專利名稱：基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
(一)國內(nèi)外相關(guān)研究技術(shù)綜述1、骨形成蛋白概述美國Urist在1965年首先報(bào)道將牛的脫鈣骨基質(zhì)植入小鼠肌肉，能誘導(dǎo)形成新的軟骨和骨組織[1]，經(jīng)過20多年的研究證明骨基質(zhì)中存在一種能夠誘導(dǎo)骨組織生成的活性蛋白，命名為骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，簡稱BMP)，這就在理論上證實(shí)了骨形成學(xué)說，并為臨床骨修復(fù)的治療提出了新途徑[2，3]。其后發(fā)現(xiàn)不僅在動(dòng)物及人的骨和牙組織中有BMP[4-9]，而且在胚胎和成年動(dòng)物許多組織中也有BMP[10-11]。至今發(fā)現(xiàn)的至少有20種不同的BMP[2-16]，組成BMP家族。
對BMP生物學(xué)功能的研究表明BMP不是一般的生長因子，而是一類多功能的分化因子。由于BMP是研究骨形成機(jī)制中發(fā)現(xiàn)的，因而對BMP誘導(dǎo)成骨的作用研究得最早最充分，目前世界上BMP醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)也還是在其成骨的作用，每年發(fā)表幾百篇BMP的研究論文內(nèi)容也主要集中在BMP誘導(dǎo)成骨的機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用上，至今已經(jīng)開發(fā)投放市場有BMP-2和BMP-7，都是用于骨疾病的治療上。雖然BMP對骨疾病的治療應(yīng)用也還會有更多的發(fā)展，但骨形成蛋白的功能是多方面的，不僅能夠誘導(dǎo)骨組織的生成，而且在造血組織、神經(jīng)組織、以及一些器官組織的誘導(dǎo)發(fā)生上都起重要作用。因此BMP有著更多方面的臨床應(yīng)用和廣闊市場前景。對BMP結(jié)構(gòu)的研究[17，18]表明除BMP-1外，其他BMPs都屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor-β，簡稱TGF-β)超家族的成員，各種BMP都具有這個(gè)超家族的共性，也有其自身的特性，歸納如下(1)大多數(shù)BMP成員基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA都大于1.4-1.8kb，有的則長約4kb。有的BMP有長短不同的轉(zhuǎn)錄物，反映BMP有不同的拼接方式，或者有不同的組織特異性與功能。
(2)屬于分泌性蛋白。所有的BMP在細(xì)胞內(nèi)剛合成時(shí)N端都帶有分泌蛋白質(zhì)所特有的信號肽段，BMP加工后分泌到細(xì)胞外。
(3)BMP蛋白的成熟都經(jīng)過加工過程。不同的BMP cDNA編碼約400-700個(gè)氨基酸組成的前原BMP(pre-pro-BMP)，翻譯形成的這個(gè)較大的BMP前體蛋白，經(jīng)切去N端信號肽段，再受內(nèi)切蛋白酶切去前肽段，才生成C段100多個(gè)氨基酸組成的成熟肽。(4)不同的成熟BMP的N端同源性性較低，長短也各不相同，但共同的特點(diǎn)是N端含堿性氨基酸較多(這是與其它TGF-β超家族不同的)，使它容易吸附在細(xì)胞外的基質(zhì)上。且成熟BMP的疏水性強(qiáng)，溶解度差，這些都給BMP的提取、分離、制備和生產(chǎn)帶來困難。
(5)BMP的活性形式是二聚體(dimer)。BMP的成熟肽一般有7個(gè)半胱氨酸(個(gè)別如BMP一8成熟肽有9個(gè)半胱氨酸)，在同一肽鏈內(nèi)部6個(gè)半胱氨酸形成3個(gè)鏈內(nèi)的雙硫鍵，余下一個(gè)半胱氨酸與另一肽的半胱氨酸形成鏈間的雙硫鍵，從而構(gòu)成二聚體，才能與細(xì)胞表面的受體相結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)活性。同種BMP之間形成的二聚體，稱同源二聚體(homodimer)，如BMP-2與BMP-2成熟肽間形成的二聚體。不同種BMP之間形成的二聚體，稱異源二聚體(heterodimer)。異源二聚體的活性往往高于同源二聚體，例如BMP-4/7異源二聚體的生物學(xué)活性比BMP-7同源二聚體高3倍、比BMP-4同源二聚體高7倍。[19，20](6)不同的BMP間的序列有較多的差別，但同一種BMP在不同種族間卻高度同源，提示BMP在生物進(jìn)化中具有共同的重要作用。
以上所述的BMP特征，都是制備有良好生物學(xué)活性BMP應(yīng)該考慮的問題。
2、骨形成蛋白的制備和存在的問題(1)從新鮮骨骼組織提取BMP及困難早期用于臨床治療的BMP是從新鮮骨骼組織提取獲得的，所用的方法基本上是Urist等經(jīng)過20多年努力所建立的提取方案。但從骨組織提取BMP存在著許多問題如材料來源困難要獲得大量新鮮的動(dòng)物骨組織是沒有問題的，但提取所得的動(dòng)物BMP對人有免疫原性，在人體內(nèi)會引起排斥反應(yīng)，不適合在人體使用，但要取得大量新鮮的人骨組織就很困難；提取步驟繁雜、收獲量低、純度不好由于組織中的BMP溶解度差，因此Urist等采用鹽酸胍等變性劑、設(shè)計(jì)了繁雜的步驟，需要花費(fèi)大量人力和時(shí)間，即使如此，一般10kg骨組織提取不到10mg BMP，難以滿足臨床需要，而且得到的BMP仍然不是純品，電泳分析仍然有許多雜蛋白帶；重復(fù)性差各批提取所獲得的BMP的純度和生物學(xué)活性差別很大。上述這些問題經(jīng)過多年的努力，仍然沒有解決。因而從骨組織提取BMP的生產(chǎn)難以有嚴(yán)格的質(zhì)量控制，至今國外從來沒有批準(zhǔn)過從骨組織提取來生產(chǎn)BMP的藥品投放市場。
(2)用培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞去表達(dá)、制備BMP及存在的問題由于從動(dòng)物或人組織提取得不到合格的BMP，因而用基因工程的手段去獲得重組人骨形成蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein，簡稱rhBMP)成為大量生產(chǎn)合格的人BMP的必由之路。1988年美國的Wozney等[2]率先報(bào)道將人BMP-1、-2、-3 cDNA插入真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的CO3-1細(xì)胞株，能分泌產(chǎn)生有活性的人BMP-1、-2、-3蛋白，開辟了用基因工程的手段去制備BMP的道路。1991年美國Wang等用培養(yǎng)的CHO細(xì)胞株也成功表達(dá)得到具有誘骨活性的人BMP-2，人BMP-4、人BMP-7也都在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)[21-23]。經(jīng)過15年的努力研究，美國用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來表達(dá)生產(chǎn)rhBMP-2和rhBMP-7通過了臨床試驗(yàn)，分別都在2003年以醫(yī)療器械的形式被批準(zhǔn)投放市場，用于骨缺損修復(fù)和脊椎骨融合等臨床治療。但美國用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來表達(dá)生產(chǎn)rhBMP表達(dá)水平低(<細(xì)胞總蛋白量的1％)、純化步驟復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本昂貴，市場價(jià)格10μg BMP約500美元，而臨床一次使用量卻要以10mg計(jì)，即使是美日歐等富裕國家的人民都用不起。
(3)用大腸桿菌系統(tǒng)去表達(dá)、制備BMP及存在的問題采用大腸桿菌系統(tǒng)去生產(chǎn)基因工程重組蛋白的突出優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)水平高、成本低廉。但Wosney等1988年最早在<Science>發(fā)表的研究[2]認(rèn)為大腸桿菌表達(dá)的人BMP-1、-2、-3蛋白都是沒有生物學(xué)活性的，而且在真核細(xì)胞內(nèi)合成大的前體蛋白后加工復(fù)雜，BMP成熟肽形成活性二聚體又涉及14個(gè)半胱氨酸正確配對成7對雙硫鍵等空間構(gòu)象問題，這些在大腸桿菌中不能完成，體外復(fù)性將十分困難，因而長時(shí)間沒有人去研究用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)rhBMP。第一個(gè)用大腸桿菌系統(tǒng)成功表達(dá)復(fù)性獲得有良好活性rhBMP的是中國。第四軍醫(yī)大學(xué)課題組[24-32]、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院趙明等[33]、上海生物化學(xué)研究所李伯良等[34]先后在1991-1994年用大腸桿菌系統(tǒng)高表達(dá)重組人骨形成蛋白-2成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein-2 matural peptide，簡稱rhBMP-2m)，并經(jīng)過復(fù)性獲得有良好誘骨活性的rhBMP-2m、rhBMP-3m等。1996年德國Ruppert等[35]也用大腸桿菌系統(tǒng)成功表達(dá)復(fù)性獲得有良好活性rhBMP-2m，并就此在歐洲申請了專利。我國用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的rhBMP-2m于2004年通過臨床試驗(yàn)，以醫(yī)療器械的形式被批準(zhǔn)生產(chǎn)投放市場，用于骨缺損的治療。但是用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)去制備BMP也有明顯的缺陷，主要問題是不會正確加工和折疊BMP使之成為有活性的蛋白質(zhì)。因此，探討B(tài)MP包涵體的體外復(fù)性就成為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一些研究報(bào)告就專門研究BMP體外復(fù)性[35，38-41]。多數(shù)復(fù)性的方案是先將BMP包涵體溶解在變性劑(如鹽酸胍、尿素)中，然后用迅速稀釋或在低蛋白質(zhì)濃度下緩慢透析，在一些氧化還原劑(如氧化型和還原型谷胱甘肽等)、防聚合劑(如CHES、精氨酸等)等幫助下使BMP肽鏈形成合適的配對雙硫鍵和合適的折疊。盡管探索了各種復(fù)性的條件，努力提高從BMP單體形成二聚體的量，但實(shí)際復(fù)性時(shí)要么大部分BMP不能形成二聚體、要么BMP會形成更多的三聚體、四聚體、五聚體、或更大的多聚體，真正能夠生成有生物學(xué)活性的BMP二聚體的比例很低。根本原因是體外的復(fù)性無法控制使只能由BMP肽鏈中7個(gè)半胱氨酸中應(yīng)該生成鏈間二硫鍵的那個(gè)半胱氨酸去生成鏈間二硫鍵，7個(gè)半胱氨酸中任何一個(gè)都有可能去與另外的BMP肽鏈中任一個(gè)半胱氨酸去形成鏈間二硫鍵，結(jié)果就會生成各種多聚體，即使產(chǎn)生一部分二聚體，也不都是由應(yīng)該生成鏈間二硫鍵的那個(gè)半胱氨酸去生成的那種活性二聚體。因此，大腸桿菌系統(tǒng)雖然能夠高水平表達(dá)并得到大量廉價(jià)的BMP成熟肽，但體外復(fù)性得到具有活性的BMP二聚體量卻很少。所以，美國市場預(yù)測研究所說過“BMP是最有市場前景的基因工程產(chǎn)品，也是難度最大的基因工程產(chǎn)品?！笔遣粺o道理的。
(二)同本發(fā)明最相關(guān)的技術(shù)如上所述，德國的Ruppert等[35]、Vallejo LF等[39-41]從1996-2004年非常認(rèn)真和反復(fù)研究探索過大腸桿菌表達(dá)的BMP包涵體的體外復(fù)性條件，確實(shí)也提高了BMP二聚體的收得量和活性，Vallejo LF等2004年的報(bào)道[41]復(fù)性時(shí)蛋白質(zhì)濃度最高可以達(dá)到2.1mg/ml(通常復(fù)性只能用很低濃度的蛋白，常用是＜0.1mg/ml，以防止肽鏈間的相互作用聚合，但這給復(fù)性后的BMP分離濃縮帶來很大的困難)，因此Vallejo LF等的工作應(yīng)該說已經(jīng)有了很大的突破，但是并沒有從根本上克服上述的困難“怎樣使兩個(gè)各自都帶有7個(gè)半胱氨酸的BMP成熟肽，只選擇其中正確的一個(gè)去形成鏈間的雙硫鍵，其它12個(gè)半胱氨酸只去形成鏈內(nèi)的雙硫鍵?！币虼?，他們的工作提高都是有限的，不很理想。迄今為止，再沒有任何大腸桿菌去直接高表達(dá)具有類似二聚體結(jié)構(gòu)BMP的設(shè)計(jì)和研究報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，本發(fā)明的目的在于，提供一種用基因工程的手段使大腸桿菌直接表達(dá)類似二聚體結(jié)構(gòu)的有活性的重組二連體骨形成蛋白及其制備方法，以期用廉價(jià)的大腸桿菌基因工程系統(tǒng)去大量生產(chǎn)具有良好生物活性的各種BMP?，F(xiàn)將本發(fā)明構(gòu)思及技術(shù)解決方案敘述如下如上所述BMP都是肽鏈合成后，由2條肽鏈上許多個(gè)半胱氨酸中特定的一對半胱氨酸之間形成鏈間雙硫鍵而構(gòu)成有活性的二聚體。廉價(jià)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠大量合成BMP成熟肽，卻不能正確地選擇特定的一對半胱氨酸去形成二聚體，成為以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備良好活性BMP的困難所在。本發(fā)明基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法其特征在于將2個(gè)BMP成熟肽間不以雙硫鍵(-S-S-)連接、而是以肽鍵(-CO-NH-)相連接，使大腸桿菌基因工程表達(dá)系統(tǒng)能夠直接合成類似二聚體結(jié)構(gòu)BMP，命名其為BMP二連體(human bone morphogenetic protein duplex，dhBMP)，由2個(gè)人骨形成蛋白BMP成熟肽組成的二連體全名為“重組人BMP二連體”(recombinant human bone morphogeneticprotein duplex)簡稱為“rdhBMP”；此發(fā)明設(shè)計(jì)，既適用于構(gòu)建表達(dá)同一種BMP組成的同源BMP二連體(homoduplex BMP)，也適用于構(gòu)建表達(dá)由不同兩種BMP組成的異源BMP二連體(heteroduplex BMP)，簡稱為rdhBMP-xmxm；其中x為構(gòu)成二連體的BMP種類名號；兩個(gè)x種類名號可相同，也可不同。構(gòu)建的基本方法是將編碼截短BMP、BMP成熟肽或更短的BMP肽段[36，37]的cDNA放在大腸桿菌中表達(dá)，使BMP成熟肽在內(nèi)部正確形成3對雙硫鍵、在BMP成熟肽的鏈間正確形成1個(gè)肽鍵而成為BMP二連體、以及BMP空間構(gòu)象的正確折疊和在體外純化、復(fù)性后成為有活性的BMP。具體方法步驟如下步驟1分析所擬構(gòu)建的BMP二聚體構(gòu)象及BMP肽鏈中應(yīng)該用于形成鏈間雙硫鍵的半胱氨酸位置；步驟2將兩個(gè)BMP分子之間原本形成二聚體鏈間雙硫鍵的半胱氨酸突變，使其變?yōu)椴荒苄纬呻p硫鍵的其它氨基酸；該突變可以用對BMP肽鏈編碼的cDNA進(jìn)行定位突變來完成、也可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、或商售的定位突變試劑盒的方法來完成；步驟3在上述經(jīng)過突變的第一個(gè)BMP肽鏈的羧基端(C端)連接上一段連接肽(linker)；這段連接肽應(yīng)當(dāng)富含甘氨酸，使相連的兩段BMP肽鏈間有足夠的空間距離和活動(dòng)度；該工作可以靠限制性核酸內(nèi)切酶或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的設(shè)計(jì)，將編碼第一個(gè)BMP肽鏈的cDNA和編碼連接肽的DNA序列按讀框連續(xù)的方式連接起來；步驟4再將上述經(jīng)過突變的第二個(gè)BMP肽鏈按讀框連續(xù)的方式連接在第一個(gè)BMP肽鏈-連接肽的羧基端(C端)；該工作同樣可以靠限制性核酸內(nèi)切酶或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的設(shè)計(jì)將兩個(gè)DNA序列連接起來；步驟5將連接好的編碼[第一個(gè)BMP肽鏈--連接肽--第二個(gè)BMP肽鏈]的DNA序列克隆入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建BMP二連體的表達(dá)載體；步驟6將BMP二連體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主菌；提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化和核酸序列測定鑒定；并鑒定帶有BMP二連體的表達(dá)載體細(xì)菌的表達(dá)水平和穩(wěn)定性；
上述步驟2中所述的將兩個(gè)BMP肽鏈中的半胱氨酸突變的過程需要加入限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列或起始碼ATG，并需要聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增引物；引物根據(jù)需要可設(shè)計(jì)為不同DNA序列；上述步驟3中所述的連接肽(linker)是指根據(jù)要求設(shè)計(jì)的一段由特定DNA序列編碼的富含甘氨酸的肽鏈化合物；上述步驟5中所述的BMP二連體的表達(dá)載體是指BMP插入大腸桿菌質(zhì)粒所構(gòu)建的、能在大腸桿菌中表達(dá)BMP二連體的質(zhì)粒；上述步驟6中所述大腸桿菌宿主菌可為DH5α、TOP 10、或基因工程大腸桿菌宿主菌。
根據(jù)本發(fā)明所提供的基因工程大腸桿菌直接表達(dá)類似二聚體結(jié)構(gòu)BMP的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法所得出的重組二連體骨形成蛋白BMP，可有多種具有大同小異DNA序列，其主體DNA序列經(jīng)鑒定，實(shí)際測定結(jié)果與設(shè)計(jì)預(yù)期的完全一致。例如要構(gòu)建重組人BMP-2成熟肽同源二連體(recombinant human bone morphogenetic protein-2 matural peptide homoduplex，簡稱為rdhBMP-2m2m)，可將2個(gè)編碼人BMP-2成熟肽(hBMP-2m)的基因插入大腸桿菌質(zhì)粒pDH2，構(gòu)建所得的BMP二連體的表達(dá)載體名稱為pDH2-dhBMP-2m2m，實(shí)際測定出其全序列如下1 AGATCTCTCT CACCTACCAA ACAATGCCCC CCTGCAAAAA ATAAATTCAT ATAAAAAACATCTAGAGAGA GTGGATGGTT TGTTACGGGG GGACGTTTTT TATTTAAGTA TATTTTTTGT61 TACAGATAAC CATCTGCGGT GATAAATTAT CTCTGGCGGT GTTGACATAA ATACCACTGGATGTCTATTG GTAGACGCCA CTATTTAATA GAGACCGCCA CAACTGTATT TATGGTGACC121 CGGTGATACT GAGCACATCA GCAGGACGCA CTGACCACCA TGAAGGTGAC GCTCTTAAAAGCCACTATGA CTCGTGTAGT CGTCCTGCGT GACTGGTGGT ACTTCCACTG CGAGAATTTT181 ATTAAGCCCT GAAGAAGGGC AGCATTCAAA GCAGAAGGCT TTGGGGTGTG TGATACGAAATAATTCGGGA CTTCTTCCCG TCGTAAGTTT CGTCTTCCGA AACCCCACAC ACTATGCTTTM Q A K H K Q R K241 CGAAGCATTG GTTAAAAATT AAGGAGAATT AATTCATGCA AGCCAAACAC AAACAGCGGAGCTTCGTAAC CAATTTTTAA TTCCTCTTAA TTAAGTACGT TCGGTTTGTG TTTGTCGCCT· R L K S S C K R H P L Y V D F S D V G W301 AACGCCTTAA GTCCAGCTGT AAGAGACACC CTTTGTACGT GGACTTCAGT GACGTGGGGTTTGCGGAATT CAGGTCGACA TTCTCTGTGG GAAACATGCA CCTGAAGTCA CTGCACCCCA· N D W I V A P P G Y H A F Y C H G E C P361 GGAATGACTG GATTGTGGCT CCCCCGGGGT ATCACGCCTT TTACTGCCAC GGAGAATGCCCCTTACTGAC CTAACACCGA GGGGGCCCCA TAGTGCGGAA AATGACGGTG CCTCTTACGG· F P L A D H L N S T N H A I V Q T L V N421 CTTTTCCTCT GGCTGATCAT CTGAACTCCA CTAATCATGC CATTGTTCAG ACGTTGGTCAGAAAAGGAGA CCGACTAGTA GACTTGAGGT GATTAGTACG GTAACAAGTC TGCAACCAGT· S V N S K I P K A S C V P T E L S A I S481 ACTCTGTTAA CTCTAAGATT CCTAAGGCAA GCTGTGTCCC GACAGAACTC AGTGCTATCTTGAGACAATT GAGATTCTAA GGATTCCGTT CGACACAGGG CTGTCTTGAG TCACGATAGA
· M L Y L D E N E K V V L K N Y Q D M V V541 CGATGCTGTA CCTTGACGAG AATGAAAAGG TTGTATTAAA GAACTATCAG GACATGGTTGGCTACGACAT GGAACTGCTC TTACTTTTCC AACATAATTT CTTGATAGTC CTGTACCAAC· E G C G C R G G G G S G G G G S G G G G601 TGGAGGGTTG TGGGTGTCGC GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCAGC GGCGGTGGCGACCTCCCAAC ACCCACAGCG CCACCTCCGC CAAGTCCGCC TCCACCGTCG CCGCCACCGC· S Q A K H K Q R K R L K S S C K R H P L661 GATCGCAAGC CAAACACAAA CAGCGGAAAC GCCTTAAGTC CAGCTGTAAG AGACACCCTTCTAGCGTTCG GTTTGTGTTT GTCGCCTTTG CGGAATTCAG GTCGACATTC TCTGTGGGAA· Y V D F S D V G W N D W I V A P P G Y H721 TGTACGTGGA CTTCAGTGAC GTGGGGTGGA ATGACTGGAT TGTGGCTCCC CCGGGGTATCACATGCACCT GAAGTCACTG CACCCCACCT TACTGACCTA ACACCGAGGG GGCCCCATAG· A F Y C H G E C P F P L A D H L N S T N781 ACGCCTTTTA CTGCCACGGA GAATGCCCTT TTCCTCTGGC TGATCATCTG AACTCCACTATGCGGAAAAT GACGGTGCCT CTTACGGGAA AAGGAGACCG ACTAGTAGAC TTGAGGTGAT· H A I V Q T L V N S V N S K I P K A S C841 ATCATGCCAT TGTTCAGACG TTGGTCAACT CTGTTAACTC TAAGATTCCT AAGGCAAGCTTAGTACGGTA ACAAGTCTGC AACCAGTTGA GACAATTGAG ATTCTAAGGA TTCCGTTCGA· V P T E L S A I S M L Y L D E N E K V V901 GTGTCCCGAC AGAACTCAGT GCTATCTCGA TGCTGTACCT TGACGAGAAT GAAAAGGTTGCACAGGGCTG TCTTGAGTCA CGATAGAGCT ACGACATGGA ACTGCTCTTA CTTTTCCAAC· L K N Y Q D M V V E G C G C R961 TATTAAAGAA CTATCAGGAC ATGGTTGTGG AGGGTTGTGG GTGTCGCTAA TCTAGAGTCGATAATTTCTT GATAGTCCTG TACCAACACC TCCCAACACC CACAGCGATT AGATCTCAGC1021 ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT CTGTTTTGGC GGATGAGAGA AGATTTTCAG CCTGATACAGTGGACGTCCG TACGTTCGAA GACAAAACCG CCTACTCTCT TCTAAAAGTC GGACTATGTC1081 CTTAAATCAG AACGCAGAAG CGGTCTGATA AAACAGAATT TGCCTCCCGG CAGTAGCGCGGAATTTAGTC TTGCGTCTTC GCCAGACTAT TTTGTCTTAA ACGGAGGGCC GTCATCGCGC1141 GTGGTCCCAC CTGACCCCAT GCCGAACTCA GAAGTGAAAC GCCGTAGCGC CGATGGTAGTCACCAGGGTG GACTGGGGTA CGGCTTGAGT CTTCACTTTG CGGCATCGCG GCTACCATCA1201 GTGGGGTCTC CCCATGCGAG AGTAGCCAAC TGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAAAGGCTCACACCCCAGAG GGGTACGCTC TCATCGGTTG ACGGTCCGTA GTTTATTTTG CTTTCCGAGT1261 GTCGAAAGAC TGGGCCTTTC GTTTTATCTG TTGTTTGTCG GTGAACGCTC TCCTGAGTAGCAGCTTTCTG ACCCGGAAAG CAAAATAGAC AACAAACAGC CACTTGCGAG AGGACTCATC1321 GACAAATCCG CCGGGAGCGG ATTTGAACGT TGCGAAGCAA CGGCCCGGAG GGTGGCGGGCCTGTTTAGGC GGCCCTCGCC TAAACTTGCA ACGCTTCGTT GCCGGGCCTC CCACCGCCCG1381 AGGACGCCCG CCATAAACTG CCAGGCATCA AATTAAGCAG AAGGCCATCC TGACGGATGGTCCTGCGGGC GGTATTTGAC GGTCCGTAGT TTAATTCGTC TTCCGGTAGG ACTGCCTACC1441 CCTTTTTGCG TTTCTACAAA CTCTTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCCGGAAAAACGC AAAGATGTTT GAGAAACAAA TAAAAAGATT TATGTAAGTT TATACATAGG1501 GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAGCGAGTACTCT GTTATTGGGA CTATTTACGA AGTTATTATA ACTTTTTCCT TCTCATACTC1561 TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTTATAAGTTGTA AAGGCACAGC GGGAATAAGG GAAAAAACGC CGTAAAACGG AAGGACAAAA1621 TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGTACGAGTGGGT CTTTGCGACC ACTTTCATTT TCTACGACTT CTAGTCAACC CACGTGCTCA1681 GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGACCCAATGTAG CTTGACCTAG AGTTGTCGCC ATTCTAGGAA CTCTCAAAAG CGGGGCTTCT1741 ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT
TGCAAAAGGT TACTACTCGT GAAAATTTCA AGACGATACA CCGCGCCATA ATAGGGCATA1801 TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGAACTGCGGCCC GTTCTCGTTG AGCCAGCGGC GTATGTGATA AGAGTCTTAC TGAACCAACT1861 GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG AATTATGCAGCATGAGTGGT CAGTGTCTTT TCGTAGAATG CCTACCGTAC TGTCATTCTC TTAATACGTC1921 TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGATCGGAGGACGACGGTAT TGGTACTCAC TATTGTGACG CCGGTTGAAT GAAGACTGTT GCTAGCCTCC1981 ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCGTGGCTTCCTC GATTGGCGAA AAAACGTGTT GTACCCCCTA GTACATTGAG CGGAACTAGC2041 TTGGGAACCG GAGCTGAATG AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGTAACCCTTGGC CTCGACTTAC TTCGGTATGG TTTGCTGCTC GCACTGTGGT GCTACGGACA2101 AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCGTCGTTACCGT TGTTGCAACG CGTTTGATAA TTGACCGCTT GATGAATGAG ATCGAAGGGC2161 GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGCCGTTGTTAAT TATCTGACCT ACCTCCGCCT ATTTCAACGT CCTGGTGAAG ACGCGAGCCG2221 CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGGGGAAGGCCGA CCGACCAAAT AACGACTATT TAGACCTCGG CCACTCGCAC CCAGAGCGCC2281 TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGACATAGTAACGT CGTGACCCCG GTCTACCATT CGGGAGGGCA TAGCATCAAT AGATGTGCTG2341 GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACTCCCCTCAGTC CGTTGATACC TACTTGCTTT ATCTGTCTAG CGACTCTATC CACGGAGTGA2401 GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAACTAATTCGTA ACCATTGACA GTCTGGTTCA AATGAGTATA TATGAAATCT AACTAAATTT2461 ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC TCATGACCAATGAAGTAAAA ATTAAATTTT CCTAGATCCA CTTCTAGGAA AAACTATTAG AGTACTGGTT2521 AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA AGATCAAAGGTTAGGGAATT GCACTCAAAA GCAAGGTGAC TCGCAGTCTG GGGCATCTTT TCTAGTTTCC2581 ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACCTAGAAGAACT CTAGGAAAAA AAGACGCGCA TTAGACGACG AACGTTTGTT TTTTTGGTGG2641 GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAACCGATGGTCGC CACCAAACAA ACGGCCTAGT TCTCGATGGT TGAGAAAAAG GCTTCCATTG2701 TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCAACCGAAGTCG TCTCGCGTCT ATGGTTTATG ACAGGAAGAT CACATCGGCA TCAATCCGGT2761 CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC TGTTACCAGTGGTGAAGTTC TTGAGACATC GTGGCGGATG TATGGAGCGA GACGATTAGG ACAATGGTCA2821 GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG GACTCAAGAC GATAGTTACCCCGACGACGG TCACCGCTAT TCAGCACAGA ATGGCCCAAC CTGAGTTCTG CTATCAATGG2881 GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCGCCTATTCCGC GTCGCCAGCC CGACTTGCCC CCCAAGCACG TGTGTCGGGT CGAACCTCGC2941 AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA GCGTGAGCAT TGAGAAAGCG CCACGCTTCCTTGCTGGATG TGGCTTGACT CTATGGATGT CGCACTCGTA ACTCTTTCGC GGTGCGAAGG3001 CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCACGCTTCCCTCT TTCCGCCTGT CCATAGGCCA TTCGCCGTCC CAGCCTTGTC CTCTCGCGTG3061 GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT TTCGCCACCTCTCCCTCGAA GGTCCCCCTT TGCGGACCAT AGAAATATCA GGACAGCCCA AAGCGGTGGA3121 CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT GGAAAAACGCGACTGAACTC GCAGCTAAAA ACACTACGAG CAGTCCCCCC GCCTCGGATA CCTTTTTGCG3181 CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTTCTTGTCGTTGCGC CGGAAAAATG CCAAGGACCG GAAAACGACC GGAAAACGAG TGTACAAGAA3241 TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA CCGTATTACC GCCTTTGAGT GAGCTGATACAGGACGCAAT AGGGGACTAA GACACCTATT GGCATAATGG CGGAAACTCA CTCGACTATG3301 CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG CGGAAGAGCGGCGAGCGGCG TCGGCTTGCT GGCTCGCGTC GCTCAGTCAC TCGCTCCTTC GCCTTCTCGC3361 CCCTTATCTT TCCCTTTATT TTTGCTGCGG TAAGTCGCAT AAAAACCATT CTTCATAATTGGGAATAGAA AGGGAAATAA AAACGACGCC ATTCAGCGTA TTTTTGGTAA GAAGTATTAA3421 CAATCCATTT ACTATGTTAT GTTCTGAGGG GAGTGAAAAT TCCCCTAATT CGATGAAGATGTTAGGTAAA TGATACAATA CAAGACTCCC CTCACTTTTA AGGGGATTAA GCTACTTCTA3481 TCTTGCTCAA TTGTTATCAG CTATGCGCCG ACCAGAACAC CTTGCCGATC AGCCAAACGT
AGAACGAGTT AACAATAGTC GATACGCGGC TGGTCTTGTG GAACGGCTAG TCGGTTTGCA3541 CTCTTCAGGC CACTGACTAG CGATAACTTT CCCCACAACG GAACAACTCT CATTGCATGGGAGAAGTCCG GTGACTGATC GCTATTGAAA GGGGTGTTGC CTTGTTGAGA GTAACGTACC3601 GATCATTGGG TACTGTGGGT TTAGTGGTTG TAAAAACACC TGACCGCTAT CCCTGATCAGCTAGTAACCC ATGACACCCA AATCACCAAC ATTTTTGTGG ACTGGCGATA GGGACTAGTC3661 TTTCTTGAAG GTAAACTCAT CACCCCCAAG TCTGGCTATC CAGAAATCAC CTGGCTCAACAAAGAACTTC CATTTGAGTA GTGGGGGTTC AGACCGATAG GTCTTTAGTG GACCGAGTTG3721 AGCCTGCTCA GGGTCAACGA GAATTAACAT TCCGTCAGGA AAGCTCGGCT TGGAGCCTGTTCGGACGAGT CCCAGTTGCT CTTAATTGTA AGGCAGTCCT TTCGAGCCGA ACCTCGGACA3781 TGGTGCGGTC ATGGAATTAC CTTCAACCTC AAGCCAGAAT GCAGAATCAC TGGCTTTTTTACCACGCCAG TACCTTAATG GAAGTTGGAG TTCGGTCTTA CGTCTTAGTG ACCGAAAAAA3841 GGTTGTGCTT ACCCATCTCT CCGAATCACC TTTGGTAAAG GTTCTCAGCT TAGGTGAGAACCAACACGAA TGGGTAGAGA GGCTTAGTGG AAACCATTTC CAAGAGTCGA ATCCACTCTT3901 CATCCCTGCC TGAACATGAG AAAAAACAGG GTACTCATAC TCACTTCTAA GTGACGGCTGGTAGGGACGG ACTTGTACTC TTTTTTGTCC CATGAGTATG AGTGAAGATT CACTGCCGAC3961 CATACTAACC GCTTCATACA TCTCGTAGAT TTCTCTGGCG ATTGAAGGGC TAAATTCTTCGTATGATTGG CGAAGTATGT AGAGCATCTA AAGAGACCGC TAACTTCCCG ATTTAAGAAG4021 AAGGCTAACT TTGAGAATTT TTGCAAGCAA TGCGGCGTTA TAAGCATTTA ATGCATTGATTTCCGATTGA AACTCTTAAA AACGTTCGTT ACGCCGCAAT ATTCGTAAAT TACGTAACTA4081 GCCATTAAAT AAAGCACCAA CGCCTGACTG GGCCATCCCC ATCTTGTCTG CGACAGATTCCGGTAATTTA TTTCGTGGTT GCGGACTGAC CCGGTAGGGG TAGAACAGAC GCTGTCTAAG4141 CTGGGATAAG CCAAGTTCAT TTTTCTTTTT TTCATAAATT GCTTTAAGGC CACGTGCGTCGACCCTATTC GGTTCAAGTA AAAAGAAAAA AAGTATTTAA CGAAATTCCG GTGCACGCAG4201 CTCAAGCTGC TCTTGTGTTA ATGGTTTCTT TTTTGTGCTC ATACGTTAAA TCTATGACCGGAGTTCGACG AGAACACAAT TACCAAAGAA AAAACACGAG TATGCAATTT AGATACTGGC4261 CAAGGGATAA ATATCTAACA CCGTGCGTGT TGACTATTTT AGCTCTGGCG GTGATAATGGGTTCCCTATT TATAGATTGT GGCACGCACA ACTGATAAAA TCGAGACCGC CACTATTACC4321 TTGCATGTAC TAAGGTTGTA TGGAACAACG CATAACCCTG AAAGATTATG CAATGCGCTTAACGTACATG ATTCCAACAT ACCTTGTTGC GTATTGGGAC TTTCTAATAC GTTACGCGAA4381 TGGGCAAACC AAGACAGCTA AAACCCGTTTGG TTCTGTCGAT TT
圖1以hBMP1-hBMP2二連體為例的基因工程重組方法示意2編碼二連體dhBMP-xmxm的基因插入質(zhì)粒所構(gòu)建的表達(dá)載體示例3pDH2表達(dá)載體示意4DH5α/pDH2-dhBMP-2m2m經(jīng)42℃誘導(dǎo)和裂菌后包涵體洗滌過程的12％PAGE-SDS電泳圖譜圖5pDH2-dhBMP2m2m/DH5α42°誘導(dǎo)4h表達(dá)全菌液電泳道光密度掃描6包涵體洗滌4次后樣品的12％PAGE-SDS電泳道激光光密度掃描7rdhBMP-2m2m HiTrap SP柱層析圖譜圖8rdhBMP-2m2m HiTrap SP柱層析純化后12％PAGE-SDS電泳圖譜圖9rdhBMP-2m2m植入小鼠14天后局部組織切片放大100倍的顯微鏡照片圖10rdhBMP-2m2m植入小鼠14天后局部組織切片放大400倍的顯微鏡照片
其中圖1中hBMP1和hBMP2分別是要構(gòu)建二連體的編碼第一和第二個(gè)BMP的DNA；mut標(biāo)記為突變，紅圓圈標(biāo)出突變處；P1、P2、P3、P4、P5、P6分別為所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物；E1、E2、E3為所設(shè)計(jì)的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)；Linker為所設(shè)計(jì)編碼連接肽的DNA序列；ATG為DNA上的翻譯起始碼，TAA為DNA上的翻譯終止碼；pBD為質(zhì)粒載體。該圖清楚地顯示了所發(fā)明的BMP二連體的構(gòu)思及構(gòu)建BMP二連體的技術(shù)解決方案。
圖2中PL為調(diào)控啟動(dòng)子；CI 875為編碼阻遏蛋白的基因；pDH2可調(diào)控表達(dá)載體；Ampr為氨芐青霉素的抗性基因；dhBMP-xmxm為所插入的編碼BMP二連體蛋白的基因。該圖顯示了以質(zhì)粒pDH2為例所構(gòu)建的pDH2-dhBMP-xmxm結(jié)構(gòu)環(huán)型圖。
圖3中MCS表示多克隆位點(diǎn)；pL為啟動(dòng)子rmBT1T2為轉(zhuǎn)錄終止子，可以提高目的蛋白表達(dá)水平；Apr為氨芐青霉素抗性基因；ori表示質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；RNAprimer為編碼質(zhì)粒復(fù)制所需要的RNA引物的DNA序列；圓環(huán)圖下的是MSC區(qū)的DNA序列，標(biāo)出其中各種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。此圖顯示了圖1中所舉出的pDH2結(jié)構(gòu)環(huán)型示意圖。
圖4中PAGE-SDS是十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳的縮寫(下同)。CU為pDH2/DH5α(空載體對照)30℃培養(yǎng)未誘導(dǎo)樣品；CI為pDH2/DH5α(空載體對照)42℃誘導(dǎo)4h樣品；BU為pDH2-dhBMP2m2m/DH5α30℃培養(yǎng)未誘導(dǎo)樣品；BI為pDH2-dhBMP2m2m/DH5α42℃誘導(dǎo)4h樣品，目的蛋白占76.7％；T1為STE懸浮的菌體沉淀樣品；T2為STE洗滌1次后的菌體沉淀懸浮液樣品；S1為裂菌離心后的上清樣品；S2為包涵體洗滌1次的上清樣品；I1為包涵體洗滌1次后的懸浮液樣品；I2為包涵體洗滌2次后的懸浮液樣品；I3為包涵體洗滌3次后的懸浮液樣品；3S為包涵體洗滌3次的上清樣品；I4為包涵體洗滌4次后的懸浮液樣品，目的蛋白占90.6％；4S為包涵體洗滌4次的上清樣品。該圖說明了所構(gòu)建的pDH2-dhBMP-2m2m轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白rdhBMP-2m2m有很高的表達(dá)水平(占細(xì)菌總蛋白量的76.7％)，因而經(jīng)裂菌后釋放出來的目的蛋白rdhBMP-2m2m也就容易純化，包涵體只經(jīng)4次洗滌rdhBMP-2m2m的純度就達(dá)到90.6％。
圖5中橫坐標(biāo)表示電泳距離，縱坐標(biāo)表示激光掃描的光密度值。該圖顯示了DH5α/pDH2-dhBMP-2m2m誘導(dǎo)后所表達(dá)的目的蛋白rdhBMP-2m2m占細(xì)菌總蛋白量76.7％的高水平的結(jié)果。
圖6中橫坐標(biāo)表示距離，縱坐標(biāo)表示激光掃描的光密度值。該圖顯示了包涵體經(jīng)4次洗滌后rdhBMp-2m2m的純度達(dá)到90.6％高水平的結(jié)果，說明包涵體洗滌的純化效果很好。
圖7中縱坐標(biāo)表示A260吸光度值，橫坐標(biāo)表示記錄紙移動(dòng)距離。該圖顯示出HiTrapSP陰離子柱層析中蛋白質(zhì)被洗脫分離的情況。
圖8中該圖顯示了經(jīng)SP陽離子柱層析后，rdhBMP-2m2m的純度已經(jīng)達(dá)到電泳純的程度。
圖9中為放大100倍照片；此圖清楚地看到rdhBMP-2m2m植入小鼠后肢肌肉14天后局部異位成骨形成骨小梁和成骨細(xì)胞的情況，證明了所制備的rdhBMP-2m2m有很好的誘骨活性。
圖10中為放大400倍照片；此圖清楚地看到rdhBMP-2m2m植入小鼠后肢肌肉14天后局部異位成骨形成骨小梁和成骨細(xì)胞的情況，證明了所制備的rdhBMP-2m2m有很好的誘骨活性。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合附圖，以主要采用PCR手段去構(gòu)建BMP二連體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建rdhBMP-2m2m為例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明(一)構(gòu)建rdhBMP-2m2m的步驟(參見圖1)步驟1分析所擬構(gòu)建的BMP二聚體構(gòu)象、以及BMP肽鏈中應(yīng)該用于形成鏈間雙硫鍵的半胱氨酸位置是在人BMP-2成熟肽(hBMP-2m)肽鏈第78個(gè)氨基酸殘基的位置上；步驟2設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方案，用PCR手段將hBMP-2m第78位半胱氨酸(C)突變?yōu)楸彼?A)，并在編碼區(qū)前面加入限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI位點(diǎn)序列和起始碼ATG。
(1)設(shè)計(jì)并合成PCR引物P1和P2。其序列如下P1CGGAATTCATGCAAGCCAAAGACAAAGAGCGP2CGGGACACAGCTTGCCTTAG(2)以本課題組克隆的人BMP-2成熟肽編碼序列為模板，P1、P2為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得預(yù)期的254bp的PCR產(chǎn)物。
步驟3在上述經(jīng)過突變的第一個(gè)BMP肽鏈的羧基端(C端)連接上一段連接肽；即將編碼富含甘氨酸(G)15肽的DNA序列加到編碼第78位半胱氨酸突變了的人BMP-2成熟肽DNA后面，并加入限制性核酸內(nèi)切酶KpnI位點(diǎn)序列。
(3)設(shè)計(jì)并合成PCR引物p3和p4。其序列如下P3GCAAGCTGTGTCCCGACAGP4CCGGTACCGATCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC GCGACACCCACAACCCTCC(4)以本課題組克隆的人BMP-2成熟肽編碼序列為模板，P3、P4為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得預(yù)期的166bp的PCR產(chǎn)物。
步驟4用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)手段，獲得編碼完整的第78位半胱氨酸突變了的人BMP-2成熟肽及其后面的連接肽(15肽)的DNA(5)以P1、P4為引物，(2)與(4)所得的PCR產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增得到預(yù)期(2)與(4)所得產(chǎn)物連接長度的DNA，將兩個(gè)DNA序列連接起來；步驟5將連接好的編碼[第一個(gè)BMP肽鏈--連接肽--第二個(gè)BMP肽鏈]的DNA序列克隆入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建BMP二連體的表達(dá)載體；即將編碼完整的第78位半胱氨酸突變了的人BMP-2成熟肽及其后面的連接肽(Linker)的DNA插入本課題組構(gòu)建的表達(dá)載體pDH2(見附圖1)中，構(gòu)建pDH2-hBMP-2m-Linker。
步驟6將BMP二連體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主菌；提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化和核酸序列測定鑒定；并鑒定帶有BMP二連體的表達(dá)載體菌株的表達(dá)水平和穩(wěn)定性；即將(6)pDH2和從(5)所得的PCR產(chǎn)物，均先用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI消化，再用Klenow聚合酶將粘端補(bǔ)平，然后用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI消化，回收片段。
(7)將由(6)回收的片段用連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌DH5α。經(jīng)氨芐青霉素(Amp)篩選，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化、瓊脂糖電泳鑒定，證明獲得了預(yù)期的pDH2-hBMP-2m-Linker。
步驟7設(shè)計(jì)PCR方案，將限制性核酸內(nèi)切酶Kpn1和Xba1位點(diǎn)序列分別加到另一編碼完整的第78位半胱氨酸突變了的人BMP-2成熟肽DNA序列的兩端。
(8)設(shè)計(jì)并合成PCR引物P5和P6。其序列如下P5CCGGTAC CAAGCCAAACACAAACAGCGP6GCTCTAGAT TAGCGACACCCACAACCCTC(9)以(5)所得PCR產(chǎn)物為模板，P5和P6為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得預(yù)期的360bp的PCR的產(chǎn)物。
步驟8構(gòu)建重組的同源人BMP-2成熟肽二連體(rdhBMP-2m2m)的表達(dá)載體pDH2-dhBMP-2m2m。
(10)pDH2-hBMP-2m-Linker和由(9)獲得的360bp的PCR產(chǎn)物，均先用KpnI酶消化，再用T4聚合酶將粘端削平，然后用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI消化，回收片段。
(11)將由(10)回收的片段用連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌DH5α。經(jīng)氨芐青霉素(Amp)篩選，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化、瓊脂糖電泳鑒定，證明獲得了預(yù)期的pDH2-dhBMP-2m2m。
(二)表達(dá)載體pDH2-dhBMP-2m2m和菌珠的鑒定和測試結(jié)果1、pDH2-dhBMP-2m2m的DNA序列測定DNA序列實(shí)際測定結(jié)果與設(shè)計(jì)預(yù)期的完全一致。(見前所公開的DNA序列)2、pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α誘導(dǎo)表達(dá)rdhBMP-2m2m蛋白質(zhì)-70℃凍存的菌種pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α，經(jīng)30℃過夜培養(yǎng)復(fù)蘇，轉(zhuǎn)接入500ml LB-Amp培養(yǎng)液中30℃培育至測OD600＝0.40，轉(zhuǎn)入42℃水浴搖床誘導(dǎo)4h，離心，收菌。按照常規(guī)操作裂菌、洗滌包涵體4次。取樣作SDS-PAGE電泳分析(電泳圖譜見附圖2)，并對相關(guān)泳道作激光光密度掃描(光密度掃描見附圖3)。結(jié)果pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α經(jīng)42℃誘導(dǎo)4h后，表達(dá)的rdhBMP-2m2m蛋白量占細(xì)菌總蛋白量高達(dá)76.7％(見附圖3)。包涵體經(jīng)4次洗滌純化后，其中rdhBMP-2m2m蛋白純度更高達(dá)90.6％。試驗(yàn)證明所構(gòu)建的pDH2-dhBMP-2m2m表達(dá)載體菌株有極高的rdhBMP-2m2m蛋白量表達(dá)能力，給制備或生產(chǎn)rdhBMP-2m2m創(chuàng)造了極有利的條件。
3、pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α菌種的穩(wěn)定性pDH2-dhBMP-2m2m/DH5α菌種經(jīng)-70℃長期凍存，經(jīng)50次傳代培養(yǎng)，任意取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，證明pDH2-dhBMP-2m2m沒有丟失。50次傳代后，任意取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，結(jié)果表達(dá)rdhBMP-2m2m目的蛋白的強(qiáng)度沒有減弱。試驗(yàn)證明DH5α/pDH2-dhBMP-2m2m菌種有很好的穩(wěn)定性，適于用作大量生產(chǎn)的工程菌株。
(三)dhBMP-2m2m二連體蛋白的純化和生物學(xué)活性1、rdhBMP-2m2m蛋白的離子交換柱層析純化洗滌后的包涵體用尿素溶解后，經(jīng)HiTrap-SP陽離子柱層析(層析圖譜見附圖4)，收集含rdhBMP-2m2m的峰液，取樣作PAGE-SDS電泳分析(電泳圖譜見附圖5)。結(jié)果經(jīng)HiTrap-SP陽離子柱層析純化后，rdhBMP-2m2m二連體蛋白純度達(dá)到95％以上。表明rdhBMP-2m2m二連體蛋白的純化比rhBMP-2m的單體更為容易。
2、rdhBMP-2m2m蛋白的分析測定純化rdhBMP-2m2m蛋白的氨基端20個(gè)氨基酸序列，結(jié)果與設(shè)計(jì)預(yù)期的結(jié)果完全一致，構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)放入的起始碼ATG所編碼的氨基端第一個(gè)蛋氨酸已被切除。
rdhBMP-2m2m蛋白質(zhì)的氨基酸全序列由243氨基酸組成1 QAKHKQRKRL KSSCKRHPLY VDFSDVGWND WIVAPPGYHA FYCHGECPFP51 LADHLNSTNH AIVQTLVNSV NSKIPKASCV PTELSAISML YLDENEKVVL101 KNYQDMVVEG CGCRGGGGSG GGGSGGGGSQ AKHKQRKRLK SSCKRHPLYV151 DFSDVGWNDW IVAPPGYHAF YCHGECPFPL ADHLNSTNHA IVQTLVNSVN201 SKIPKASCVP TELSAISMLY LDENEKVVLK NYQDMVVEGC GCR
(四)rdhBMP-2m2m蛋白的復(fù)性及生物活性檢測1、rdhBMP-2m2m蛋白的復(fù)性經(jīng)純化的rdhBMP-2m2m蛋白對4-8M尿素透析，再透析去除尿素。復(fù)性后的rdhBMP-2m2m蛋白在pH5中是可溶性的，水溶液完全無色透明。用還原和非還原的PAGE-SDS電泳分析復(fù)性結(jié)果(復(fù)性后rdhBMP-2m2m蛋白的還原和非還原PAGE-SDS電泳圖譜見附圖7)。結(jié)果復(fù)性后的rdhBMP-2m2m蛋白帶仍在原來的電泳位置，極少形成多聚體，提示經(jīng)復(fù)性rdhBMP-2m2m中的半胱氨酸殘基主要都形成了肽鏈內(nèi)的雙硫鍵。這結(jié)果還重要地表明使大腸桿菌直接表達(dá)rdhBMP-2m2m二連體，可以省卻過去大腸桿菌表達(dá)rhBMP-2m單體、復(fù)性后要分離二聚體的困難步驟。
2、復(fù)性后的rdhBMP-2m2m蛋白生物學(xué)活性檢測采用了體外培養(yǎng)細(xì)胞株和整體小鼠肌袋誘導(dǎo)異位成骨2種方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果都顯示復(fù)性后的rdhBMP-2m2m二連體具有很好的生物學(xué)活性。具體的實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下。
(1)用本課題組建立并獲得專利的C2C12-K4細(xì)胞(國家專利號ZL 01 1 31813.9)測定BMP活性。此檢測法的基本原理是本課題組所建立的C2C12-K4細(xì)胞，細(xì)胞膜表面有BMP受體，細(xì)胞基因組內(nèi)整合有接受BMP受體傳遞的信息而表達(dá)的熒光素酶(luciferase)報(bào)告基因。當(dāng)加入有生物學(xué)活性的BMP時(shí)，BMP與細(xì)胞膜表面的BMP受體相互作用而向細(xì)胞發(fā)出信號，經(jīng)信號傳導(dǎo)，使熒光素酶表達(dá)，能夠分解酶的底物發(fā)出熒光，熒光的強(qiáng)弱可以反映BMP的生物活性。
用復(fù)性后的rdhBMP-2m2m二連體蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果rdhBMP-2m2m蛋白濃度在納克水平(ng/ml)就顯示出很明顯的活性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下
(2)整體小鼠肌袋誘導(dǎo)異位成骨試驗(yàn)此法是世界公認(rèn)的整體BMP生物活性檢測試驗(yàn)，一般將1-2mg不溶性BMP(或?qū)MP吸附在某些載體上)，植入小鼠肌肉，通常在2周左右局部會誘導(dǎo)生成軟骨，3周左右會形成骨組織。將復(fù)性后的rdhBMP-2m2m沉淀吸附在小塊豬皮膠元上，植入小鼠肌肉。結(jié)果2周時(shí)局部已經(jīng)形成硬塊，取局部組織做組織切片染色，顯微鏡下觀察，證實(shí)已經(jīng)有骨小梁的形成。證明復(fù)性后的rdhBMP-2m2m有良好的誘導(dǎo)異位成骨的活性。(顯微鏡照片見附圖9)
權(quán)利要求
1.基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征在于用基因工程手段，將2個(gè)BMP成熟肽間的雙硫鍵(-S-S-)改為以肽鍵(-CO-NH-)相連接，即將編碼BMP成熟肽截短或?qū)⒏痰腂MP肽段的cDNA放在大腸桿菌中表達(dá)，使BMP成熟肽在內(nèi)部正確形成3對雙硫健，在BMP成熟肽的鏈間以肽健相連接而成為BMP二連體以及經(jīng)在體外純化、復(fù)性后折疊成為有活性的BMP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1說述的基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征在于具體方法步驟如下步驟1分析所擬構(gòu)建的BMP二聚體構(gòu)象及BMP肽鏈中應(yīng)該用于形成鏈間雙硫鍵的半胱氨酸位置；步驟2將要原本應(yīng)該形成二聚體鏈間雙硫鍵的兩個(gè)BMP肽鏈中的半胱氨酸突變，使其變?yōu)椴荒苄纬呻p硫鍵的其它氨基酸；可以用對編碼BMP肽鏈的cDNA進(jìn)行定點(diǎn)突變來完成；或用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR或商售定位點(diǎn)突變試劑盒的方法來完成；步驟3在上述經(jīng)過突變的第一個(gè)BMP肽鏈的羧基端連接上一段連接肽；這段連接肽富含甘氨酸，使相連的兩段BMP肽鏈間有足夠的空間距離和活動(dòng)度；該工作可以靠限制性核酸內(nèi)切酶或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的設(shè)計(jì)，將編碼第一個(gè)BMP肽鏈的cDNA和編碼連接肽的DNA序列按讀框連續(xù)的方式連接起來；步驟4再將上述經(jīng)過突變的第二個(gè)BMP肽鏈按讀框連續(xù)的方式連接在第一個(gè)BMP肽鏈-連接肽的羧基端；該工作同樣可以靠限制性核酸內(nèi)切酶或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的設(shè)計(jì)將兩個(gè)DNA序列連接起來；步驟5將連接好的編碼[第一個(gè)BMP肽鏈--連接肽--第二個(gè)BMP肽鏈]的DNA序列克隆入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建BMP二連體的表達(dá)載體；步驟6將BMP二連體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主菌；提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化和核酸序列測定鑒定；并鑒定帶有BMP二連體的表達(dá)載體菌株的表達(dá)水平和穩(wěn)定性；
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2說述的基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征在于將2個(gè)BMP成熟肽間的雙硫鍵(-S-S-)該為以肽鍵(-CO-NH-)相連接的2個(gè)BMP構(gòu)成的產(chǎn)物命名為BMP二連體，由2個(gè)人骨形成蛋白BMP成熟肽組成的二連體全名為“重組人BMP成熟肽二連體rdhBMP-xmxm；其中x為構(gòu)成二連體的BMP種類名號，m為成熟肽的代號；兩個(gè)x種類名號可相同，也可不同；
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2說述的基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征在于所述的將兩個(gè)BMP肽鏈中的半胱氨酸突變的過程需要加入限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列和起始碼，并需要聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增引物；引物根據(jù)需要可設(shè)計(jì)為不同DNA序列；
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2說述的基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征在于所述的連接肽是指根據(jù)要求設(shè)計(jì)的一段具有特定DNA序列編碼富含甘氨酸的肽鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2說述的基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征在于所述的BMP二連體的表達(dá)載體是指BMP插入大腸桿菌質(zhì)粒所構(gòu)建的、能在大腸桿菌中表達(dá)BMP二連體的質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1說述的基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征在于所述大腸桿菌宿主菌可為DH5α、TOP 10、或基因工程大腸桿菌宿主菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程重組二連體骨形成蛋白的設(shè)計(jì)構(gòu)建方法，其特征是用基因工程手段構(gòu)建“重組人BMP成熟肽二連體”，基本方法是將編碼BMP成熟肽的cDNA放在大腸桿菌中表達(dá)，使BMP成熟肽在內(nèi)部正確形成3對雙硫鍵，在BMP成熟肽的鏈間以肽鍵相連接而成為BMP二連體以及經(jīng)在體外純化復(fù)性后折疊成為有活性的BMP；半胱氨酸突變的過程需要加入限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列和起始碼，并需要PCR的擴(kuò)增引物；引物根據(jù)需要可設(shè)計(jì)為不同DNA序列；本發(fā)明提供了用基因工程的手段使大腸桿菌直接表達(dá)類似二聚體結(jié)構(gòu)的有活性的重組二連體骨形成蛋白及其制備方法，以期用廉價(jià)的大腸桿菌基因工程系統(tǒng)去大量生產(chǎn)具有良好生物活性的各種BMP。
文檔編號C12N15/70GK1782075SQ20041007316
公開日2006年6月7日 申請日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者陳蘇民, 梁克明, 秦云, 陳南春 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)