種基因檢測(cè)技術(shù)，它可將大量的寡核苷酸探針有規(guī)律地排列在一張玻片上，這些探針可以與信號(hào)顯示物質(zhì)標(biāo)記的樣品DNA的擴(kuò)增序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行相結(jié)合，通過(guò)對(duì)信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行計(jì)算機(jī)軟件處理分析，從而獲得雜交信號(hào)的強(qiáng)度及其分布模式圖。
與傳統(tǒng)的方法相比，寡核苷酸芯片可以對(duì)胃粘膜活檢標(biāo)本直接進(jìn)行菌株變異檢測(cè)，對(duì)混合菌株感染時(shí)同樣適用，而用細(xì)菌培養(yǎng)的方法卻很難區(qū)分混合株，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，培養(yǎng)相當(dāng)困難。測(cè)序是一種經(jīng)典的方法，但是往往只能檢測(cè)優(yōu)勢(shì)株的序列；或者野生株和突變株的數(shù)量相當(dāng)時(shí)才容易檢測(cè)；而寡核苷酸芯片可以檢測(cè)少量變異菌株。該方法可以讓醫(yī)生在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確判斷患者的耐藥情況。因此，寡核苷酸芯片檢測(cè)細(xì)菌耐藥具有其優(yōu)越性。
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Hp克拉霉素耐藥基因多態(tài)性檢測(cè)芯片在載體上設(shè)有如下探針
Hp克拉霉素耐藥基因多態(tài)性檢測(cè)芯片制備方法步驟為1)芯片載體的處理玻片用鉻酸洗液浸泡過(guò)夜，水洗，24～26％氨水中過(guò)夜，水洗，玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4～4.5，95％乙醇超聲清洗，150～160℃烘干3～5小時(shí)，5～10％戊二醛處理成醛基化；2)引物及探針的合成針對(duì)Hp的23S rRNA基因A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一組探針，它的長(zhǎng)度范圍在15-17個(gè)堿基(表1)，針對(duì)Hp的23S rRNA基因設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，長(zhǎng)度21個(gè)堿基(表2)，每條引物中各有一條Cyp-3信號(hào)分子標(biāo)記。所有寡核苷酸引物或探針均采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法在ABi 8089DNA自動(dòng)合成儀上合成，寡核苷酸的合成采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰氨化學(xué)方法，固定探針在3’端以氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(spacer，聚乙二醇亞磷酰胺試劑)相連。熒光標(biāo)記引物用Cy3亞磷酰胺試劑在普通引物序列的5’末端直接以標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)合成法進(jìn)行熒光標(biāo)記。合成后用濃氨水50～60℃脫保護(hù)，切割13～17小時(shí)，OPC柱純化，紫外定量后真空干燥濃縮，-20～-80℃保存?zhèn)溆茫?)基因芯片制備及后處理將探針至終濃度為100μmol/L；用750mmol/L NACl，75mmol/L乙酸鈉，5％glycerol，1％Ficoll and 0.1％SDS合成點(diǎn)樣液；前述兩者1∶1稀釋，并取10μL至96孔板，用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)至醛基化玻片上，每點(diǎn)體積約為0.5nL，點(diǎn)心間距為500μm，點(diǎn)直徑約為200μm，每條探針重復(fù)點(diǎn)2次。寡核苷酸探針在玻片上的排列如下。點(diǎn)樣完畢后，室溫放置24小時(shí)后備用。
Hp克拉霉素耐藥基因多態(tài)性檢測(cè)芯片用于檢測(cè)Hp克拉霉素耐藥的23s rRNA基因多態(tài)性和分型。
本發(fā)明將經(jīng)過(guò)選擇的探針點(diǎn)樣于玻片上，分別與經(jīng)PCR擴(kuò)增的23S rRNA基因片段進(jìn)行雜交，一次性獲得各位點(diǎn)的多態(tài)情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Hp的23S rRNA相關(guān)基因多態(tài)性進(jìn)行快速、簡(jiǎn)捷、高通量檢測(cè)和分型，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明玻片上固相化的探針為寡核苷酸探針(表2)，其序列根據(jù)Hp23S rRNA基因A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)。
所說(shuō)引物是針對(duì)Hp的23S rRNA的基因特征設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)合成引物(表2)，用于上述基因的擴(kuò)增。
信號(hào)分子標(biāo)記是針對(duì)Hp的23S rRNA的基因序列擴(kuò)增的引物。信號(hào)分子標(biāo)記是熒光分子。
表1Hp克拉霉素耐藥基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的探針
表2乙醇代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性檢測(cè)芯片的引物
實(shí)施例1核苷酸基因芯片的制備1)芯片載體的處理玻片用鉻酸洗液浸泡過(guò)夜，水洗，25％氨水中過(guò)夜，水洗。玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4.5，95％乙醇超聲清洗，160℃烘干4小時(shí)，10％戊二醛處理成醛基化。
2)引物及探針的合成本發(fā)明針對(duì)Hp的23S rRNA A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G的基因多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一組探針(見表1)。針對(duì)Hp的23S rRNA基因設(shè)計(jì)合成了2條引物(見表2)。每條引物中各有一條Cyp-3熒光標(biāo)記。所有寡核苷酸引物或探針均采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法在ABi 8089DNA自動(dòng)合成儀上合成，寡核苷酸的合成采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰氨化學(xué)方法，固定探針在3’端以氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(spacer，聚乙二醇亞磷酰胺試劑)相連。熒光標(biāo)記引物用Cy3亞磷酰胺試劑在普通引物序列的5’末端直接以標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)合成法進(jìn)行熒光標(biāo)記。合成后用濃氨水55℃脫保護(hù)，切割15小時(shí)，OPC柱純化。紫外定量后真空干燥濃縮，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>
3)基因芯片制備及后處理將探針至終濃度為100μmol/L；用750mmol/L NACl，75mmol/L乙酸鈉，5％glycerol，1％Ficoll and 0.1％SDS合成點(diǎn)樣液；前述兩者1∶1稀釋，并取10μL至96孔板，用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)至醛基化玻片上，每點(diǎn)體積約為0.5nL，點(diǎn)心間距為500μm，點(diǎn)直徑約為200μm，每條探針重復(fù)點(diǎn)2次。寡核苷酸探針在玻片上的排列如
圖1。點(diǎn)樣完畢后，室溫放置24小時(shí)。
實(shí)施例2核苷酸基因芯片的制備1)芯片載體的處理玻片用鉻酸洗液浸泡過(guò)夜，水洗，24％氨水中過(guò)夜，水洗，玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4.0，95％乙醇超聲清洗，150℃烘干3小時(shí)，9％戊二醛處理成醛基化；2)引物及探針的合成針對(duì)Hp的23S rRNA A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G的基因多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一組探針(見表1)。針對(duì)Hp的23S rRNA基因設(shè)計(jì)合成了2條引物(見表2)。每條引物中各有一條Cyp-3熒光標(biāo)記。所有寡核苷酸引物或探針均采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法在ABi 8089DNA自動(dòng)合成儀上合成，寡核苷酸的合成采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰氨化學(xué)方法，固定探針在3’端以氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(spacer，聚乙二醇亞磷酰胺試劑)相連。熒光標(biāo)記引物用Cy3亞磷酰胺試劑在普通引物序列的5’末端直接以標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)合成法進(jìn)行熒光標(biāo)記。合成后用濃氨水50℃脫保護(hù)，切割13小時(shí)，OPC柱純化，紫外定量后真空干燥濃縮，-20℃保存?zhèn)溆茫?)基因芯片制備及后處理將探針至終濃度為100μmol/L；用750mmol/L NACl，75mmol/L乙酸鈉，5％glycerol，1％Ficoll and 0.1％SDS合成點(diǎn)樣液；前述兩者1∶1稀釋，并取10μL至96孔板，用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)至醛基化玻片上，每點(diǎn)體積約為0.5nL，點(diǎn)心間距為500μm，點(diǎn)直徑約為200μm，每條探針重復(fù)點(diǎn)2次。寡核苷酸探針在玻片上的排列如圖1。點(diǎn)樣完畢后，室溫放置24小時(shí)。
實(shí)施例3核苷酸基因芯片的制備1)芯片載體的處理玻片用鉻酸洗液浸泡過(guò)夜，水洗，26％氨水中過(guò)夜，水洗，玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4.5，95％乙醇超聲清洗，160℃烘干5小時(shí)，11％戊二醛處理成醛基化；2)引物及探針的合成針對(duì)Hp的23S rRNA A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G的基因多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一組探針(見表1)。針對(duì)Hp的23S rRNA基因設(shè)計(jì)合成了2條引物(見表2)。每條引物中各有一條Cyp-3熒光標(biāo)記。所有寡核苷酸引物或探針均采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法在ABi 8089DNA自動(dòng)合成儀上合成，寡核苷酸的合成采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰氨化學(xué)方法，固定探針在3’端以氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(spacer，聚乙二醇亞磷酰胺試劑)相連。熒光標(biāo)記引物用Cy3亞磷酰胺試劑在普通引物序列的5’末端直接以標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)合成法進(jìn)行熒光標(biāo)記。合成后用濃氨水60℃脫保護(hù)，切割17小時(shí)，OPC柱純化，紫外定量后真空干燥濃縮，-80℃保存?zhèn)溆茫?)基因芯片制備及后處理將探針至終濃度為100μmol/L；用750mmol/L NACl，75mmol/L乙酸鈉，5％glycerol，1％Ficoll and 0.1％SDS合成點(diǎn)樣液；前述兩者1∶1稀釋，并取10μL至96孔板，用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)至醛基化玻片上，每點(diǎn)體積約為0.5nL，點(diǎn)心間距為500μm，點(diǎn)直徑約為200μm，每條探針重復(fù)點(diǎn)2次。寡核苷酸探針在玻片上的排列如圖1。點(diǎn)樣完畢后，室溫放置24小時(shí)。Hp克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片的使用方法為1)載有寡核苷酸探針的玻片使用前0.2％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后待用，完成將探針共價(jià)固相化于玻片表面。
2)為產(chǎn)生單鏈的目標(biāo)片段采用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增的方法，正向引物HPF(5’-CTGCATGAATGGCGTAACGAG-3’)與熒光標(biāo)記反向引物HPR(5’-CAAGGATGACTCCATAAGAGC-3’)的比例優(yōu)化為1∶10。20μL反應(yīng)體系中含有1.5mM MgCl2，dNTP各200μmol/L，正向引物0.1μmol，反向引物1μmol，Hp DNA50ng，1×PCR緩沖液和1U Taq酶。PCR擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃5min；變性94℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃30sec，共30循環(huán)；最后延伸72℃5min。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳分析。
3)Cy3-標(biāo)記的不對(duì)稱PCR產(chǎn)物與雜交液(750mmol/L NACl，75mmol/L sodiumacetate，0.1％SDS，1ug/ml鮭精DNA，2.5％甲酰銨)按2∶8混合，將10μL混合液轉(zhuǎn)移至芯片的雜交區(qū)域。芯片置于雜交盒中在42℃水浴中保溫1小時(shí)。雜交后取出芯片依次在洗液A(150mmol/L NACl，15mmol/L乙酸鈉，0.2％SDS)，洗液B(30mmol/L NACl，3mmol/L乙酸鈉)和洗液C(15mmol/L NACl，1.5mmol/L乙酸鈉)中各洗滌1分鐘。待干后芯片用激光共聚焦掃描儀GenePix 4000(Axon Instrument)在激發(fā)波長(zhǎng)532nm，發(fā)射波長(zhǎng)570nm(Cy3)掃描，產(chǎn)生并分析精度為10μm的16位TIFF圖象。
Hp克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片使用實(shí)例胃粘膜活檢標(biāo)本取自在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化科行胃鏡檢查的病人，共54例患者入選，其中男性30例，女性24例，平均年齡44.3歲(25-86歲)。所有入選患者胃粘膜病理和PCR檢查均為陽(yáng)性。胃竇和胃體各取2塊粘膜組織，其中一份置于10％福爾馬林固定，用于病理HE染色，另一份用于提取DNA。患者接受胃粘膜活檢均簽署知情同意書。按常規(guī)提取DNA用上述方法檢測(cè)。結(jié)果為經(jīng)病理和PCR證實(shí)為Hp陽(yáng)性的54例標(biāo)本，雜交結(jié)果顯示2142位點(diǎn)均為野生型(54/54)；A2143G突變率為11.11％(6/54)，尚未發(fā)現(xiàn)A2143C和A2143T的突變；C2182T突變率為12.96％(7/54)，尚未發(fā)現(xiàn)C2182A和C2182G的突變，其余均為野生型。
測(cè)序驗(yàn)證測(cè)序采用CEQTMTDCS試劑盒(BECKMAN COULTERTM，USA)，在CEQTM2000XL測(cè)序儀(BECKMAN COULTERTM，USA)上進(jìn)行。結(jié)果寡核苷酸微陣列技術(shù)與測(cè)序檢測(cè)Hp 23S rRNA基因多態(tài)性結(jié)果完全一致。
權(quán)利要求
1.一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片，其特征在于在載體上設(shè)有如下探針
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片，其特征在于所說(shuō)的載體為玻片。
3.一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于方法步驟為1)芯片載體的處理波片用鉻酸洗液浸泡過(guò)夜，水洗，24～26％氨水中過(guò)夜，水洗，玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)PH至4～4.5，95％乙醇超聲清洗，150～160℃烘干3～5小時(shí)，5～10％戊二醛處理成醛基化；2)引物及探針的合成針對(duì)幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一組探針，它的長(zhǎng)度范圍在15-17個(gè)堿基，針對(duì)幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，長(zhǎng)度21個(gè)堿基，下游引物用Cyp-3熒光標(biāo)記，合成后用濃氨水50～60℃脫保護(hù)，切割13～17小時(shí)，OPC柱純化，紫外定量后真空干燥濃縮，-20～-80℃保存?zhèn)溆茫?)基因芯片制備及后處理將探針至終濃度為100μmol/L，用750mmol/L NACl，75mmol/L乙酸鈉，5％glycerol，1％Ficoll and 0.1％SDS合成點(diǎn)樣液；前述兩者1∶1稀釋，并取10μL至96孔板，用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)至醛基化玻片上，每點(diǎn)體積為0.5nL，點(diǎn)心間距為500μm，點(diǎn)直徑為200μm，每條探針重復(fù)點(diǎn)2次，點(diǎn)樣完畢后，室溫放置24小時(shí)即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于所說(shuō)的探針是
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于所說(shuō)引物是根據(jù)幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因特征設(shè)計(jì)，分別用于上述基因的擴(kuò)增，所說(shuō)的引物為正向引物HPF(5’-CTGCATGAATGGCGTAACGAG -3’)與反向引物HPR(5’-CAAGGATGACTCCATAAGAGC-3’)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的的一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于所說(shuō)的信號(hào)分子標(biāo)記是熒光分子。
7.一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片的用途，其特征在于用于檢測(cè)幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥的23S rRNA2142、2143和2182位點(diǎn)的基因多態(tài)性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種幽門螺旋桿菌克拉霉素耐藥基因檢測(cè)芯片及其制備方法和用途。在載體上設(shè)有如右探針，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)幽門螺旋桿菌的23S rRNA 2142、2143和2182位點(diǎn)的基因多態(tài)性快速、簡(jiǎn)捷、高通量檢測(cè)并直接檢測(cè)胃黏膜而不需進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1730667SQ20041007345
公開日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者厲有名, 陳韶華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)