專利名稱：溫敏型聚n－異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法。
背景技術(shù)：
基因工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中往往面臨這樣一個(gè)難題表達(dá)出的產(chǎn)物通常是以沒(méi)有生物活性的聚集體形式存在的。如何使蛋白質(zhì)高效地重折疊成具有天然構(gòu)象的活性蛋白質(zhì)，是決定該基因工程蛋白質(zhì)能否產(chǎn)業(yè)化和為人類所利用的關(guān)鍵。這就使得對(duì)于蛋白質(zhì)體外復(fù)性技術(shù)的研究成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。但由于蛋白質(zhì)的多樣性、結(jié)構(gòu)和折疊過(guò)程的復(fù)雜性，使得人們不能對(duì)一種復(fù)性方法進(jìn)行簡(jiǎn)單的移植，也很難找到具有普適性而又低成本的高效復(fù)性方法。因此實(shí)際操作過(guò)程中必須針對(duì)每種目標(biāo)蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，對(duì)影響復(fù)性的各個(gè)因素逐一優(yōu)化，才能最終確定適用于該種蛋白質(zhì)的復(fù)性方法。
蛋白質(zhì)復(fù)性方法中的許多問(wèn)題依然困擾著我們，如蛋白質(zhì)活性回收率低、復(fù)性起始和終了的蛋白質(zhì)濃度偏低等。目前出現(xiàn)的一些能夠?qū)Ω邼舛鹊鞍踪|(zhì)進(jìn)行高效復(fù)性的方法如色譜復(fù)性等，往往因?yàn)樵O(shè)備及材料投入成本高而在工業(yè)化生產(chǎn)中難以得到大規(guī)模應(yīng)用。常規(guī)的能夠協(xié)助蛋白質(zhì)復(fù)性的添加劑如分子伴侶、小分子伴侶、聚乙二醇、L-精氨酸、去污劑和表面活性劑以及人工分子伴侶等，對(duì)設(shè)備要求不高，同時(shí)能夠在一定程度上提高復(fù)性收率。但是一方面如分子伴侶、小分子伴侶等價(jià)格偏高，質(zhì)粒表達(dá)后還需對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，工作量較大，成本偏高；另一方面如聚乙二醇、L-精氨酸、去污劑和表面活性劑以及人工分子伴侶等，復(fù)性結(jié)束后存在難于與目標(biāo)蛋白質(zhì)分離的問(wèn)題。在這種情況下，開發(fā)出一種新型、高效、易于分離回收而又低成本的蛋白質(zhì)體外復(fù)性添加劑就顯得尤為重要。近年來(lái)功能高聚物作為一種新型的協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性的添加劑越來(lái)越引起人們的重視，其主要優(yōu)點(diǎn)在于影響復(fù)性的參數(shù)較少、操作方便、儀器設(shè)備要求較低且易于分離回收。
Shimizu等(參見Colloids and Surfaces BBiointerfaces，18，2002，p137-144)采用反相懸浮法合成了Poly(styrene-co-glycidyl metharrylate)(SG)微球，再通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在微球體表面分別連接上巰基或二硫鍵等功能基團(tuán)，這樣就可以使處于去折疊態(tài)且疏水基團(tuán)大量外露的變性目標(biāo)蛋白質(zhì)方便地吸附到微球體表面，在抑制蛋白質(zhì)相互聚集沉淀的同時(shí)，隨著二硫鍵的正確配對(duì)而緩慢折疊。通過(guò)該方法可以使溶菌酶的復(fù)性收率在稀釋復(fù)性的基礎(chǔ)上提高40％。但是該法制備步驟較繁瑣，且得到的微球僅限于協(xié)助含有較多巰基或二硫鍵的蛋白質(zhì)的體外復(fù)性。Lin等(參見Biotechnology and Bioengineering，67(5)，2000，p505-511)嘗試了用一種具有一定疏水作用的非離子型聚合物-未交聯(lián)的的線性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺poly(N-isopropyl acrylamide)(PNIPA)，協(xié)助β-內(nèi)酰胺酶的復(fù)性，PNIPA的加入使得復(fù)性后酶的活性提高了40％。但是采用該線性聚合物作為添加劑協(xié)助復(fù)性時(shí)，復(fù)性后需先通過(guò)加熱的方式使液態(tài)PNIPA從水溶液中析出，再通過(guò)一步離心才能實(shí)現(xiàn)復(fù)性后目標(biāo)蛋白質(zhì)與PNIPA水溶性聚合物的分離，且容易造成聚合物與蛋白質(zhì)水溶液界面附近蛋白質(zhì)的損失，操作相對(duì)麻煩?？紤]到經(jīng)交聯(lián)后合成的PNIPA水凝膠在水溶液中也會(huì)具有線性PNIPA聚合物所具有的疏水特性，從而也應(yīng)該具有協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性的特性。復(fù)性結(jié)束后利用其溫度響應(yīng)特性，可通過(guò)在水中反復(fù)溶脹(低于其臨界溶解溫度LCST)和縮水(高于LCST)的方法使凝膠快速而便捷地再生，將會(huì)使復(fù)性操作變得更加簡(jiǎn)單。這樣與其它可以協(xié)助復(fù)性的添加劑相比，采用PNIPA溫敏性凝膠協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性，在簡(jiǎn)化復(fù)性操作的同時(shí)，復(fù)性后可方便地實(shí)現(xiàn)凝膠與目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。由于凝膠具有可迅速回收的特性，大大降低了復(fù)性成本。目前還未見粒狀PNIPA凝膠協(xié)助蛋白質(zhì)體外復(fù)性的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法。
方法的步驟如下1)配制聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠反應(yīng)物的水溶液將單體N-異丙基丙烯酰胺、交聯(lián)劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺以及氧化劑過(guò)硫酸銨，其中單體與交聯(lián)劑濃度為5-15％(w/w)、交聯(lián)度為1-10％(w/w)、過(guò)硫酸銨濃度為0.1-0.7％(w/v)，溶于25mL去離子水中，用微濾膜過(guò)濾溶液以除去未溶解的雜質(zhì)；2)反相懸浮法制備溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠先向反應(yīng)容器中加入75mL液體石蠟作為分散相，37.5-150mg Tween80作為表面活性劑，充分分散后加入步驟1)反應(yīng)物的水溶液，攪拌后加入1μL N，N，N’，N’-四甲基乙二胺作為加速劑引發(fā)聚合，聚合溫度20-25℃，機(jī)械攪拌速度為350-450rpm，聚合3-4h，整個(gè)過(guò)程均需向反應(yīng)容器中通入N2，得到粒狀聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠，用1-5體積比率的無(wú)水乙醇/水溶液洗滌該凝膠，將凝膠于真空干燥箱中50-70℃烘干24-36h；3)溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性稱取5-20mg/mL溶菌酶試劑溶于變性緩沖液中，置于搖床中反應(yīng)，即可獲得無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液，取0.05-0.25mL該溶液，緩慢加入復(fù)性緩沖液，稀釋到終體積均為5mL，再向溶液中加入20-120mg/mL的粒狀PNIPA凝膠，充分震蕩使其分散均勻后，于4-36℃、0-180rpm搖床中復(fù)性2-5小時(shí)。
本發(fā)明在制備工藝上采取“反相懸浮法”，制備得到的PNIPA凝膠平均粒徑為0.3mm，分布于0.2-0.5mm的較窄區(qū)域，且基本呈正態(tài)分布。該凝膠具有合適的低臨界溶解溫度(LCST，33℃)，同時(shí)其表面直徑為1-2μm的多孔孔洞間相通，從而具有快速的溫度響應(yīng)特性，達(dá)到溶脹及縮水平衡僅需3分鐘。在協(xié)助溶菌酶復(fù)性時(shí)，伸展態(tài)溶菌酶可以自由而快速地與凝膠側(cè)鏈上的疏水基團(tuán)異丙基發(fā)生疏水相互作用，從而抑制蛋白質(zhì)間的相互聚集，可使溶菌酶的活力回收率比稀釋復(fù)性提高68％以上，凝膠重復(fù)利用8次后溶菌酶的活力回收率仍比稀釋復(fù)性提高22％以上。因此，所開發(fā)的PNIPA粒狀凝膠可以作為蛋白質(zhì)體外復(fù)性的添加劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1)制備工藝簡(jiǎn)單，易于控制和放大；2)制備的PNIPA粒狀凝膠在水中能夠充分溶脹的同時(shí)，還具有一定的疏水性能，從而可以抑制蛋白質(zhì)復(fù)性過(guò)程中的聚集趨勢(shì)。PNIPA粒狀凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性時(shí)，可使溶菌酶的比活及活力回收率均得到較大的提高；3)該法復(fù)性操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器及設(shè)備的要求低；4)影響復(fù)性的參數(shù)少，易于操作；5)與常規(guī)凝膠相比，利用其溫敏特性，該凝膠易于回收利用，從而可以降低生產(chǎn)成本。
圖1是本發(fā)明不同組成溫敏型PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性效果圖，圖中溶菌酶濃度10mg/mL，PNIPA凝膠加入量80mg/mL；圖2是本發(fā)明溫敏型PNIPA凝膠于不同稀釋倍數(shù)下協(xié)助溶菌酶復(fù)性效果圖，圖中溶菌酶濃度10mg/mL，PNIPA凝膠加入量80mg/mL。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明采用溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPA)凝膠協(xié)助溶菌酶體外復(fù)性。步驟包括溫敏型PNIPA凝膠的制備和PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性過(guò)程。為實(shí)現(xiàn)該過(guò)程，首先配制反應(yīng)物水溶液，將單體N-異丙基丙烯酰胺、交聯(lián)劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺以及氧化劑過(guò)硫酸銨溶于去離子水中，用微濾膜過(guò)濾溶液以除去未溶解的雜質(zhì)；然后采用反相懸浮法制備溫敏型PNIPA凝膠，向容器中加入液體石蠟和Tween80，充分分散后加入反應(yīng)物的水溶液，形成均一、穩(wěn)定的油包水反相懸浮分散體系，緩慢加入加速劑TEMED引發(fā)聚合，將得到的粒狀凝膠經(jīng)反復(fù)洗滌后，于真空干燥箱中烘干，得到顆粒大小均一、分散性能良好的PNIPA凝膠；其次溫敏型PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性，將溶菌酶試劑溶于變性緩沖液中，獲得無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液。再按照不同的稀釋倍數(shù)緩慢加入不同體積的復(fù)性緩沖液，向溶液中加入粒狀PNIPA凝膠。充分震蕩使其分散均勻后，進(jìn)行復(fù)性實(shí)驗(yàn)；最后，溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠的回收。復(fù)性結(jié)束后需將PNIPA凝膠充分縮水，實(shí)現(xiàn)凝膠與復(fù)性后目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離，將凝膠回收，以便重復(fù)利用。本發(fā)明所采用的復(fù)性方法中氧化劑過(guò)硫酸銨的濃度為0.5％(w/v)，表面活性劑Tween80的添加量為75mg，機(jī)械攪拌速度為420rpm，總單體(包括單體與交聯(lián)劑)濃度為5-15％(w/w)，交聯(lián)度(交聯(lián)劑的質(zhì)量與總單體質(zhì)量之比)為1-10％(w/w)，復(fù)性液中PNIPA凝膠的加入量為80-100mg/mL，稀釋倍數(shù)為20-100倍，復(fù)性溫度為30℃，速度為120rpm。
單體NIPA為N-異丙基丙烯酰胺(99％，聚合級(jí)，ACROS公司)，交聯(lián)劑BIS為N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺(化學(xué)純，中國(guó)醫(yī)藥上海試劑公司)，引發(fā)劑又稱加速劑為N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)購(gòu)自上海生工生物工程公司；溶菌酶購(gòu)自上海生工生物工程公司，二硫蘇糖醇(DTT)，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)購(gòu)自上海生工生物工程公司，還原及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)購(gòu)自上海生工生物工程公司，考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司，底物微球菌Micrococcus lysodeikticus ATCC4698購(gòu)自Sigma公司，其它試劑均為市售分析純。變性緩沖液為8mol/L尿素、30mmol/L二硫蘇糖醇、0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH8.5；復(fù)性緩沖液為1mmol/L乙二胺四乙酸鈉、0.15mol/L氯化鈉、3mol/L尿素、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L、氧化型谷胱甘肽、0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH8.5。溶菌酶比活測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)的F.I.P.法，溶菌酶的濃度采用考馬斯亮蘭法測(cè)定，溶菌酶的活力回收率為復(fù)性后溶液中溶菌酶的總活力與變性前溶菌酶總活力之比。
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述1、反相懸浮法制備溫敏型PNIPA凝膠實(shí)施例1溫敏型PNIPA凝膠的制備(總單體濃度10％，交聯(lián)度5％)反應(yīng)在250mL的三頸瓶中進(jìn)行，電子恒速攪拌器調(diào)節(jié)攪拌速度為420rpm。整個(gè)反應(yīng)器浸沒(méi)在超級(jí)恒溫槽內(nèi)，聚合溫度25℃。將75mg表面活性劑Tween80溶于連續(xù)相75mL液體石蠟中，加入反應(yīng)器，通入適量流速的N2，攪拌約20分鐘使溶液混合均勻，然后將總單體濃度為10％，交聯(lián)度為5％的反應(yīng)物的水溶液用移液槍緩慢滴加入反應(yīng)器中，繼續(xù)攪拌30分鐘后，緩慢加入1μL引發(fā)劑TEMED 20μL，聚合3小時(shí)出料。最后產(chǎn)物用不同體積比例的無(wú)水乙醇/水溶液反復(fù)浸泡，于真空干燥箱中烘干待用。得到的PNIPA粒狀凝膠最大溶脹倍率為17。采用XS-200型普通光學(xué)顯微鏡(江南光學(xué)儀器廠)觀察粒狀凝膠在溶脹前后的外觀形狀、相互間的粘連特性及大小，計(jì)算凝膠粒子在溶脹前后的平均粒徑變化。得到的PNIPA凝膠的平均粒徑為0.3mm，分布于0.2-0.4mm的較窄區(qū)域，分散性能良好且基本呈正態(tài)分布。采用JSM55 10LV型掃描電鏡(JEOL，Japan)觀察粒子表面孔洞分布情況，凝膠粒子表面分布的孔洞直徑為1-2μm。
溫度低于32℃時(shí)，凝膠溶脹倍率隨溫度升高略呈下降趨勢(shì)；當(dāng)溫度升高到32℃以上時(shí)，凝膠的溶脹倍率急劇下降；當(dāng)溫度高于36℃時(shí)，溶脹倍率幾乎不再變化，而在33℃時(shí)，凝膠的溶脹倍率約為最大溶脹倍率的一半，即PNIPA凝膠的低臨界溫度(LCST)在33℃左右。
通過(guò)記錄粒狀凝膠于不同時(shí)間的溶脹倍率，可得到該粒狀PNIPA凝膠具有快速的溫度響應(yīng)特性，在水溶液中達(dá)到溶脹及縮水平衡所需的時(shí)間僅為3分鐘。
實(shí)施例2粒狀PNIPA凝膠的制備(總單體濃度14％，交聯(lián)度10％)反應(yīng)在250mL的三頸瓶中進(jìn)行，電子恒速攪拌器調(diào)節(jié)攪拌速度為420rpm。整個(gè)反應(yīng)器浸沒(méi)在超級(jí)恒溫槽內(nèi)，聚合溫度25℃。將75mg表面活性劑Tween80溶于連續(xù)相中，加入反應(yīng)器，通入適量流速的N2，攪拌約20分鐘使溶液混合均勻，然后將總單體濃度為14％，交聯(lián)度為10％的反應(yīng)物的水溶液用移液槍緩慢滴加入反應(yīng)器中，繼續(xù)攪拌30分鐘后，緩慢加入1μL引發(fā)劑TEMED，25℃聚合3小時(shí)出料。最后產(chǎn)物用不同體積比例的無(wú)水乙醇/水溶液反復(fù)浸泡，于真空干燥箱中烘干待用。得到的PNIPA粒狀凝膠最大溶脹倍率為9，其低臨界溫度(LCST)在33℃左右。平均粒徑為0.3mm且粒徑分布于0.3-0.5mm的較窄區(qū)域，分散性能良好且基本呈正態(tài)分布。凝膠粒子表面分布的孔洞直徑為1-2μm。該粒狀PNIPA凝膠具有快速的溫度響應(yīng)特性，在水溶液中達(dá)到溶脹及縮水平衡所需的時(shí)間少于3分鐘。
2、粒狀PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性實(shí)施例3粒狀PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性(制備凝膠的總單體濃度10％，交聯(lián)度5％)10mg/mL無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液加入到復(fù)性緩沖液后(稀釋倍數(shù)為40)，向其中加入100mg/mL的粒狀PNIPA凝膠，充分震蕩分散均勻后，于30℃、120rpm搖床中復(fù)性3小時(shí)，結(jié)果如圖1所示。復(fù)性后溶菌酶活力回收率達(dá)50.34％，而相同條件下稀釋復(fù)性僅能得到44.9％的活力回收率。
實(shí)施例4粒狀PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性(制備凝膠的總單體濃度10％，交聯(lián)度10％)10mg/mL無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液加入到復(fù)性緩沖液后(稀釋倍數(shù)為40)，向其中加入100mg/mL的粒狀PNIPA凝膠，充分震蕩分散均勻后，于30℃、120rpm搖床中復(fù)性3小時(shí)，結(jié)果如圖1所示。復(fù)性后溶菌酶活力回收率達(dá)52.10％，而相同條件下稀釋復(fù)性僅能得到44.9％的活力回收率。
實(shí)施例5粒狀PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性(制備凝膠的總單體濃度14％，交聯(lián)度5％)10mg/mL無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液加入到復(fù)性緩沖液中(稀釋倍數(shù)為40)，向其中加入100mg/mL的粒狀PNIPA凝膠，充分震蕩分散均勻后，于30℃、120rpm搖床中復(fù)性3小時(shí)，結(jié)果如圖1所示。復(fù)性后溶菌酶活力回收率達(dá)63.50％，而相同條件下稀釋復(fù)性僅能得到44.9％的活力回收率。
實(shí)施例6粒狀PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性(制備凝膠的總單體濃度14％，交聯(lián)度10％)10mg/mL無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液加入到復(fù)性緩沖液中(稀釋倍數(shù)為40)，向其中加入100mg/mL的粒狀PNIPA凝膠，充分震蕩分散均勻后，于30℃、120rpm搖床中復(fù)性3小時(shí)，結(jié)果如圖1和圖2所示。復(fù)性后溶菌酶活力回收率達(dá)74％，而相同條件下稀釋復(fù)性僅能得到44.9％的活力回收率。
實(shí)施例7粒狀PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性(稀釋倍數(shù)20)無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液(10mg/mL)稀釋20倍到復(fù)性緩沖液中，向其中加入100mg/mL的粒狀PNIPA凝膠(制備凝膠的總單體濃度14％，交聯(lián)度10％)，充分震蕩分散均勻后，于一定溫度的搖床中復(fù)性3小時(shí)。溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，結(jié)果如圖2所示。稀釋復(fù)性時(shí)溶菌酶復(fù)性收率為30.11％，而加入凝膠協(xié)助復(fù)性時(shí)，可使其復(fù)性收率提高到49.96％。在提高復(fù)性收率的同時(shí)，該過(guò)程對(duì)于設(shè)備及儀器要求較低且操作簡(jiǎn)單。
實(shí)施例8粒狀PNIPA凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性(稀釋倍數(shù)100)無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液(10mg/mL)稀釋100倍到復(fù)性緩沖液中，向其中加入80mg/mL的粒狀PNIPA凝膠(制備凝膠的總單體濃度14％，交聯(lián)度10％)，充分震蕩分散均勻后，于一定溫度的搖床中復(fù)性3小時(shí)。溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，結(jié)果如圖2所示。稀釋復(fù)性時(shí)溶菌酶復(fù)性收率為86.60％，而加入凝膠協(xié)助復(fù)性時(shí)，可使其復(fù)性收率提高到87.23％。即當(dāng)溶菌酶濃度較高時(shí)，加入PNIPA粒狀凝膠協(xié)助復(fù)性的效果較好。且復(fù)性結(jié)束后只需將其放于36℃的恒溫槽中10分鐘，即可使凝膠充分縮水，實(shí)現(xiàn)凝膠與復(fù)性后目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離。
實(shí)施例9粒狀PNIPA凝膠的重復(fù)利用復(fù)性后的PNIPA粒狀凝膠置于4℃、36℃的水浴中使其反復(fù)溶脹、縮水，這樣重復(fù)10次后，即可方便、快速地實(shí)現(xiàn)凝膠的回收。最后清洗干凈的PNIPA凝膠用無(wú)水乙醇置換出其中的水后，放于烘箱中烘干，再次用于蛋白質(zhì)的復(fù)性實(shí)驗(yàn)中。通過(guò)該方法回收的凝膠可反復(fù)用于溶菌酶復(fù)性實(shí)驗(yàn)，凝膠重復(fù)利用8次后，仍能得到54.98％的溶菌酶活力回收率，比稀釋復(fù)性提高20％。從而說(shuō)明PNIPA凝膠在協(xié)助蛋白質(zhì)復(fù)性領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法。其特征在于方法的步驟如下1)配制聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠反應(yīng)物的水溶液將單體N-異丙基丙烯酰胺、交聯(lián)劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺以及氧化劑過(guò)硫酸銨，其中單體與交聯(lián)劑濃度為5-15％(w/w)、交聯(lián)度為1-10％(w/w)、過(guò)硫酸銨濃度為0.1-0.7％(w/v)，溶于25mL去離子水中，用微濾膜過(guò)濾溶液以除去未溶解的雜質(zhì)；2)反相懸浮法制備溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠先向反應(yīng)容器中加入75mL液體石蠟作為分散相，37.5-150 mg Tween80作為表面活性劑，充分分散后加入步驟1)反應(yīng)物的水溶液，攪拌后加入1μL N，N，N’，N’-四甲基乙二胺作為加速劑引發(fā)聚合，聚合溫度20-25℃，機(jī)械攪拌速度為350-450rpm，聚合3-4h，整個(gè)過(guò)程均需向反應(yīng)容器中通入N2，得到粒狀聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠，用1-5體積比率的無(wú)水乙醇/水溶液洗滌該凝膠，將凝膠于真空干燥箱中50-70℃烘干24-36h；3)溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性稱取5-20mg/mL溶菌酶試劑溶于變性緩沖液中，置于搖床中反應(yīng)，即可獲得無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液，取0.05-0.25mL該溶液，緩慢加入復(fù)性緩沖液，稀釋到終體積均為5mL，再向溶液中加入20-120mg/mL的粒狀PNIPA凝膠，充分震蕩使其分散均勻后，于4-36℃、0-180rpm搖床中復(fù)性2-5小時(shí)。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法，其特征在于所述的氧化劑過(guò)硫酸銨的濃度為0.5％(w/v)，表面活性劑Tween80的添加量為75mg，機(jī)械攪拌速度為420rpm。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法，其特征在于所述的變性緩沖液為8mol/L尿素、30mmol/L二硫蘇糖醇、0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH 8.5。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液為1mmol/L乙二胺四乙酸鈉、0.15mol/L氯化鈉、3mol/L尿素、3mmol/L還原型谷胱甘肽和0.375mmol/L、氧化型谷胱甘肽、0.1mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-HCl溶液，pH8.5。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法，其特征在于所述的無(wú)活性的伸展態(tài)的溶菌酶溶液的稀釋倍數(shù)為20-100倍。
6.按照權(quán)利要求1所述的一種溫敏型聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法，其特征在于所述的復(fù)性溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，聚N-異丙基丙烯酰胺凝膠添加量為80-100mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種溫敏型聚N－異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性的方法。步驟如下1)配制聚N－異丙基丙烯酰胺凝膠反應(yīng)物的水溶液；2)反相懸浮法制備溫敏型聚N－異丙基丙烯酰胺凝膠；3)溫敏型聚N－異丙基丙烯酰胺凝膠協(xié)助溶菌酶復(fù)性。本發(fā)明所開發(fā)的溫敏型聚N－異丙基丙烯酰胺凝膠，作為一種新型的蛋白質(zhì)體外復(fù)性的添加劑，可使溶菌酶的活力回收率比稀釋復(fù)性提高68％以上，凝膠重復(fù)利用8次后溶菌酶的活力回收率仍比稀釋復(fù)性提高22％以上。該凝膠具有高效、影響復(fù)性的參數(shù)較少、操作方便、儀器設(shè)備要求較低且易于分離回收等優(yōu)點(diǎn)，可降低生產(chǎn)成本，因而在蛋白質(zhì)體外復(fù)性領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1648243SQ20041007340
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者關(guān)怡新, 姚善涇, 崔志芳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)